Realizar una dilucin al 1/10 con solucin tampn ( Hepes- Na + )
Aadir el marcador citometrico ( Fluo-3 AM ), que va a detectar los cambios de Ca2+ citoslico ( un incremento debido tanto al flujo a travs de la membrana, como a la liberacin de los depsitos intracelulares). Incubar a 15 minutos a 37 c Aadir anticuerpo monoclonal CD41- PE ( conjugado con ficoeritrina ) ( especifico para glicoprotenas constitutivas de la membrana plaquetaria tales como CD41 complejo glicoproteico GPIIb / IIIa ) Incubar a 15 minutos a 37 C Aadir BCECF-AM, que es un indicador permeable a la membrana celular, una vez dentro de la celula este es hidrolizada por las esterasas citoslicas, generando BCECF libre , cuya fluorescencia es sensible a la concentracin de H +. Incubar a 15 minutos a 37 C Aadir tampn Tyrode a 37 C Llevar al clitmetro de flujo.
La intensidad de fluorescencia de ser modificada a cambios en la concentracin
de Ca mas , se incorpora a la celula donde es hidrolizado y de esta forma queda atrapado dentro de ella.
ANALISIS DE CICLO CELULAR Y APOPTOSIS
Generalmente, la cantidad de ADN se analiza para determinar la
presencia de clulas aneuploides ( con alteracin del contenido en ADN ) y el porcentaje de clulas en cada fase del ciclo celular. En cada una de estas fases, las clulas normales tienen una cantidad de ADN
conocida. En la fase Go ( reposo) y G1 ( pre sinttica), la celula tiene un
contenido diploide ( 2n) de ADN, correspondiente a 23 pares de cromosomas. Durante la fase S o de sntesis, la celula duplica su contenido en ADN convirtindose en tetraploide ( paso de 2n a 4n). en la fase G2 o postsintetica ,y al inicio de la mitosis M la celula mantiene este doble contenido de ADN hasta que se divide en dos hijas de contenido diploide. Para estudiar la ploidia de una poblacin celular se emplea una poblacin de referencia, con un contenido de ADN conocido, que sirve para identificar la posicin del pico diploide en el histograma.
En un histograma para estudiar el ciclo celular que represente la cantidad de
ADN en una poblacin celular habr cuatro regiones bien definidas tal como se muestran en el grafico.
La intensidad de fluorescencia de IP (ioduro de propidio ) es directamente proporcional a la
cantidad de ADN dentro de la celula. La regin que se encuentra en los canales ms bajos del espectro, llamada subG0, corresponde a clulas con el ADN fragmentado, lo cual puede correlacionarse con una fase tarda de apoptosis. Al final de esta regin se encuentra el pico G0/G1 correspondiente a clulas con contenido diploide de ADN. La siguiente regin no muestra un pico, sino un intervalo de canales que corresponde a una cantidad de ADN variable entre 2N y 4N. Esta regin se asocia a clulas en diferentes etapas de la fase de sntesis S. Al final de sta regin se encuentra el pico G2/M, situado en un canal doble del correspondiente al pico G0/G1, ya que se debe a clulas tetraploides.
El fluorocromo ms utilizado para este tipo de estudios es el ioduro de
propidio. Sus ventajas principales son la facilidad de uso, estabilidad y espectro
de absorcin/emisin, que le hace vlido para la mayora de citmetros de
flujo. Se excita con luz entorno a los 480 nm (para lo cual resulta vlido un lser de Argon-ion) y emite fluorescencia roja (entorno a los 620 nm). Las molculas de ioduro de propidio se intercalan entre los pares de bases de los cidos nucleicos, tanto del ADN como del ARN, por lo cual es necesario eliminar ste ltimo por procesos enzimticos si se quiere una determinacin lo ms exacta posible de la cantidad de ADN.
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN EL CICLO CELULAR
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS: Debido a las especiales caractersticas de los citometros de flujo, la muestra a analizar debe encontrarse en forma de suspensin monodispersa. Hay muestras como la sangre perifrica, medula osea u otros fluidos biolgicos, que precisan de un mnimo procesamiento ; en cambio los tumores slidos o las muestras parafinadas necesitan de una disgregacin mas o menos intensa ( mecnica , enzimtica, etc) En ocasiones puede ser conveniente o necesario enriquecer la concentracin celular en la muestra antes de su procesamiento por citometria, ya sea para obtener una concentracin celular adecuada para la incubacion con los reactivos, o para acelerar el proceso de sorting. 1. Preparacin de suspensiones celulares/nucleares para citometria de flujo: un factor limitante comn en citometria de flujo es la disponibilidad de una suspensin celular, para estudiar sus caractersticas y relacionar o extrapolar sus resultados a fenmenos in vivo . Para ello la suspensin celular debe cumplir una serie de requisitos: (1) representatividad del tejido, (2) suspensiones celulares de alta calidad, con pocos agregados, y bajo coeficiente de variacin ( CV), (3) preservacin de las caractersticas celulares y (4) suficiente muestra celular. 1.1Disgregacin de material fresco (clulas) : cuando el tejido es slido se emplean mtodos mecnicos o enzimticos basados en tripsina, proteasas, colagenasas, hialuronidasas, DNAasa o cocktails de ellas. Todos estos procedimientos tiene limitaciones (alteracin de las caractersticas celulares o antgenos de membrana) y varia su efectividad segn el tipo de tejido. Si queremos analizar en inmunofenotipo de superficie debemos emplear solo mtodos mecnicos y asegurarnos que los antgenos celulares no son destruidos por el procedimiento.
1.2Disgregacin de material fresco (ncleos): la preparacin de
suspensiones nucleares es una alternativa para el anlisis del ADN. Vindelow fue el primero en desarrollar un buen mtodo. Es importante hacer notar que los mtodos lticos no conducen a una disminucin del nmero de mitosis puesto que estas se retienen (comprobado por microscopia) por puentes intercromosomicos. 1.3Disgregacin de material parafinado: procedimiento basado en el mtodo desarrollado por Hedley en 1983. Sirve para muestras archivadas con ms de 10 aos de antigedad. En un 10-15 % de casos se obtienen CV superiores al 10 % que no permiten el anlisis del ciclo celular. Se obtienen histogramas casi idnticos si el tumor es procesado en fresco o despus de parafinizacin, si no hay perdida celular selectiva durante el procesamiento, adems los ndices de ADN son casi idnticos y solo se advierte de ADN muy bajos (por el aumento de CV de los picos). Se pueden procesar y estudiar las muestras con patrones internos de ploidia (hemates de pollo), pero en los tumores suele quedar algo de poblacin normal residual y es mejor emplear estas clulas como control de diploida de ADN. Para analizar los histogramas de ADN hace falta software especial ( discriminacin de ruido continuo por ncleos cortados, aproximacin matemtica para el clculo de fases). 2- Enriquecimiento celular:
Existen diversos mtodos de separacin y enriquecimiento celular
basados en las caractersticas fsicas, qumicas y funcionales de las clulas. Los ms empleados son los basados en el tamao y densidad celular (centrifugacin) El enriquecimiento previo en citometra beneficia sobretodo al sorting. Suponiendo igual pureza, tiempo muerto y generacin de gotas, si se aumenta la riqueza celular de las partculas a sortear en la suspensin celular se aumenta el flujo de partculas seleccionadas, aumentndose el numero de eventos procesados y activados, y por lo tanto la velocidad de sorter. Para una concentracin de clulas a sortear de 0.1 que se aumenta a 0.8 se aumenta la velocidad de sorter en 44 veces.