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SEMINARIO CIENTFICO

HORMONA
ANTIDIURTICA y
ACUAPORINAS
Integrantes:
Carolina Bonti
Luccianna Bruschi
Emiliano Buscarons
Matilde Cabral
Agustn Cabrera
Beatriz Camacho

Esteban Cantero
Stefana Castelnovo
Juan Ignacio Luna
Sofa Marta
Camila Prez
Valentina Snchez

Prof.: Vernica Abudara


Grupo: AQP H1/A

ARTCULO CIENTFICO:
Efectos del antagonista del
receptor V2 de ADH en la expresin
de acuaporinas y su distribucin
subcelular en el rin.

Generalidades
Etimologa: Acua=agua. Porina=poro.
Conformacin: Protena transmembrana con 6 alfahlice.
Tipos:
- Acuaporinas: slo agua (AQP 0-8).
- Acuagliceroprotenas: Agua-Urea-Glicerol (AQP 910)
- Sin clasificacin: AQP 11 y 12.
Localizacin de AQP2: Membrana apical y vesculas
de clulas del tbulo colector.

Descubrimiento

Peter Agre - Roderick Mac Kinnon.


Hiptesis de existencia y comienzo de trabajos en
1991.
Primera descubierta en 2003. Premio Nobel.

Receptor V2
Receptor para vasopresina/ADH.
Tiene un solo sitio en el extracelular amino-terminal
a diferencia del resto.
AMPc/Adenilato ciclasa/PKA.
La va activa la fusin de vesculas.
Expresin del ARNm de la AQP2.
Inhibido por OPC-31260 (principal uso en esta
investigacin).

Mecanismos de regulacin de la
reabsorcin de agua por ADH:
ADH:
A corto plazo

A largo plazo

Translocacin hacia la membrana apical de


los canales de AQP2 ya sintetizados.

Nueva sntesis de canales de AQP2.

RELEVANCIA::
RELEVANCIA
Reabsorbe 99% del filtrado.
Por da:

170 litros 1.5 litros aprox.

IMPORTANCIA CLNICA
CLNICA::
Falta de AQP2: Se excreta gran cantidad de agua
- Severa diabetes inspida nefrognica
primaria o central.
Exceso de AQP2: Expansin del fluido extracelular
- Insuficiencias cardacas congestivas
- Cirrosis heptica

INTRODUCCIN AL ARTCULO
Objetivo:
Demostrar la participacin del receptor V2 en la
regulacin de la expresin de AQP2.
Estrategias:
 Observar los cambios de localizacin de AQP2
luego del tratamiento con OPC.
 Observar si el tratamiento con OPC sobre el
receptor V2 disminuye los niveles de ARNm de la
AQP2.

MATERIALES Y MTODOS
Protocolo 1 (48 horas)
-Sin agua (sedientas).
-Sobrecargadas con agua usando 300 mM de sacarosa
en el agua.
- Libre acceso al agua (control).

Protocolo 2 (15 min)


Protocolo 3 (30 min)
Protocolo 4 (60 min)
- Administracin OPC por va intravenosa.
-Suero fisiolgico por va intravenosa (control).

Protocolo 5 (6 das)
- Ratas con dieta normal durante 5 das y luego se suministr
OPC a la comida por 24 horas.
- Ratas con dieta estndar durante todo el estudio (control).

RESULTADOS
1) Efectos a corto plazo del tratamiento con antagonista
del receptor V2 sobre la distribucin celular de AQP2 en la
clulas principales del tbulo colector.
2) Expresin del ARNm y de la protena de AQP2 en la
mdula interna del rin de ratas sedientas y ratas con
sobreingesta de agua.
3) Expresin del ARNm de AQP2 en mdula interna del
rin de ratas tratadas con el antagonista del receptor V2,
OPC-31260.

1) Efectos a corto plazo del tratamiento con

antagonista del receptor V2 sobre la distribucin


celular de AQP2 en la clulas principales del tbulo
colector.

Resultado esperado

Resultado esperado

Cuatro ratas tratadas con OPC intravenoso.

Rpido aumento de la produccin de orina.

Protocolos utilizados: 2, 3 y 4

Localizacin de AQP2:
 Situacin control
A: ratas control tratadas con 0,2 mL de
solucin salina intravenosa.

Se observa que las AQP2 se


encuentran principalmente asociadas
a la membrana plasmtica apical y en
vesculas subapicales.
Inmunofluorescencia

 Tratamiento con OPC por 15 min


B: Ratas tratadas con OPC intravenoso
durante 15 minutos.

Se observa una disminucin de la


presencia de AQP2 en la
membrana plasmtica apical con
un concomitante aumento de
vesculas subapicales.

 Tratamiento con OPC por 30 min


C: ratas tratadas con OPC intravenoso
durante 30 minutos.

Casi no se observan dominios en


la membrana plasmtica apical y
sigue aumentando en las
vesculas internas.

Localizacin de AQP2

Micrografa electrnica marcada con inmunogold


Ratas del grupo
control:
vemos el marcado de
AQP2 que en su gran
mayora se
encuentran en la
membrana apical y
una porcin se
encuentra en
vesculas subapicales.

Flechas: AQP2 en membrana


plasmtica.
Cabezas de flechas: vesculas.

Luego de 15 min de
tratamiento con OPC: se
sugiere internalizacin
de AQP2 desde la
membrana apical hacia
las vesculas
citoplasmticas.

Cabezas de flechas
pequeas: vesculas.

Luego de 30 min de
tratamiento con OPC: vemos
las AQP2 internalizadas en las
vesculas citoplasmticas y
conformando cuerpos
multivesiculares (B y C).

Cabezas de flechas pequeas:


vesculas.
Cabezas de flechas grandes:
cuerpos multivesiculares.

Estudio semicuantitativo a partir de inmunogold:


comparacin de partculas de oro adheridas a AQP2 entre ratas
control (sham) y ratas luego de 30 min de tratamiento de OPC.

2) Expresin del ARNm y de la protena de AQP2


en la mdula interna del rin de ratas sedientas y
ratas con sobreingesta de agua.
Northern blot

Northern blot

Anlisis de densidad

Anlisis densitomtrico de ARNm de AQP2

La expresin de ARNm de AQP2 en las ratas sedientas


aumenta y en las ratas con sobreingesta de agua disminuye.

Inmunoblot (western blot)

Tcnica utilizada para la deteccin de protenas especficas.


Es un estudio cuantitativo que informa sobre la cantidad de protenas, a
diferencia de la tcnica de inmunofluorescencia que permite visualizar
la distribucin celular de la protena.

Se compara la expresin de la protena AQP2 en ratas


sedientas y ratas con sobreingesta de agua.
Inmunoblot

AQP2
glicosiladas

AQP2 no
glicosiladas

Ratas con
sobreingesta de agua

Ratas con
sed

La expresin de la protena AQP2 aumenta


significativamente en las ratas sedientas en
comparacin con las ratas con sobreingesta de
agua.

3) Expresin del ARNm de AQP2 en mdula


interna del rin de ratas tratadas con el
antagonista del receptor V2, OPC-31260.

Objetivo: investigar el rol del receptor V2 en la regulacin de la


expresin de ARNm de AQP2.

Protocolos utilizados: 2, 3, 4 y 5.

 Efectos en la expresin de ARNm de AQP2 en 15 minutos de


tratamiento con OPC

No se constat reduccin significativa del ARNm de AQP2.

 Efectos en la expresin de ARNm de AQP2 en 30 minutos de


tratamiento con OPC
Northern blot

Anlisis de densidad

Se observa una reduccin significativa del ARNm de AQP2.

 Efectos en la expresin de ARNm de AQP2 en 60 minutos de


tratamiento con OPC
Northern blot

Anlisis de densidad

Reduccin del ARNm de AQP2 persiste luego de 60 minutos.

 Efectos en la expresin de la PROTEINA de AQP2 en 60 minutos de


tratamiento con OPC
Inmunoblot

protena glicosilada
protena sin
glicosilar

No se observan cambios significativos en la cantidad de protena.

 Efectos en la PRODUCCIN DE ORINA en 60 minutos de


tratamiento con OPC

Gran aumento de la produccin de orina.


Reduccin de la osmolalidad.

 Efectos en la expresin de ARNm de AQP2 en 24 horas de


tratamiento con OPC

Se mantiene reduccin.

 Efectos en la PRODUCCIN DE ORINA en 24 horas de tratamiento


con OPC

Produccin de orina 5 veces mayor.


Reduccin de la osmolalidad.

 Receptor V2 importante en la modulacin de los


niveles de ARNm de AQP2.
 Tratamiento con OPC posee la capacidad de reducir
los niveles de ARNm de AQP2. Corroborando la
participacin del receptor V2 en la expresin de AQP2.
 Mecanismos independientes de ADH involucrados en
la regulacin a largo plazo de la expresin de AQP2.

DISCUSIN Y CONCLUSIONES
 La inmunofluorescencia y la microscopa inmunoelectrnica demostraron que el
tratamiento in vivo con antagonista del receptor V2 de la vasopresina caus una rpida
recuperacin de AQP2 de la membrana plasmtica apical en las vesculas y cuerpos
multivesiculares.

 Tratamiento con OPC se asocia con poliuria y reduccin de osmolalidad.

 Tratamiento con OPC induce una reduccin de los niveles de ARNm de AQP2.

 El balance del agua corporal est regulado por la vasopresina, la cual incrementa la
permeabilidad al agua del tbulo colector.

No toda la AQP2
intracelular est
disponible para el
reciclaje.

Todas son
internalizadas en
respuesta al
tratamiento con
OPC.
La mayora van a las
vesculas para luego
ser reutilizadas.

Externalizacin
Fosforilacin

Internalizacin
Se da por endocitosis, puede
requerir una desfosforilacin.

Ratas Brattleboro
No tienen ADH. Pero igual
reabsorben agua.

Sugiere la existencia de
mecanismos independientes de
ADH.

En suma:
 El receptor V2 est crticamente involucrado en la va de
sealizacin (a corto plazo) que regula la expresin de ARNm
de AQP2.
 A pesar de la participacin del receptor V2 en la regulacin
a largo plazo (24 horas) en la expresin de ARNm de AQP2, la
ausencia de una mayor reduccin de ste mas all de las 24
horas, es consistente con la existencia de mecanismos de
modulacin a largo plazo independientes del receptor V2.
Y cules son esos mecanismos?

GRACIAS!!