Facultad de Qumica

C/Profesor garca Gonzlez, 1

41071 Sevilla
Spain
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PRCTICAS DE BIOQUMICA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA VEGETAL
Y BIOLOGIA MOLECULAR

PRCTICA 1. 3. ELECTROFORESIS ANALTICA DE PROTENAS EN GEL DE

POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
Protocolo de Laemli, UK (1970) Nature 227: 680-685
Soluciones para la electroforesis:
A.

B.

C.
D.
E.
F.
G.

H.

I.

30 % (p/v) acrilamida
0,45 % (p/v) bisacrilamida (para el gel separador)
Disolver en agua, filtrar y almacenar en fro protegida de la luz.
25 % (p/v) acrilamida
2,5 % (p/v) bisacrilamida (para el gel empaquetador)
Preparar igual que A.
Tris-HCl 1,875 M, pH 8,8 (22,7 g/ 100 ml)
Tris-HCl 0,6 M, pH 6,8 (3,63 g / 50 ml)
10 % (p/v) SDS
10 % (p/v) persulfato amnico (AMPS) en agua, recin preparado.
Tampn de electroforesis: Para 4 l (pH 8,3)
4,0 g SDS
12,12 g Trizma base
57,6 g glicina
5 x tampn de muestras
1 g SDS
5 g sacarosa
5 ml Tris-HCl 0,6 M, pH 6,8
1 ml azul de bromofenol (2,5 mg/ml)
Completar con agua destilada hasta 9 ml y dividir en alcuotas de 0,45 ml para congelar.
Antes de usar descongelar y aadir 50 l -mercaptoetnol
TEMED (solucin comercial)

Procedimiento de la electroforesis
1. Preparar las placas limpindolas previamente con etanol.
2. Preparar y aplicar un gel sellante en la base de las placas, como precaucin para evitar derrames:
Solucin A: ................... 2 ml
Solucin F:.................... 50 l
TEMED.........................
6 l

3. Preparar el gel separador al 12 % de acrilamida en un vasito de precipitado:

Solucin A ..................... 12 ml
Solucin C...................... 6 ml
Agua destilada................ 11,6 ml
Solucin E ..................... 0,3 ml
TEMED.......................... 18 l
Solucin F...................... 0,15 ml
Rellenar con esta disolucin el contenido entre las placas hasta aproximadamente 4 cm del extremo
superior.
Cubrir con una finacapa de 2-butanol y esperar la polimerizacin durante al menos 30 min*.
Eliminar el butanol y lavar con agua destilada varias veces la parte superior, dejando escurrir tras el
ltimo lavado.
4. Preparar el gel empaquetador ("stacking gel")
Solucin B ....................... 1,7 ml
Solucin D........................ 1,0 ml
Agua destilada.................. 7,2 ml
Solucin E........................ 0,1 ml
TEMED............................ 10 l
Solucin F........................ 50 l
Aplicar entre las placas hasta prcticamente el extremo superior.
Introducir el peine para las muestras inmediatamente procurando evitar burbujas.
Dejar polimerizar al menos durante 30 min*.
Retirar el paine y lavar exhaustivamente con agua destilada, cubriendo finalmente con tampn de
electroforesis.
5. Tratamiento de muestras y patrones:
a) Preparar las muestras conteniendo:
120 l de extractos crudos + 30 l de 5 x tampn de muestras
40 l (10 g) de protenas purificadas + 10 l 5x tampn de muestras (H)
10 l stock 10 Bio-Rad (20 g) + 30 l tampn extraccin + 5xtampn de muestras (H)
.
(Nunca sobrepasar un volumen final de muestra de 150 l).
b) Hervir durante 5 min
c) Centrifugar si hubiese precipitados antes de cargar a la electroforesis.
6. Aplicar las muestras y patrones y correr la electroforesis; primero a 50 mA hasta que toda la protena ha
penetrado en los geles, y despus al mnimo de corriente (10 mA para dos placas) toda la noche hasta
que el azul de bromofenol alcance el fondo del gel.
7. Tincin de las protenas en el gel:
a) Sumergir el gel durante 30 min en una solucin de azul de Coomassie R-250 al 0,1 % (p/v), disuelto
en 10 % (v/v) de actico y 45 % (v/v) metanol, con agitacin suave.
b) Desteir en 10 % de actico y 25 % de etanol (v/v), con agitacin suave, haciendo varios cambios de
lquido.
8. Observar las bandas de protena, comparando las diferentes muestras entre s, especialmente los extractos
crudos con las preparaciones de protena purificada. Tratar de identificar las protenas ms abundantes
en cada extracto, y las cadenas polipeptdicas que se expresan diferencialmente en los extractos de hojas
y races, por un lado, y hojas y tallos, por otro. Estimar el peso molecular de la protena purificada as
como de la banda ms abundante del extracto crudo mediante el clculo de sus respectivos Rf , y la

interpolacin del mismo en la representacin grfica del logaritmo del peso molecular de las bandas
correspondientes a las protenas patrones respecto a sus respectivos Rf :

Banda
Miosina
-galactosidasa
Fosforilasa b
Seroalbmina(BSA)
Ovalbmina
Anhidrasa carbnica
Inhibidor de tripsina
Lisozima
Aprotinina
Azul de bromofenol
Protena purificada
Protena ms
abundante extractos
Otras protenas de
expresin diferente
en hojas, races y
tallos

Mr
200.000
116.250
97.400
66.200
45.000
31.000
21.500
14.400
6.500
-

log Mr

(cm)

Rf = / 0

Preparacin de los extractos proteicos y determinacin de la concentracin de protena presente

Mientras las distintas fases del gel polimerizan, se aprovechar para preparar los extractos crudos que sern
utilizados como muestras de la siguiente forma:
1. Tomar una muestra vegetal de aproximadamente 0,25 g (hojas), 0,5 g (tallos), 1,0 g (races) de la planta
Lotus japonicus; y colocarla en un mortero de porcelana.
2. Aadir al mortero una pequea cantidad de nitrgeno lquido y triturar en presencia de nitrgeno lquido
hasta convertir la muestra en un polvo fino.
3. Aadir 1 ml de tampn de extraccin fro (50 mM Tris-HCl, pH 7,5 + 0,5 mM EDTA + 14 mM mercaptoetanol) y transferir el homogenado a un tubo eppendorf. Lavar el mortero con 0,5 ml de
tampn de extraccin fro y juntar en el tubo anterior.
4. Centrifugar la muestra durante 15 min a mxima velocidad, para obtener los sobrenadantres (extractos
crudos), que se mantienen en hielo.
5. Determinacin de la cantidad de protena presente en ambos extractos por el mtodo de Bradford:
a) Dilur una alcuota de cada extracto:
para hojas y tallos 20 veces(100 l en 2 ml de agua)
para races 10 veces (100 l en 1 ml de agua)

b) Preparar tubos para las muestras, patrones y blancos de acuerdo con el siguiente esquema:

Agua destilada
Patrn Seroalbmina bovina
(BSA, 0,1 g/l)
extracto diludo 1:20
reactivo de Bradford

Blanco

Patrn 1

Patrn 2

Patrn 3

Patrn 4

Extracto
diludo

0,8 ml
-

0,78 ml
25 l

0,75 ml
50 l

0,72 ml
75 l

0,7 ml
100 l

0,7 ml
-

0,2 ml

0,2 ml

0,2 ml

0,2 ml

0,2 ml

100 l
0,2 ml

c) Determinar la absorbancia a 595 nm y calcular la concentracin de protena de la muestra

interpolando en la recta calibrado de la protena patrn.
Patrn 1
A595

Patrn 2

Patrn 3

Patrn 4

Extracto