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Clostridium perfringens

3Introduccin
4Las superficies mucosas del organismo son la principal barrera de proteccin contra la
5permanente carga antignica del medio ambiente frente a la colonizacin y proliferacin de
6microorganismos en el tracto intestinal, siendo una de las principales puertas de entrada para los
7microorganismos potencialmente patgenos (Neutra et al., 2001). Sin embargo, a pesar de
8desarrollarse un complejo sistema de defensa, es necesario que esta respuesta no sea exagerada,
9establecindose un grado de tolerancia inmunolgica hacia la flora normal (Liu y Lefranois,
102004; Kaiserlian et al., 2005).
11Los camlidos sudamericanos, entre ellas la alpaca, son la principal fuente econmica de las
12comunidades altoandinas de nuestro pas. Actualmente existe una alta mortalidad y morbilidad
13en cras que va desde el periodo perinatal (0-7 das) hasta el destete (6-8 meses) (Martn, 2010;
14Rosadio, 2010).
15La enterotoxemia, es una enfermedad aguda responsable del 85 % de mortalidad en alpacas
16(More, 2013) y es causada por toxinas del Clostridium perfringens, estando implicado
17principalmente en el Per el tipo A y slo en algunos casos el tipo C (Maturrano y col, 2010).
18La presentacin cclica de la enfermedad est asociada al aumento de la precipitacin pluvial y
19esta relacionada con la inmunidad en masa debido a infecciones naturales, que permiten la
20transmisin de anticuerpos hacia las nuevas generaciones. La disminucin progresiva de la
21cantidad y calidad de anticuerpos incrementa la susceptibilidad en las cras de alpacas (Yaya y
22Rosadio, 2005).

23Una caracterstica biolgica determinante en la aparicin de cuadros infeccioso en cras de

24alpaca, es que estas nacen hipogammaglobulinmicas debido a la placentacin epiteliocorial
25difusa de los camlidos (Cid, 2010) y absorben las inmunoglobulinas (principalmente IgG) del
26calostro ingerido (Ramrez y col,. 1998). La falla en la transferencia pasiva de inmunoglobulinas
27presentes en el calostro ha sido asociada a la mortalidad de cras (Garmendia y col, 1987); es as
28que se debe garantizar una adecuada toma de calostro en las primeras 24 horas de vida, tiempo a
29partir del cual la absorcin del mismo disminuye en eficacia (Cid y Martn, 2010). Otra
30particularidad del sistema inmune de las alpacas es que presenta inmunoglobulinas G, carentes
31de cadena ligera (Chiok, 2012), por lo que es necesario esclarecer los mecanismos moleculares
32de la respuesta inmune de mucosa.
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34El presente estudio se enfoca en que el sistema inmune de mucosas presenta su propio perfil de
35expresin de genes de protenas asociados frente al Clostridium perfringens y citoquinas
36asociadas.Para ello se caracterizar mediante tcnicas moleculares los mecanismos de la
37respuesta inmune intestinal en cras de alpacas frenteClostridium perfringens.
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39Similarmente a lo que ocurre en aves, la infeccin previa con protozoarios del grupo Eimeria sp.
40seguida de infeccin por Clostridium perfringens suelen causar enteritis necrticas en ambas
41especies.
42 La enfermedad est causada por toxinas del Clostridium perfringens estando implicado en el
43 Per principalmente el tipo A y slo en algunos casos el tipo C (Maturrano y col, 2010). Se trata
44 de un bacilo anaerbico esporulado (Ramrez y col, 1998) capaz de producir potentes toxinas
45 (Fernndez-Baca, 2005) en el lumen intestinal provocando alteracin de la permeabilidad de la

46 pared intestinal y resultando en acumulacin de fluidos y electrolitos dentro del lumen, as como
47 la absorcin de toxinas al torrente sanguneo (Ramrez y col, 1998).
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49En el Per, se ha genotipificado y subtipificado aislamientos de C. perfringens obtenidos de 47
50casos clnicos de enterotoxemia en cras de alpaca, diagnosticados por signos clnicos, lesiones
51histopatolgicas y aislamiento bacteriano. Se encontr que el 70.2% de estos aislamientos
52correspondieron al genotipo A (cpe-, cpb2-), el 27.7% correspondi al genotipo A subtipo cpe 53cpb2+ y el 2.1% fue del subtipo cpe+ cpb2+. Este estudio ha demostrado la predominancia del
54genotipo A en nuestro territorio (Prez, 2006).
55 Sobre los camlidos sudamericanos, se ha clonado y secuencia las citoquinas IFN,IL-2,
56 IL12p35 e IL12p40 obtenindose cDNA de 501, 465, 669 y 993pb de longitud con marcos de
57 lectura abierto codificando 166, 154, 22 y 330 aminocidos, respectivamente. El anlisis
58 filogentico revela relacin cercana con las secuencias de mamfero del orden Artiodactyla como
59 el cerdo y el bovino, de manera similar a lo encontrado en el camello bactriano (Odbileg y col.,
60 2004).
61Recientes publicaciones sealan como agentes patgenos causantes de infecciones entricas en
62cras de camlidos sudamericanos menores de 7 meses de edad a la Salmonella sp., Clostridium
63perfringens, Rotavirus (2%), Coronavirus (42%), y ciertos parsitos como Giardia duodenalis
64(18%), Cryptosporidium spp (9%), Eimeria spp (13%), nemtodos (2%) (Genova y col., 2008).
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81Materiales y Mtodos
82Animales
83Los animales fueron obtenidos de la Estacin Experimental IVITA-Marangan y de zonas
84aledaas a la estacin. Se emplearon dos grupos de cras de alpaca de recin nacido a 45 das de
85edad que provendrn bajo ciertas condiciones experimentales.
86El primer grupo fue de cras sanas que fueron evaluadas bajo condiciones normales de crianza
87para la caracterizacin inmune de mucosas y un segundo grupo de cras nacidas de madres bajo
88buenas condiciones nutricionales durante el ltimo tercio de gestacin, las cuales tambin se
89evalu las variaciones de la expresin de citoquinas y protenas del sistema inmune de mucosas
90en cras con o sin estimulacin de inmungenos orales, que fueron enfrentadas al Clostridium
91perfringens; para lo cual se formaron grupos de animales:
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a. No tratados y enfrentados al Clostridium perfringens

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b. Tratados (con inmungeno oral) y luego enfrentadas a Clostridium perfringens

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c. No tratadas y no enfrentadas a Clostridium perfringens

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97Se emple una combinacin de Ketamina (20 mg/Kg IM) y clorhidrato de Xylacina (2 mg/Kg
98IM) para conseguir la anestesia general del animal. Finalmente, se aplic una sobredosis de
99Pentobarbital sdico (70 mg/Kg IV) produciendo en el animal un paro cardio-respiratorio
100Swindle (1998). Se comprobaron los signos vitales para confirmar el deceso de los animales y
101proceder con las necropsias y toma de muestras.
102
103Toma de muestra

104Se colect las muestras durante las necropsias realizadas a los animales. Para las tcnicas
105moleculares, se tomaron porciones de 2cm de longitud del segmento medio del duodeno, yeyuno
106e ilion de forma asptica. Los segmentos fueron inmediatamente lavados con suero fisiolgico al
1070.9% estril para eliminar restos de contenido intestinal potencialmente inhibidores de las
108tcnicas moleculares. Los segmentos fueron colocados en crioviales estriles de 2ml de
109capacidad, rotulados y congelados en nitrgeno lquido (-196 C) para su transporte hacia el
110laboratorio.
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112Procesamiento de muestras
113Los segmentos intestinales fueron descongelados gradualmente desde -196 C seguido de -70 C,
114-20 C y a 4 C. Seguidamente, se procedi a realizar el raspado profundo del tejido intestinal
115mediante hoja de bistur a 4 C sobre placa Petri estril. El contenido obtenido del raspado fue
116lavado 3 veces en PBS 0.15M pH 7.2 para eliminar restos de contenido intestinal inhibidores del
117PCR y el pellet final fue resuspendido en 500l de agua libre de nucleasas y congelado a -70 C
118hasta la extraccin de ARN total.
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120Extraccin de ARN
121Se emple para la extraccin el reactivo TRIZOL (Invitrogen, USA) siguiendo las
122instrucciones del fabricante. Este mtodo se basa en el uso de una solucin monofsica de fenol e
123isotiocianato de guanidina para la lisis de las clulas y la separacin de la muestra en dos fases
124(acuosa y orgnica), seguida de la extraccin y precipitacin del ARN total con cloroformo e
125isopropanol respectivamente a partir de la fase acuosa. Brevemente, los pellets fueron incubados

126a temperatura ambiente por 3 minutos con el reactivo para luego adicionarles cloroformo fro.
127Tras centrifugar, se tom la fase acuosa de la mezcla y el ARN total fue precipitado con alcohol
128isoproplico fro, centrifugado e inmediatamente lavado con Etanol fro al 70%. Finalmente, el
129ARN fueresuspendido en 60l de agua libre de nucleasas y almacenado a -70 C hasta su uso en
130el RT-PCR.
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132Sntesis de ADNc (Transcripcin reversa)
133El ARN obtenido de cada una de las muestras fue tomado como templado para la sntesis de
134ADNc (ADN complementario) empleando el kit SuperScriptTM III First-StrandSynthesis
135SuperMix for qRT-PCR (Invitrogen, USA), segn las instrucciones del fabricante. El kit emplea
136la transcriptasa reversa MuLV H+ para generar ADNc a partir de molculas de ARN templado en
137las muestras y viene provedo de dNTP, hexmeros al azar (0.2M, concentracin final) y sales
138para optimizar la reaccin.
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140PCR Tiempo Real
141Se emple el ADNc de cada una de las muestras como templado para la reaccin de PCR con el
142kit SuperScriptTM III First-StrandSynthesis SuperMix for qRT-PCR (Invitrogen, USA),
143siguiendo las recomendaciones del fabricante. La reaccin PCR utiliza la polimerasa
144hotStartTaqPlatinum modificada para mayor estabilidad contenida en 2x qPCR Master mix que
145contiene SYBR Green II, buffer, 5mM de MgCl2, dNTP mix (0,2 M concentracin final) y
146como referencia pasiva se utiliz ROX 50x tambin provedo por el kit. Los oligonucletidos
147fueron diluidos en agua libre de nucleasas para obtener soluciones de trabajo de 10 M de forma

148que su concentracin final en la reaccin fue de 0.2 M en todos los casos.

149Anlisis estadstico
150Para el nmero de animales en estudio, se determino si las variables a analizar seguan la
151distribucin normal, empleando la prueba de Shapiro Wilk. Para estimar si la diferencias entre
152los individuos tratados en comparacin con los no tratados, y el anlisis segn grupo etario,
153fueron estadsticamente significativas, se emple la prueba no paramtrica U de Mann- Whitney154Wilcoxon. Los resultados se presentan como la mediana de las variables, y los rangos promedios
155de cada una de las variables fueron utilizados para realizar el anlisis estadstico. Todas las
156pruebas fueron realizadas en el programa estadstico STATA 12.
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159Referencias:
160Chiok K. 2012. Expresin de Citoquinas de la respuesta TH1 (Ifne Il2) y TH2 (Il4 e Il10) en
161mucosa intestinal de cras de alpaca (Vicugna Pacos) sanas y con Enteropata. Tesis para optar el
162Grado Acadmico de Magster en Ciencias Veterinarias con mencin en Salud Animal.
163Kaiserlian D, Cerf-Bensussan N, Hosmalin A. 2005. The mucosal inmune system from control of
164inflammation to protection againt infections. J. Leukoc. Biol. 78: 311-318.
165Liu Z, LefranoisL. 2004. Intestinal Epithelial Antigen Induces Mucosal CD8 T cell Tolernce.
166Activation and Inflammatory Response. The Journal of Inmunology. 173: 4324-4330.
167Martin C, Pinto C, Cid M. 2010. Camlidos sudamericanos: estado sanitario de sus cras.
168Revista Complutense de Ciencias Veterinarias 4(1): 37-50.
169More J. 2013. Efecto de antgenos clostridiales con cido retinoico sobre la expresin de
170citoquinas de la respuesta inmune humoral y celular de la mucosa intestinal de cras de alpacas
171(Vicugna pacos). Tesis para optar el Grado Acadmico de Magster en Ciencias Veterinarias con
172mencin en Salud Animal.
173Neutra MR, Mantis NJ, Kraehenbuhl JP. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal
174lymphoid tissues. Nat Immunol 2001; 2 (11): 1004-9.
175Ramrez A. 1987. Alpaca Clostridium perfringens type Aenterotoxemia: purification and assays
176of the enterotoxin. PhD Thesis. USA: Colorado StateUniversity. 201 p
177Rosadio R. 2010. Mortalidad neonatal en alpacas. En: Cid, M. Sanidad de alpacas en la etapa
178neonatal. 1 ed. Madrid: Editorial Complutense. 148 p.
179Swindle MM. 1998. Surgery, Anesthesia and Experimental Techniques in Swine. Iowa
180StateuniversityPress.

181Yaya K, Rosadio R. 2005. Ensayo de tres programas de vacunacin anticlostridial en alpacas.

182RevInvVet Per; 16 (1):49-55.
183
18448.

Genova SG, Streeter RN, Simpson KM, Kapil S. 2008. Detection of an antigenic group

185

2 coronavirus in an adult alpaca with enteritis. Clinical and vaccine immunology, 15(10):

186

1629-1632.

187

49. (Maturrano y col, 2010).Kim-tesis de maestria

188

50. (Cid, 2010)

189

51. (Ramrez y col,. 1998).

190

52. (Garmendia y col, 1987);

191

53. (Cid y Martn, 2010).

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