Extraccin de DNA plasmdico.

Objetivo

Extraccin del DNA del plasmdico contenido en una cepa de la bacteria E. coli.
Materiales:

Centrifuga Refrigerada.
Micropipetas.
Tubos Eppendorf.
Vortex
Material comn de laboratorio

Resultados y Discusin
En la extraccin del ADN plasmdico, el contenido celular de los cultivos
bacterianos se concentro por centrifugacin y se liso utilizando un mtodos que
incluyen tratamiento con lcalis, detergentes inicos o no inicos y disolventes
orgnicos.
La eleccin del mtodo de extraccin depende de la especie bacteriana que
contiene el plsmido, su tamao molecular y el tipo de anlisis que se planee
realizar: por lo que los resultados varan ampliamente dependiendo la especie
microbiana con la que se trabaje
Pere y Coque (2005) mencionan que para los plsmidos de alto peso molecular
se han de extraerse con una lisis suave que evite su fragmentacin. Normalmente
se resuspenden en soluciones de sacarosa y se tratan con lisozima y EDTA para
romper la membrana, procediendo a la lisis de los esferoplastos resultantes del
tratamiento previo con detergentes como dodecil sulfato de sodio (SDS).
Por otro lado los plsmidos de bajo o medio peso molecular (los ms
frecuentemente analizados) se extraen con mtodos ms agresivos que incluyen
tratamiento con EDTA y lisozima y exposicin posterior al calor o a lcalis.

Por mencionar una de tantos resultados, realizando una lisis alcalina en presencia
de SDS es una tcnica flexible que trabaja muy bien con todas las cepas de E. coli
y con cultivos bacterianos en fase logartmica en un rango de 1 mL a >500 mL.
Sin embargo el tratamiento debe modificarse segn la cepa hospedadora (especie
bacteriana, debido a la diferente composicin de la pared celular de distintos
microorganismos). Se han descrito numerosos protocolos para la separacin de
ADN plasmdico. Los protocolos actuales permiten el anlisis de un gran nmero
de muestras presentndose algunas ventajas en protocolo ya que estas tcnicas
se disean para cubrir un marco amplio de microorganismo.
Palmira y Riward (2002) observaron que estas tcnicas se basan en su mayoria
en el mtodo de lisis alcalina de Birnboim y Doly y son aplicables a un gran
nmero de bacterias grampositivas y gramnegativas. Este mtodo se basa en la
diferente resistencia a valores de pH elevados del ADN plasmdico. La aplicacin
de una solucin de SDS y NaOH provoca la lisis celular y la desnaturalizacin del
ADN plasmdico.
Dada la simplicidad de los protocolos se pueden generar resultados en poco
tiempo y procesar un elevado nmero de clonas al mismo tiempo
Para obtener resultados factibles tambin es importante no tomar demasiada
biomasa pues esto potencia la probabilidad de contaminacin de la preparacin
con ADN genmico. En este tipo de preparaciones difcilmente se observa un
precipitado, dada la pequea cantidad de ADN obtenido. Sin embargo se realiza la
electroforesis para comprobar los resultados.

Conclusiones

Al momento de realizar la prctica se tuvieron algunas dificultades como es el

hecho de que en los tres tubos con medio de cultivo en los cuales se sembraron
las clulas para extraer el ADN plasmdico nicamente se obtuvo crecimiento en
uno, esto se observ por la turbidez que presentaba. La razn por la que solo

hubo crecimiento en un solo tubo se debi a que las clulas con las que se estaba
trabajando ya tena demasiado tiempo almacenadas por lo que eran consideradas
clulas viejas. A pesar de todos estos inconvenientes se logr extraer ADN
plasmdico satisfactoriamente.
Gracias a esta prctica se logr tener una mejor compresin de cmo es que se
lleva a cabo la extraccin del ADN, al observar que ocurra en cada paso de la
tcnica.
BIBLIOGRAFIA
1 Pere Coll, M. Teresa Coque, (2005). Procedimientos en Microbiologa Clnica,
Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica, Espaa.
2 Dra. Palmira G, Lic. Riward C., (2002). Fundamentos de Gentica Molecular,
Universidad Central de Venezuela, Facultad de Ciencias, Escuela de Biologa,
Departamento de Biologa Celula
3 Facultad De Ingenieria Qumica (2013). Extraccin De Adn Plasmdico,
Ingeniera en Biotecnologa Biologa Molecular