INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

METODOS DE ANALISIS
DETERMINACIN DE PROTNAS POR EL MTODO DE BRADFORD
4IV1 SECCION 1
JOAQUN ROBLERO MNDEZ

Objetivo.

Realizar una curva de calibracin para as poder saber la cantidad de

protena que contiene cada uno de los tubos en el anlisis estadstico y
en el anlisis de interferencias.
Realizar las pruebas t de student y F de Fisher para as saber si existen
diferencias significativas entre el mtodo de Lowry y el mtodo de
Bradford.
Saber que sustancias interfieren con el mtodo de Bradford y determinas
si sobreestiman o subestiman la cantidad de color en nuestra muestra.

Introduccin.
El mtodo de Bradford es una tcnica colorimtrica utilizada para medir la
cantidad de protena contenida en una muestra por medio de su absorbancia
midindola con espectrofotmetro. Con ayuda de una curva de calibracin
sabremos la cantidad de protena que tiene cada uno de los tubos que
preparemos, con lo cual podemos comparar las absorbancias obtenidas en la
curva de calibracin con las absorbancias obtenidas en los tubos problema. El
mtodo de Bradford utiliza el azul brillante de comassie G-250, este colorante
forma un complejo con protenas que contengan aminocidos aromticos y
bsicos tal es el caso de la arginina, histidina y lisina, por lo tanto podemos
decir que es selectiva y puede ser ms funcional para las protenas que tengan
mayoritariamente estos aminocidos. Esta unin del colorante con las
protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde
470 a 595 [nm]. Ya que el colorante azul brillante de comassie G- 250 depende
de la carga que tenga en ese momento, ya que si se encuentra en forma
catinica el color se tornara de una tonalidad caf rojizo que es posible
medirse a una longitud de onda de 470 [nm], si se encuentra en forma neutra
el colorante tornara a una tonalidad verde la cual es posible medirse a una
longitud de onda de 650 [nm], en cambio cuando se encuentra en forma
anionica se puede observar que el colorante torna a una tonalidad de azul la
cual es posible medir a 595 [nm], en el mtodo de Bradford el colorante al
ponerlo en contacto con los tubos de protena se torna azul, esto sucede por
las energas de enlace implicados. Mientras que los grupos sulfnicos ionizados
pueden experimentar interacciones electrostticas con la protena existe la
posibilidad de que se encuentre cargada grupos funcionales de la protena 1

Imagen 1. Azul brillante de Comassie G-250

Resultados

1) Curva de calibracin

1.1a partir de los mL de la disolucin estndar de protena adicionados, se

calcul la cantidad de protena en microgramos.
Tubo
1
2
3
4
5

Cantidad de
protena [g]
25
50
75
100
125

Promedio A

595[nm]

595[nm]

0.094
0.209
0.355
0.415
0.553

0.100
0.232
0.296
0.382
0.531

0.097
0.2205
0.3255
0.3985
0.542

Tabla 1. Obtencin de la cantidad de protena para la obtencin de la curva de calibracin.

1.2 construccin de la grfica de la curva de calibracin

Curva de calibracin de albumina

0.6
0.5
0.4

Absorbancia a 5905[nm] 0.3

0.2
0.1
0
20

40

60

80

100

120

140

Cantidad de proteina [g]

Grfica 1. Curva de calibracin obtenida a partir de la tabla 1.

De la grfica se observa que la curva de calibracin de albumina cumple la ley

de Bouger Beer en un rango de 25-75 g ya que cumple con una tendencia
lineal positiva que cuando se aumenta la concentracin aumenta la
absorbancia.

1.3Tratamiento de la curva de calibracin con regresin lineal

Curva de calibracin de la albumina

0.6
0.5
0.4

f(x) = 0x - 0
R = 0.99

Absorbancia a 595 [nm] 0.3

0.2
0.1
0
20

40

60

80

100

120

140

Cantidad de proteina [g]

Grfica 2. Tratamiento de la curva de calibracin para obtener la ecuacin de la recta y el coeficiente de
correlacin.

1.4
Pendiente: nos indica la sensibilidad que tiene el mtodo de Bradford.
Ordenada al origen: nos indica la absorbancia mnima que puede llegar a
detectar el mtodo de Bradford.
Coeficiente de correlacin: Es la precisin que existe entre los valores de
absorbancia dependientes de la cantidad de protena, en cuanto el valor se
encuentre ms cercano a la unidad es porque existe una mayor precisin en
nuestro mtodo.

1.5Obteniendo la ecuacin de la recta podemos conocer x; X=cantidad de

protena. Por medio de:

X=

y (0.0037) [ ]
[ g]
0.0043

2) Anlisis estadstico.
2.1 Con la ecuacin para conocer x se calcul la cantidad de protena para
cada uno de los tubos del anlisis estadstico.
Tubo

A595[nm]

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0.22
0.281
0.196
0.24
0.255
0.256
0.299
0.26
0.235

0.26

Cantidad de protena
[g]
61.3255814
52.0232558
66.2093023
46.4418605
56.6744186
60.1627907
60.3953488
70.3953488
61.3255814
55.5116279

Tabla 2. Obtencin de la cantidad de protena en cada uno de los tubos en el anlisis estadstico.

2.2 Clculo de parmetros estadsticos

Media= 53.4953488
Para el clculo de desviacin estndar:
(Xi-Media)2
61.3125419
2.16705787
161.644613
49.7516982
10.1064846
44.454781
47.61
285.61
61.3125419
4.06538129

Xi-Media
7.83023256
-1.472093
12.7139535
-7.0534884
3.17906977
6.66744186
6.9
16.9
7.83023256
2.01627907

Tabla 3. Datos para la obtencin de la desviacin estndar.

(Xi-Media)2=728.0351, de esta forma podemos obtener la desviacin estndar

con:

S=

728.0351
=8.99404186
101

Con la desviacin estndar se puede obtener la varianza, de modo que:

Varianza S2=80.892788889
Coeficiente de variacin= %CV

S
8.9940
(100 )=
( 100 )=16.812676
Media
53.4953488

Lmites de confianza para la media poblacional:

=(MEDIA)

Tv , NCS
n

Donde Tv,NC = valor t de student critica o de tablas, Tv,NC para n=10 y n-1= 9 con
un 95% de confiabilidad es de 2.262, entonces para calcular los lmites de
confianza tenemos que

=53.4953488

2.262 ( 8.994044186 )
=53.4953488 6.433502
10

Entonces por lo tanto nuestros lmites de confiabilidad van de [47.0618

59.9288]
2.3 Diferencias de exactitud entre el mtodo de lowry y el mtodo de
Bradford. Prueba T
Para prueba T

T ==

Di
n

X prueba (Bradford)
61.3255814
52.0232558
66.2093023
46.4418605
56.6744186
60.1627907
60.3953488
70.3953488
61.3255814
55.5116279

Donde Di= X prueba X referencia

X referencia (Lowry)
73.6842
87.3684
65.7894
70.5263
70.5263
51.0526
51.0526
65.7894
56.8421
64.2105
( X prueba X
referencia)

X prueba X referencia
-12.358619
-35.345144
0.4199023
-24.08444
-13.851881
9.1101907
9.3427488
4.6059488
4.4834814
-8.6988721
-75.075556

Tabla 4. Datos para la obtencin del promedio de la diferencia de los datos de Lowry y Bradforf.

Di 75.075556
=
= -7.5075556
n
10

Con este dato podemos realizar la sumatoria de las diferencias al cuadrado.

Di-D
-4.851063

(Di-D)2
23.5328123

-27.837589
7.92745789
-16.576884
-6.3443258
16.6177463
16.8503044
12.1135044
11.991037
-1.1913165
(Di-D)2

774.93134
62.8445886
274.79308
40.25047
276.149492
283.932758
146.736989
143.784968
1.41923503
2028.37573
Tabla 5. Datos para la obtencin de T calculada.

Con estos datos podemos calcular SD entonces SD=

2028.77573
=
101

15.0124975
Ahora se calcula el valor de T

10

Tcalculada= 7.5075556 ( 15.0124975 ) =-1.581414

Ya que T de tablas es igual a 2.262 y T calculada es menor a la de tablas,
entonces no existe diferencia significativa en cuanto a exactidud, entre los dos
mtodos utilizados.

2.4 Diferencias en precisin entre el mtodo de lowry y el mtodo de

Bradford con base a la prueba F de Fisher
Para la prueba de Fisher necesitamos conocer las varianzas de cada uno de los
mtodos entonces de la prctica de Lowry obtenemos que S 2=121.0711;
S2BRADFORD=80.892788889 entonces:

F=

varianza de b
121.0711
=
varianza de a 80.89278888 =1.49668

Consultando las F de tablas se encontr que para 9 grados de libertad el valor

ser de 4.03 y como nuestro valor de F, F calculado es de 1.49668 entonces no
existe diferencia estadstica significativa, en cuanto a la precisin de ambos
mtodos utilizados ya que F calculada es menor a F de tablas.

3) Interferencias
3.1 y 3.2
Tubo

Sustancia

A595[nm]

Cantidad de
protena

Interferenci
a

Tris pH=7

Glicerol 1%

0.425

Detergente
1%
Dodecil
sulfato de
sodio 1%
cido tricoloro
actico 5%
Fenol 1%
Mercaptoetan
ol 0.1%
Tris pH= 10

0.059

Urea 5%
Sulfato de
amonio

0.384
0.334

5
6
7
8
9
10

0.46

0.01

[g]
107.837209
3
99.6976744
2
14.5813953
5
3.18604651
2

Positivo
Positivo
Negativo
Negativo

0.412

96.6744186

Positivo

0.451
0.461

105.744186
108.069767
4
95.0465116
3
90.1627907
78.5348837
2

Positivo
Positivo

0.405

Positivo
Positivo
Positivo

Tabla 6. Obtencin de la cantidad de protena en cada tubo con posibles interferencias.

Comparacin.
Nos damos cuenta que el mtodo de Bradford es ms rpido, tiene
demasiadas interferencias que pueden afectar en nuestro anlisis como los
compuestos con cationes, detergentes o los compuestos con un pH alcalino,
en el mtodo de lowry es un mtodo lento en el que se pueden tener como
interferencias los detergentes o sustancias reductoras.

Discusiones.
a) El mtodo de Bradford puede debe de utilizarse preferentemente en
protenas que tengan un alto contenido de aminocidos como arginina,
lisina o histidina para que as se forme la carga necesaria para que
podamos ver la coloracin azul y podamos medir la absorbancia a una
longitud de onda de 595[nm].
b) En nuestro caso se perdi la linealidad en el penltimo punto
correspondiente a la cantidad de protena de 100 g esto se puede
deber a un descuido o falta de precisin por parte de los analistas, ya
que hubo la posibilidad de que no se adicionara la cantidad correcta en
ese tubo.
c) Se encontr que existe una desviacin estndar mayor en el mtodo de
Lowry, esto puede deberse a que en este mtodo se utilizan 3 reactivos
ms la protena, generando as ms posibilidades de error por la

exactitud con la que se adicionaban dichos reactivos, en cuanto a

precisin y exactitud en ambos mtodos no se not una diferencia
significativa.
d) Las sustancias que debieron de interferir con nuestro mtodo son los
detergentes, sustancias de un pH muy alcalino como el de 10, aquellos
compuestos que contengan algn catin que pudiera regresarnos a esa
tonalidad caf que tena desde un principio nuestro colorante.
Conclucin.
Se debe de escoger el mtodo que se crea ms conveniente dependiendo de la
protena con la que se est trabajando, as mismo se debe de tener el cuidado
de realizar la curva de calibracin con exactitud ya que esta puede influir
mucho en el mtodo que se est realizando

Bibliografa.
1

Steve J. Compton, Mechanism of dye response and interference in Bradfor

protein Assay, Analytical Biochesmistry 1985.

Amando Garrido Pertierra, Fundamentos de bioqumica estructural,

segunda edicin editorial Tbar, 2006 pg. 165-166