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RET.

Revista de Estudios Transdisciplinarios


ISSN: 1856-9161
publicaciones@idea.gob.ve
Fundacin Instituto de Estudios Avanzados
Venezuela

Franco, Alicia Y.; Longart, Marins


Aplicaciones de la protena verde fluorescente (GFP) en la biologa celular y en la visualizacin del
sistema nervioso
RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios, vol. 1, nm. 2, julio-diciembre, 2009, pp. 84-96
Fundacin Instituto de Estudios Avanzados
Caracas, Venezuela

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=179214945007

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RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. N 2. Serie verde | Caracas,

julio- diciembre 2009

Aplicaciones de la protena verde fluorescente


(GFP) en la biologa celular y en la
visualizacin del sistema nervioso
Applications of Green Fluorescent Protein (GFP) in Cell Biology
and Visualization of the Nervous System.
Alicia Y. Franco,* Marins Longart*
Universidad Simn Bolvar, Decanato de Estudios Profesionales.
Unidad de Neurociencias, Centro de Biociencias y Medicina Molecular, Instituto de Estudios Avanzados, Caracas, Venezuela

La medusa bioluminiscente Aequorea victoria provee una herramienta til para la biologa celular, una protena que
tiene la propiedad de emitir luz verde. La protena verde fluorescente (GFP, por sus siglas en ingls) ha sido modificada para emitir colores en muchas y diversas longitudes de onda. La GFP, junto con protenas derivadas de otros
organismos, ofrece nuevas variedades de protenas fluorescentes. Entre otras caractersticas que la hacen, sin duda,
especial, la protena fluorescente destaca por no necesitar intermediarios para su expresin en cualquier organismo
vivo, ser susceptible de modificacin para mejorar su intensidad, cambiar colores de emisin, construir quimeras
con otras protenas y servir de gen reportero, sensor bioqumico y medidor sensible de pH intra e intercelular, etc.
Desde su descubrimiento en 1962, la protena ha sufrido muchos cambios y sus aplicaciones involucran todas las
reas de la biologa. La neurociencia ha sido una de las ms beneficiadas por los mltiples usos de la GFP. Uno de
ellos ha sido marcar neuronas in vivo hasta con 90 colores fluorescentes, lo que ha permitido visualizar las redes de
la arquitectura neural de un mismo organismo de una manera sin precedentes. La presente revisin bibliogrfica
se enfoca en la descripcin de parte del descubrimiento de la protena GFP, as como de sus variantes, principales
aplicaciones y su actual utilizacin en la visualizacin de neuronas del sistema nervioso central.

Palabras clave
GFP, GFP supereclptica, GFP fotoactivable, aquorina
The bioluminiscent jelly fish Aequorea victoria provides a powerful tool to cell biology, a protein that fluoresces with the emission of green light. The green fluorescent protein (GFP) has been modified to emit in
many different wavelengths. The GFP, together with other proteins derived from different organisms, offers an immense variety of fluorescent proteins. This protein shows features that make it special; no other
factors are needed for its expression in any living organism, it can be modified to improve its intensity, to
change emission colors, to construct chimera with other proteins, it can also be used as a reporter gene,
biochemical sensor, sensitive intra and intercellular pH meter, etc. Since the discovery of the protein in
1962 it has experienced many changes and its applications extend to all areas in biology. Neuroscience is
one of the areas more benefited with the application of GFP. One of these applications involves the in vivo
labeling of neurons with multiple fluorescent colors which allow visualizing the neural network architecture
as never seen before, up to 90 different colors in a same organism. In the present work, we performed a
review that goes from the discovery of GFP, its variants, main applications and to its use in the visualization of neurons in the central nervous system.
Keywords
GFP, supereclptic GFP, fotoactivable GFP, aequorin.

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ALICIA Y. FRANCO Y MARINS LONGART.

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Introduccin

Historia de la GFP

La fluorescencia es la emisin de radiacin electromagntica en la regin visible por parte de una molcula o
tomo luego de la absorcin inicial de un fotn. (Chang,
2002). El descubrimiento de protenas que tienen capacidad fluorescente (protenas fluorescentes, en ingls, fluorescent proteins o FP), nativas de organismos acuticos
que poseen bioluminiscencia, ha sido una revolucin en
la biologa celular. Existen protenas fluorescentes naturales que emiten su fluorescencia en rangos de distintos
colores, como verde y rojo; ste ltimo proveniente del
coral Discosoma sp. (Shaner et al., 2003). Otras protenas
verdes fluorescentes se atribuyen a organismos como el
cnidario Renilla reniformis (Ward et al., 1979; Loening et
al., 2007).
Sin embargo, la protena proveniente de la medusa
Aequorea victoria, que han denominado protena verde
fluorescente nativa (Green Fluorescent Protein, GFP,
por sus siglas en ingls), ha sido la que ms impacto
dentro de la comunidad cientfica ha tenido; de hecho,
en octubre de 2008, los investigadores Osamu Shimomura, Martin Chalfie y Roger Tsien fueron galardonados con el Premio Nobel de Qumica por sus trabajos
con la protena verde fluorescente. El descubrimiento
tuvo gran impacto cuando se observ que la GFP conservaba su propiedad fluorescente incluso dentro de organismos distintos al de la medusa, lo que representaba
una gran ventaja respecto a otros tipos celulares (Chalfie
et al., 1994; Shaner et al., 2007).
En la biologa celular, estas protenas permiten obtener
datos sobre localizacin, dinmica y redes de interaccin
molecular con otras protenas de gran resolucin temporal y espacial (Tsien, 1998). A estas protenas se les
considera marcadores de localizacin (genes reporteros)
porque permiten el monitoreo de los cambios bioqumicos dentro y entre las clulas, o de cualquier otro fenmeno dinmico que se desee observar sin necesidad
de tincin o fijacin de la clula. Para la neurociencia es
relevante, entre muchas otras razones, porque favorece
el estudio de las redes neuronales y de las conexiones
sinpticas in vivo.
El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar una
breve historia de la protena verde fluorescente y describir algunas de sus aplicaciones, especialmente las utilizadas para visualizar clulas del sistema nervioso.

En el ao 1962, Shimomura, Johnson y Saiga publicaron


sus hallazgos sobre el aislamiento de un extracto obtenido de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria, del
que lograron obtener a su vez dos protenas: la aquorina
(nombre derivado de la especie con que trabajaban) y
la protena verde (Shimomura et al., 1962; Shimomura,
2005).
Aunque el objetivo principal de esa investigacin era la
obtencin de aquorina, protena dependiente del calcio,
estos investigadores identificaron de manera accidental
una segunda protena de color verde (Shimomura et al.,
1962; Shimomura, 2005). Se determin que la protena
verde tena un pico en el espectro de emisin a 508 nm,
cercano al que emite el tejido vivo de la medusa, mientras que la aquorina pura lo tena a 470 nm en la zona
azul del espectro visible; esto indicaba cierta interaccin
entre las dos protenas. De estas observaciones se determin que la protena verde converta la emisin azul de
la aquorina en verde brillante mediante un proceso de
transferencia de energa, sin emisin y reabsorcin de
radiacin (Tsien, 1998; Fernandez et al., 2006).
En 1969, Morin y Hastings (citado por Shimomura, 2005)
la llamaron por primera vez protena verde fluorescente (GFP) por sus caractersticas luminiscentes emitidas
en cierta longitud de onda. En 1974 esta protena fue finalmente purificada y cristalizada (Morise et al., 1974;
Tsien, 1998). En el ao 1992 fue secuenciada por primera
vez mediante tcnicas de cDNA (Prasher et al., 1992);
pero no fue hasta 1994 que Chalfie (Chalfie et al., 1994),
por un lado, e Inouye y Tsuji (citado por Tsien, 1998),
por otro, lograron conservar su fluorescencia en un cultivo con otros organismos procariticos y eucariticos.
Con ello demostraron que el gen de la GFP por s solo
contiene toda la informacin necesaria para sintetizar
el cromforo postraduccionalmente y que no requiere
la accin de enzimas especficas de la medusa Aequorea
victoria.

Caractersticas de la GFP
La protena verde fluorescente presenta dos picos de
excitacin: el primero, cercano a los 395 nm; el segundo, de 475 nm, y tambin dos picos de emisin: si es
excitada a los 395 nm su pico de emisin ser a los 508
nm, y si, por el contrario, es excitada a 475 nm, entonces
la emisin ocurrir a 503 nm (Tsien, 1998), cuando esto
ocurre la protena capta mayor luz fuera del espectro vi-

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sible y la convierte en luz visible verdosa. La protena


est conformada por 238 aminocidos, cuya secuencia,
descifrada por Prasher y sus colaboradores (Prasher et
al., 1992), se muestra en la figura 1.
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GLY
VAL
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ASP
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ASP
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FIGURA
1. Secuencia aminoacdica de la GFP nativa. Los aminocidos
!
subrayados son los que conforman el cromforo
(Tomado de Prasher et al., 1992).

La estructura terciaria de la protena consiste en un barril beta de 40 , formado por once hojas antiparalelas,
acompaadas de una hlice con el cromforo al centro
de dicha estructura, tal como se muestra en la Figura 2
(Ormo et al., 1996).
La GFP presenta un cromforo p-hidroxibenzilideneimidazolinona (Prasher et al., 1992), sujeto a la hlice
dentro del barril. Dicho cromforo se forma por la ciclizacin espontnea y la oxidacin de los residuos 65
67, correspondientes a los aminocidos Ser 65 Tyr 66
Gly 67 (subrayados en la figura 1) de la protena nativa,
y es el responsable de la emisin de luz verde. Las series de residuos de aminocidos estn acompaados de
grupos polares que propician la presencia de molculas
de agua, adyacentes al cromforo (Heim et al., 1994). La
sntesis del cromforo comienza con el plegamiento de
la protena en su conformacin inicial y la formacin de
imidazolina por un ataque nucleoflico del grupo amino
de Gly-67 sobre el carbonilo del residuo 65, para producir deshidratacin. Al final, el oxgeno molecular quita
el hidrgeno del enlace C-C del residuo Tyr 66 y crea
un anillo fenlico con el imadazlico, el cual producir

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FIGURA 2. Esquemas de la forma terciaria de la protena nativa GFP:


A) Esquema original tomado de Ormo et al., 1996, obsrvese la forma de
barril (cilndrica) de la protena; B) Se observan las hojas (color verde)
dispuestas diagonalmente para formar la estructura cilndrica y el cromforo en el centro del barril (color naranja); C) Vista superior de la GFP
donde se observa la hlice (fucsia) y las hojas (mostaza). Esquemas
tomados de la pgina web del laboratorio del Dr. Tsien, disponible en:
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Default.htm

absorbancia y fluorescencia (Heim et al., 1994).


Al analizar la estructura cuaternaria se hizo patente que
las altas concentraciones de GFP resultan de un fenmeno de agregacin de subunidades de la misma protena y de otras protenas de la membrana, conocido como
dimerizacin, que inhibe la fluorescencia o la reduce
por debajo de la intensidad mnima requerida para ser
visible. Es necesario 1 M (aproximadamente 105 copias
en un volumen celular de 1-2 pL) de GFP correctamente
plegada (Tsien, 1998) para que la protena pueda emitir
luz.
En el ao de 1996, Yang y sus colaboradores (Yang et al.,
1996) establecieron que en la formacin de la interfase
de dimerizacin intervienen residuos hidrofbicos como
Leu (206), Leu (221) y Phe (223), y residuos hidroflicos
como Tyr (39) y Glu (142), entre otros. El fenmeno de
dimerizacin pudo ser solventado al crear una mutacin
en el residuo 206. En la figura 3 se muestran las imgenes del GFP dimerizado y del GFP monmero (Zhang
et al., 2002).
Otra caracterstica de capital importancia de la GFP fue
la observada por Chalfie y colaboradores, quienes al insertar ADN complementario en un vector de expresin
en clulas procariotas (Escherichia coli) y eucariticas
(Caenorhabditis elegans), pudieron comprobar que la

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FIGURA 3. El dmero de GFP se forma por altas concentraciones de


dicha protena y el monmero fue producido por una mutacin en el
aminocido 206, que suprime la tendencia a dimerizar. Tomado y modificado de Zhang et al., 2002.

Aequorea victoria no requera sustratos exgenos ni cofactores para producir fluorescencia. El trabajo de Chalfie y su equipo fue, adems, el primero atribuir a esta
protena la cualidad de marcador gentico y localizador
de protenas en organismos vivos (Chalfie et al., 1994).

Variantes de la GFP
Se conocen decenas de protenas mutadas derivadas de
la GFP de Aequorea victoria (nativa), cuyas alteraciones
producen propiedades fsico-qumicas distintas a la original, y en las cuales se ha mejorado su expresin (mayor fluorescencia, cambios en el rango de excitacin y
emisin; cintica de oxidacin del cromforo, fotoestabilidad, etc), pero sin modificar el comportamiento general de la protena (Knee et al., 1998). La clasificacin
de las variantes de la GFP son diversas porque toman en
cuenta distintas caractersticas, como la estructura del
cromforo (Zacharias et al., 2006), el rango de emisiones
en el espectro visible (Sharner et al., 2007) y las aplicaciones como sondas intracelulares (Miyawaki, 2003).
La creacin de estas mutantes fue originada por la necesidad de frenar la tendencia de la protena a dimerizar,
porque esa propensin limitaba sus aplicaciones in vivo
(Fernandez et al., 2006). De esta manera, la GFP nativa
fue modificada para obtener variantes con emisin en
diferentes rangos espectrales y estabilidad en la forma
cuaternaria de la protena (Heim 1994; Ormo, 1996). A
continuacin se mencionan las mutantes ms importantes y, en el Anexo 1, se muestra un cuadro resumen.

Muchas otras FP que exhiben tonos desde el anaranjado


hasta el rojo no derivan de la GFP de A. victoria, sino
de una protena fluorescente roja obtenida de un coral
no bioluminiscente (Matz et al., 1999), por lo que no se
desarrollarn en el presente trabajo.
De todas las variantes hasta ahora obtenidas, la de mayor uso (actualmente producida por la casa comercial
Clontech) es la EGFP (por sus iniciales en ingls, enhanced green fluorescent protein), la cual es una versin
mejorada de la GFP nativa. Este fue el primer grupo de
FP que combinaba un alto brillo con slo un pico de
excitacin (Tsien, 1998). La mutacin ms comn, que
causa ionizacin del fenol en el fluorforo, es el remplazo de Ser 65 por Thr, tambin llamada S65T. El pico de
absorbancia ocurre a 489 nm y el de emisin a 509 nm,
de ah su fluorescencia verde (Patersonn et al., 1997). Las
variantes EGFP muestran un decremento paulatino del
fotoblanqueamiento, en contraste con la GFP nativa que
muestra un incremento inicial y luego un rpido descenso en la fluorescencia (Patterson et al., 1997). Dentro de
las ventajas que presenta la variante EGFP, se encuentran una oxidacin cuatro veces ms rpida que la de la
GFP nativa, una formacin del cromforo mucho ms
rpida y una produccin de fluorescencia tambin ms
rpida y con mayor estabilidad, cuando el plegado se expresa a temperatura ambiente y a 37 C (Tsien, 1998).
La protena fluorescente azul BFP (del ingls, Blue
Fluorescent Protein) fue la primera variante creada y result de una mutacin del aminocido 66 Tyr por His
(Y66H). Presenta un pico de excitacin a los 384 nm y
de emisin a los 448 nm. Esta variante inicialmente report problemas con la velocidad de plegamiento y bajo
rendimiento cuntico (Sharner et al., 2007). Esta variante
tambin tiene versiones mejoradas, como EBFP (del ingls, enhanced BFP), con mayor brillo y fotoestabilidad,
obtenida por una mutacin de la Y145F (Tsien, 1998), y
SBFP2 (del ingls, strongly enhanced BFP), con aun mejor brillo y estabilidad que la EBFP, que, sin embargo,
permite monitorear las clulas vivas durante un tiempo
considerablemente mayor que el que ofrecen el resto de
las protenas (Shaner et al., 2007). Dentro de las ventajas
que presenta esta familia de FP azules est su utilidad
como marcadores dobles (Sharner et al., 2007).
La variante protena fluorescente azul-verde CFP (del
ingls, Cyan Fluorescent Protein) presenta un espectro
de emisin de fluorescencia entre los 470 y los 500 nm,
aproximadamente. Dentro de las mutaciones introducidas se encuentran N146I, M153T y V163A, como versiones mejoradas (ECFP), con un pico de excitacin a los
452 nm y de emisin a los 505nm, las cuales presentan

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altos niveles de brillo, fotoestabilidad y poca sensibilidad


a los cambio de pH, muy tiles para algunas estrategias
de microscopia de fluorescencia, como FRET (que explicaremos ms adelante) y marcajes dobles. (Tsien, 1998;
Sharnert et al., 2007).
La protena fluorescente amarilla YFP (del ingls, Yellow
Fluorescent Protein) fue diseada luego de dilucidar la
estructura cristalizada de la GFP, que revel que el residuo Thr 203 estaba cerca del cromforo (Ormo et al.,
1996). La mutacin de este residuo a Tyr otorg mayor
estabilidad al cromforo en su estado excitado, con un
pico a los 514 nm y un pico de emisin a los 527 nm
(Patterson et al., 1997). Sin embargo, la YFP presenta
sensibilidad a cambios de pH y a los haluros, por lo que
las versiones ms utilizadas de esas PF son la mCitrine,
mVenus, SYFP y YPet (en ingls,Yellow fluorescent protein for energy transfer; en espaol, Protena Fluorescente Amarilla para Transferencia de Energa), las cuales presentan ms brillo que YFP y mayor resistencia a
los ambientes cidos (Patterson et al., 1997).
Las variantes de la GFP no slo establecen cambios en
los espectros de emisin y absorcin (al proporcionar
distintos colores), o mejoras en la estructura del cromforo para darle mayor estabilidad a la protena, tambin
aportan otras caractersticas fsicas que permiten evaluar las actividades celulares, como sensibilidad al pH,
concentraciones de calcio, etc. (Miyawaki, 2003).
La GFP fotoactivable posee la particularidad que luego de una radiacin intensa a 413 nm, que le produce
apagamiento, incrementa su fluorescencia 100 veces
cuando es activada con luz a 488 nm y prolonga su estabilidad por das bajo condiciones aerbicas (Patterson
et al., 2002). Al estudiar algunas variantes, como indicadores no invasivos de pH intracelular, Kneen y colaboradores, en 1998, observaron, por medio de mediciones
con microscopios de fluorescencia acoplados a cmaras
CCD, que la GFP es sensible a cambios en la acidez del
medio en una unidad de pH, en aproximadamente el
50% de las clulas. Tambin observaron que la fluorescencia responde de forma reversible a cambios rpidos
de pH tanto in vivo como in vitro, lo que constituye la
nica ventaja de las mutaciones estudiadas (GFP-S65T;
Y66H; T203I; F64L). Comparada con otros indicadores
qumicos, la GFP fotoactivable tiene baja toxicidad para
la clula por su inercia qumica y por su procedimiento
no invasivo.
Segn estos autores, un indicador de pH fluorescente
ideal debe tener alta sensibilidad, una respuesta rpida
ante los cambios de pH y buenas propiedades pticas
(Kneen, et al., 1998). Tambin se conoce que la GFP

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FIGURA 4. Espectro de pHluorins ecliptico a pH mayores y menores de


6.0. Eje de las X, longitud de onda de excitacin. Eje de las Y, intensidad
de fluorescencia. Consultado en Enero del 2009, en World Wide Web:
http://www.bristol.ac.uk

nativa es poco sensible a los cambios de pH en el rango


cercano al fisiolgico (Ward, 1988, citado por Ashby et
al., 2004) y que no desarrolla fluorescencia en organelas
cidas como lisosomas, endosomas o el aparato de Golgi, si los valores de pKa son cercanos al 4,5 (Tsien, 1998).
Las versiones mutadas de EGFP presentan mejoras con
respecto al fotoblanqueado (disminucin hasta de un
50%), pero an insuficientes para aquellos estudios que
requieran mayor sensibilidad (Ashby et al., 2004)
El proceso de sensibilidad al pH por parte de la GFP fue
propuesto y probado a finales de 1997 por dos grupos
de investigadores (Kneen et al., 1998 y Palm et al., 1997,
citado por Ashby, 2004), los cuales propusieron que la
sensibilidad al pH es consecuencia de la protonacin
y desprotonacin de importantes residuos aminoacdicos en el centro del cromforo, el cual es crticamente
sensible y, en consecuencia, susceptible de emitir o no
fluorescencia, incluso al variar un protn, sobre todo en
condiciones acdicas (Ashby, 2004).
Nuevas mutaciones, con sensibilidad diferenciada al
pH, pueden ser utilizadas para medir los ambientes intracelulares, el trfico de protenas (tanto por compartimentos subcelulares como en el citosol) y las cercanas
de la membrana celular. De hecho, en el ao 1998, fueron creadas dos variantes de GFP, llamadas pHluorins
(Miensenbock et al., 1998). La primera, denominada
pHluorins radiomtrica, muestra cambios reversibles de
excitacin entre pH 7.5 y 5.5, y la otra, pHluorins eclptica, decrece su absorbancia cuando el pH disminuye y,
por debajo de 6.0, con el pico de excitacin a 475 nm, no
est presente y la protena pierde su fluorescencia, mientras que a pH 7,4 se observa el mximo de su fluorescencia (Miensenbock et al., 1998). La pHluorin eclptica est

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fusionada a un receptor N-terminal de glutamato que


le permite eliminar su fluorescencia al encontrarse con
un pH menor de 6.0 (dentro de vesculas intracelulares,
por ejemplo), mientras que si la protena se acerca a la
membrana celular, el pH aumenta y se observa una gran
fluorescencia (Miensenbock et al., 1998).

Aplicaciones de las Protenas Fluorescentes (FP)

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Son mltiples las aplicaciones de las FP en la ciencia.


Dentro de las ms comunes est su utilizacin como
marcador fusionado a polipptidos o como indicador
de estados qumicos-fisiolgicos intracelulares, en todo
tipo de clulas, subcompartimentos celulares y organismos, desde procariotas hasta mamferos. La FP tambin
es til a diversas disciplinas de la biologa y la medicina.
Esto se puede verificar simplemente mediante un buscador de artculos cientficos reconocido, en donde con
slo introducir GFP en la palabra clave, miles de publicaciones saldrn a la vista.
Si la FP es usada como marcador fusionada a otra protena, Tsien la clasifica como una aplicacin pasiva que slo
refleja los niveles de expresin de la protena diana o la
ubicacin subcelular de dicha protena. Se debe recordar
que la FP, al no ser una enzima, resulta un excelente
indicador porque no interfiere con el mecanismo fisiolgico de la clula (Tsien, 1998; Fernndez et al., 2006).
Si la FP es unida a otras protenas, en donde la fluorescencia depende de las condiciones del medio, se pueden
crear sensores capaces de monitorear procesos complejos intracelulares, como actividad y visualizacin de las
seales en cascadas, cambios de pH, calcio, voltaje, potasio, dinmica de segundos mensajeros, activacin enzimtica, interaccin protena-protena y cambios conformacionales, por lo cual, entonces, seran clasificados
como indicadores activos (Tsien, 1998; Miyawaki, 2003;
Zaccolo, 2004).
Aplicaciones ms avanzadas son posibles si se unen las
propiedades de las FP a otras tcnicas, como las de microscopia de fluorescencia para los estudios en clulas
vivas. Estas tcnicas confieren acertadas ventajas sobre
los estudios en tejidos fijados, en los que no se aprecia la
dinmica del sistema que se desea estudiar.

Aplicaciones de las FP en la microscopia


de fluorescencia
De todas las aplicaciones mencionadas, la ms frecuentemente utilizada es la de sensor bioqumico, que muestra la transferencia de energa por resonancia entre dos

protenas. Esta capacidad se ha denominado Transferencia de energa de resonancia fluorescente (del ingls,
Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET. Zaccolo, 2004). El FRET es un fenmeno mecnico cuntico
que ocurre cuando existe transferencia de energa entre
dos fluorforos prximos, generalmente a distancias
menores de 100 , y el espectro de emisin de uno, el
fluorforo donador, se superpone con la emisin del
segundo, que acta como receptor. De esta manera, la
excitacin del donador produce la emisin del receptor
con la transferencia de energa (Tsien, 1998), y la fluorescencia del donador (molcula excitada) disminuye,
mientras que la del receptor aumenta (Takanishi et al.,
2006). Otros autores proponen que la distancia para que
se produzca la transferencia de energa puede variar entre 2 a 6 nm, si los dos cromforos estn adecuadamente
orientados en el espacio con una eficiencia mayor al 30%
(Zaccolo, 2004).
La eficiencia de esta tcnica del FRET va a depender de
la diferencia de energa entre los fluorforos donante y
receptor, lo que implica que la velocidad de la transferencia de energa es proporcional al solapamiento entre el
espectro de emisin del donante y el espectro de absorcin del receptor (Fernandez et al., 2006). Al medirlo, la
eficiencia de la transferencia de energa es inversamente
proporcional a la sexta potencia de la distancia entre los
dos fluorforos (Takanishi et al., 2006).
Los primeros pares de fluorforos usados para estudiar
la transferencia de energa entre protenas pertenecen a
las familias de las GFP y a las de BFP; sin embargo, las
BFP tienen poca duracin ya que presentan blanqueamiento (Zaccolo, 2004). Actualmente, la pareja que presenta mayores ventajas para este tipo de anlisis son las
mutantes de las familias de las CFP y las YFP, mucho
ms estables que las BFP (Heim et al., 1994).
La fuerte dependencia con la distancia y la ventaja que
presenta el poder utilizar el sistema de medicin en organismos in vivo y en tiempo real han hecho de FRET
una herramienta muy til en estudios biolgicos de
proximidad molecular y de cambios conformacionales
(Takanishi et al., 2006). Tambin ofrece una alta resolucin temporal y espacial en el seguimiento de la interaccin protena-protena, en cualquier lugar de la clula,
y la cuantificacin del grado de disociacin o de asociacin in situ (Tsien, 1998). Entre las desventajas, podemos
mencionar la necesidad de la correcta orientacin espacial de los fluorforos para que sea eficiente la transferencia de energa, y la necesidad de controles positivos y
negativos (Tsien, 1998).
Para cuantificar FRET se han descrito varias estrategias.

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Una de ellas consiste en la medicin de la disminucin


de la fluorescencia del donante respecto al aumento de
la fluorescencia del receptor (con mediciones basadas
en el aumento de la emisin del donante si se destruye el aceptor; por ejemplo, por fotoblanqueamiento). Tal
cuantificacin permite determinar la eficiencia absoluta
de FRET, mtodo que se conoce como acceptor photobleaching. Otra estrategia contempla la medicin de
la separacin espectral de las imgenes del donante de
energa (en el caso de CFP) y la de la emisin del aceptor
(en el caso de YFP), mediante algoritmos establecidos
por la contribucin de cada protena en los dos canales
de deteccin (emisin y recepcin); a este mtodo se le
conoce como emisin sensibilizada (Fernndez et al.,
2006).
La cantidad de fluorescencia que emite el donador y la
velocidad con la que las protenas se unen y se separan
(reaccin que generalmente es muy rpida) tambin
pueden ser medidas por medio de la microscopia. La
tcnica FLIM (por las siglas en ingls, Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) permite saber la vida media
de la fluorescencia de un cromforo. (Bastiaens, 2006).
La imagen microscpica es capaz, entre otras cosas, de
evaluar FRET en tiempo real, al medir la intensidad de
la fluorescencia que la seal emite y estudiar las reacciones bioqumicas que ocurren en una localizacin particular dentro de una clula (Bastiaens et al., 1999).
Otro conjunto de tcnicas avanzadas, que unidas a las
FPs presentan mltiples aplicaciones, son las tcnicas
de fotoblanqueado. El fotoblanqueamiento es una alteracin fotoinducida que destruye la fluorescencia de un
cromforo (Snapp, 2003). Estas tcnicas difieren por el
tamao de la regin a blanquear, el nmero de eventos blanqueadores y la forma de analizar la fluorescencia. Las tcnicas de blanqueamiento ms comunes son
FRAP, FLIP e iFRAP (Goldman et al., 2004)
FRAP es una tcnica que permite la recuperacin de la
fluorescencia despus del fotoblanqueamiento (FRAP,
del ingls Fluorescence Recovery After Photobleaching).
Cuando se aplica un rayo lser de alta intensidad sobre
cierta zona celular, que presenta una protena unida a
una FP, la fluorescencia desaparece de la zona y es necesario recurrir a la microscopia confocal para seguir el
movimiento de las molculas no blanqueadas hacia la
zona blanqueada. Con el uso de una luz de menor intensidad como la que provee el microscopio, es posible
observar la recuperacin paulatina de la fluorescencia,
que se haba perdido debido a la migracin lateral de los
fluorforos no blanqueados (Snapp et al., 2003).
Dependiendo de lo que se desee estudiar, se utilizarn

julio- diciembre 2009

mtodos cuantitativos o cualitativos de FRAP. Si se desea determinar el coeficiente de difusin de la protena, la cantidad de movimiento aleatorio de la molculas
no blanqueadas, la capacidad de recuperacin molecular en una fraccin determinada o la viscosidad del
microambiente en donde est la protena se utilizan los
mtodos cuantitativos de FRAP; pero si lo que se desea
observar es el proceso de difusin de la protena en una
nica clula, o si la protena de inters es parte de un
gran complejo proteico, se utilizan los mtodos cualitativos, que requieren imgenes de alta calidad. (Snapp et
al., 2003)
La tcnica del FLIP (del ingls, Fluorescence Loss In
Photobleaching) est estrechamente relacionada con el
FRAP, con la diferencia que FLIP sigue la ruta del fluorforo fotoblanqueado, mientras que el FRAP sigue la
recuperacin de la fluorescencia en la regin fotoblanqueada. Esta tcnica puede ser utilizada para examinar
el movimiento o difusin de molculas dentro de las
clulas o membranas. Tpicamente, una membrana celular est marcada con un marcador fluorescente (puede ser expresin de una protena de fusin con GFP),
y un rea especfica de la membrana es fotoblanqueada con el lser del microscopio confocal. La intensidad
de la fluorescencia de esa regin se mide a lo largo del
tiempo. Ocurre un movimiento de molculas fluorescentes dentro del rea fotoblanqueada, la cual restaura
lentamente la fluorescencia en dicha rea mientras se
extingue la fluorescencia en otras regiones. En estas ltimas regiones se calcula la prdida de fluorescencia a
lo largo del tiempo, a travs de la medicin de la intensidad de fluorescencia (Lippincott-Schwartz et al., 2001).
Esta tcnica revela principalmente las conexiones entre
diferentes regiones y compartimentos celulares y el estudio de flujo proteico entre ellos (Snapp, 2003). Para los
anlisis con FLIP es necesario obtener imgenes antes
e inmediatamente despus del primer blanqueado, y as
sucesivamente con los blanqueados posteriores, hasta
que desaparece la fluorescencia (Snapp et al., 2003).
Por ltimo, en iFRAP (FRAP inversa) toda la regin de
fluorescencia, por lo general toda la clula, excepto la
zona de inters, es blanqueada. En las imgenes postblanqueamiento se mide la disminucin de la fluorescencia de la regin no blanqueada (Goldman et al.,
2004).

90

ALICIA Y. FRANCO Y MARINS LONGART.

Expresin de protenas fluorescentes


en el sistema nervioso

90

91

Desde hace ms de un siglo, el estudio del sistema nervioso ha atrado a un gran nmero de investigadores
ansiosos de dilucidar su arquitectura y dinmica, para
lo cual se hizo necesario poder visualizar la disposicin
de las neuronas. Hasta finales del siglo XIX no existan
tcnicas que lo permitieran. Golgi plante entonces la
tcnica reazione nera (reaccin negra), que permiti
observar por primera vez una preparacin histolgica del Sistema Nervioso al teir varias clulas a la vez.
Luego, Santiago Ramn y Cajal, al utilizar esta tcnica
y otras que desarroll en sus estudios, dilucid la teora
de la conexin nerviosa y descubri que la neurona es la
unidad anatmico-funcional del sistema nervioso, teora
que an es vlida en nuestros das. Otras tcnicas que
desarroll fueron la tincin de las clulas del sistema
nervioso con azul de metileno y con plata, que tuvo mayor acogida que la realizada con azul. (Cajal, 1907 citado
por Jones, 2007).
Aunque estas tcnicas de tincin fueron muy tiles, la
informacin obtenida resultaba bastante limitada. Con
la llegada de las FP, algunos investigadores comenzaron
a marcar neuronas de diversas formas, con el fin de estudiar la arquitectura del SNC con ms detalle, e incluso
lograron obtener imgenes de clulas in vivo (Niel et al.,
2004). Dentro de las estrategias de marcado, se encuentran aquellas que involucran la expresin permanente
de protenas fluorescentes en mamferos, con la construccin de animales quimricos. Entre los mamferos,
el ratn es el que se ha usado de manera ms extensiva
como modelo experimental, debido a que sus genes son
homologables a los de los humanos, y porque los ratones representan un organismo nico como modelo para
el estudio de la organognesis, inmunologa, neurobiologa y reproduccin (Branda et al., 2004).
En el ao 2000, un grupo de investigadores (entre ellos
Feng, Mellor, Berstein, entre otros) logr marcar selectivamente, con varias protenas fluorescentes, neuronas
en el ratn. Posteriormente, generaron ratones transgnicos que expresaban GFP, RFP, YFP y CFP, y con ello
alcanzaron a etiquetar la totalidad de la morfologa de
algunas neuronas, como los axones, y de las terminaciones nerviosas, dendritas y espinas dendrticas. Estos
investigadores lograron que cada una de las variantes
de las FP mencionadas se expresara en neuronas in vivo
y demostraron que la expresin de todas estas protenas fluorescentes no afecta la funcin de la neurona ni
presenta toxicidad en las estructuras sinpticas. Consi-

FIGURA 5. Uniones Neuromusculares en ratones transgnicos que


expresan diversas PFs. a) Expresando thy1-YFP, b) Expresando thy1-GFP,
c) Expresando thy1-CFP y d) Expresando thy1-RFP. (Tomado de Feng et
al., 2000).

guieron, adems, crear un ratn doble transgnico que


expresaba dos PF simultneamente (YFP y CFP o GFP y
RFP) (Feng et al., 2000).
Los ratones transgnicos fueron generados por DNA purificado del complejo Thy 1, asociado a cada variante de
la FP (especficamente EGFP, EYFP, ECFP y DsRed1 de
clontech), dentro de oocitos fertilizados. Para seleccionar los ratones positivos visualizaron las uniones musculares in vivo y con estos ratones positivos estabilizaron
la lnea de animales transgnicos (Feng et al., 2000). El
gen thy1 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y codifica una glicoprotena de la superficie celular, que se expresa en varios tipos celulares
que incluyen fibroblastos, clulas de cncer de ovario,
clulas endoteliales, clulas hematopoyticas, linfocitos
T y neuronas (Rege y Hagood, 2006; Lewis, 2008).
Feng y colaboradores (2000) lograron expresar las FP
en uniones neuromusculares (mostradas en la figura 5) y probaron la no toxicidad de las protenas GFP,
YFP y CFP en sus experimentos. La RFP mostr menor porcentaje de efectividad en la produccin de ratones transgnicos (14% vs 84% de las otras tres FP).
El marcaje con dos colores en neuronas fue posible en
un mismo ratn al cruzar thy1-CFP con thy1-YFP o
thy1-GFP con thy1-RFP. Los colores muestran algunas
zonas del sistema nervioso perifrico (SNP) y central
(SNC), en donde las neuronas expresan las FP en pares
(figura 6).
La desventaja de la aplicacin del marcaje con dos colores fue que en algunas zonas del sistema nervioso que
debieron colorearse y mostrar la actividad de la zona no
lo hicieron. Aunque lograron marcar selectivamente
neuronas, estos marcajes no se expresaron en todo el
sistema nervioso (Feng et al., 2000).
En un estudio realizado en el 2005, que utiliz mtodos

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julio- diciembre 2009

FIGURA 6. Doble marcaje de PF en un mismo ratn transgnico. Izq.: Neuronas del ganglio espinal dorsal (SNP) provenientes del cruce entre ratones thy1-GFP y thy1-RFP. Centro: Neuronas del ganglio espinal dorsal (SNP) que expresan thy1-CFP con thy1-YFP. Der.: Neuronas de la corteza (SNC)
provenientes del cruce entre ratones thy1-GFP y thy1-RFP (Tomado de Feng et al., 2000).

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DNA para catalizar su recombinacin. La tcnica tiene la


particularidad de que la expresin de Cre est controlada
por un promotor especfico de la clula diana. Slo en el
momento y en el lugar donde el promotor est activo,
la enzima Cre tambin lo estar. (Lodish et al., 2005).
Los resultados de la investigacin se muestran en la
figura 7.
Basados en las investigaciones hasta ahora comentadas, cientficos de la Universidad de Harvard, a finales
de 2007, lograron obtener imgenes sin precedentes al
marcar diferencialmente neuronas hasta con 90 colores,
con una tcnica a la cual denominaron Brainbow (Livet
et al., 2007). Brainbow (juego de palabras que combina
brain, cerebro, y rainbow, arco iris) es un transgn creado con mtodos de clonacin estndar que usan XFPs y
el sistema de recombinacin Cre/lox. Las XFP son polipptidos compuestos por 3 o ms FP, entre las cuales se
encuentran las EGFP, EYFP, CFP y otras FP derivadas
del coral Discosoma sp. (Livet et al., 2007). Estos autores
tambin usaron recombinacin aleatoria por medio de
sitios Lox (loxN, loxp y lox2272) e incorporaron secuencias de algunas FP, ya mencionadas, con lo cual slo una

genticos de mosaico, Zong y otros colaboradores generaron y marcaron, por recombinacin de cromosomas
homlogos de clulas somticas de ratn, a las clulas
progenitoras de los grnulos cerebelares de la capa molecular de la corteza cerebelar. Con una, dos y hasta tres
protenas fluorescentes lograron marcar diferencialmente parte del sistema nervioso de los ratones genticamente modificados. Estos investigadores modificaron
un sistema de gen knockout condicional al utilizar la
estrategia Cre loxP (Zong et al., 2005). A esta modificacin metodolgica la denominaron MADM (Anlisis de
mosaico con marcadores doble) y bsicamente consisti en introducir dos genes quimricos, cada uno conteniendo el extremo N terminal de un marcador (GFP,
color verde) y el C Terminal del otro marcador (ds Red,
rojo), interrumpidos por un intrn conteniendo el sitio
loxP. De esta manera es posible obtener los dos colores
en las neuronas de los ratones.
La estrategia Cre-loxP, que permite inactivar genes diana en tipos especficos de clulas somticas, o en momentos particulares de su desarrollo, consiste en la aplicacin de la enzima llamada Cre en sitios especficos del

FIGURA 7. Izquierda. Corte sagital de cerebro de ratn adulto que muestra la expresin de la GFP uniforme (1mm). Centro. Corteza cerebral de ratn
adulto que muestra distincin entre neuronas verdes, rojas y con el doble coloreado (50 m). Derecha. Grupo de clulas de los grnulos cerebelares que
expresan la GFP y la RFP, pero no su combinacin (100 m). (Tomado de Zong et al., 2005)

ALICIA Y. FRANCO Y MARINS LONGART.

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93

Conclusiones y Perspectivas

de las protenas poda expresarse. Construyeron 4 tipos


de constructos que denominaron Brainbow 1.0; 1.1; 2.0;
y 2.1. Por ejemplo, Brainbow 1.0 posee EGFP, EYFP
y M-CFP, los cuales, al expresarse en cada clula, permite slo uno de los eventos. Incorporaron tambin al
constructo el gen Cre, que invierte el segmento de ADN
independientemente en cada clula, y cuando este gen
es usado, se obtienen mltiples expresiones de las XFP
(Livet et al., 2007).
Inicialmente, para probar sus constructos, utilizaron clulas HeK 293 y luego transfectaron estos mismos transgenes en neuronas (Figura 9) y en glias (Fig. 10). Estos
autores probaron que Brainbow es una tcnica muy promisoria con mltiples ventajas, no slo en el trazado de
mapas entre conexiones neurales, sino tambin con las
glias y con las clulas postsinpticas musculares (Livet
et al., 2007).

FIGURA 8. Brainbow 1.0 aplicado a clulas Hek 293 donde se muestra


la expresin de las XFP bajo efectos de Cre. Tomado y modificado de
Levit et al., 2007.

FIGURA 9. Se muestran a la izquierda fibras musgosas del hipocampo


que expresan Brainbow 1.1. A la derecha, el giro dentado del hipocampo
que expresa Brainbow 1.1. Tomado de Levit et al., 2007.

!
FIGURA 10. Expresin de Brainbow 1.1 en astrocitos.

Tomado de Levit et al., 2007.

- Para expresar GFP no es necesaria la accin de cofactores de la medusa A. victoria. Con tan slo oxgeno (necesario para sintetizar el cromforo) se puede expresar
esta protena en cualquier organismo eucarionte o procarionte.
- La GFP est formada por 238 aminocidos y posee un
cromforo constituido por 3 residuos aminoacdicos. Su
estructura cuaternaria es de barril b.
- Se crearon variantes (modificadas por unos pocos aminocidos) que logran expresar longitud de ondas diferentes y que proporcionan as varios tonos de fluorescencia y caractersticas en su intensidad (fotoactivable)
y sensibilidad al pH (pHluorins).
- Una de sus grandes ventajas es que la GFP no presenta toxicidad para la clula y permite su observacin con
una mnima alteracin del sistema in vivo.
- Aplicado a la microscopa de fluorescencia, la GFP y
sus variantes pueden ser utilizadas en tcnicas como
FRET, FRAP, FLIM y FLIP.
- En su aplicacin a estudios en el Sistema Nervioso, tcnicas como Brainbow pueden utilizarse para descifrar el
diagrama de conexiones del sistema nervioso, no slo en
personas sanas, sino tambin en enfermas, pues es til
para observar los cambios anatmicos y fisiolgicos que
sufre el cerebro en estados de enfermedad.
Sin duda, las PF tienen un amplio futuro como indicadores lumnicos que permiten aplicar sus potenciales
fotoqumicos a la biologa celular, estructural, medicina, diagnstico, embriologa, biotecnologa, botnica y
muchas otras reas de la ciencia. A pesar de que son
muchos los investigadores que estudian y utilizan estas
protenas actualmente, podramos afirmar, sin temor a
equivocarnos, que son muchas las aplicaciones que an
no se han descubierto, pero que en un futuro prximo
nos sorprendern.

RET. Revista de Estudios Transdisciplinarios Vol. 1. N 2. Serie verde | Caracas,

julio- diciembre 2009

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(*)Autor para la correspondencia:


Marins Longart,
Unidad de Biociencias y Medicina Molecular,
Instituto de Estudios Avanzados IDEA,
Baruta, Miranda,
Repblica Bolvariana de Venezuela
mlongart@idea.gob.ve

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Anexo 1
TABLA I. Se muestra la clasificacin por familias de las variantes derivadas de GFP de Aequorea Victoria. Tomado y modificado de Tsien 1998
y Sharnet et al., 2007.

Nombre
comn

Segn la
Color de
Pico de
Pico de
estructura fluorescencia excitacin
emisin
del
en el
(nm)
(nm)
cromforo
espectro
GFP nativa Clase I:
Verde
Presenta 2 508 / 503
Equilibrio
picos
fenol395-397/
fenolato
475

EGFP

Verde

488

507-509

clase III:
Verde
Fenol en el
cromforo

399

511

EYFP /
Topaz

Clase IV:
Fenolato
en sistema
electrnico
! apilado

amarillo

508-512

518-529

ECFP

Clase V:
Indol en el
cromforo

Turquesa
(Cyan)

434-452

476-505

380-384

440-448

H9

Clase II:
Cromforo
fenolato

BFP /EBFP Clase VI:


Azul
Imidazol en
el
cromforo

Ventajas / Desventajas

Aunque requiere uso de filtro, la excitacin


con UV es conveniente porque es
invisible; sin embargo, hay que tomar en
cuenta que la autofluorescencia y la
posibilidad de fotodegradacin de los
tejidos son ms severas con excitacin
por UV.
La oxidacin del fluorforo es cuatro veces
ms rpida que en la protena salvaje. Es
estable cuando se expresa a temperatura
ambiente y el plegado fue mejorado a 37
C, pero tiende a plegarse mal y producir
agregados
no
fluorescentes
a
temperaturas mayores
Estas mutantes poseen la ventaja de ser
fotoqumicamente ms simples, carecen
del pico de excitacin a 479-490 nm, por
lo que pueden emplearse junto con las
GFP clase II para un doble marcaje.
Algunas de estas mutantes exhiben un
decaimiento en el rendimiento cuntico
con prdidas de fluorescencia superiores
al 90%, por cortos perodos de vida. Otras
versiones provenientes de PF de coral han
sido mejoradas.
Muy tiles para FRET y marcajes dobles.
Una versin mejorada mTFP1 introduce
una variante monomrica a esta familia
con alto brillo y fotoestabilidad, pero esta
mutacin no es derivada de Aequorea
victoria.
Son tiles para marcajes dobles. A pesar
de que mediante mutaciones se ha
mejorado su velocidad de plegamiento, las
BFP tenan bajo rendimiento cuntico,
pero
nuevas
versiones
han
sido
mejoradas (SBFP2).

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