Caracterizacin gentica:

caracterizacin gentica, se entiende el proceso de determinacin del

genotipo o contenido genmico, en forma de ADN, especfico de un
organismo biolgico, mediante un procedimiento de laboratorio. En otras
palabras, es la tcnica de laboratorio que se utiliza para determinar la
informacin gentica de un organismo, o genotipo, y poder diferenciarlo del
resto.a seleccin en la especie bovina se ha basado principalmente en la
mejora de caracteres cuantitativos como leche, grasa y protenas
controlados por mltiples
loci. Si adems tenemos en cuenta que para conseguir mejorar estos
caracteres se acta principalmente controlando los machos y que las
medidas se hacen en individuos adultos, resulta sencillo entender que el
progreso gentico es lento y costoso. Los avances producidos acerca del
estudio de la importancia de algunos genes sobre caracteres productivos,
permite en este momento priorizar lo que podramos llamar caracteres
cualitativos relacionados especialmente con la calidad. Por otra parte,
determinados marcadores se consideran herramientas fundamentales para
conocer genes de inters econmico como los denominados QTL
Recientemente se han publicado trabajos de caracterizacin de diferentes
ganados criollos de Latinoamrica que contribuyen al conocimiento del
potencial gentico de los mismos y brindan la posibilidad de realizar
estudios de comparacin con sus ancestros europeos En Cuba se han
desarrollado estudios de polimorfismo bioqumico a nivel proteico.
Marcador gentico:
Un marcador gentico o marcador molecular es un segmento de ADN con
una ubicacin fsica identificable (locus) en un cromosoma y cuya herencia
gentica se puede rastrear. Un marcador puede ser un gen, o puede ser
alguna seccin del ADN sin funcin conocida. Dado que los segmentos del
ADN que se encuentran contiguos en un cromosoma tienden a heredarse
juntos, los marcadores se utilizan a menudo como formas indirectas de
rastrear el patrn hereditario de un gen que todava no ha sido identificado,
pero cuya ubicacin aproximada se conoce. Los marcadores se usan para el
mapeo gentico como el primer paso para encontrar la posicin e identidad
de un gen. Son ampliamente utilizados en gentica humana, vegetal, animal
y microbiana. Permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la
secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen stas o no su fenotipo.
Funcionan como sealadores de diferentes regiones del genoma.
FACTORES QUE AFECTAN LA TERNEZA
La terneza al igual que toda caracterstica determinada por procesos
biolgicos, est afectada por un gran nmero de factores.

En trminos generales los clasificaremos en factores del ambiente, de

manejo, y genticos.
A continuacin se har un breve comentario de los factores que a nuestro
juicio tienen mayor importancia relativa.
Factores ambientales
Edad: la terneza de la carne disminuye al aumentar la edad del animal, es
decir que animales viejos poseen carne ms dura.
Esto es explicado en parte por una menor solubilidad del colgeno, que es
una protena que forma parte del tejido conjuntivo que envuelve las fibras
musculares. Existen muy pocas evidencias de que el colgeno sea afectado
por el proceso de maduracin. Algunos autores no encontraron diferencias
en terneza trabajando con animales faenados en el rango de
aproximadamente 12 a 22 meses de edad, es decir, que en animales jvenes
con rangos de edades a faena estrechos, las variaciones en terneza seran
de poca importancia.
Sexo: la terneza es menor en machos enteros, que en machos castrados,
registrndose los mayores valores en las hembras, debido a que presentan
en general mayores niveles de engrasamiento que los machos castrados, y
stos mayor que los machos enteros, debido a su mayor precocidad.
Alimentacin: un alto plano nutricional y un rpido crecimiento (invernadas
intensivas, feed lots) provocan un alto ndice de sntesis de colgeno. El
nuevo colgeno sintetizado diluye al antiguo colgeno estable al calor,
hacindolo en promedio ms inestable, resultando de esta forma en un
msculo con mayor terneza.
La terneza en carne est relacionada con la presencia de calpanas que
tienen actividad proteoltica sobre las protenas miofibrilares. El anlisis de la
frecuencia de un alelo relacionado con terneza presente en el gen de la
calpana, se us como predictor de su capacidad para mejorar su suavidad
durante el proceso de maduracin. El presente estudio pudo evidenciar la
frecuencia de un SNP, Calpana 530, relacionado con mayor resistencia al
corte despus de los procesos de maduracin. Se propone esta tcnica de
deteccin molecular para predecir cortes con potencial de incrementar su
terneza.

INTRODUCCIN
La terneza es la principal caracterstica buscada en la carne bovina, y si
bien puede elegirse inicialmente a un producto crnico por algn otro
carcter, por ejemplo color, la continuidad o lealtad de un cliente a una
marca o producto estar dada por la caracterstica terneza.

Este comentario no se refiere exclusivamente a Argentina, sino a

consumidores de carne bovina de todo el mundo.
Cuando queremos caracterizar un alimento lo hacemos por sus diferentes
cualidades: sensoriales, nutricionales, inocuidad, presentacin, tiempo de
preparacin, etc. Entre los caracteres sensoriales, y considerando en
particular a la carne bovina, incluimos terneza, color, jugosidad, sabor y
aroma.

CUL ES EL FUNDAMENTO O MECANISMO QUE EXPLICA CMO SE

DESARROLLA LA TERNEZA ?
Hay dos mecanismos bsicos. El primero consiste en un complejo de
enzimas (sustancias que se encuentran en pequea cantidad y
desencadenan procesos metablicos complejos), que actan sobre las
protenas produciendo su ruptura y expresando, entonces, la terneza. Pero
por otra parte, hay otras enzimas que inhiben a las anteriores, y realmente
del balance entre ambos grupos de enzimas tendremos el nivel de terneza.
Todo este complejo es constitutivo de los tejidos de los animales y en el
caso de una especie, bovino por ejemplo, son factores comunes a todos los
individuos de esa especie; hay un fundamento hereditario. Por esta misma
razn, hay casos en los que esos factores varan entre razas, y an entre
individuos. Por otra parte esas enzimas requieren ciertas condiciones para
actuar (temperatura, tiempo, acidez, etc.), y en caso que estas no se den, la
actividad enzimtica estar inhibida o ser escasa; si esto sucede y afecta al
complejo de enzimas relacionadas a la terneza, este carcter no se
manifestar y la carne ser dura. El segundo mecanismo se basa en la
fragmentacin de los tejidos elementales del msculo, a travs de acciones
mecnicas (como estiramientos).

CULES SON LOS FACTORES QUE DETERMINAN CUN TIERNO SER

UN CORTE DE CARNE?
Estos factores estn ligados a tres etapas de la cadena de la carne:
produccin primaria, industrializacin y procesamiento en los lugares de
consumo (restaurantes, hogares, comedores institucionales).
PRODUCCIN PRIMARIA
Como dijimos hay aspectos hereditarios, y aqu uno muy importante es la
raza. Los individuos de ciertas razas transmiten con mayor frecuencia las
enzimas que favorecen la terneza, y dado que esto puede estudiarse o
determinarse en los animales se est en camino de seleccionar padres con

esta cualidad; las razas britnicas se caracterizan por producir, en general,

carne tierna.
Otro elemento a considerar es la edad, ya que los tejidos se modifican con el
aumento de ella, y se reduce la accin de las enzimas que favorecen la
terneza; este hecho es particularmente importante a partir de los 30 meses
de edad. Asimismo, este Sector Productor debe trabajar para fijar sus Puntos
Crticos de Control, y no slo referidos a los aspectos sanitarios, sino
tambin los que tienen que ver con la calidad sensorial de la carne; esto
significa fijar los puntos que son crticos en su sistema: raza, velocidad de
crecimiento, nutricin, etc. Relacionado con esto est la necesidad,
comentada, de aplicar sistemas que favorezcan la seleccin de canales por
criterios de calidad (terneza, color, marmoreo, pH, etc.), pero a la vez estos
sistemas deben permitir orientar al productor en cuanto al animal que debe
producir y las herramientas a utilizar para ello: en nutricin, gentica,
sanidad, manejo.

INDUSTRIALIZACIN
Tenemos aqu factores que llevan a producir carne dura y otros que
favorecen la terneza. Entre los primeros tenemos uno derivado de la
aplicacin rpida y excesiva del fro.
Sin duda es necesario refrigerar las medias reses con el fin de evitar su
deterioro, pero si esta prctica no se hace correctamente se puede producir
el fenmeno denominado "contraccin por fro", que lleva al endurecimiento
de la carne y es irreversible. Entre los que tienen efectos favorables sobre la
terneza tenemos el madurado. Este consiste en almacenar carne en
refrigeracin (entre 0 y 2C) por periodos de 7 a 14 das para permitir y
exaltar el efecto de las enzimas ya comentadas. Tambin se tienen
operaciones que actan mecnicamente sobre los msculos: estimulacin
elctrica, suspensin del agujero obturador, tender cut, etc. Todas estas
producen carne ms tierna en funcin del segundo de los mecanismos
citados. Sin embargo, todos los procesos que se pueden aplicar a nivel
industrial pueden favorecer la presentacin de cortes tiernos, lo cual es muy
importante, pero el nivel de ello estar determinado o limitado a lo que
genticamente traa o portaba el animal. Otro proceso importante en el
sector industrial es la aplicacin de temperaturas de coccin. La preparacin
de una materia prima para elaborar platos preparados o los mismos platos,
requiere cierto nivel de coccin que estar bsicamente definido por la
temperatura y tiempo que se apliquen. Sin embargo, cumplir con el
requerimiento de inocuidad (ausencia de riesgo razonable para la salud
humana o animal) puede llevar a la necesidad de aplicar altas temperaturas

con el consiguiente deterioro de la calidad sensorial de la carne; esto es lo

que sucede con las exportaciones a algunos pases como EE.UU. (por el
riesgo de difundir al virus de Fiebre Aftosa): el producto se desmerece y el
precio es inferior al deseado.

PROTEASAS Y LOCALIZACIN CELULAR

Dado que la mayor parte de las protenas se utilizan intracelularmente, la mayora se
recambian dentro de la clula. Las primeras proteasas intracelulares que se
caracterizaron fueron las que se encuentran en los lisosomas. Sin embargo, es evidente
que las protenas se degradan en todos los compartimentos celulares principales,
puesto que hay enzimas proteolticas en todas las partes de la clula. En las clulas
eucariotas se ha encontrado al menos cuatro sistemas de protelisis citoslica unas
proteasas activadas por el Ca2+ denominadas calpanas , una proteasa neutra de
gran tamao.. Los lisosomas, que se forman por gemacin a
partir del complejo de Golgi, son bolsas de enzimas
digestivas, que contienen proteasas, nucleasas, lipasas
y enzimas de degradacin de hidratos de carbono.
Desempean diversas funciones celulares como la
secrecin de enzimas digestivas, digestin de orgnulos destinados a la destruccin, digestin de partculas alimentarias o bacterias capturadas mediante
fagocitosis, o liberacin
intracelular de enzimas
seguida de autlisis, digestin y muerte de una clula
como parte del proceso morfogentico normal del
desarrollo. As, por ejemplo, la membrana que existe
entre los dedos de los pies y entre los dedos de las
manos en la fase fetal inicial del ser humano se
destruye mediante este tipo de muerte celular programada.
Las calpanas (EC 3.4.22.17) son una familia de
cisten-proteasas citosli
cas relacionadas con el
procesamiento de protenas del citoesqueleto, la
diferenciacin celular y la apoptosis. El control de la
actividad de estas proteasas est determinado por las
concentraciones de Ca
2

Protelisis Intracelular:
Recambio Proteico Jos Neptuno Rodrguez Lpez

9
Las calpanas, que estn fuertemente reguladas por su

unin a membranas y actan a pH neutro, han sido

encontradas en casi todos los organismos, desde
mamferos hasta
Drosophila
melanogaster
, as como
en levaduras y bacterias, pero no han sido detectadas
en plantas. En la actualidad se han identificado hasta
12 diferentes calpanas en mamferos que se expresan
en todas las clulas (como son m- and

-calpanas) o
en un tejido concreto (como por ejemplo, la calpana
p94, expresada en el msculo esqueltico). La m- y

calpainas son las mejor caracterizadas y se diferencian

en sus afinidades por Ca
2+

, as

-calpana (tambin
llamada calpana I) requiere concentraciones micromolares de calcio para su activacin (5-50

M)
mientras que m-calpana (cal
pana II) es slo activada
por concentraciones milimolares (0.2-1 mM
Las calpanas hidrolizan una amplia variedad de
protenas
in vitro
, sin embargo, y debido a que sus
sustratos endgenos no son bien conocidos, el papel
de estas enzimas en los organismos no est muy claro.
Se sabe que protenas de corta vida media, que llevan
secuencias PEST, son buenos sustratos de estas
enzimas. Una de las primer
as reacciones descubiertas
para las calpanas fue la degradacin de diferentes
quinasas como la piruvato quinasa o la fosforilasa B
quinasa. Adems, las calpanas hidrolizan protenas
miofibrilares y otras protenas del citoesqueleto como
protenas de asociacin de microtbulos (MAPs),
actina, laminina, tubulina, fodrina y vicentina.

Tambin se ha implicado a esta familia de protenas

en las reacciones de muerte programada o apoptosis y
en la degradacin del receptor de la eritropoyetina.
Implicacin de l
as calpanas en procesos
patolgicos

Algunos procesos relacionados con la

distrofa
muscular
, como la degradacin del disco Z,
troponinas, I y C, y la caden
a pesada de la miosina,
son activados por altas concentraciones de Ca
2+

. Esto
ha hecho que se implique a la calpanas en esta
enfermedad. Otras enfermedades en las que se ha
implicado a estas proteasas se pueden observar en la tabla 6 quemia cardiaca
Ruptura de protena miofibrilares cau
sando muerte celular irreversible
Distrofia muscular
Ruptura de protena miofibrilares
Cataratas
Ruptura del cristalino dando l
ugar a precipitacin proteica
Trombosis
Protelisis de agreguina cau
sando agregacin plaquetaria
Artritis
Ruptura del cartlago y proteoglicanos co
mponentes de la ma
triz extracelul

La gran variacin de las canales que llegan a las plantas de faenado en

Colombia, como consecuencia de variaciones fisiolgicas, de manejo y
seleccin gentica provocan gran heterogeneidad en trminos de calidad final
de la carne. La terneza se considera uno de los factores fundamentales para la
comercializacin en la industria ganadera, especialmente por el consumidor
final (1). Las normas establecidas para el manejo de las carnes en las plantas
de desposte se dedican a mejorar la inocuidad del producto, las
especificaciones de empaque y cortes, entre otras (2). Por su parte, la gentica
molecular permite asociar el genoma con el fenotipo y disminuir la

incertidumbre en relacin al producto final de los animales criados en

cautiverio. Su aplicacin en la valoracin de la calidad de carnes posmortem,
se realiza por la identificacin de polimorfismos genticos entre los que se
encuentran la proteasa calpana que acta sobre las protenas miofibrilares (3).
Este gen ubicado en el cromosoma bovino 29 exn 14 (4), posee hasta el
momento los polimorfismos de un solo nucletido (SNPs) C316, C4751 y C530
(4) (5), este ltimo responsable de cambios en los nucletidos G a A,
provocando la sustitucin aminoacdica de isoleucina a valina (5). El objetivo
del presente trabajo fue cuantificar la frecuencia del SNP calpaina 530
(CAPN530) en canales de bovino que ingresan a desposte en Antioquia
teniendo en cuenta su informacin disponible para verificar condiciones de
calidad.

Las caractersticas de importancia econmica en las especies de produccin

animal son en su mayora cuantitativas, su expresin depende de la interaccin
de muchos pares de genes que tienen efecto sobre la caracterstica en
diferentes proporciones. Dos de los genes de mayor importancia para la
produccin, composicin y/o calidad sanitaria de la carne son Calpana (CAPN1)
y Calpastatina (CAST). El objetivo del presente trabajo es estimar las
frecuencias allicas y genotpicas de los diferentes SNPs en los genes CAPN1 y
CAST en el ganado criollo colombiano, para ser comparadas con la frecuencias
de los ganados importados, mediante las tcnicas Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR) y Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restriccin
(RFLP). Se est trabajando con 30 muestras de ADN de cada raza bovina
criolla. Se han amplificado los marcadores CAPN316, CAPN530, CAPN4751,
CAPN4753, CAPN5331 Y CAST2959. Mediante la PCR-RFLP se ha genotipificado
el marcador CAPN4751 donde el genotipo ms frecuente fue el heterocigoto
(CT) con 67% y el marcador CAST2959 el cual presento la mayor frecuencia
para el alelo (A) con 67%. Las variantes allicas favorables para suavidad de la
carne (C en CAPN4751 y A en CAST2959) son segregados de manera
importante en la poblacin Introduccin Colombia es considerado uno de los
pases ms diversos en recursos zoogenticos, posee diez razas bovinas
criollas (Bos taurus) adaptadas, las cuales han demostrado un alto
potencial gentico, expresan caractersticas adaptativas de gran importancia
como tolerancia al calor y humedad, as como resistencia a ciertas
enfermedades, mejores rendimientos en canal y una mejor eficiencia
alimenticia lo cual incrementa su valor como recurso gentico. Martnez (1992)
seala que los bovinos criollos se caracterizan por su habilidad para
reproducirse, longevidad, rusticidad y por su capacidad para aprovechar
forrajes toscos y de escaso valor nutritivo (Casas y Valderrama, 1998; Vsquez,
2005). El desarrollo de programas de mejoramiento gentico a principios de los
aos 90, orientados principalmente sobre criterios de produccin: cantidad de

produccin de leche o rendimiento en canal para la produccin de carne, llev

a someter a las razas criollas a constantes Actas Iberoamericanas de
Conservacin Animal AICA 1 (2011) 191-194 191 cruzamientos graduales de
absorcin hacia ganado cebuino o taurino, ocasionando disminucin en las
poblaciones puras e introgresin con razas forneas tanto Bos taurus como Bos
indicus (Neira, 2011; Martinez, 1999). En los ltimos aos estudios a nivel
genmico del bovino han hecho posible predecir su valor gentico, en
particular el potencial para transmitir caracteres deseados en su descendencia,
inclusive caracteres difciles de evaluar o poco heredables, por lo que los
marcadores moleculares han ayudado en el estudio de la informacin,
funcionando como sealadores de diferentes regiones del genoma. Los grandes
tipos de marcadores utilizados en genmica de especies de inters zootcnico
son los microsatlites y los SNP, la principal ventaja de los SNP es el desarrollo
actual de herramientas de genotipage de alta resolucin y el relativo bajo costo
unitario (Neira, 2011). Las caractersticas de importancia econmica en las
especies de produccin animal son en su mayora cuantitativas, y aunque su
herencia no rie con las leyes descritas por Mendel, su expresin depende de
la interaccin de muchos pares de genes que tienen efecto sobre la
caracterstica en diferentes proporciones. Si bien todas las caractersticas
cuantitativas dependen de muchos genes, en el ganado bovino no se conoce
con exactitud cuntos y cules genes estn involucrados directamente en cada
una de las caractersticas de importancia econmica (Echeverri et al, 2011).
Algunos de los genes de mayor importancia para la produccin, composicin
y/o calidad sanitaria de la carne son Calpana (CAPN) y Calpastatina (CAST), por
presentar variantes allicas que se asocian con caracteres productivos de
calidad de la carne. La Calpana, es una protena responsable de la protelisis
postmortem en la carne (Koohmaraie, 1996; Koohmaraie et al, 2005), se han
identificados varios SNP en el gen de -CAPN que se asocian con
caractersticas de importancia econmica (Page et al., 2004; White et al., 2005;
Casas et al., 2006). Esta proteasa est involucrada en el desarrollo muscular,
pero la mayor importancia econmica se le ha otorgado a su efecto en el grado
de terneza de la carne (Koohmaraie et al., 1994; Geesink et al., 1999; Geesink
et al., 2000; Riley et al., 2003). La calpastatina se localiza en el cromosoma
bovino 7 (Bishop et al., 1994), y est organizado en 35 exones y sus
respectivos intrones, abarcando aproximadamente 130kb se considera un gen
candidato, ya que se sabe que acta como inhibidor natural de las calpanas en
el sistema de protelisis de estas en la carne (Koohmaraie, 1996). Los genes
descritos anteriormente han sido ampliamente valorados por la comunidad
cientfica dedicada a la investigacin gentica, por lo que el objetivo del
presente trabajo es estimar las frecuencias allicas y genotpicas en el ganado
criollo Colombiano y compararlas con la frecuencias en los ganados
importados.

Resultados y discusin Actualmente se han estimado las frecuencias allicas en

los genes CAPN y CAST, los cuales han sido previamente reportados por su
asociacin con la terneza de la carne bovina en razas B. taurus, B. indicus y sus
cruces (Buchanan et al, 2002; Casas et al, 2006; Page et al, 2002; White et al,
2005). Se amplificaron los marcadores CAPN316, CAPN530, CAPN4751,
CAPN4751, CAPN5331 y CAST2959 en la poblacin de animales estudiada,
obtenindose fragmentos de 731bp, 568bp, 144bp, 224bp, 177bp y 269bp
respectivamente. La tipificacin de los genotipos hasta el momento se ha
realizado para el marcador CAPN4751 y CAST2959. Actas Iberoamericanas de
Conservacin Animal AICA 1 (2011) 191-194 192 El marcador CAPN4751 que se
asocia significativamente con FCWB (Fuerza de Corte de Warner Bratzler) es
una transicin de Citocina por Timina en la posicin 6545 del intrn 17 del gen
(White et al. 2005). La presencia del alelo C (Citocina) en forma homocigtica o
heterocigtica para este marcador, ha demostrado que disminuye la FCWB
(Casas et al, 2005; Page et al, 2004; Parra-Bracamonte et al, 2009; White et al,
2005). En el presente estudio el marcador CAPN4751 present una frecuencia
allica de 38% para el alelo (C) favorable para este marcador, en donde el 67%
de los genotipos fueron heterocigotos (tabla I). White (2005) report una
frecuencia del 10,8% para el alelo C en una poblacin Brahaman, de un 57,5%
para una poblacin Bos taurus y de un 63,9% para animales de cruce Bos
taurus x Bos indicus. Parra-Bracamonte (2009) report en una poblacin de
Brahman, 49% para el alelo C donde el 99% de los genotipos fueron
heterocigotos. Proponiendo la necesidad de validar, sobre todo en pruebas
controladas, el efecto fenotpico puntual que tiene la segregacin de las copias
allicas favorables (asociados positiva y significativamente al rasgo
cuantitativo) para estos marcadores y ser utilizados en casos particulares de
seleccin, sobre todo considerando la gran variabilidad dentro y entre razas
crnicas y los diferentes ambientes de manejo en los que se cran, pero sobre
todo debido a la naturaleza polignica de esta caracterstica de naturaleza
cuantitativa.

La terneza de la carne est determinada por numerosos factores como: sexo,

edad, raza, peso al sacrificio, caractersticas del tejido conectivo, veteado,
actividad de las enzimas proteolticas postmortem (calpanas y calpastatinas), y
tiempo de maduracin de la carne, entre otros.
El enternecimiento postmortem de la carne se produce por la degradacin de las
protenas miofibrilares, que conduce a una desorganizacin de la estructura del
tejido. El proceso es llevado a cabo por el complejo enzimtico calpanas
calpastatina. Las calpanas (-calpana, principal responsable del enternecimiento,
y m-calpana) son proteasas que degradan las protenas miofibrilares. La
calpastatina inhibe la actividad enzimtica de la -calpana.

Las diferencias en el nivel de proteolisis de la carne entre especies pueden ser

explicadas por la variacin en la actividad de la calpastatina (Koohmaraie et al.,
1991). Mediante el estudio de la expresin de estas dos enzimas se ha observado
que existen diferencias raciales en terneza de la carne. La terneza es estimada
indirectamente por la resistencia al corte (RC) de una muestra de carne con la
cizalla de Warner-Bratzler (WB). De esta forma, se conoce que en las razas
cebunas (Bos indicus) hay mayor expresin de la calpastatina que en razas
europeas, lo que se traduce en una menor degradacin de las protenas
miofibrilares y por lo tanto en una mayor dureza de la carne (Marshall, 1999).
En los ltimos aos, cientficos de Estados Unidos y Australia han diseado test
genticos para seleccionar a los mejores progenitores, cuya descendencia tendr
carnes ms tiernas. Estos anlisis proveen a los criadores de una herramienta eficaz
que proporciona criterios de seleccin objetivos para la terneza.
A igualdad en el manejo postmortem, la seleccin de genotipos favorables (hasta
-1,2 Kg de resistencia al corte) mantendr la competitividad de la carne de bovino
frente a la de otras especies, mejorando adems la economa de la industria crnica
En Espaa estos test se estn utilizando en el programa de mejora de la raza
Retinta,

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica "in vitro" que

imita la habilidad natural de la clula de duplicar el ADN.
Se trata de una tcnica usada para crear un gran nmero de copias de un
segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin, apareamiento con
cebadores y extensin por una ADN polimerasa termoresistente.
Hasta la dcada de 1980, el nico mtodo para obtener grandes cantidades de un
fragmento de ADN era clonndolo en vectores adecuados e introducindolo y
multiplicndolo en bacterias. En el ao 1985, un investigador norteamericano,
Kary Mullis (acreedor del Premio Nobel en Qumica 1993 por este aporte),
desarroll un mtodo que permite, a partir de una muestra muy pequea de ADN,
obtener millones de copias de ADN in vitro, en unas pocas horas y sin necesidad
de usar clulas vivas. Esta tcnica, llamada reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), requiere conocer la secuencia de nucletidos de los extremos del
fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para disear dos

oligonucletidos sintticos de ADN complementarios a una porcin de cada una

de las dos cadena de la doble hlice.

1. La mezcla de reaccin contiene la

secuencia de DNA que se quiere amplificar,
dos oligonucletidos sintticos (P1 y P2) qu
servirn como cebadores, una DNA
polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro
desoxirribonucletidos trifosfato dATP,
dGTP, dCTP y dTTP.

2. Proceso:
La mezcla de reaccin se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a
una fase de desnaturalizacin, una de hibridacin o alineacin y una
de elongacin.

a) Durante la desnaturalizacin, que se reali

por calentamiento de la mezcla a 95C, se se
las dos cadenas del ADN molde.

b) Durante la hibridacin, la temperatura de

incubacin se reduce para permitir el
apareamiento de las bases de ambos cebador
el sitio donde encuentran una secuencia
complementaria.

c) Durante la fase de elongacin, la mezcla se calienta a 72C y la

enzima Taq ADN polimerasa se usa para replicar las hebras de DNA.
La Taq polimerasa comienza el proceso de extensin de la cadena
complementaria a partir del extremo 3 de los cebadores. Al finalizar cada ciclo,
la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.
Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposicin se encuentran la
deteccin precoz o prenatal de enfermedades genticas, la deteccin de

infecciones virales latentes o la produccin de grandes cantidades de fragmentos

de ADN humano a una velocidad muy superior a la posible mediante otros
mtodos. Esta tcnica tambin se aplica para estudios de identidad y filiacin.

PCR a partir de ARN.

El genoma de muchos virus de importancia clnica est compuesto de ARN en
lugar de ADN, los ms sobresalientes son el Virus de la Inmunodeficiencia
Humana (VIH), el Virus de la Hepatitis C (HCV) y la familia de Enterovirus
(EV).
Transcripcin Reversa- PCR (RT-PCR).
Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es
necesario hacer una transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin
por PCR. La transcripcin reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero
esta copia es ADN complementario (cADN) el cual es estable al calor y puede
resistir la metodologa PCR.
Los pasos de la RT-PCR son:
1. Transcripcin reversa: Unin del partidor a la secuencia de ARN objetivo.
2. Transcripcin reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensin del partidor
mediante la incorporacin de nucletidos complementarios.
3. Fin de transcripcin reversa, se obtiene la hebra del cADN
complementario al ARN.
4. PCR.

n 1985, Sir Alec Jeffreys descubri los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
restriccin que en biologa molecular, el trmino RFLP (del ingls Restriction Fragment Length
Polymorphism) se refiere a secuencias especficas de nucletidos en el ADN que son
reconocidas y cortadas por las enzimas de restriccin (tambin llamadasendonucleasas de
restriccin) y que varan entre individuos. En un cromosoma humano, una enzima de
restriccin puede producir un gran nmero de cortes en los lugares donde reconozca la
secuencia especfica para hacerlo. Las secuencias de restriccin presentan usualmente

patrones de distancia, longitud y disposicin diferentes en el ADN de diferentes individuos de

una poblacin, por lo que se dice que la poblacin es polimrfica para estos fragmentos de
restriccin. Los RFLP son marcadores gnicos del ADN y se pueden encontrar en regiones
que codifican protenas o exones, en los intrones o en el ADN que separa un gen de otro. Lo
nico que se necesita para que puedan ser marcadores genticos es que sean polimrficos
teniendo ms de un alelo. La tcnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos
particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genticas, en ciencia
forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relacin
gentica entre individuos.

Metodologa[editar]
El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado
usando la tcnica molecular Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (del
inglsPolymerase Chain Reaction), luego tratado con enzimas de restriccin especficas para
producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Estas enzimas de restriccin hacen un
proceso de digestin restrictiva en el cual reconocen cortas secuencias especficas en el ADN
donde cortan formando fragmentos de distintas longitudes. Los fragmentos de restriccin se
separan mediante electroforesis en geles de agarosa a travs del cual corren debido a un
campo elctrico y su disociacin obedece a la masa o a la carga elctrica de las muestras
segn la tcnica utilizada. Esto proporciona un patrn de bandas que es nico para un ADN
en particular debido a la diferencia en las secuencias del ADN en los individuos donde los
sitios de restriccin varan. Las bandas pueden ser transferidas por Southern Blot a una
membrana donde se hibridan con una sonda que permite determinar la longitud y la
separacin de los fragmentos. En este paso las cadenas de ADN tienen que estar
desnaturalizadas, es decir, en forma de cadena sencilla para permitir la hibridacin con las
sondas especficas. Las endonucleasas de restriccin en su mayora cortan el ADN de cadena
doble en secuencias especficas y cada enzima reconoce un sitio en particular. Un ejemplo es
la EcoRI: corta solamente cuando encuentra la secuencia 5`G/AATTC3` en la doble
hlice. Para esta tcnica, es importante seleccionar endonucleasas que corten en sitios
especficos y no sea en secuencias degeneradas.

Aplicaciones[editar]
El anlisis de la variacin de RFLP en genomas ha supuesto en el pasado una herramienta
fundamental en el mapeo genmico y el anlisis de enfermedades genticas. Cuando los
investigadores pretendan determinar la localizacin cromosmica de una determinada
enfermedad, analizaban el ADN de los miembros de una familia afectada por la enfermedad, y
buscaban los alelos para RFLP que mostraban patrones de herencia similares a los de la
enfermedad. Una vez el gen era localizado, el anlisis RFLP de otras familias podra predecir

su riesgo de padecer esa enfermedad, o quines tenan posibilidades de portar el gen

mutante. Tambin se ha usado este anlisis para determinar el origen parental de muchas
trisomas en humanos, e incluso para determinar en qu fase meitica ocurri el fenmeno
desencadenante de la trisoma.
El anlisis RFLP fue tambin la base de las modernas tcnicas de anlisis de huellas
genticas (Genetic Fingerprinting analysis en ingls), tiles en la identificacin de muestras
recuperadas de la escena de un crimen, en pruebas de paternidad, y en el estudio de la
biodiversidad en poblaciones animales.

Diagnstico de una enfermedad mediante screening de

un marcador RFLP[editar]
Cuando un RFLP normalmente se asocia con una enfermedad de origen gentico, la
presencia o ausencia de ste puede usarse a modo de consejo sobre el riesgo de desarrollar
o transmitir la enfermedad.
La suposicin es que el gen en el que los investigadores estn realmente interesados est
localizado tan cerca del RFLP que su presencia puede servir como indicador de la alteracin
en el gen. A veces, un RFLP en particular puede estar asociado con el alelo sano. Por esto es
esencial examinar no slo al paciente, sino a todos los miembros de la familia que sea posible.
Las pruebas ms tiles para tales anlisis son las asociadas a una nica secuencia del DNA;
esto es, una secuencia que est presente en un solo lugar del genoma. A menudo, este DNA
presenta una funcin que es desconocida. Esto puede ser de ayuda si ha mutado libremente
sin daar al individuo. La muestra del sujeto sometido al diagnstico hibridar con distintas
longitudes de DNA digerido de diferentes personas dependiendo de los sitios de corte de la
enzima que haya heredado. Una gran variedad de polimorfismos puede presentarse en la
poblacin, obteniendo una gran coleccin de alelos. Algunas personas sern homocigotos y
presentarn una nica banda, otros ( ej, todos los miembros de la familia mostrados abajo)
sern heterocigotos y presentarn una banda distinta por cada alelo.
Archivo:RFLPSCREENING.GIF
El pedigr muestra la herencia del marcador RFLP a travs de tres generaciones en una sola
familia. Un total de 8 alelos (numerados a la izquierda del gel) estn presentes en la familia.
Los RFLPs de cada miembro de la familia estn enumerados justo debajo de ellos.
Si, por ejemplo, cada persona que hered el alelo RFLP 2 tuviera tambin cierto desorden
heredado, y ninguno de los que carecieran del alelo tuviera la afeccin, deduciramos que el

gen de la enfermedad est ligado de manera muy prxima al RFLP. Si los padres decidieran
tener otro hijo, un test prenatal podra revelar si el nio presentara la enfermedad. Pero
destacar que el cruzamiento durante la formacin de los gametos podran mover el marcador
RFLP al alelo sano. Por esto, a mayor distancia entre el RFLP y el locus del gen, disminuye la
probabilidad de un diagnstico preciso.

Introduccin de la tcnica PCR-RFLP para

el diagnstico de dos mutaciones en el
gen VHL
Antonio Alejandro Espern, Ins Virginia Noa Hechavarra, Ldice Reyes Navarro

Resumen

Fundamento: La enfermedad de Von Hippel-Lindau es un trastorno neoplsico hereditario. Se

debe a mutaciones germinales en el gen VHL. En Cuba se realiza el diagnstico molecular por
el mtodo de anlisis de polimorfismo conformacional de simple cadena de ADN (SSCP) de
los tres exones del gen seguido por secuenciacin. Este mtodo es costoso, laborioso y

consume tiempo.
Objetivo: describir la introduccin del diagnstico molecular por PCR-RFLP de las mutaciones
c.362A>G y c.481C>T del gen VHL.
Mtodos: se emple el programa informtico CLC Sequence viewer 6.5.1 para identificar
enzimas de restriccin cuyos sitios de corte resultaran modificados por las mutaciones
c.362A>G en el exn 2 y c.481C>T en el exn 3 del gen VHL. Se utilizaron muestras de ADN
de pacientes ya diagnosticados por SSCP-secuenciacin, las cuales se amplificaron mediante
mtodo de PCR seguido por digestin enzimtica con las enzimas de restriccin SfaNI y
BtgZI. Los fragmentos amplificados fueron analizados en electroforesis en gel de agarosa. Se
compararon los resultados obtenidos por ambos mtodos.
Resultados: se estandariz y comprob la efectividad de la tcnica PCR-RFLP para el
diagnstico de las mutaciones c.362A>G y c.481C>T en el gen VHL.
Conclusin: la tcnica PCR-RFLP tiene ventajas sobre la estrategia SSCP-secuenciacin
para establecer de forma rpida, reproducible y confiable el diagnstico de la enfermedad VHL
en casos de familias molecularmente ya caracterizadas.

http://es.scribd.com/doc/180520716/Solucionario-de-Matematicas-para-administracion-yeconomia-pdf