CFGS LABORATORIO DE DIAGNSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO.

TEMA 10. BIOLOGA MOLECULAR.

TEMA 10. BIOLOGA MOLECULAR. TECNOLOGA DEL ADN

1.

INTRODUCCIN

La Biologa molecular aparece desde el descubrimiento de la doble hlice de ADN de

Watson y Crick en 1954. Luego Francis Crick contina con el descubrimiento del
cdigo gentico en los 60. Es decir se descubri que las bases del ADN se leen de 3 en
3, y tres combinaciones de letras significan un aminocido que formar parte de una
protena. All comienza a comprenderse como es la molcula de ADN y como lleva la
informacin que contiene a la clula que la contiene. A esto se lo denomin Dogma
central de la biologa molecular.
Luego aparece el descubrimiento de las enzimas de restriccin que permiten cortar
el ADN y as analizarlo. Nace all la ingeniera gentica. Eso permiti cortar y pegar
a la molcula de ADN para estudiarla, analizar patologas en ciertos genes, etc. Hasta
que, hacia fines de los 80, Karl Mullis descubre la tcnica de PCR que revolucion a la
gentica, consistente en amplificar una regin de ADN en cantidad suficiente para
luego hacer todo tipo de anlisis.

2.

CIDOS NUCLEICOS

Todos los organismos poseen unas molculas que dirigen y controlan la sntesis de sus
protenas, proporcionando la informacin que determina su especificidad y
caractersticas biolgicas. Estas molculas que reciben el nombre de cidos nucleicos,
contienen las instrucciones necesarias para realizar los procesos vitales y son las
responsables de todas las funciones bsicas de los seres vivos.
(La relevancia de los cidos nucleicos en la sntesis de las protenas especficas de un
organismo, se pone de manifiesto cuando al introducir en una clula, una molcula de
un cido nucleico de otro individuo, se sintetizan protenas de este, diferentes a las
propias. Muchas de las tcnicas de manipulacin gentica se basan en este hecho.)
Los cidos nucleicos (ADN y ARN) son macromolculas formadas por la unin de
muchos monmeros denominados nucletidos.
2.1.

Nucletidos

Son las unidades que forman los cidos nucleicos (equivalen a los monmeros
que constituyen las otras molculas biolgicas).
Cada nucletido est compuesto por la unin de tres unidades:
Monosacrido: una pentosa
Base nitrogenada.
Uno o varios grupos fosfatos.
Tanto la base nitrogenada como los grupos fosfato se encuentran unidos a la
pentosa.

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2.1.1. La pentosa es:

una -D-ribofuranosa (ribosa pero en la forma de anillo pentagonal), en

cuyo caso el nucletido se denomina ribonucletido.

una -D-2 desoxirribofuranosa (la pentosa carece de un tomo de

oxgeno en el hidroxilo del C2) en cuyo caso el nucletido es un
desoxirribonucletido.

C5 H10 O5

C5 H10 O4

2.1.2. La base nitrogenada puede ser de dos tipos:

Prica, derivada de la purina: adenina (A) y guanina (G)

Pirimidnica, derivada de la pirimidina: citosina (C), timina (T) y Uracilo
(U)

La porcin constituida por la pentosa y la base nitrogenada, se denomina nuclesido.

2.1.3. Grupos fosfato: La unin de uno o varios, al C 3 o 5 de la pentosa da
lugar al nucletido completo.

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2.2.

cido desoxirribonucleico (ADN)

Esta formado por la unin de desoxirribonucletidos (sus nucletidos contienen

desoxirribosa). En cuanto a las bases nitrogenadas pueden ser: A, G, C, T, pero nunca
Uracilo. Esta constituido por dos cadenas de polinucletidos (una 5-3y la otra 35) unidas entre s en toda su longitud mediante las bases nitrogenadas, por medio de
puentes de hidrgeno. La adenina enlaza con la timina, mediante dos puentes de
hidrgeno, mientras que la citosina enlaza con la guanina, mediante tres puentes de
hidrgeno. En las clulas eucariotas, el ADN se encuentra en el ncleo celular
formando los cromosomas.

Esta molcula aporta la informacin necesaria para el desarrollo de las caractersticas

biolgicas de un individuo y contiene los mensajes e instrucciones para que las clulas
realicen sus funciones. Es decir lleva codificada la informacin a partir de la cual se
forma un organismo vivo, por lo que constituye el material gentico.
2.2.1. Estructura del ADN
De manera semejante a las protenas se distinguen varios niveles de complejidad.

Estructura primaria: Se trata de la secuencia de desoxirribonucletidos de una de

las cadenas. Como todos los nucletidos contienen desoxirribosa, la diferencia
entre las molculas de ADN de los distintos organismos, radica nicamente en el
orden de las bases nitrogenadas.

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Estructura secundaria: La secuencia de nucletidos se dispone en el espacio en

forma de una doble hlice, segn la estructura propuesta por Watson y Crick en
1953.
En 1950 Chargaff observ que siempre exista la misma cantidad de bases
nitrogenadas pricas y pirimidnicas y que el nmero de Adeninas siempre es igual
al de Timinas y el de Guaninas al de Citosinas. Esto constituye la ley de
equivalencia de bases de Chargaff. Esta molcula posee una estructura helicoidal
con dos periodicidades, una cada 034 nm y otra cada 34 nm.
A partir de estos datos, Watson y Crick elaboraron su modelo de estructura
tridimensional del ADN, que presenta las siguientes caractersticas:
El ADN est constituido por dos cadenas polinucletidas unidas entre si en
toda su longitud.
Las dos cadenas son antiparalelas, lo que significa que el extremo 3 de una
de ellas se enfrenta con el extremo 5 de la otra.
La unin entre las cadenas se realiza por puentes de hidrgeno entre las
bases nitrogenadas de ambas: concretamente, la Adenina forma dos de
estos puentes con la Timina y la Guanina tres con la Citosina. Resulta
evidente que las dos cadenas no son idnticas, sino complementarias, ya
que una de ellas tiene la secuencia de bases complementaria de la otra.
Las dos cadenas estn enrolladas en espiral formando una doble hlice
alrededor de un eje imaginario.
Las bases nitrogenadas quedan en el interior de la doble hlice, mientras
que los esqueletos pentosa-fosfato se sitan en la parte externa.
Los planos de las bases nitrogenadas enfrentadas son paralelos entre si y
perpendiculares al eje de la hlice.
Las cadenas no se pueden separar sin desenrollarlas.

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La doble hlice es dextrgira (en el sentido del enrollamiento), el

enrollamiento gira en el sentido de las agujas del reloj.
La anchura de la hlice es de 2 nm, la longitud de cada vuelta es de 34 nm
y cada 034 nm se encuentra un par de bases complementarias

Estructura terciaria: la estructura en doble hlice sufre nuevos plegamientos

que dan lugar a un tercer nivel estructural, es necesario porque las largas
cadenas de ADN deben acoplarse en el reducido espacio disponible en el
interior celular.
La estructura terciaria es compleja y no se conoce totalmente, aunque se
sabe que hay protenas asociadas al ADN que organizan la estructura
(histonas). Como resultado final, el ADN aparece constituyendo la cromatina
o los cromosomas, (la cromatina es el conjunto de ADN, histonas y protenas
no histnicas que se encuentra en el ncleo de las clulas eucariotas y que
constituye el cromosoma eucaritico).

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2.3.

cido ribonucleico (ARN)

El ARN al igual que el ADN, est compuesto por una serie de nucletidos unidos por
enlaces. Difiere del ADN en que la pentosa de los nucletidos constituyentes es la
Ribosa y que en las cuatro bases nitrogenadas mayoritarias presentes aparece Uracilo
en lugar de Timina (que se empareja con la adenina).
Las cadenas de ARN son ms cortas que las de ADN y pueden aparecer tanto en el
ncleo como en el citoplasma celular.
El ARN siempre es unicatenario excepto en algunos virus. Es la molcula encargada de
sintetizar las protenas especficas de un organismo, realizando el mensaje gentico
codificado por el ADN. As mientras el ADN contiene la informacin, el ARN la utiliza
para que se concrete en las protenas especficas del individuo. Esto requiere la
intervencin de varios tipos de ARN:

ARN mensajero: es el encargado de llevar la informacin (mensaje) del ADN del

ncleo al citoplasma y una vez ledo es degradado, porque si no, la sntesis de
protenas se prolongara indefinidamente
Es una copia de una parte del ADN (la que corresponde a cada gen o grupo de
genes que vaya a expresarse) que es utilizado por los ribosomas como informacin
para poder unir los a.a. en el orden adecuado y constituir una protena concreta.
ARN ribosmico: forma parte de los ribosomas y participa en el proceso de unin
de los a.a. para sintetizar las protenas (no contiene informacin sobre la clase de
protena que se va a sintetizar). Es el ms abundante, corresponde al 80-85% del
ARN celular total.
ARN transferente: se encarga de transportar los a.a. presentes en el citoplasma
hasta los ribosomas, donde se unirn para construir las protenas. Cada molcula
de ARNt transporta un a.a. especfico. Estas diferencias son debidas a una
secuencia de tres bases nitrogenadas denominadas anticodn.
Las molculas de ARNt poseen una estructura secundaria muy caracterstica, en la
que existen tramos de doble cadena por emparejamiento intracatenario. Estos
tramos se llaman brazos y hay cuatro en cada molcula. En los extremos de tres
de los brazos existen zonas sin emparejar que componen los denominados bucles.
El extremo 3 de la cadena tiene siempre la secuencia de bases CCA. A este

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nucletido terminal de adenina se une el a.a. que va a ser transportado. En el

extremo 5 siempre existe un nucletido con guanina.
La estructura extendida del ARNt tiene forma de hoja de trbol (estructura en
boomerang)
(En el ARNt se distinguen tres tramos (brazos). En uno de ellos, aparece una secuencia de tres nucletidos,
denominada anticodon. Esta secuencia es complementaria con una secuencia del ARNm, el codon. En el brazo
opuesto, en el extremo 3' de la cadena, se une un aminocido especfico de la secuencia de anticodn).

3.

LA BASE MOLECULAR DE LA HERENCIA

3.1.

EL ADN (portador de la informacin gentica)

La secuencia de bases nitrogenadas del ADN, constituye la informacin codificada que

las clulas emplean para sintetizar sus protenas.
En Eucariotas el ADN tiene una serie de caractersticas:
slo un 10% de esta molcula se emplea para codificar protenas el resto tiene
funciones poco conocidas.
casi la mitad del ADN es altamente repetitivo y este no lleva informacin para
la sntesis proteica y quiz desempea un papel importante en la estabilidad de
la estructura de los cromosomas.
Las secuencias nucleotdicas que codifican para protenas (exones) no suelen
ser continuas, sino que existen secuencias no codificadoras intercaladas
(intrones).

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3.2.

Replicacin del ADN

El ADN portador de la informacin gentica debe transmitirse fielmente a cada una de

las clulas hijas obtenidas tras la divisin celular. Por tanto antes de producirse esta,
es imprescindible que el ADN pueda formar rplicas exactas de s mismo para
disponer de dos copias iguales, este proceso se llama replicacin o auto duplicacin.
La precisin necesaria en la replicacin del ADN implica un mecanismo complejo para
asegurar la obtencin de copias idnticas.
La replicacin comienza en ciertas zonas del ADN dnde existen determinadas
secuencias de nucletidos. En primer lugar interviene una enzima helicasa que
separa las dos hebras de ADN Al romper los puentes de hidrgeno entre

las bases nitrogenadas complementarias. La separacin y desespiralizacin de las dos

hebras, genera tensiones en ellas, que son eliminadas por la intervencin de otras
enzimas, las topoisomerasas. Una vez separadas las dos hebras se mantienen as
por la accin de las denominadas protenas SSB, (bolitas rojas)
A continuacin comienza la sntesis de las hebras complementarias sobre cada una de
las originales. El proceso se lleva a cabo mediante la enzima ADN polimerasa III
que presenta las siguientes caractersticas:
Necesita una hebra molde de ADN, que recorre en sentido 3 5 y sobre la que
sintetiza la hebra complementaria.
Une nucletidos en sentido 5 3; es decir la nueva hebra formada crece en
este sentido.
No puede empezar la sntesis por s misma, pues slo puede aadir nucletidos
sobre el extremo 3 libre de una cadena previa. Por eso es necesario que exista
una cadena corta de ARN, denominada ARN cebador o primer
El ARN cebador o primer es sintetizado por la enzima primasa
Que utilizando ADN como molde, sintetiza ARN complementario de este.

A medida que la doble hlice del ADN original se va separando (de manera semejante
a una cremallera que se abre), se forma la llamada burbuja de replicacin, donde se
produce la accin de la ADN polimerasa III. Cataliza la sntesis de las nuevas
cadenas aadiendo nucletidos sobre el molde. Esta sntesis se da bidireccionalmente
desde cada origen, con dos horquillas de replicacin que avanzan en sentido opuesto.
Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir,

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cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el
cromosoma ha quedado replicado.
Dado que la ADN polimerasa III recorre el ADN molde en sentido 3 5, la sntesis
de una de las hebras es continua, ya que, a medida que se abre la doble hlice, la
enzima va avanzando y aadiendo nuevos nucletidos a la cadena en formacin,
denominada hebra conductora. Sin embargo como la otra cadena es
complementaria, la ADN polimerasa debera recorrerla en sentido 5 3, aadiendo
nucletidos a la hebra en formacin en sentido 3 5, lo cual no es posible. La
sntesis en este caso, es discontinua y se produce en segmentos separados. Esta
cadena se denomina hebra retardada, pues su sntesis es ms lenta que la de la
hebra conductora. Los fragmentos de ADN sintetizados de este modo se conocen
como fragmentos de Okazaki cada fragmento de Okazaki requiere un ARN cebador
para iniciar la sntesis de una secuencia de nucletidos.
Posteriormente, tras la eliminacin de los ARN cebadores, los fragmentos de Okazaki
se unen gracias a la accin de las enzimas ligasas.
Por ltimo cada hebra recin sintetizada y la que ha servido de patrn se disponen
enrolladas originando una doble hlice.
El ADN es la nica molcula capaz de efectuar una reparacin de s misma. La
replicacin no ha concluido hasta que se comprueba que la copia de la secuencia
nucleotdica es correcta. Es necesario, pues, detectar y corregir los errores
producidos.
El ADN forma una copia de parte de su mensaje sintetizando una molcula de ARN
mensajero (proceso denominado transcripcin), la cual constituye la informacin
utilizada por los ribosomas para la sntesis de una protena (proceso de traduccin).

3.3.

Transcripcin

Consiste en copiar una parte del mensaje gentico desde su forma original (ADN) a
otra (ARN) que se puede utilizar directamente para la sntesis de protenas
especficas.
En el proceso de transcripcin se forma una cadena de ARN cuya secuencia de bases
nitrogenadas es la misma que la de una de las hebras de la doble hlice de ADN.
La sntesis de ARN se produce gracias a la accin de una enzima, la ARN polimerasa
ADN dependiente, la cual tiene una serie de caractersticas:
Esta se fija a regiones especficas del ADN (regiones o genes promotores) para
comenzar su accin a partir de ese punto.
Necesita una molcula de ADN como molde o patrn para poder establecer la
secuencia especfica de bases del ARN que se va a sintetizar
As cada ribonucletido (que van a constituir el ARN) se sita frente al nucletido
correspondiente del ADN y esta enzima, los va uniendo. La cadena de ARN sintetizada
al ser complementaria de la hebra de ADN que se utiliza como molde, es igual a la
otra hebra. Es decir, si se quiere formar una copia de una hebra se utiliza la otra
como molde.
En el proceso de transcripcin, es necesario un proceso de maduracin, ya que los
genes constan de fragmentos con sentido (exones), es decir, llevan informacin til, y
de fragmentos sin sentido (intrones), que tambin se transcriben pero que son
posteriormente cortados y eliminados del ARN recin sintetizado.
Existe una secuencia en el ADN que indica el final de la transcripcin.

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Llamamos cdigo gentico a la relacin entre la secuencia de nucletidos (o ms

concretamente, de bases nitrogenadas presentes en ellos) del ARNm y la secuencia de
a.a. que constituye una protena.
Es en definitiva la clave que permite la traduccin del mensaje gentico a su forma
funcional las protenas.
Cada seal que codifica para un a.a. esta constituida por tres bases nitrogenadas
consecutivas (un triplete). Los tripletes de bases del ARNm reciben el nombre de
codones.

3.4.

Traduccin

Una vez transcrito el ADN, la molcula de ARNm formada contiene la informacin

necesaria para la sntesis de la protena correspondiente. El proceso de biosntesis de
protenas recibe el nombre de traduccin ya que se cambia de lenguaje para pasar de
una secuencia especfica de nucletidos a una secuencia especfica de a.a. Este
proceso se lleva a cabo en los ribosomas del citoplasma celular.
El ARN mensajero es el que lleva la informacin para la sntesis de protenas, es decir,
determina el orden en que se unirn los aminocidos
Los aminocidos son transportados por el ARN transferente o ARNt, especfico para
cada uno de ellos, y son llevados hasta el ARN mensajero (ARNm), dnde se aparean
el codn de ste y el anticodn del ARN de transferencia, por complementariedad de
bases, y de sta forma se sitan en la posicin que les corresponde.
Una vez finalizada la sntesis de una protena, el ARN mensajero queda libre y puede
ser ledo de nuevo. De hecho, es muy frecuente que antes de que finalice una
protena, ya est comenzando otra, con lo cual, una misma molcula de ARN
mensajero, est siendo utilizada por varios ribosomas simultneamente.
Como hemos dicho anteriormente el ARN de transferencia, ARN transferente o
ARNt, es un tipo de a. ribonucleico encargado de transportar los a.a. a los ribosomas
para incorporarlos a las protenas durante el proceso de sntesis proteica, pero antes
de que se inicie propiamente la sntesis de las protenas, es preciso que los a.a. que
van a ser unidos se activen, esta fase ocurre en el citoplasma no en los ribosomas.
Cada a.a. se une a una molcula de ARNt especfica formndose aminoacil ARNt.
Una vez activados los a.a. por la formacin de los aminoacil ARNt tiene lugar la
sntesis de protenas, el proceso se lleva a cabo en tres etapas:

Iniciacin
Elongacin
Alargamiento
Terminacin

Iniciacin
El ARNm se une a los ribosomas citoplasmticos, cuyas dos subunidades, que se
encuentran separadas cuando no estn realizando su funcin, debern acoplarse:
1 el ARNm se une a la subunidad menor del ribosoma.
A continuacin se produce la fijacin del primer aminoacil ARNt por la formacin de
puentes de hidrgeno entre las bases complementarias del anticodn del ARNt y
las del codn del ARNm.
Por ltimo se produce el acoplamiento de la subunidad mayor del ribosoma. Queda
formado as el complejo de iniciacin

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Elongacin o alargamiento
En esta etapa, la cadena peptdica se sintetiza por la unin de los sucesivos a.a. que
se van situando en el ribosoma transportados por los correspondientes ARNt. Para ello
es necesario el desplazamiento del ribosoma a lo largo de la cadena del ARNm (53)
Llega un segundo ARNt llevando su respectivo aminocido y se acopla al siguiente
codn del ARNm, para el ejemplo, al codn CCU. Hasta aqu se ha formado un
dipptido, donde ambos aminocidos permanecen unidos por un enlace peptdico.
El primer ARNt que lleg al ribosoma se retira del complemento ribosmico en busca
de otros aminocidos. El tercer ARNt llega con otro aminocido y se une al codn del
ARNm, a UAG en el ejemplo. El aminocido se adhiere al dipptido antes formado
mediante otro enlace peptdico.
El segundo ARNt se retira del ribosoma. Un cuarto ARNt llega con su aminocido hasta
el ribosoma para acoplarse con el codn AGU del ARNm. La secuencia se repite tantas
veces como aminocidos tenga la futura protena.

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Fase de terminacin
La etapa final de la sntesis de protenas contina hasta que aparecen los llamados
codones stop o de terminacin, representados por UUA, UAG y UGA. No existen
anticodones complementarios para los codones stop. En cambio, quienes s reconocen
a estos codones son unas protenas llamadas factores de terminacin, que detienen
la sntesis de protenas.

La protena formada se desprende del ribosoma y queda libre en el citoplasma, lista

para ser utilizada por la clula para cumplir una determinada funcin.

El ARNm se desprende del ribosoma y puede ser ledo de nuevo por otros ribosomas,
incluso en forma simultnea. Tambin se liberan el ARNt y el factor de terminacin.
Las subunidades del ribosoma se separan.

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La sntesis proteica no tiene lugar continuamente, ya que depende de las necesidades

celulares

4.

INGENIERIA GENTICA

Desde siempre, los humanos han intentado mejorar la produccin de un alimento,

tanto por la calidad como por la cantidad. Por ello, se han seleccionado razas o
variedades de distintas especies. Estos individuos se han cruzado de forma inducida
con el fin de obtener buenos resultados. Los resultados de estos cruzamientos no han
sido siempre tan buenos como se esperaban!
La seleccin y el cruzamiento de estos individuos han consistido realmente en la
seleccin y combinacin de informaciones genticas.
Los espectaculares avances conseguidos actualmente en este proceso de seleccin se
deben en gran parte a la capacidad tecnolgica para poder modificar el ADN de los
seres vivos.
A partir de 1970 se desarrolla un conjunto de tcnicas que se denomina Ingeniera
gentica y que consiste en manipular el ADN, obtener fragmentos del mismo,
secuenciarlos e identificar los genes del genoma de un individuo, modificar su
secuencia e, incluso, introducir nuevos genes en el genoma de un ser vivo, obteniendo
con ello una nueva variedad biolgica con nuevas caractersticas.

5.

TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

El estudio del ADN ha ampliado los conocimientos de las bases moleculares de algunas
enfermedades genticas. Las tcnicas de Biologa Molecular se aplican en el
laboratorio de anlisis clnicos para el diagnstico de patologas de origen gentico de
las que es conocido el gen causante. En un principio eran tcnicas lentas, complejas y
su coste era demasiado elevado como para aplicarse en analtica de rutina. En la
actualidad, se emplean en los laboratorios clnicos de Microbiologa, Bioqumica,
Hematologa, etc.

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5.1.

Hibridacin de cidos nucleicos

La hibridacin de cidos nucleicos consiste en la fijacin in Vitro de una sonda

(cadena de ADN o ARN marcada), a su correspondiente cadena complementaria
procedente de la muestra del paciente.
En las tcnicas de hibridacin se parte de dos poblaciones de cidos nuclicos: una de
secuencia conocida que acta como sonda y otro conjunto heterogneo de cidos
nuclicos de secuencia desconocida donde queremos detectar la secuencia diana.
Tcnicas de hibridacin se utilizan a menudo para detectar una molcula diana
partiendo de una sonda complementaria a ella. Muchas tcnicas moleculares estn
basadas en la hibridacin. Entre ellas estn tcnicas tan importantes como la PCR
Es posible detectar un gen o una secuencia especfica de ADN en presencia de otras
muchas secuencias si se dispone de la hebra de ADN complementario adecuada
(normalmente marcada) que pueda hibridar con ella. Este ADN complementario
(sonda), puede proceder de otra especie o de la misma, tambin puede ser sintetizado
en el laboratorio, estas tcnicas pueden modificarse para detectar un ARN especfico
en lugar de un ADN.
La hibridacin puede producirse en medio lquido o sobre un soporte slido, como
nitrocelulosa, al que se encuentra unida una de las dos poblaciones de cidos
nuclicos. En la hibridacin estndar sera el ADN diana el que ira unido al soporte
slido, mientras que en la hibridacin reversa sera la sonda. Durante la hibridacin se
produce la unin de las molculas diana con las molculas sonda. Esta unin depende
de la complementariedad de bases. Los procesos son los siguientes:

En primer lugar se realiza una desnaturalizacin del ADN (Las disoluciones

de ADN, en las que este haya sido cuidadosamente aislado, cuando se someten
a valores extremos de pH o a altas temperaturas, su viscosidad desciende, lo
que indica que el ADN ha sufrido un cambio en su estado fsico, producindose
la desnaturalizacin o sea el desenrollamiento de la doble hlice, ya sea
totalmente, dando lugar a dos hebras sencillas completamente separadas, o
bien parcialmente.
Posteriormente una renaturalizacin, es decir, una vez separadas las dos
hebras del ADN doble hlice, es posible volver a formar una doble hlice
(renaturalizacin) con una hebra de ADN (sonda) que sea complementaria
(hibridacin de ADN con ADN) o volver a formar una doble hlice con un
segmento de ARN (sonda) que contenga la secuencia complementaria
(hibridacin de ADN con ARN). La renaturalizacin ocurre cuando la T y el pH
retornan a valores situados dentro del margen biolgico, vuelven
espontneamente a enrollarse o a hibridar (Fig. A)

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La capacidad de dos hebras complementarias de ADN para aparearse entre si, es

aprovechada para detectar secuencias de ADN similares en dos especies diferentes o
en el genoma de una misma especie.
Ej. : (Fig. E ) Si los duplex de ADN aislados de clulas humanas y de ratn se
desnaturalizan completamente por accin del calor y a continuacin se mezclan y
mantienen a 65C durante muchas horas, una gran parte del ADN se renaturalizar.
La mayor parte de las cadenas de ADN de ratn se unirn a cadenas complementarias
de ADN de ratn; anlogamente, la mayora de molculas de ADN humano hibridarn
con hebras humanas complementarias. Sin embargo, una parte de las molculas del
ADN del ratn se asociar con ADN humano, para dar lugar a duplex hbridos, en los
cuales fragmentos de la cadena de ADN de ratn estarn apareados con fragmentos
de ADN humano.
5.1.1. Reactivos: Para esta tcnica son necesarios los reactivos siguientes:

cido nucleico diana. Es el a. nucleico procedente de la M, cuya secuencia

genmica se pretende detectar.
Sondas de hibridacin. Son fragmentos de a. nucleicos marcados
(frecuentemente marcaje radiactivo aunque tambin puede ser: qumico,
enzimtico, colorimtrico etc.). Se elaboran en el laboratorio y su secuencia de
bases es complementaria a la secuencia genmica del ADN diana.

5.1.2. Tcnicas de hibridacin

Las diferentes tcnicas, responden a este esquema:

Extraccin del a. nucleico. Tambin conocido como purificacin de a.

nuclicos. En el mercado existen sistemas de aislamiento de ADN a partir de
sangre perifrica o de clulas en suspensin.

Digestin del a. nucleico. Incubar el ADN o ARN de la muestra, con enzimas de

restriccin (EdR), que son enzimas que seccionan la cadena de ADN, tras

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reconocer una secuencia especifica constituida entre 4 y 8 pares de bases

nitrogenadas que delimitan las denominadas zonas de restriccin. Luego estos
fragmentos pueden separarse y reconocerse mediante tcnicas de separacin,
como la electroforesis. Todo esto en un tampn adecuado a 37C.

Separacin de los fragmentos de ADN. Se disuelve el gel de agarosa en un

tampn y se coloca en los pocillos el a. nucleico y el marcador y se realiza la
electroforesis. Posteriormente, la efectividad de la electroforesis, se comprueba
observando la placa a la luz U.V.
o Se corta la placa con los fragmentos de a. nucleico separados a nivel de
los pocillos, eliminando el del marcador. Despus, se corta una placa de
nitrocelulosa del mismo tamao.

Desnaturalizacin del gel. Mezclar el gel de agarosa con soluciones

desnaturalizantes, centrifugar y decantar el sobrenadante hasta que quede
limpio.

Transferencia a un filtro de nitrocelulosa.

o Se colocan el gel de agarosa y el filtro de nitrocelulosa, junto con una
serie de soluciones de elevada fuerza inica, para que se produzca la
transferencia.

Prehibridacin e hibridacin de a. nucleicos. Proceso de unin de dos secuencias

de a. nucleico desnaturalizado de distinta procedencia (a. nucleico diana y la
sonda marcada). Este proceso se realiza en una cmara de hibridacin en
condiciones controladas de T y pH.
o Si la sonda esta marcada con istopos radiactivos, una vez acabado el
proceso de hibridacin, se elimina el exceso de radiactividad no fijada
mediante el lavado de los filtros.

Un ejemplo de un mtodo clsico para detectar una secuencia de ADN, puede ser:

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5.1.3. Tipos
En biologa molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes
de hibridacin: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN (explicada
anteriormente) y tipo Northern, para uniones ADN-ARN.
Ambos mtodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada, sonda, para
detectar otras molculas de ARN o ADN.
El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material gentico y el
Northern Blot, la expresin de diferentes genes.
5.1.4. Las aplicaciones de estas tcnicas pueden servir para:

5.2.

identificar a un individuo a partir de un nico cabello.

prediccin de la aparicin de ciertas enfermedades en un individuo, dcadas
antes de aparecer los primeros sntomas. Etc. En el siguiente cuadro se
muestran algunas de las enfermedades que se pueden diagnosticar
mediante tcnicas de hibridacin de a. nucleicos.

Reaccin en cadena de la polimerasa

Es un proceso de amplificacin selectiva in vitro, de una secuencia de ADN. O

sea, obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular,
partiendo de un mnimo; (en teora basta partir de una nica copia de ese
fragmento original, o molde).
Debido a la accin de Las enzimas ADN polimerasas que duplican el ADN
copiando las dos cadenas de la doble hlice.
A partir de una molcula de ADN bicatenario, se obtienen dos molculas de ADN
bicatenario exactamente iguales.
Su utilidad es:
Tras la amplificacin, resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta
probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad.
Identificar personas (cadveres).
Hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Etc
Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una
tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario
para llevarla a cabo.
La capacidad de amplificacin, alcanza hasta ms de 106 veces la secuencia
original. Esta tcnica permite, la deteccin de una sola molcula de ADN en la
muestra problema a pesar de estar mezclada con otras molculas de ADN
diferentes.

5.2.1.Reactivos

Diana o Target. Es la molcula de ADN que contiene la secuencia de

nucletidos que se pretende amplificar.

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Una mezcla de desoxinucletidos trifosfato (dNTP). El sustrato para

polimerizar nuevo ADN. Que componen las piezas de construccin de las
cadenas que se van a sintetizar.
Cebadores o Primers. Son pequeos fragmentos de ADN monocatenario
(oligonucletidos, que hibridan con el ADN desnaturalizado), cuya secuencia
de bases es complementaria de uno de los extremos de la cadena molde.
Son necesarios dos cebadores adecuados por PCR, cada uno
complementario a una cadena del ADN. Siempre se encuentran en exceso de
concentracin para favorecer el proceso.
Son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reaccin. Delimitan
la zona de ADN a amplificar.
ADN polimerasa. O mezcla de distintas polimerasas con temperatura
ptima alrededor de 70C (la ms comn es la Taq polimerasa)
Otros reactivos. Iones: Se suele usar magnesio (Mg2+), como cloruro de
magnesio (MgCl2), tambin se puede emplear manganeso (Mn2+). Actan
como cofactores de la polimerasa, iones monovalentes, como el potasio,
una solucin tampn (buffer) que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.

Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de 100 L.

Termociclador. Aparato que va a mantener la temperatura necesaria en

cada una de las etapas que conforman un ciclo.
Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante este aparato
que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la
temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin.

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5.2.2. Proceso puede resumirse en cinco etapas:

Extraccin y purificacin de la molcula de ADN de la muestra

problema.
Desnaturalizacin de la doble hlice del ADN. Se separan las dos
hebras de las cuales est constituido. Este paso puede realizarse de
diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95C) de la muestra la forma
ms habitual. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR,
seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la
desnaturalizacin.
Hibridacin de las cadenas por separado con los cebadores. Es decir, el
cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello
es necesario bajar la temperatura a 50-65C durante 20-40 segundos,
permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las
cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del
cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los
cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser
amplificada.
Extensin del complejo cebador-ADN o elongacin de la cadena,
mediante la accin de la polimerasa.
Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para
la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN
complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP's complementarios en
direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el grupo 3'hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La
temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos.
Para la Taq polimerasa, la temperatura de mxima actividad est en 7580C (comnmente 72C). El tiempo de extensin depende tanto de la ADN
polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a
amplificar. Hay una regla bsica: en su temperatura ptima, la polimerasa
de ADN polimerizar mil bases en un minuto.
Repeticin de los ciclos de extensin hasta que se alcance la dimensin
que se haba pautado.
El proceso que se acaba de describir constituye un ciclo de sntesis. Si se
repitiera el proceso ntegramente, se partira de 4 hebras molde y se
obtendran cuatro molculas bicatenarias. Si se realizara un nuevo ciclo, se
partira de 8 hebras molde que, a su vez, daran 8 molculas bicatenarias.
En el siguiente ciclo, los moldes seran 16, se trata, por tanto, de un proceso
exponencial, en el que se llevan a cabo tantos ciclos como sea necesario
para obtener el nmero de copias deseado. Tras 20 ciclos de sntesis, se
puede obtener del orden de un milln de copias de una molcula de ADN.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se

emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN
generados de acuerdo a su longitud, y, en menor medida, a su tamao: El/los

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tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de

peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao
conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

Optimizacin de la PCR
En la prctica, la PCR puede fallar por varias razones, pero normalmente es debido
a su sensibilidad a la contaminacin, que a veces provoca la amplificacin de ADN
"falso". Por esto, se han desarrollado un gran nmero de tcnicas y procesos para
optimizar la PCR:

La contaminacin con ADNs extraos puede solucionarse con protocolos y

procedimientos que separen las reacciones pre-PCR de los contaminantes
potenciales del ADN. Esto normalmente implica la separacin espacial de las
reas de realizacin de la PCR de las de anlisis o purificacin de los
productos de PCR, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre
la realizacin de una PCR y la siguiente.
Las tcnicas de diseo de primers son importantes en la mejora de la
obtencin de productos de PCR y en evitar la formacin de productos falsos,
etc..

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5.2.3.Aplicaciones de la PCR
Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en
laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de
aplicaciones
Las aplicaciones de esta tcnica son prcticamente ilimitadas:

En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como:

Herramienta de diagnostico: Permite el genotipar la especie o especies que

provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona

del genoma bacteriano, que permita identificarlo de forma inequvoca. En el
caso de infecciones virales que implican la integracin del genoma del patgeno
en el ADN del hospedador, como es el de la infeccin por VIH, la PCR
cuantitativa posibilita la determinacin de la carga viral existente y por tanto,
del estadio de la enfermedad.

En revisiones mdicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre,

para test de rutina. A travs de esta tcnica se pueden detectar infecciones

peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras an estn en el
periodo de incubacin.

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En el diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma, este

es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente

gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante
sus correspondientes primers y posteriormente secuenciar para detectar la
existencia de mutaciones.

En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiacin de una persona

o para obtener pruebas a partir de muestras mnimas dejadas por el autor de

un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos

Historia
En 1971, un artculo publicado por Kleppe et al. en Journal of Molecular Biology
describi por primera vez un mtodo que usaba enzimas para replicar una
secuencia pequea de ADN con primers in Vitro. Sin embargo, este temprano
ejemplo del principio bsico de la PCR no recibi mucha atencin, y la invencin
de la reaccin en cadena de la polimerasa en 1983 es generalmente atribuida a
Kary Mullis. Mullis gan el Premio Nobel por su trabajo en PCR. #

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