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UNIDAD DE TRABAJO N 5
TCNICAS DE TOMA Y PREPARACIN DE LA
MUESTRA: HOMOGENEIZACIN Y DILUCIN.
NDICE.
1. INTRODUCCIN.
2. TCNICAS DE TOMA DE MUESTRAS.
2.1.-Definicin de muestreo.
2.2.-Nmero de muestras.
2.3.-Concepto de muestra nica.
2.4.-Condiciones que deben cumplirse en la toma de muestras.
2.5.- Toma de muestras de alimentos.
2.6.-Identificacin de las muestras.
3. TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUESTRAS.
4. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANLISIS.
4.1.-Preparacin de una muestra con exceso de flora y acompaante.
4.2.-Muestras slidas o pastosas que es necesario licuar.
4.3.-Muestras con una elevada carga bacteriana.
4.3.1.-Diluciones decimales seriadas.
4.3.2.-Empleo de la escala de MacFarland.
4.3.3.-Otras suspensiones de muestra y colonias bacterianas
5. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES MICROBIOLOGICOS.
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1. INTRODUCCIN.
En esta unidad de trabajo nos ocuparemos de un conjunto de aspectos previos al anlisis
microbiolgico en s. Nos referimos a las tcnicas de seleccin, toma y preparacin de muestras, as
como a su transporte y conservacin. La importancia de estas tcnicas no debe ser subestimada,
pues un defecto en cualquiera de ellas puede invalidar los resultados del anlisis microbiolgico.
Podemos citar algunos ejemplos de esto. Para realizar un recuento de bacterias en el agua
corriente hay que dejar el grifo abierto durante un tiempo largo antes de tomar la muestra. Si se
toma la muestra nada ms abrir el grifo y este lleva varios das sin abrirse, el agua del ltimo tramo
de caera llevar estancada all el tiempo suficiente para que pueda haber habido crecimiento
bacteriano. Por lo tanto, la muestra contendr muchas ms bacterias que el agua corriente de la red
general y los resultados del anlisis no sern ciertos para el agua corriente.
Otro ejemplo: los gonococos (Neisseiria gonorrhoeae) mueren rpidamente a la temperatura
de un frigorfico. Si una muestra de exudado uretral de un paciente con gonorrea se refrigera para
intentar conservarla durante su traslado al laboratorio, los gonococos morirn y el anlisis dar un
resultado negativo a pesar de que el paciente s sufre una infeccin por esta bacteria.
El problema de la contaminacin de los alimentos por los microorganismos es algo conocido
de antiguo. Dicha contaminacin implica en muchos casos un peligro sanitario y/o una prdida del
valor comercial del producto. Por estos motivos el problema ha sido frecuentemente considerado en
la legislacin, con el fin de establecer una serie de normas que controlen la calidad microbiolgica
de los alimentos y permitan disminuir al mximo los riesgos, sanitarios y comerciales, que la
presencia de microorganismos puede implicar.
Como consecuencia de todo esto, los anlisis microbiolgicos de los alientos se realizan de
forma frecuente y rutinaria. Sin embargo muchas veces se olvida un factor importante a tener en
cuenta en dichos anlisis, y es que si la muestra del alimento que se analiza no es una muestra
representativa de la partida completa que se pretende valorar, el resultado puede no tener
significacin real. Esto incluye, tanto el nmero y la distribucin de las unidades de muestra
tomadas, como la forma en la que se toman y manejan esas unidades de muestra.
Por muestreo de alimentos, ya sea destinado a su anlisis microbiolgico o al de otras
caractersticas, se entiende la operacin que consiste en separar un cierto nmero de unidades de
muestra de un lote, remesa, partida, etc., con el fin de obtener unos resultados analticos fiables y
representativos. Es necesario realizar un muestreo ya que, obviamente, no es posible someter un
lote completo a dichos anlisis, ya que sera demasiado destructivo y costoso. Por esto mismo, al
igual que prcticamente todos los estudios que realiza el hombre, lo que se hace es extrapolar los
resultados obtenidos a partir de la fraccin del lote analizada en la muestra al lote completo.
Desde un punto de vista ideal, un lote es una cantidad de alimento producida y manipulada
bajo condiciones uniformes. En la realidad slo se puede aplicar este concepto a la cantidad de
alimento producido en un periodo de tiempo limitado, de tal forma que en funcin de la
uniformidad de las condiciones de produccin, el periodo de tiempo ser mayor o menor. Cuanto
ms uniforme, el lote incluir una cantidad de alimento elaborada en un mayor intervalo de tiempo.
Una partida puede contener cierto nmero de lotes, siendo conveniente, si es posible, la toma de
muestras de cada lote y su anlisis independiente de los otros. De esta forma se garantiza la
seguridad y se minimiza la magnitud de cualquier rechazo si el anlisis indica que el lote no es
aceptable. Si se trata de una partida grande no separable en lotes se debe establecer el nmero de
unidades de muestra de la misma, que habra que analizar considerndola como un lote. Si son
partidas pequeas, no identificables por nmero de lote alguno, pueden tratarse como lotes
individuales.
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representa al paciente o al material analizado. Las muestras nicas en muchos casos son
irreemplazables y entonces hay que tratarlas con un cuidado especial porque su prdida o deterioro
puede suponer un problema serio.
Las muestras nicas en microbiologa de alimentos normalmente son de lquidos a granel
bien mezclados, aunque hay situaciones menos frecuentes como un bote de conservas a medio
consumir por una persona que ha tenido que ser hospitalizada poco despus. Esta muestra es
irreemplazable (no se puede sustituir por otra).
Las muestras nicas son muy frecuentes en usos clnicos: a un paciente se le toma
normalmente una sola muestra de sangre, orina, etc., para cada tipo de anlisis. Si la muestra se
pierde o se estropea (tubo roto, etc.) a veces podra tomarse otras muestra, pero estas muestras
deben tratarse como si fuesen irreemplazables por las molestias que supone para el paciente
(desplazamientos, un nuevo pinchazo a un beb para extraerle sangre, etc.).
2.3 Sistema de eleccin de las unidades de muestra
La eleccin de las muestras se realiza siguiendo el mtodo del muestreo aleatorio, ya
que elimina las posibles subjetividades que pueden surgir en la eleccin de las mismas. Segn este
mtodo, las unidades de la muestra poblacional, ya sean cajas, contenedores, masas de slidos o
volmenes lquidos, se obtienen mediante el uso de los nmeros aleatorios de muestreo. Este
mtodo no garantiza que la muestra elegida tenga idnticas caractersticas a las del lote, pero s
asegura que la muestra haya sido elegida de una forma objetiva.
Consiste en separar del lote un nmero de muestras calculado previamente, utilizando una
tabla de nmeros generados al azar: Una vez establecido el nmero de muestras que se deben tomar
del lote, se numeran ordenadamente cada uno de los paquetes, contenedores o unidades del
producto por muestrear, se elige un nmero de la tabla al azar y a partir del mismo se toman las
unidades de muestras numeradas con los mismos nmeros que aparecen a continuacin del primero
elegido.
En ocasiones, no slo se puede sino que adems se debe utilizar un proceso de
estratificacin del muestreo aleatorio: el lote puede venir almacenado en diferentes cajas,
o vagones, o bodegas de un barco, donde posiblemente han estado sometidos a diferentes
condiciones ambientales, o se puede saber que la partida que se analiza est compuesta por varios
lotes que representan, por ejemplo, diferentes das de produccin de la misma planta o de diferentes
plantas de la compaa. El objetivo de la estratificacin es dar a cada pequea parte del material de
cada estrato, la misma oportunidad de estar en la muestra total, el obtener muestras al azar de un
nmero dada de alcuotas a partir de cada estrato (cajas, vagones, bodegas, etc.) o de un nmero
elegido de tales sublotes o cajas. Al final, los resultados de los distintos estratos se valoran
separadamente y despus se juntan si resultan homogneos.
Un factor anlogo a la estratificacin dentro de una partida o lote es la heterogeneidad
dentro de las unidades de muestra. Con este concepto se pretende considerar el hecho de que en
algunos productos alimenticios existen zonas con distinta calidad dentro de las unidades de muestra.
El nmero de unidades de muestra que se van a analizar, el mtodo exacto por el cual se
debe de obtener la muestra y el sistema de muestreo, se determinar segn diferentes factores como
son:
Peligrosidad: referida a la posibilidad de que ese alimento transmita microorganismos
patgenos y gravedad clnica y epidemiolgica de esos patgenos.
Uniformidad: esta caracterstica, que indica que todo el alimento es homogneo
existiendo una mezcla perfecta del mismo, permite disminuir el nmero de unidades de muestra a
analizar. La ausencia de esa uniformidad requiere un mayor nmero de unidades de muestra.
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1. TOMA DE MUESTRA
El objetivo del muestreo es obtener una muestra representativa del alimento de tal forma que
al analizarla ofrezca resultados fiables sobre su estado higinico-sanitario. Es evidente, por tanto,
que el producto debe reunir, en el momento de su anlisis, las mismas caractersticas
microbiolgicas que tena al ser tomada la muestra. Es por ello necesario seguir una serie de pautas
con objeto de conseguir la muestra idnea.
3.1 Condiciones que debe cumplir el operador para realizar una toma de
muestras adecuada son:
1. Poseer unos conocimientos microbiolgicos generales y usar estos conocimientos aplicando
el sentido comn, y
2. Conocer las caractersticas fsico-qumicas y microbiolgicas del material que se va a
analizar.
3.2 Precauciones que deben tenerse en cuenta al realizar la toma
de muestra se resumen en:
La muestra debe ser representativa del alimento que se analiza o, en muestras clnicas,
de la enfermedad estudiada. Veamos un ejemplo: si un paciente presenta lesiones en la piel
que indican que probablemente sufra un infeccin por hongos dermatofitos, una toma de
muestra adecuada consiste en realizar un raspado para obtener escamas de la piel lesionada
donde puede haber micelio y esporas del hongo que pueden ser cultivadas para identificarlo.
Es absurdo en este caso hacer una extraccin de sangre porque esta muestra no es
representativa de una micosis cutnea.
La cantidad de muestra tomada debe ser suficiente para realizar todo el proceso
analtico. Para alimentos generalmente se toman unos 100 gramos, aunque las muestras
clnicas son mucho menores. Adems, es conveniente tomar al menos el doble de la cantidad
mnima para tener una reserva de muestra en previsin de algn error que pueda obligar a
repetir el anlisis. Por consiguiente, habra que tomar unos 200g de muestra de un alimento.
Las operaciones de toma de muestra deben preservar la identidad de la misma. Esto
significa que deben evitarse contaminaciones de la muestra, lo que obliga a trabajar con
instrumentos y recipientes estriles.
Esto tambin obliga a tomar precauciones especiales cuando se investigan microorganismos
anaerobios muy sensibles al oxgeno del aire.
3.3 Material utilizado en la toma de muestras
Se incluyen los envases para la toma de muestra los cualesdebern:
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Estos datos se anotarn en etiquetas adhesivas que no puedan despegarse o rotuladas sobre el
envase de modo que no pueda borrarse accidentalmente. Adems, las anotaciones deben ser
perfectamente legibles sin que haya posibilidad de confusin. Cualquier muestra inadecuadamente
identificada debe ser devuelta a su lugar de procedencia con la anotacin ilegible o
identificacin inadecuada.
Cuando las muestras sean restos de alimentos sospechosos de una toxiinfeccin
alimentaria, es imprescindible remitir, junto a ellas, un informe donde se incluyan los
datos referentes a la sintomatologa de la enfermedad, epidemiologa del caso, etc.
Nunca se insistir lo bastante en la importancia de una adecuada identificacin de las muestras. Los
errores en la identificacin de las muestras son una de las principales causas de resultados errneos
en el laboratorio de microbiologa. La identificacin de las muestras debe considerarse
responsabilidad del laboratorio.
5. PREPARACIN DE
LABORATORIO
LA
MUESTRA
PARA
SU
ENVO
AL
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MATERIALES
Todos los materiales utilizados para la toma de muestras debern ser estriles, estar secos y
limpios y reunir las caractersticas establecidas para cada tipo de producto.
RECIPIENTES
Para las muestras de productos lquidos, debern ser de material apropiado, impermeable al
agua y a las grasas (vidrio, acero inoxidable, plstico especialmente acondicionado), estril o que
permita su esterilizacin, y de forma y capacidad adecuadas. Tales recipientes debern estar secos y
limpios y se podrn cerrar hermticamente. Podrn utilizarse tambin bolsas de plstico adecuadas.
Los recipientes para las muestras de productos slidos o semislidos sern cilndricos, de
boca ancha y debern reunir todas las condiciones anteriores. Tambin se podrn utilizar bolsas de
plstico adecuadas. En el caso de pequeos envases para la venta al pblico, servir como muestra
el contenido de dichos recipientes intactos y cerrados (se consideran envases pequeos aquellos
cuya capacidad sea inferior a 2 litros).
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Tales instrumentos debern tener una superficie suficiente para provocar una buena
agitacin del producto y ser lo bastante ligeros en peso para que el operador pueda
moverlos rpidamente en el lquido. Generalmente lo ms apropiado es un agitador
metlico de paletas anchas, provisto en su base de un gran disco perforado, y de
suficiente longitud para llegar al fondo del recipiente (Figura siguiente).
Para el mezclar el contenido de recipientes de gran, tamao se aconseja la agitacin
por medios mecnicos.
b) Tcnica:
- Mezclar perfectamente el lquido.
- Tomar la muestra con el cacillo. El volumen mnimo ser de 250 ml.
Leches concentrada, evaporada y condensada (estado semislido)
a) Materiales:
Agitador para el caso de recipientes (cntaras, bidones...)
que contengan el producto a granel. Generalmente lo mas apropiado
es un agitador metlico de paletas anchas (Fig 3).
Los recipientes para la muestras debern ser de boca ancha y
sus tapas cerrar hermticamente.
En el caso de tratarse de pequeos envases para la venta al
pblico, la muestra consistir en uno de tales envases, intacto sin
abrir, y si es posible con la identificacin del fabricante.
b) Tcnica:
El agitador se utilizar para desprender el producto que se ha a adherido a las paredes y al
fondo del recipiente (figura 3) y para mezclar cuidadosamente el contenido de este ltimo. Se
pasarn de dos a tres litros del producto bien mezclado a un recipiente ms pequeo. En ste se
repetir la operacin de agitacin y se tomar una muestra de 200 g por lo menos. En el caso de
pequeos envases para la venta al pblico, el que sirva de muestra no deber abrirse hasta
inmediatamente antes de proceder al anlisis.
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b) Recipientes:
Las muestras se trasvasarn a recipientes limpios y secos, provistos de cierre hermtico, que
sern opacos cuando el tipo de anlisis as lo exija. Las dimensiones del recipiente sern lo
suficientemente amplias para permitir la mezcla del contenido por medio de sacudidas.
c) Tcnica:
La sonda se introducir en el polvo a una velocidad constante de penetracin.
Cuando el tubo de la sonda llegue al fondo del envase se retirar y su contenido se vaciar
inmediatamente en el recipiente destinado a la muestra.
No deber tocarse el polvo con los dedos.
Se realizar uno o varios sondeos para obtener un peso de muestra total de 300 a 500g.
Toma de muestras de queso (slidos)
Dependiendo del peso, forma y tipo de queso:
a) Toma de muestras mediante el corte de un sector.
b) Toma de muestras con un sacabocados o sonda adecuada.
c) La muestra la constituye un queso entero o una parte sustancial del mismo.
Inmediatamente despus del muestreo, las muestras han de colocarse en un recipiente estril
de tamao y forma adecuadas, y ste se sella y se etiqueta adecuadamente de forma que se eviten
confusiones, prdidas etc. Especialmente importante es este punto cuando se trata de inspeccin
sanitaria de productos o lugares de trabajo o muestras nicas.
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correspondiente, excepto cuando se trate de leches en polvo, que podrn conservarse a temperatura
ambiente.
Aunque la conservacin en fro suele ser lo habitual para la mayora de muestras, hay casos
particulares en que esto no es recomendable, ya que determinada carga bacteriana puede no soportar
esta temperatura, y falsear los resultados ofreciendo datos menores a los reales. Igualmente para
muestras con carga psicrfila especfica, puede interesar conservacin a temperaturas mayores o
menores.
TRANSPORTE
Una vez tomadas, las muestras se llevarn al laboratorio lo antes posible para su anlisis
inmediato.
Durante el transporte se adoptarn las debidas precauciones para evitar que estn expuestas
directamente al sol y, en el caso de productos perecederos, para no ser sometidos a temperaturas
inferiores a 0C ni superiores a 10C.
MUESTREO Y ESTADSTICA
DEFINICIONES DE LOS PRINCIPALES CONCEPTOS DE UN PROCESO
DE MUESTREO
Lote: Es un conjunto de unidades de producto del que se extrae una muestra para
realizar una inspeccin. Tambin se llama poblacin.
Tamao del lote (N): nmero de unidades de producto de que consta el lote.
Muestra: Conjunto de una o varias unidades de producto (n) extrada al azar de un
lote, o parte de ste.
Muestreo: Accin que consiste en tomar una muestra de un lote.
Niveles de inspeccin: determinan la relacin que guardan el tamao del lote y el
tamao de la muestra. Existen normalmente tres niveles de inspeccin, y a mayor nivel,
ms grande es la muestra en relacin al lote. Se considera el nivel II el normal y el I de
confianza.
Planes de muestreo: conjunto de normas dnde se indica el nmero de unidades
de producto de cada lote que debern ser inspeccionadas, as como el criterio para
aceptar o rechazar el lote en base a la informacin derivada de la inspeccin de las
unidades muestreadas.
Estadstica: es la ciencia que estudia los fenmenos aleatorios. Proporciona
herramientas muy potentes para analizar conjuntos de datos y la relacin existente entre
ellos. Trata de sacar conclusiones de una poblacin a partir de muestras tomadas en la
misma.
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de la misma.
El muestreo es ms econmico y rpido para lotes de gran tamao y
es imprescindible en el caso de que el anlisis que se realice al producto sea destructivo.
La inspeccin total sera el examen de todos los individuos de una poblacin y slo se
realiza para casos en que el anlisis no sea destructivo, el lote sea muy pequeo y/o no
se tolere ningn defecto.
Inconvenientes:
-
Hay riesgos que hay que manejar (dar como buenos lotes que tienen mala calidad
y al contrario) y evaluar estadsticamente.
El proceso conlleva mayor cantidad de documentacin y mayor planificacin.
Da menos informacin el examen de una muestra que el de toda la poblacin.
TIPOS DE MUESTREO
Para conocer el valor medio de una caracterstica de la poblacin existen
bsicamente dos modelos:
Muestreos probabilsticos
Se pretende obtener una muestra representativa de la poblacin aplicando un
sistema de seleccin aleatoria de la muestra y mtodos estadsticos y probabilsticos. "Al
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aceptable
Entre m y M:
marginalmente aceptable
Mayor que M:
defectuosa
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Ejemplos:
La normativa espaola establece lmites microbiolgicos para los distintos
productos alimenticios. Por ejemplo, en el caso de la leche en polvo se establecen, entre
otros, los siguientes lmites (recogidos en el RD 1649/94 y en el RD 402/96):
- Coliformes: (Ej de 3 atributos)
n (nmero de muestras a analizar) = 5
c=2
M = 10 UFC/g
m = 0 UFC/g
Lo que quiere decir que:
- Si el recuento de una muestra supera el valor 10 UFC/g, el lote al que
representa se declara inaceptable, desde el punto de vista de la higiene
alimentaria.
- El nmero de muestras que presenten un recuento entre 0 UFC/g y 10
UFC/g no puede ser superior a 2, de lo contrario el lote se declara
inaceptable.
- Si hubiera 2 o menos muestras con carga entre 0 y 10 UFC/g, estas
muestras seran marginalmente aceptables, luego el lote se acepta
(aceptable).
- Sin para n=5 todas muestran ausencia de crecimiento de coliformes
(m=0 UFC/g) el lote se declarara SATISFACTORIO.
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- Salmonella
n=10
c=0
Ausencia en 25 g
Lo que quiere decir que tras el anlisis de 10 muestras de 25 g cada una, no debe
encontrarse presencia de Salmonella en ninguna. Si se encontrase una muestra con
presencia de esta bacteria, es INACEPTABLE, se considera contaminado todo el lote y
debe rechazarse.
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A continuacin estudiaremos las tcnicas utilizadas en cada una de estas situaciones, pero
antes tenemos que advertir que en las operaciones de preparacin de muestras hay que
guardar todas las reglas de asepsia que permitan evitar la contaminacin de la muestra.
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medido de diluyente.
b) Cuando resulta difcil pesar una cantidad exacta de muestra, se pesa una cantidad
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Homogenizadores de jarra: consisten en un vaso de vidrio o acero con una hlice en su base
que funciona cuando se acopla a un motor.
Homogeneizadores de vstago con hlice: el vstago se introduce en un vaso con la mezcla
que se va a homogeneizar. Funciona como una batidora clsica de cocina.
Estos dos tipos de homogenizadores tienen el inconveniente de que necesitan una limpieza
exhaustiva y una esterilizacin antes de cada homogeneizacin. Esto supone un engorro. Otro
inconveniente es que producen aerosoles que pueden contener microorganismos patgenos. Los
inconvenientes de estos homogenizadores no estn presentes en los:
Homogeneizadores de paletas: la mezcla de muestra y diluyente se introduce en una bolsa de
plstico estril. Esta bolsa se sita en el homogeneizador, que est provisto de paletas que
golpean rtmicamente la bolsa. Esto dislacera el alimento y pone los grmenes en
suspensin. Para homogeneizar una nueva muestra no hay que limpiar nada: se utiliza una
nueva bolsa. Modelos comerciales conocidos son: Stomacher y Masticator.
En la homogeneizacin de alimentos slidos es frecuente que la suspensin se prepare al 10%
peso/volumen. De este modo, la cantidad de alimento pesada expresada en gramos se multiplica por
9 y el nmero obtenido es el volumen en centmetros cbicos de diluyente a agregar. A la
suspensin obtenida se le llama suspensin madre, dilucin 1/10 o dilucin -1, porque:1/10=10-1
Las muestras de alimentos lquidos no es necesario licuarlas, pero puede ser necesario
homogeneizarlas. Esto puede conseguirse simplemente agitando bien el envase antes de abrirlo.
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Para realizar una resiembra puede prepararse una suspensin de bacterias o levaduras tomando
una porcin de colonia con un asa y suspendindola en un pequeo volumen de diluyente estril en
un tubo de ensayo tambin estril. Con la misma asa puede tomarse un muy pequeo volumen de
suspensin para inocular la placa.
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DE
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