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ANALISIS CITOMETRICO DE Ph CITOSOLICO EN PLAQUETAS DE

SANGRE ENTERA
MUESTRA : sangre anticuagulada ( citrato)
PROCEDIMIENTO:

Realizar una dilucin al 1/10 con solucin tampn ( Hepes- Na + )


Aadir el marcador citometrico ( Fluo-3 AM ), que va a detectar los
cambios de Ca2+ citoslico ( un incremento debido tanto al flujo a
travs de la membrana, como a la liberacin de los depsitos
intracelulares).
Incubar a 15 minutos a 37 c
Aadir anticuerpo monoclonal CD41- PE ( conjugado con ficoeritrina
) ( especifico para glicoprotenas constitutivas de la membrana
plaquetaria tales como CD41 complejo glicoproteico GPIIb / IIIa )
Incubar a 15 minutos a 37 C
Aadir BCECF-AM, que es un indicador permeable a la membrana
celular, una vez dentro de la celula este es hidrolizada por las
esterasas citoslicas, generando BCECF libre , cuya fluorescencia
es sensible a la concentracin de H +.
Incubar a 15 minutos a 37 C
Aadir tampn Tyrode a 37 C
Llevar al clitmetro de flujo.

La intensidad de fluorescencia de ser modificada a cambios en la concentracin


de Ca mas , se incorpora a la celula donde es hidrolizado y de esta forma
queda atrapado dentro de ella.

ANALISIS DE CICLO CELULAR Y APOPTOSIS

Generalmente, la cantidad de ADN se analiza para determinar la


presencia de clulas aneuploides ( con alteracin del contenido en
ADN ) y el porcentaje de clulas en cada fase del ciclo celular. En cada
una de estas fases, las clulas normales tienen una cantidad de ADN

conocida. En la fase Go ( reposo) y G1 ( pre sinttica), la celula tiene un


contenido diploide ( 2n) de ADN, correspondiente a 23 pares de
cromosomas.
Durante la fase S o de sntesis, la celula duplica su contenido en ADN
convirtindose en tetraploide ( paso de 2n a 4n). en la fase G2 o
postsintetica ,y al inicio de la mitosis M la celula mantiene este doble
contenido de ADN hasta que se divide en dos hijas de contenido diploide.
Para estudiar la ploidia
de una poblacin celular se emplea una
poblacin de referencia, con un contenido de ADN conocido, que sirve
para identificar la posicin del pico diploide en el histograma.

En un histograma para estudiar el ciclo celular que represente la cantidad de


ADN en una poblacin celular habr cuatro regiones bien definidas tal como se
muestran en el grafico.

La intensidad de fluorescencia de IP (ioduro de propidio ) es directamente proporcional a la


cantidad de ADN dentro de la celula. La regin que se encuentra en los canales ms bajos del
espectro, llamada subG0, corresponde a clulas con el ADN fragmentado, lo cual puede
correlacionarse con una fase tarda de apoptosis. Al final de esta regin se encuentra el pico
G0/G1 correspondiente a clulas con contenido diploide de ADN. La siguiente regin no muestra
un pico, sino un intervalo de canales que corresponde a una cantidad de ADN variable entre 2N
y 4N. Esta regin se asocia a clulas en diferentes etapas de la fase de sntesis S. Al final de
sta regin se encuentra el pico G2/M, situado en un canal doble del correspondiente al pico
G0/G1, ya que se debe a clulas tetraploides.

El fluorocromo ms utilizado para este tipo de estudios es el ioduro de


propidio. Sus ventajas principales son la facilidad de uso, estabilidad y espectro

de absorcin/emisin, que le hace vlido para la mayora de citmetros de


flujo. Se excita con luz entorno a los 480 nm (para lo cual resulta vlido un
lser de Argon-ion) y emite fluorescencia roja (entorno a los 620 nm). Las
molculas de ioduro de propidio se intercalan entre los pares de bases de los
cidos nucleicos, tanto del ADN como del ARN, por lo cual es necesario eliminar
ste ltimo por procesos enzimticos si se quiere una determinacin lo ms
exacta posible de la cantidad de ADN.

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN EL CICLO CELULAR


PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:
Debido a las especiales caractersticas de los citometros de flujo, la muestra a
analizar debe encontrarse en forma de suspensin monodispersa. Hay
muestras como la sangre perifrica, medula osea u otros fluidos biolgicos, que
precisan de un mnimo procesamiento ; en cambio los tumores slidos o las
muestras parafinadas necesitan de una disgregacin mas o menos intensa
( mecnica , enzimtica, etc)
En ocasiones puede ser conveniente o necesario enriquecer la concentracin
celular en la muestra antes de su procesamiento por citometria, ya sea para
obtener una concentracin celular adecuada para la incubacion con los
reactivos, o para acelerar el proceso de sorting.
1. Preparacin de suspensiones celulares/nucleares para citometria
de flujo:
un factor limitante comn en citometria de flujo es la disponibilidad de una
suspensin celular, para estudiar sus caractersticas y relacionar o extrapolar
sus resultados a fenmenos in vivo .
Para ello la suspensin celular debe cumplir una serie de requisitos: (1)
representatividad del tejido, (2) suspensiones celulares de alta calidad, con
pocos agregados, y bajo coeficiente de variacin ( CV), (3) preservacin de las
caractersticas celulares y (4) suficiente muestra celular.
1.1Disgregacin de material fresco (clulas) : cuando el tejido es slido
se emplean mtodos mecnicos o enzimticos basados en tripsina,
proteasas, colagenasas, hialuronidasas, DNAasa o cocktails de ellas. Todos
estos procedimientos tiene limitaciones (alteracin de las caractersticas
celulares o antgenos de membrana) y varia su efectividad segn el tipo de
tejido. Si queremos analizar en inmunofenotipo de superficie debemos
emplear solo mtodos mecnicos y asegurarnos que los antgenos celulares
no son destruidos por el procedimiento.

1.2Disgregacin de material fresco (ncleos): la preparacin de


suspensiones nucleares es una alternativa para el anlisis del ADN.
Vindelow fue el primero en desarrollar un buen mtodo. Es importante hacer
notar que los mtodos lticos no conducen a una disminucin del nmero
de mitosis puesto que estas se retienen (comprobado por microscopia) por
puentes intercromosomicos.
1.3Disgregacin de material parafinado: procedimiento basado en el
mtodo desarrollado por Hedley en 1983. Sirve para muestras archivadas
con ms de 10 aos de antigedad. En un 10-15 % de casos se obtienen CV
superiores al 10 % que no permiten el anlisis del ciclo celular.
Se obtienen histogramas casi idnticos si el tumor es procesado en fresco o
despus de parafinizacin, si no hay perdida celular selectiva durante el
procesamiento, adems los ndices de ADN son casi idnticos y solo se
advierte de ADN muy bajos (por el aumento de CV de los picos).
Se pueden procesar y estudiar las muestras con patrones internos de
ploidia (hemates de pollo), pero en los tumores suele quedar algo de
poblacin normal residual y es mejor emplear estas clulas como control de
diploida de ADN. Para analizar los histogramas de ADN hace falta software
especial ( discriminacin de ruido continuo por ncleos cortados,
aproximacin matemtica para el clculo de fases).
2- Enriquecimiento celular:

Existen diversos mtodos de separacin y enriquecimiento celular


basados en las
caractersticas fsicas, qumicas y funcionales de las
clulas.
Los ms empleados son los basados en el tamao y densidad celular
(centrifugacin)
El enriquecimiento previo en citometra beneficia sobretodo al sorting.
Suponiendo igual pureza, tiempo muerto y generacin de gotas, si se
aumenta la riqueza celular de las partculas a sortear en la suspensin
celular se aumenta el flujo de partculas seleccionadas, aumentndose el
numero de eventos procesados y activados, y por lo tanto la velocidad
de sorter. Para una concentracin de clulas a sortear de 0.1 que se
aumenta a 0.8 se aumenta la velocidad de sorter en 44 veces.