Diagnostico Laboratorial Coagulopatias Hereditarias Plaquetopatias PDF

MINISTRIO DA SADE
Manual de diagnstico
laboratorial das Coagulopatias
Hereditrias e Plaquetopatias
Braslia DF
2012
MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Ateno Sade
CoordenaoGeral de Sangue e Hemoderivados
Manual de diagnstico
laboratorial das Coagulopatias
Hereditrias e Plaquetopatias
Srie A. Normas e Manuais Tcnicos
Braslia DF
2012
2012 Ministrio da Sade.

Todos
os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a
fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de
textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser
acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade: http://www.saude.gov.br/bvs
Tiragem: 1 edio 2012 2.000 exemplares
Elaborao, distribuio e informaes
MINISTRIO DA SADE
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Departamento de Ateno Especializada
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Coordenao
Guilherme Genovez
Elaborao
Ana Suely Leite Saraiva
Gisele Marlia Pianetti Sternick
Maria Emlia Santos
Silmara Aparecida Lima Montalvo
Tnia de Ftima G. Siegl Machado
Tnia Rbia Flores da Rocha
Reviso Tcnica
Suely Meireles Rezende
Joo Carlos Campos Guerra
Marinez Matos
Normalizao
Claudio Oliveira - Editora MS
Capa, projeto grfico e diagramao
Fabiano Bastos
Impresso no Brasil / Printed in Brazil
Ficha Catalogrfica
Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Ateno Sade. Departamento de Ateno Especializada.
Manual de diagnstico laboratorial das coagulopatias hereditrias e plaquetopatias / Ministrio
da Sade. Secretaria de Ateno Sade. Departamento de Ateno Especializada. CoordenaoGeral de Sangue e Hemoderivados. Braslia : Ministrio da Sade, 2012.
132 p. : il. (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos)
ISBN 978-85-334-1933-9
1. Hematologia. 2. Coagulopatias. 3. Plaquetas. I. Ttulo. II. Srie.
CDU 616.151
Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2012/0116
Ttulos para indexao:

Em ingls: Guideline of laboratory diagnosis in hereditary coagulopathies and platelets function disorders.
Em espanhol: Manual de diagnstico de laboratorio de coagulopatas hereditarias y plaquetopatias.
Sumrio
1 Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2 Condies mnimas para o funcionamento de um
laboratrio de hemostasia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3 Tcnica manual e equipamentos disponveis para os
testes de hemostasia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
4 Coleta de amostra para coagulao e suas variaes
pranalticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
5 Validao dos testes de coagulao e estabilizao
do intervalo normal de referncia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
5.1 O que validao? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
5.2 Porque validar? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
5.3 Determinao de um intervalo normal de referncia . . . . . . . 15
5.4 Caractersticas de desempenho de uma rotina validada . . . . . . 16
5.4.1 Verificar a exatido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
5.4.2 Determinar a preciso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
5.4.3 Determinar a sensibilidade dos fatores da coagulao . . . 17
6 Implantao dos controles de qualidade interno e externo
no Laboratrio de Hemostasia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
6.1 Controle de qualidade interno no Laboratrio de Hemostasia . . 20
6.1.1 Controle de qualidade na etapa pranaltica . . . . . . . . 20
6.1.2 Controle de qualidade na etapa analtica . . . . . . . . . . 23
6.1.3 Controle de qualidade na etapa psanaltica . . . . . . . . 26
6.2 Controle de qualidade externo no laboratrio de hemostasia . . . 26
7 Preparao e calibrao de Pool de plasma normal . . . . . . . . . 29

7.1 Coleta e preparao do pool . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
7.1.1 Preparo do pool para teste de inibidor de fator VIII pela
tcnica de Nijmegen Bethesda modificada . . . . . . . . 30
7.1.2 Calibrao do pool . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
8 Testes de triagem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
8.1 Tempo de protrombina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
8.1.1 Curva de calibrao para tempo de protrombina . . . . . . 34
8.1.2 Relao Normatizada Internacional (RNI) . . . . . . . . . . 35
8.2 Tempo de tromboplastina parcial ativada . . . . . . . . . . . . . . 35
8.3 Tempo de Trombina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
9 Diagnstico Laboratorial das coagulopatias hereditrias . . . . . . 41
9.1 Doena de von Willebrand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
9.1.1Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
9.1.2 Manifestaes Clnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
9.1.3Diagnstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
9.1.4 Testes laboratoriais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
9.1.5 Recomendaes para coleta e processamento
da amostra para os teste de diagnstico de
doena de von Willebrand . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
9.2Hemofilia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
9.2.1 Diagnstico laboratorial da hemofilia . . . . . . . . . . . . 76
9.3 Coagulopatias raras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
9.3.1 Deficincia de fator VII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
9.3.2 Deficincia de fator V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
9.3.3 Deficincia de fator X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
9.3.4 Deficincia de fator XI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
9.3.5 Deficincia de fator XII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
9.3.6 Deficincia de fator XIII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
9.3.7 Deficincia de fibrinognio (fator I) . . . . . . . . . . . . . 98
9.3.8 Deficincia de fator II (protrombina) . . . . . . . . . . . . 100
10Plaquetopatias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
10.1Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .103
10.2 Testes laboratoriais para a quantificao das plaquetas e
caracterizao de plaquetopenias hereditrias . . . . . . . . . .107
10.3 Plaquetopatias hereditrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
10.4 Plaquetopatias adquiridas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
10.5 Testes laboratoriais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
10.5.1 Testes de triagem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .112
10.5.2 Testes especficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .114
10.5.3 Testes especiais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
11Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
1 Introduo
O Manual de Diagnstico Laboratorial das Coagulopatias Hereditrias e
Plaquetopatias tem como objetivo principal abordar os principais aspectos
dos testes laboratoriais necessrios para o diagnstico das coagulopatias e
plaquetopatias. Desta forma, este manual poder auxiliar os profissionais
que atuam no laboratrio a realizar os testes de hemostasia com maior
desenvoltura, visando uma padronizao das tcnicas utilizadas atravs da
descrio de diretrizes bsicas para a investigao laboratorial adequada.
Este manual foi elaborado por um grupo de profissionais atuantes em labo
ratrio, que reuniram informaes relevantes e atualizadas sobre as tcnicas
e mtodos empregados em laboratrio de hemostasia. Sero abordados v
rios temas relacionados prtica laboratorial, tais como: mtodos, reagentes,
equipamentos, manuseio de amostras, anlise de qualidade e validao.
Este manual no deve ser utilizado como fonte de referncia nica sobre o
tema, ficando a cargo dos profissionais atuantes na rea a complementao
das informaes e a atualizao contnua com relao teoria e prtica
relacionadas ao diagnsticos das doenas citadas.
2 Condies mnimas para

o funcionamento de um
laboratrio de hemostasia
Diferentemente de inmeros procedimentos laboratoriais que passaram a
ser realizados exclusivamente em equipamentos semi e/ou totalmente au
tomatizados, os testes usuais de triagem e diagnstico das coagulopatias
continuam dispondo de mtodos manuais, que utilizam banhomaria a 37C
para sua realizao. O princpio destas tcnicas se baseia na deteco visual
da formao do cogulo de fibrina.
Nos anos setenta, foram introduzidos os aparelhos semiautomatizados,
com princpio de deteco fotomtrica ou mecnica da formao da fi
brina. Em seqncia, aparelhos totalmente automatizados e interfaceveis,
com sistemas de informao, foram desenvolvidos proporcionando maior
agilidade na liberao de resultados em laboratrios clnicos de grande porte.
Diante deste cenrio com vrias opes, ao planejar a criao de um labora
trio de hemostasia, tornase imperativo quantificar o nmero de amostras
a serem testadas, com vistas a realizar uma avaliao de custobenefcio
para a aquisio adequada do equipamento e dos insumos necessrios.
O Quadro 1lista alguns itens indispensveis para o funcionamento de um
Laboratrio de Hemostasia.
Quadro 1 Insumos bsicos necessrios ao funcionamento de um Laboratrio de
Hemostasia
Balana semianaltica
Banho Maria 37 C, com estante para tubos de hemlise
Centrfuga de bancada com capacidade mnima de rotao de 1700x g
Climatizador de ambiente (aparelho de ar condicionado ou split) em locais com
temperatura superior a 25C*.
Cronmetro
Freezer 18C a 20C e 60C a 80C
Geladeira
Continua
Continuao
Reagentes para determinao dos testes de triagem e de diagnstico de coagulao,

de acordo com o mtodo/principio dos testes
Negatoscpio ou outra fonte de luz para leitura da formao do cogulo
Papel monolog para grficos
Pipetas automticas com volumes em microlitros: 50l, 100l, 200l e 1000l
Ponteiras descartveis compatveis com as pipetas automticas
Termmetro
Tubos de hemlise de vidro siliconizado (Pyrex n 9820)
Tubos para coleta de amostra com Citrato de Sdio 3,2%
* Temperatura Ambiente ideal: 18a 25C.
Fonte: Santilli, Joo Cludio, 2006
O projeto arquitetnico da rea laboratorial deve observar s normas sani

trias e de segurana do trabalho.
Os laboratrios clnicos, de uma maneira geral, devem atender aos requisitos
das seguintes legislaes:
RDC n 50, de 21de fevereiro de 2002, referente s normas arqui
tetnicas;
RDC n 302, de 13de abril de 2005, referente ao regulamento tc
nico para funcionamento de Laboratrios Clnicos.
10
3 Tcnica manual e equipamentos

disponveis para os testes
de hemostasia
Embora existam muitos aparelhos automatizados disponveis para a reali
zao de testes em coagulao, a tcnica manual ainda muito utilizada
em laboratrios de hemostasia. Esta tcnica, alm de ser bastante didtica
para o aprendizado inicial dos mtodos em hemostasia, permite, ainda, a
comparao dos resultados obtidos com os aparelhos automatizados.
A utilizao de tubos de vidro siliconizado permite um melhor desempenho
da tcnica manual. O tamanho conveniente de 75x 10mm; diferentes tipos
de tubo podem ser utilizados, porm estas diferenas podem influenciar no
tempo de coagulao obtido, particularmente para testes de triagem como:
tempo parcial de tromboplastina ativada (TTPA). Se houver uma mudana
na tcnica ou nos reagentes utilizados, uma comparao dos resultados
dever ser realizada antes de dar continuidade rotina de exames. Diferen
as sistemticas entre a tcnica manual e automatizada pedem um novo
intervalo de normalidade.
Etapas importantes para manter a boa qualidade dos testes realizados
manualmente so:
os reagentes devero ser praquecidos a 37C por pelo menos
5minutos antes da realizao dos testes;
o plasmateste e os reagentes devero ser misturados rapidamente;
o cronmetro dever ser iniciado simultaneamente com a mistura
de reagentes e
a leitura dever ser realizada posicionando o tubo em um ngulo de
90C por trs vezes a cada 5segundos com constante observao
para o incio da formao de fibrina.
11
4 Coleta de amostra para coagulao

e suas variaes pranalticas
As variveis pranalticas se referem a todos os fatores que afetam a
qualidade da amostra antes do incio do teste. A observao das variveis
pranalticas nos testes de coagulao extremamente importante para
que se obtenha confiabilidade e qualidade em todos os resultados dos testes
de hemostasia.
Para a coleta de amostras de exames de coagulao, o paciente deve estar
em jejum mnimo de 4horas.
Recomendase que as amostras sejam coletadas atravs da utilizao de
seringa e/ou sistema a vcuo que permita uma coleta rpida, sempre em
tubos de vidro siliconizados ou tubos de poliestireno.
As amostras no resultantes de puno imediata devem ser descartadas,
pois o material colhido para realizao de testes de coagulao deve advir
de coleta no traumtica e o garroteamento no deve ultrapassar 1minuto.
Para a determinao da dosagem dos fatores VII, VIII e fator de von Wille
brand (FvW), as amostras devero permanecer em temperatura ambiente,
para evitar ativao da coagulao por baixa temperatura.
Na coleta com seringa, a agulha dever ser sempre retirada ao se transferir o
sangue para o tubo contendo o anticoagulante, para que no haja hemlise
da amostra, o que inviabiliza os resultados. A homogeneizao deve ser feita
atravs da inverso do tubo (5vezes), delicadamente, sendo esta medida
importante para impedir a hemlise. Coletas com seringa e sistemas a vcuo
no podero ser utilizados conjuntamente.
O tubo para coleta dever conter citrato de sdio (0,109mol/L) 3,2% tam
ponado. A soluo de citrato de sdio tamponada para prevenir aumento
no pH, o que pode afetar os resultados. Esta soluo poder ser estocada a
4C por trs meses, desde que seja sempre inspecionada para a verificao
de material particulado que pode significar contaminao.
13
A proporo sangue/anticoagulante deve ser exatamente de 9:1 (por

exemplo, 4,5ml de sangue para 0,5ml de citrato).
A concentrao de citrato de sdio dever ser ajustada em pacientes com
valores de hematcrito acima de 55%. Em amostras com hematcrito
elevado, a relao sangue/anticoagulante (9:1) no mantida, podendo
causar excesso de citrato para o volume de sangue presente no tubo. Isso
pode levar a uma falsa elevao do tempo de coagulao. Devese, por isto,
ajustar o volume de citrato atravs da frmula:
C= (1,85x 103) (100HCT) (V sangue)
Onde, C = Volume de citrato;
HCT = Hematcrito do paciente;
V = Volume de sangue adicionado (se o tubo for de 5mL, ento o volume
ser 4,5mL).
Para hematcritos abaixo de 30%, no h informaes disponveis que
sustente a recomendao especfica.
Coleta de amostras de acessos venosos perifricos, profundos ou implantados
(AVPPI) ou dispositivos: O sangue deve ser idealmente coletado diretamente
de uma veia perifrica, mas em algumas ocasies, principalmente em crian
as e pacientes idosos, pode ser necessrio coletar amostras de AVPPI. Nos
casos de acessos venosos totalmente implantados e salinizados, 2volumes
do espao intraluminal do dispositivo utilizado devem ser desprezados,
antes da coleta de amostras para testes de hemostasia. Quando se utilizar
outra forma de acesso venoso, primeiramente lavase o acesso infundindo
com soro fisiolgico a 0,9% e aps coletamse 6volumes de espao intraluminal, que so descartados antes da coleta das amostras.
14
5 Validao dos testes de

coagulao e estabilizao do
intervalo normal de referncia
5.1 O que validao?
A validao um processo documentado que demonstra que um
procedimento encontrase estvel e capaz de produzir informaes
prdeterminadas.
5.2 Porque validar?

A principal responsabilidade do profissional que atua no laboratrio
assegurar que as informaes e servios providos pelo mesmo atendam
as necessidades dos usurios. Para isso, ele deve atentar para informa
es de cunho cientfico geradas por instituies de reconhecida exceln
cia pela comunidade cientfica. Estas instituies regulam e padronizam
procedimentos no laboratrio, atualizandoos constantemente de acordo
com novos conhecimentos. Assim, para que o laboratrio mantenha um
bom nvel de excelncia, anlises peridicas devem ser realizadas atravs de
consultas na literatura atualizada.
Desta forma, fundamental que cada laboratrio planeje um programa de
validao que contemple as necessidades locais. Para orientar a implanta
o deste programa, algumas diretrizes precisam ser seguidas, tais como as
expostas nos prximos tpicos.
5.3 Determinao de um intervalo normal de referncia

A fim de adequar a interpretao dos resultados dos testes de hemostasia,
fundamental que se tenha informao sobre a populao normal (local). A
seleo de indivduos saudveis para determinao de valores normais ser
influenciada por consideraes prticas da rotina laboratorial local. Mais
15
frequentemente, doadores de sangue ou funcionrios da instituio podem

ser utilizados. A seguir, encontramse algumas consideraes importantes
para a determinao de um intervalo normal de referncia.
Um valor de referncia normal dever ser sempre estabelecido localmente;
literatura e informaes de bula devero ser usadas somente como um guia.
Para realizao do tempo de protrombina (TP) e do tempo parcial de trom
boplastina ativada (TTPA) possvel que um novo lote de reagente da mesma
empresa tenha uma faixa de normalidade diferente do anterior. O controle
de qualidade interno dever informar se houve alguma mudana, sendo
que algumas delas podero indicar a necessidade de um novo valor de
normalidade.
O nmero ideal de indivduos normais ideal para se estabelecer um valor
de normalidade de 120. Porm, pela dificuldade de se obter este nmero
de indivduos, os estatsticos recomendam uma populao de, no mnimo,
40indivduos.
Convencionalmente, o valor de referncia normal dever conter 95% dos
valores obtidos resultando em uma curva Gaussiana de distribuio normal.
Se esta distribuio for diferente, amostras adicionais devero ser includas.
Se a distribuio for normal, devese, ento, calcular a mdia e o desvio pa
dro dos valores normais e usar como faixa de normalidade o resultado de
2desvios padro para o limite inferior e superior.
5.4 Caractersticas de desempenho de uma rotina validada

5.4.1 Verificar a exatido
Exatido a concordncia entre a melhor estimativa de uma quantidade
e seu valor real. Assim, a inexatido expressa por uma diferena num
rica entre a mdia de um conjunto de medies em replicata e o valor
verdadeiro, estando, assim, associada ao erro sistemtico. A exatido um
dado importante para correlacionar o resultado obtido no laboratrio com
a clnica e obter uma investigao diagnstica adequada. Uma das formas
de se avaliar a exatido atravs da participao do laboratrio em um
16
programa de controle de qualidade externo, assunto que ser abordado com

mais detalhes no captulo 6.
5.4.2 Determinar a preciso

A preciso referese melhor concordncia encontrada em medidas
repetidas. Esta concordncia pode ser verificada atravs do desvio padro
ou coeficiente de variao, sendo que, quanto menor o desvio padro, maior
a preciso. Esta verificao permite tomada de decises imediatas na libe
rao ou no de um resultado.
5.4.3 Determinar a sensibilidade dos fatores da coagulao

Os testes de TP e TTPA so considerados testes de triagem da coagula
o. importante conhecer a sensibilidade destes testes na identificao
da deficincia de diferentes fatores da coagulao. Um teste com pouca
sensibilidade, ou seja, incapaz de identificar anormalidades pode gerar
resultados inadequados que prejudicam a investigao das coagulopatias.
A sensibilidade de um determinado reagente pode ser especfica para uso
em um determinado equipamento ou para uso combinado com outros
reagentes. Recomendase, assim, seguir alguns passos para esta verificao:
Preparar diluies que avaliam diferentes nveis de concentraes

do fator em estudo. Para isso, devese utilizar um plasma humano
padro com concentrao conhecida como amostra, e um reagente
de plasma deficiente no fator em questo, como diluente. Exemplo:
fazer diluies com concentraes de 100%, 50%, 40%, 30%, 20%,
10%, 5% e 2,5%;
Testar cada amostra em duplicata;
Fazer uma curva correlacionando o resultado de TTPA ou TP obtido

com a concentrao esperada;
Identificar em qual ponto est o seu intervalo de referncia para

o TTPA ou TP, que corresponder sensibilidade do seu reagente
(Grfico 1).
17
Grfico 1 Curva para deteco da sensibilidade de reagente

100
90
80
TTPA (segundos)
70
60
50
40
30
20
10
0
20
40
60
Atividade de fator VIII%
Abreviao: TTPA tempo de tromboplastina parcialmente ativado

Fonte: Montalvo, S. A. L., 2011
18
80
100
120
6 Implantao dos controles de

qualidade interno e externo no
Laboratrio de Hemostasia
O termo garantia da qualidade pode ser usado para descrever todos os
procedimentos que so realizados para assegurar a confiabilidade dos testes
e anlises do laboratrio. Isso inclui a escolha do teste, a coleta de uma
amostra, a obteno de um resultado de uma maneira correta, interpretao
do resultado, e, quando apropriado, a comunicao destes resultados para
o profissional requisitante.
O controle de qualidade interno (CQI) e externo (CQE) so componentes
distintos entre si, embora complementares, de um programa de qualidade. O
CQI usado para padronizar uma srie de tcnicas e processos em realizao
de acordo com um perodo de tempo. Assim, ele usado para garantir a
consistncia de resultados dia aps dia no laboratrio. O CQE utilizado para
identificar o grau de acordo entre os resultados de diferentes laboratrios.
Desta forma, o CQI prope avaliar a preciso dos resultados atravs da sua
reprodutibilidade e o CQE avalia a exatido deste mesmo resultado, uma vez,
que resultados precisos no so necessariamente corretos ou exatos. Para
isso, tornase necessrio que o laboratrio tenha procedimentos definidos
para esta avaliao, ou seja, no basta apenas usar controles normais e pa
tolgicos, mas estabelecer e padronizar programas consistentes de qualidade
(CQI e CQE) que avaliem de maneira constante e rotineira.
Outro item to importante quanto os j descritos a padronizao dos
processos envolvidos desde a solicitao mdica dos exames at a liberao
do resultado. Todas as atividades do laboratrio devem ser documentadas
atravs de instrues de trabalho ou procedimento operacionais padro
(POP), aprovadas e colocadas a disposio do corpo tcnico e de apoio.
Os POP so documentos que descrevem detalhadamente cada processo do
laboratrio.
Contudo, importante ressaltar que a implantao de um programa de
qualidade envolve a construo de uma srie de processos, cada um com fontes
19
potenciais de erro. Assim, recomendase considerar as seguintes etapas para sua

implantao: (1) Etapa pranaltica, (2) Etapa analtica e (3) Etapa psanaltica.
O programa depender de um fluxo de rotinas prprias de cada laboratrio
no havendo, assim, um protocolo pronto a seguir, ou seja, cada laboratrio
dever propor seu prprio programa de qualidade que contemple os CQI e
CQE. No entanto, existem algumas recomendaes que devem ser utilizados
como guia, para que o mesmo seja completo.
6.1 Controle de qualidade interno no

Laboratrio de Hemostasia
6.1.1 Controle de qualidade na etapa pranaltica
6.1.1.1 Coleta de amostras
O procedimento de coleta de amostra foi descrito no captulo 4. No entanto,
esto listados abaixo alguns exemplos de procedimentos para garantir boa
qualidade na coleta:
quando houver a necessidade de alterar o tubo de coleta quanto
ao material ou fabricante, necessrio que sejam conduzidos no
laboratrio estudos paralelos de validao;
a diferena ou variabilidade atribuda aos diferentes tubos ou
fabricantes pode no ser aparente para amostras com valores
dentro do intervalo de referncia, mas pode variar quando valores
prolongados so testados.
6.1.1.2 Transporte de amostras
Transporte de amostra em rotina laboratorial
O transporte de amostra de sangue total em gelo (28C) no recomendado
para a maioria dos testes de coagulao que utilizam plasma, devido
possibilidade de ativao dos fatores VII, VIII e FvW em baixas temperaturas,
alm de provocar ativao das plaquetas. Idealmente, o transporte e o
processamento das amostras no devem ultrapassar uma hora. muito
20
importante que o laboratrio tenha documentado, para cada amostra, a

data e horrio do envio e recebimento da amostra.
Transporte de amostra de plasma para outra instituio
As amostras devero ser centrifugadas, o plasma dever ser separado,
acondicionado e enviado em gelo seco. As amostras devero chegar ao local
de destino ainda congeladas.
O procedimento de envio de amostra biolgica por via area dever respeitar
as normas vigentes no pas. Vale lembrar que estas normas sofrem revises
anuais e os procedimentos devem ser observadas antes do envio.
De acordo com o manual IATA (International Air Transport Association)
DGR (Dangerous Goods Regulations), as substncias (amostras e gelo seco)
so consideradas produtos perigosos e seus embarques devem estar de
acordo com as regulamentaes federais.
O embarcador o responsvel legal e deve assegurar que as substncias
esto apropriadamente identificadas, classificadas, marcadas, etiquetadas,
documentadas e em condies para o transporte em conformidade com
as regulamentaes. Ainda, devese comprovar que os produtos perigosos
esto embalados em conformidade com todos os requerimentos aplicveis
ao transporte areo.
Preparo da embalagem
Forrar o fundo da caixa de isopor com uma camada de gelo seco

de aproximadamente 5cm;
Posicionar sobre esta camada de gelo seco os containeres (com
estantes) fechados contendo os tubos com as amostras congeladas
eqidistantes entre si e das paredes da caixa do isopor;
Importante: As condies de transporte areo (vibrao,
temperatura e presso) podem provocar um efeito em substncias
e embalagens que alteram o seu estado normal. Desta maneira, no
se deve adicionar gelo seco no container(com estante) das amostra
e lacrlo. Esta substncia libera gases que so perigosos quando
no houver local para ser extravasado podendo provocar exploses.
21
Cobrir os containers depois de lacrados com gelo seco, formando

uma nova camada de gelo seco de aproximadamente 5cm;
Preencher o restante do espao da caixa com gelo seco de tal forma
que no comprometa o fechamento da mesma;
Encaixar a tampa da caixa de isopor e selar;
Colocar na embalagem as informaes do remetente e destinatrio
Remetente. (Nome da instituio / Endereo completo / Nome da
pessoa responsvel pelo embarque e respectivo telefone)
Destinatrio. (Nome da instituio / Endereo completo / Nome da
pessoa responsvel pelo recebimento e respectivo telefone)
Aplicar uma tira de fita adesiva no centro da caixa de papelo e
uma em cada lateral;
Identificar a rea externa da caixa com a numerao adequada
disponvel para cada material transportado, de acordo com as es
pecificaes da IATA;
Entregar a embalagem preparada com os formulrios para a
empresa de transportes.
6.1.1.3 Processamento e estocagem de amostra de plasma

Quanto ao processamento da amostra de plasma, a centrifugao dever ser
realizada a temperatura ambiente. No entanto, algumas centrfugas podem
aumentar a temperatura interior no processo de centrifugao. Desta forma,
recomendase a utilizao de centrfugas com monitoramento de temperatura.
Quanto estocagem de amostras, de acordo com a Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI) algumas consideraes de tempo e temperatura
devem ser respeitadas (Quadro 2). No entanto, muitos laboratrios utilizam
freezers domsticos, que no so adequados para laboratrio, devido a sua
incapacidade em manter a temperatura a 20C aps a abertura da porta.
Assim, a Federao Mundial de Hemofilia recomenda o no armazenamento
de amostras de plasma a 20C devendo ser utilizado apenas freezers
<35C ou 70C.
22
Quadro 2 Tempo de estocagem de amostras para testes de coagulao

Estocagem de amostras para testes de coagulao
Estocagem com sangue total
Teste
TP
TTPA
TA 25C Refrigerado Congelado TA 25C Refrigerado

At
No
24horas
At
Desconhecido
4horas
TTPA para anlise

de Heparina no 1hora Desconhecido
fracionada
TTPA (para anlise
4horas
No
de FVIII e FvW)
Outros
Alquota de plasma e processamento
4horas Desconhecido
Freezer
20C
Freezer
70C
No
At
24horas
No
2Semanas
12meses
No
4horas
4horas
2Semanas
12meses
No
4horas
4horas
+++
+++
2Semanas Desconhecido
No
4horas
4horas
No
4horas
4horas
++++
++++
2Semanas
6anos
Depende da anlise ver
tabela anexo A1
Abreviaes: + Sangue total diretamente em gelo ou refrigerao mantida por banho de gelo;
++ Temperatura deve ser controlada; +++ Deve ser pobre em plaqueta; ++++ Deve ser bem
homogeneizado antes do teste. Abreviaes: TA, temperatura ambiente; TP, tempo de Protrombina;
TTPA, tempo de tromboplastina parcialmente ativado; FVIII, fator VIII; FvW, fator de von Willebrand.
Fonte: CSLI, 2008, adaptado
6.1.1.4 Descongelamento das amostras de plasma citratado

Amostras de plasma que so descongeladas de forma inadequada podem ter
os nveis de fator VIII, FvW e fibrinognio diminudos, devido formao de
crioprecipitados. As amostras devem ser descongeladas preferencialmente
em banhomaria a 37C por um perodo de aproximadamente de 5minutos
e homogeneizadas em seguida, antes dos ensaios.
6.1.2 Controle de qualidade na etapa analtica

Consiste na anlise diria da amostra controle com valores dos analitos conhe
cidos para avaliar a preciso dos ensaios. Atravs do controle de qualidade
na etapa analtica (CQI EA) podese avaliar o funcionamento confivel e
eficiente dos procedimentos laboratoriais na gerao de resultados vlidos,
que possam contribuir eficazmente no estabelecimento do diagnstico. Desta
forma, o CQI tem a funo de garantir a reprodutibilidade (preciso), verificar
a calibrao do sistema e indicar o momento de se promover aes corretivas
quando surgir uma no conformidade.
23
6.1.2.1 Material para controle de qualidade Interno

Com o objetivo de avaliar a preciso de um mtodo necessrio realizar
anlise de alquotas de uma mesma amostra. importante incluir amostras
de controle de qualidade com valores normal e anormal para assegurar que
um mtodo controlado em diferentes nveis de resultados. O material de
controle deve ser similar amostra teste e deve ser analisado no mesmo
tempo, utilizando a mesma metodologia. O material deve ser estvel para uso
por um determinado perodo. Especificamente para testes de coagulao, o
material de controle deve ser estocado a 80C ou estar na forma liofilizada
para no comprometer sua estabilidade e, por conseguinte, os resultados. O
descongelamento deve ser realizado a 37C por, no mximo, cinco minutos.
Pelo menos um controle de qualidade deve ser includo em cada grupo de
ensaio. Para testes de triagem (TP, TTPA e TT) devese incluir um controle
normal e um controle anormal a cada incio de rotina ou a cada 8horas
para os laboratrios que funcionam 24horas. Em todos os casos, o material
controle deve ser tratado exatamente como a amostra. So quatro os tipos
de materiais indicados como controle em um laboratrio de coagulao:
Controle normal (origem comercial);
Controle anormal (origem comercial);
Pool de plasma normal (geralmente preparado no laboratrio, isto
, in house) e
Plasma de paciente prdiagnosticado com uma coagulopatia.
Os controles de origem comercial so teis devido estabilidade que apresen

tam por um determinado perodo, o que no atingido com o pool in house. Atravs da utilizao destes controles, possvel avaliar isoladamente o
sistema equipamento/ reagente independentemente da variao da amostra.
Por outro lado, o pool de plasma o controle normal mais prximo da amos
tra do paciente e, por isso, essencial a sua incluso no painel de controle
do laboratrio. O material de um paciente com diagnstico comprovado
de uma coagulopatia de valia, uma vez que uma fonte de informa
o diferente do controle anormal comercial. Por exemplo, no caso de um
paciente com o diagnstico de hemofilia grave cujo nvel de fator menor
que 1%, esta amostra auxilia a verificao da curva de calibrao em n
veis no contemplados por controle comercial. importante salientar que
24
a utilizao do controle normal e anormal comercial previsto como uma

exigncia da Anvisa na RDC n 302que normatiza procedimentos de labo
ratrio clnico.
6.1.2.2 Limites de aceitabilidade e variao
Os resultados dos controles so plotados em um grfico controle e comparado
com os limites aceitveis de erro para aquele analito. Quando os valores
encontrados na amostra controle esto dentro dos limites aceitveis, isto ,
dentro da mdia mais ou menos dois desviospadro, concluise que o m
todo analtico est funcionando adequadamente. Por outro lado, quando os
valores encontrados na amostra controle esto fora dos limites aceitveis, isto
, o valor encontrado ultrapassa a mdia mais ou menos dois desviospadro,
a equipe deve ser alertada para a possibilidade de problemas no processo,
indicando que o mtodo analtico no est funcionando adequadamente.
Atualmente, existem vrios sistemas de controle para as variveis analticas.
De uma maneira geral, o emprego destes sistemas muito til para sanar
inmeros problemas que surgem na realizao de um exame de laboratrio.
Um bom sistema de controle deve ter as seguintes caractersticas:
Prever a avaliao do desempenho de mtodos, equipamentos

e tcnicas. Os sistemas de controle de qualidade internos mais
empregados so:
-- Sistema de controle de LeveyJennings
-- Sistema de controle atravs pelas regras Westgard
Fornecer informaes sobre exatido e preciso de cada mtodo;

Ter sensibilidade suficiente para detectar variaes nas diversas
fases do ensaio;
Ser fcil de implantar, manter e interpretar e
Ser capaz de revelar os diversos tipos de erros ou variaes que
possam ocorrer.
As amostras para CQI comerciais so providas com bulas que fornecem

um intervalo de resultado aceitvel. No entanto, os resultados obtidos so
dependentes de reagentes e da maneira de deteco do mtodo. Ointervalo
de referncia dever demonstrar essas variaes e, desta forma, ser
25
determinado por cada laboratrio, sendo a bula do controle utilizado apenas

como um guia. De acordo com a Federao mundial de Hemofilia (FMH) o
CV% (coeficiente de variao em %) dos resultados em diferentes dias para
TP e TTPA deve ser menor que 8% e, preferencialmente, mais baixo. Para os
outros ensaios, tal como dosagem de fatores da coagulao, o CV% pode
chegar a 10%.
6.1.3 Controle de qualidade na etapa psanaltica

Os processos psanalticos consistem nas etapas executadas aps a reali
zao do exame. Estes so: clculo de resultado, anlise da consistncia de
resultados, liberao dos laudos, armazenamento de material, transmisso
e arquivamento de resultados. Um exemplo deste tipo de anlise a avalia
o de paralelismo de curvas (padro, controle e paciente) na realizao da
dosagem de fatores de coagulao, explanado no captulo 9.
6.2 Controle de qualidade externo no

laboratrio de hemostasia
O CQE considerado um controle interlaboratorial. Consiste na comparao
da exatido dos exames de um laboratrio com os de outros. O CQE visa
padronizar os resultados de laboratrios diferentes atravs da compara
o interlaboratorial de anlises de alquotas do mesmo material. Em um
programa de CQE abrangente, anlises respectivas dos resultados obtidos
por laboratrios participantes permitem, no somente a identificao do
laboratrio com resultado discordante, mas tambm a anlise de todos
os reagentes e mtodos inadequados que o laboratrio possa possuir em
sua rotina. Com a participao efetiva neste programa o laboratrio pode
assegurar que os seus resultados se aproximam o mximo possvel do valor
real (exatido) dentro de uma variedade analtica permitida. No CQE, os
laboratrios participantes analisam amostrascontrole de concentraes
desconhecidas que lhes so enviadas pelo programa. Aps a anlise, o
programa recebe os resultados dos participantes, separaos por grupo de
metodologias e reagentes iguais (quando possvel), determina a mdia de
consenso de cada grupo e calcula o respectivo desviopadro. Por ltimo,
26
realizada uma avaliao dos resultados de cada laboratrio e emitido ao

participante um conceito, de aceitabilidade ou no.
A principal funo do CQE testar a competncia individual do labora
trio. A participao contnua no programa est relacionada com um
melhor desempenho individual, assim como a uma menor variabilidade
dos resultados. H muitas razes possveis para um laboratrio produzir
um resultado insatisfatrio, podendo o(s) fator(es) responsvel(is) ser
imediatamente identificado(s). Por outro lado, a identificao de problemas
latentes nem sempre bvia. Grandes programas so capazes de identificar
alteraes no desempenho dos testes, os quais so relativamente especfi
cos para problemas em reagentes ou metodologia utilizados. A total con
fidencialidade dos resultados deve ser uma importante caracterstica do
programa.
27
7 Preparao e calibrao de
Pool de plasma normal
7.1 Coleta e preparao do pool
O pool local poder ser preparado coletandose sangue de 20a 40pessoas
sadias e que no tenham usado nenhuma medicao que possa interferir
com os fatores da coagulao nos ltimos 10dias. importante salientar
que o nmero de doadores para composio do pool deve representar a dis
tribuio normal obtida, por isso recomendase que quanto maior o nmero
de doadores, melhor qualidade tem o pool.
Para que se obtenha uma distribuio homognea, o ideal que se tenha um
nmero semelhante de homens e mulheres com idade entre 20e 50anos.
Materiais
Tubos plsticos com anticoagulante citrato de sdio a 3,2%;

Frascos Erlenmeyer ou becker plstico;
Tromboplastina clcica;
Cefalina;
Cloreto de clcio 0,025M.
Tubos de hemlise (12x 75mm)
Micropipetas automticas;
Banhomaria a 37 C;
Microtubos plsticos com tampa;
Caixa para armazenamento em Freezer;
Banho de gelo.
Recomendase que todo o procedimento, desde a coleta at o congelamento,

no exceda quatro horas. Aps a centrifugao a 3000rpm por 15minutos
para obteno de plasma pobre em plaqueta (PPP), devese proceder ao
processamento, sem demora, do TP e TTP de todas as amostras para verificar
se os resultados se encontram dentro da faixa de normalidade estabelecida
pelo laboratrio. As amostras, cujos resultados estiverem fora desta faixa
devero ser descartadas, no devendo ser utilizadas para a preparao do
29
pool. Devese observar, ainda, a presena de hemlise ou lipemia, devendo

ser excludos os plasmas lipmicos e/ou hemolisados. Durante a preparao,
manter as amostras de plasma em gelo. A seguir, devese pipetar a mesma
quantidade de plasma de cada amostra coletada, misturlos em recipiente
de plstico grande, homogeneizar bem, evitando a formao de bolhas e,
em seguida, testar a mistura para os testes de TP e TTPA.
O valor obtido do pool de plasma normal deve ser anotado e utilizado como
parmetro de CQI em ensaios posteriores.
Para uso na rotina laboratorial, alquotas mnimas de 0,5ml a 1,0ml devem
ser preparadas e acondicionadas em microtubos plsticos tipo eppendorf
com tampa. Estes tubos devem ser identificados com data de realizao e o
nome do tcnico que preparou o pool. Devese proceder ao congelamento
rpido das alquotas, seguidas de armazenamento em estantes identificadas
coma sigla PPN. Uma vez descongelada para uso, a alquota de pool no
poder ser utilizada novamente.
A validade do pool varia de acordo com as condies de armazenamento; por
seis meses e trs meses, se armazenadas a 80 C e 35 C, respectivamente.
7.1.1 Preparo do pool para teste de inibidor de fator VIII

pela tcnica de Nijmegen Bethesda modificada
O mtodo de Bethesda com a modificao de Nijmegen a tcnica de
escolha para a realizao do teste de quantificao de inibidor. Para rea
lizao desta tcnica, recomendase o preparo de um PPN especifico que
tenha uma estabilidade melhor, uma vez que, esta tcnica exige condio de
temperatura diferenciada. Devese utilizar tubos para coleta contendo o an
ticoagulante citrato de sdio 0.109M (3,2%) previamente tamponado com
imidazol slido na seguinte proporo: a cada 25ml da soluo de citrato de
sdio 0,109M adicionar 1,7g de imidazol slido. Essa modificao aumenta a
sensibilidade e especificidade do teste. Para evitar resultados falsopositivos
importante assegurar que o pool tenha cerca de 100% de fator VIII.
Materiais
30
Tubos para coletacom anticoagulante citrato de sdio a 3,2%;

Imidazol slido, C3H4N2
Rolhas de borracha siliconadas;

Tubo de hemlise;
Pipetas automticas
Outra forma de preparar este pool atravs da adio de tampo imidazol

slido na concentrao de 0,1M ao pool j preparado, ajustando o pH por
adio lenta de 1N HCl, em agitao constante a 4C.
Obs: De acordo com a tcnica original o ajuste de pH do plasma tamponado
para 7,4 feito com HCl 1N, mas na prtica diria a adio de HCl nessa con
centrao promove uma diluio significativa do plasma e consequentemente
do fator VIII:C. Uma alternativa para evitar a diluio do plasma a adio
lenta de HCl mais concentrado, 5N em agitao constante a 4C.
7.1.2 Calibrao do pool

A obteno do pool de doadores de sangue baseiase na necessidade de se
ter um plasma referncia representativo da populao local para uso como
calibrador na rotina do laboratrio de hemostasia. Poder ser utilizado como
controle normal e para realizao das curvas de calibrao de TP, fibrino
gnio e dosagem de fatores. Uma mistura preparada seguindo a tcnica
descrita acima, de forma correta, tem concentrao de aproximadamente
100U/dl (100%) ou 1U/ml para os fatores II, V, VII, IX, X, XI e XII. J para os
fatores VIII e FvW, a concentrao obtida varivel, no podendo, assim,
assumir concentrao de 100U/dl. Desta forma, no recomendada sua
utilizao para calibrao do fator VIII e FvW.
Objetivando padronizar mundialmente as substncias utilizadas para diag
nstico das coagulopatias, a Organizao Mundial de Sade possui prepara
espadro, (OMS International Biological Reference National Institute for
Biological and Control NIBISC) com concentraes conhecidas e unidades
padronizadas. Existem fornecedores que utilizam estas preparaes como
referncia para preparo de calibradores e controles comerciais. Portanto,
quando no h disponibilidade de calibrador comercial para realizar uma
curva de referncia recomendase a calibrao do pool com preparaes de
referncia (NIBISC).
31
8 Testes de triagem
8.1 Tempo de protrombina
O TP avalia as via extrnseca e comum da coagulao. dependente da
integridade dos fatores VII, V, II, e X. O teste consiste na adio de trombo
plastina ao plasma (fator tecidual) e posterior mensurao do tempo de co
gulo. O fator tecidual ativa o fator VII, ativando a via extrnseca, formando
o complexo protrombinase ancorado pela tromboplastina, que culmina na
gerao de trombina. Esta atua na molcula do fibrinognio, formando a
fibrina, que ser estabilizada pelo fator XIII.
Um TP prolongado pode indicar deficincias hereditrias, principalmente do
fator VII ou adquiridas, como deficincia de vitamina K, doena heptica,
coagulao intravascular disseminada ou uso de medicamentos. o teste
de escolha para monitorizar o uso de anticoagulantes orais antivitamina K.
O TP mais sensvel deficincia do fator VII e tem menor sensibilidade aos
fatores da via comum e na deficincia de fibrinognio.
A tromboplastina ou fator tecidual pode ser extrado de tecido cerebral
humano, de porco ou coelho. Atualmente, fator tecidual recombinante vem
sendo cada vez mais utilizado, e o TP mensurado com essa tromboplastina
parece ser mais confivel na identificao de variantes de deficincia de
fator VII.
A origem da tromboplastina interfere na sua sensibilidade, por isso os
resultados de um TP do mesmo paciente na mesma amostra podem variar
de um laboratrio para outro. Em funo disso, criouse uma tromboplastina
padro. Conforme ser explicado adiante, os reagentes para TP devem ser
comparados tromboplastina padro, e essa comparao chamada de
ndice de Sensibilidade Internacional (ISI).
Materiais e Reagentes
Tubos de ensaio de vidro 12x 75mm

Tromboplastina clcica
33
Micropipetas automticas (100a 200l)

Cronmetro
Banhomaria 37C
Soluo salina
Procedimento
Incubar a 37 C por 60segundos 100l de plasma citratado pobre em

plaquetas (PPP);
Adicionar 200l de tromboplastina clcica praquecida a 37C
Cronometrar o tempo de coagulao. As provas devero ser realizadas em
duplicata.
8.1.1 Curva de calibrao para tempo de protrombina

A cada mudana de lote ou marca do reagente necessrio realizar a curva
de calibrao, para que se calcule a atividade enzimtica a partir da dilui
o seriada de um plasma calibrador conhecido. Devese fazer diluies do
calibrador em tampo utilizando tubos plsticos e testar para obteno do
tempo em segundos, conforme Tabela 1:
Tabela 1 Modelo para construo de curva de calibrao do tempo de
protrombina
Atividade enzimtica (%)
100
50
25
12,5
6,25
Diluio do calibrador
Puro
1:2
1:4
1:8
1:16
Fonte: Autoria prpria
Os tempos de coagulao de cada diluio so relacionados graficamente

com as respectivas atividades percentuais, em escala monolog. Para validar
a curva, devese testar um plasma controle normal e anormal (controles
internos) conhecidos.
34
8.1.2 Relao Normatizada Internacional (RNI)

A RNI foi instituda pela Organizao Mundial de Sade para padronizar as
diferenas de resultados de TP entre os vrios laboratrios. Essas diferenas
ocorrem devido diferena de mtodos, aparelhos e tromboplastinas. Todos
os fabricantes de tromboplastina devem determinar o ISI mediante a padro
nizao de sua tromboplastina frente a uma tromboplastina de referncia
internacional (International Reference Preparation) proveniente de crebro
humano, que define a sensibilidade do reagente. Quanto mais prximo de
1,0for o ISI (International Sensibility Index) mais sensvel a tromboplastina.
O clculo do RNI feito de acordo com a seguinte frmula:
RNI: (TP do paciente/TP normal)ISI
Os resultados do TP podem ser reportados em tempo de protrombina, ativi
dade enzimtica (%) e RNI. O valor de referncia para o TP varia de acordo
com o reagente utilizado.
Um tempo de protrombina alargado est relacionado com uso de
medicamentos, hepatopatias ou deficincia de fator VII, principalmente.
Como j mencionado, o TP pouco sensvel deficincia de fibrinognio.
Entretanto, na hipofibrinogenemia grave (abaixo de 100mg/dl de fibrino
gnio) e na afibrinogenemia (ausncia de fibrinognio), o TP encontrase
alargado e incoagulvel, respectivamente. O teste da mistura (com pool de
plasma normal na proporo 1:2) deve ser realizado para identificar se o
prolongamento ocorre por deficincia de fator ou presena de inibidor. Se
houver correo do TP, devese determinar o fator VII inicialmente. Caso
sua dosagem esteja normal, devese avaliar o resultado do TTPA e ento
testar, os fatores V, II ou X de acordo com a clnica do paciente. No havendo
correo do TP na mistura, devese fazer a pesquisa de inibidores dirigidos
contra fatores da via extrnseca e comum. Os inibidores de fator VII so raros.
8.2 Tempo de tromboplastina parcial ativada

O TTPA o teste de triagem para a avaliao dos fatores das vias intrnse
ca e comum da coagulao. Detecta as deficincias dos fatores VIII, IX, XI
e XII, precalicrena e cininognio de alto peso molecular. Dependendo da
35
sensibilidade do reagente, o TTPA pode ser mais sensvel s deficincias de

fator VIII e IX, e menos sensvel s deficincias dos fatores XI e XII ou dos
fatores envolvidos na via comum. usado como teste de triagem para defi
cincias de fator, presena de inibidores e para monitorar o uso da heparina
no fracionada.
Quando uma mistura de plasma e fosfolipdeo (substituto da plaqueta)
recalcificada, a fibrina formada a uma velocidade normal que depende dos
fatores envolvidos na via intrnseca (prcalicrena, cininognio de alto peso
molecular, fatores VIII, IX, XI e XII) e na via comum (fatores X e V, protrombi
na e fibrinognio). O TTPA realizado por adio de tromboplastina parcial,
a cefalina, que uma substncia carregada negativamente e um ativador
da via intrnseca. O cloreto de clcio adicionado e o tempo necessrio para
formar o cogulo medido.
A tromboplastina parcial utilizada no TTPA incapaz de ativar a via ex
trnseca, que requer tromboplastina completa, isto , o fator tecidual. Por
conseqncia, este teste faz um bypass na via extrnseca, no sendo afetado
pela deficincia de fator VII.
No caso de controle de heparinoterapia no fracionada, importante realizar
o teste o mais rpido possvel (em at 1hora) aps a coleta, para evitar a
neutralizao heparina pelo fator plaquetrio 4.
Materiais e Reagentes
Tubos de vidro 12x 75mm

Micropipeta automtica (100l)
Cefalina contendo um ativador (slica, caolim, cido elgico, etc)
Cloreto de clcio 0,025M
Cronmetro
Banhomaria a 37C
Procedimento
100l do plasma teste 100l de cefalina ativada
Incubar a mistura a 37C por 3minutos
100l de cloreto de clcio 0,025M praquecida a 37 C
36
Cronometrar o tempo de coagulao

As provas devero ser realizadas em duplicata
Resultados: Os resultados so relatados em tempo (em segundos) e relao
TTPA paciente/TTPA mdia do valor de referncia.
Um TTPA prolongado com um TP normal indica uma possvel deficincia
dos fatores VIII, IX, XI, XII, cininognio de alto peso molecular, precali
crena ou a presena de um inibidor da via intrnseca. Nesses casos, uma
mistura de plasma normal e plasma teste dever ser feita (1parte de plasma
teste+1parte de plasma normal, v/v).
Caso haja correo de mais de 50% da diferena existente entre os tempos
de coagulao do plasmateste e da misturas sugerese a deficincia de um
fator. Caso contrrio, a ausncia de correo sugere a presena de um ini
bidor de um dos fatores da coagulao, ou do tipo no especfico, tal como
um anticoagulante lpico. O clculo para a interpretao dos resultados est
descrito no captulo 9.
O TTPA deve ter sensibilidade para detectar deficincias de fator. Entretanto,
a sensibilidade reagentedependente e certos reagentes podem no
detectar deficincias moderadas de fator.
Portanto, a escolha do reagente para TTPA deve ser feita cuidadosamente,
uma vez que existem no mercado diversos tipos de cefalinas, com diferentes
sensibilidades a heparina, s deficincias de fator e a presena de anticorpo
lpico. Alm disso, a fosfatidilserina e fosfatidilinositol so importantes na
composio da cefalina. Ainda, tem sido descrito uma melhor sensibilidade
do ativador slica para deteco da deficincia de fatores da coagulao em
relao ao cido elgico.
Adicionalmente, quando se avalia novos lotes de reagentes de coagulao,
importante determinar seu nvel de sensibilidade para detectar deficincias
de protenas da coagulao, tal como descrito no captulo 5.
37
8.3 Tempo de Trombina

O TT avalia o tempo de coagulao do plasma citratado na presena de
trombina, permitindo testar a converso de fibrinognio a fibrina.
A trombina adicionada ao plasmateste para determinar o tempo de for
mao do cogulo. O tempo de coagulao, aps a adio de trombina
do plasma, inversamente proporcional a concentrao de fibrinognio
plasmtica.
O TT avalia diretamente o fibrinognio funcional, sendo utilizado para
investigar defeitos na molcula do fibrinognio. Est prolongado na presen
a de heparina, em altas concentraes de imunoglobulinas (por exemplo,
na macroglobulinemia de Waldenstrom), nas disfibrinogenemias, na hipofi
brinogenemia, estando incoagulvel na afibrinogenemia.
O TT para uso clnico deve ter concentrao de trombina de aproximadamente
4U/ml para que se obtenha um tempo normal de cerca de 20segundos.
Assim, o teste ter sensibilidade suficiente para detectar anormalidades leves
do fibrinognio.
Material e reagentes
Tubos de vidro 12x 75mm

Soluo fisiolgica
Trombina 4U/ml (humana ou bovina)
Micropipetas automticas (100l e 200l)
Cronmetro
Banhomaria a 37 C
Tcnica
200l do plasma teste

Incubar a 37 C por 60segundos
Adicionar 100l da trombina
Cronometrar o tempo de coagulao
As provas devero ser realizadas em duplicata
Obs.: A soluo me de trombina pode ser mantida congelada, mas a

soluo de trabalho deve ser descartada aps uso.
38
O TT um teste de alta sensibilidade presena de heparina, sendo utilizado

para deteco de heparina no fracionada contaminante de amostras
colhidas de cateter de longa permanncia, mantidos com heparina. Neste
caso, o TT incoagulvel e o TTPA prolongado, devendo ser feita nova coleta,
de preferncia com coleta em stio distante do vaso cateterizado.
Avaliao clnica dos testes de triagem
O conhecimento sobre o princpio do teste, sua aplicao e resultado

auxilia sugerir o diagnstico. Por exemplo, se um paciente tem apenas TTPA
prolongado, tem histria de sangramento e do sexo masculino, o diagns
tico diferencial em ordem decrescente deve incluir deficincia dos fatores
VIII, IX e XI. Os fatores da via intrnseca que prolongam o TTPA, mas no esto
relacionados com histria de sangramentos so o fator XII, precalicrena, e
cininognio de alto peso molecular. As deficincias dos fatores da via extrn
seca e comum, quando muito graves, se associam a prolongamento tambm
do TTPA, como por exemplo, na afibrinogenemia (Quadro 3).
Quadro 3 Interpretao de testes de triagem
TTPA anormal isoladamente
Associado com sangramento: deficincia dos fatores VIII, IX e XI.
No associado com sangramento: deficincia de fator XII, prcalicrena, cininognio
de alto peso molecular e anticorpo lpico.
TP anormal isoladamente
Deficincia de fator VII
TP e TTPA anormais
Anticoagulantes, coagulao intravascular disseminada, deficincia de vitamina K,
transfuso macia
Afibrinogenemias, deficincias de fatores X, V e II.
Fonte: Santos, Maria Emlia, 2010
39
9 Diagnstico Laboratorial das

coagulopatias hereditrias
9.1 Doena de von Willebrand
9.1.1 Introduo
O FvW uma protena de adeso, sintetizado pelas clulas endoteliais e
megacaricitos. Est presente no plasma, subendotlio e nos grnulos
das plaquetas em forma de oligmeros contendo um nmero varivel de
subunidades.
A primeira das trs funes conhecidas do FvW na hemostasia de se ligar
s estruturas expostas do subendotlio e, subseqentemente, s plaquetas,
atravs do complexo de receptores plaquetrios GPIbIXV. Essa interao
inicia a hemostasia primria, principalmente em condies de alto fluxo
vascular (alta fora de cisalhamento). A segunda funo a ligao entre
as plaquetas (agregao plaquetria) atravs dos receptores GPIIbIIIa pla
quetrios, tambm em condies de alta fora de cisalhamento. Alm disso,
o FvW participa da hemostasia secundria, transportando o fator VIII na
circulao, que quando livre rapidamente inativado.
A doena de von Willebrand (DvW) a doena hemorrgica hereditria
mais freqente e apresenta diferentes expresses fenotpicas com sinais e
sintomas de intensidade varivel.
Em 1993, Sadler, baseado em estudos de mutao gentica, classificou a
doena em dois grandes grupos: doena resultante de alterao quantitativa
e qualitativa.
Alterao quantitativa tipo 1: a mais freqente, sendo caracterizada pela
deficincia parcial do FvW. Esses pacientes podem apresentar sangramento
de intensidade leve a moderada. Este fentipo heterogneo se deve a
existncia de 3subtipos: tipo 1plaqueta normal, que se apresenta com
quantidade e funo normais de FvW intraplaquetrio; tipo 1plaqueta
41
baixa, que se apresenta com reduo da quantidade do FvW, mas com

funo normal e o tipo 1plaqueta discordante, que se apresenta com
quantidade normal de FvW e funo diminuda.
Alterao quantitativa tipo 3: caracterizada por nveis plasmticos e pla
quetrios indetectveis do FvW, o que ocasiona manifestaes hemorr
gicas graves.
Alterao qualitativa tipo 2: esta se subdivide em subtipo 2A que apresenta
reduo da funo dependente de plaquetas, associada ausncia dos mul
tmeros intermedirios e de alto peso molecular; subtipo 2B que se apresenta
com maior afinidade pela GPIb plaquetria e ausncia dos multmeros de
alto peso molecular; subtipo 2M que se apresenta com reduo da fun
o dependente de plaquetas no devido a ausncia de multmero de alto
peso molecular e subtipo 2N (ou Normandy) que se apresenta com menor
afinidade do FvW pelo fator VIII.
Algumas disfunes plaquetrias assemelhamse DvW, como por exemplo,
a DvW do tipo plaquetrio ou pseudo DvW. Tratase de uma alterao da
glicoprotena lb (GPlb) plaquetria com grande afinidade pelo FvW.
9.1.2 Manifestaes Clnicas

As formas mais leves da DvW so, na maioria das vezes assintomticas,
podendo se apresentar com sangramento mucocutneo tais como equi
mose, epistaxe, gengivorragia e menorragia. Por outro lado, as formas mais
graves (DvW tipo 3) cursam com quantidade de fator VIII bastante reduzida,
e, conseqentemente, podem apresentar sangramentos internos, dentre
os quais hemartroses e hematomas intramusculares, manifestaes estas
semelhantes hemofilia grave.
A DvW pode ser adquirida, podendo, neste caso, estar associada a outras
doenas, tais como mieloma mltiplo, linfoma no Hodgkin, doenas mielo
proliferativas, gamopatias monoclonais, lpus eritematoso sistmico, outras
doenas autoimunes ou idioptica. A DvW adquirida rara.
42
9.1.3 Diagnstico
O diagnstico de DvW geralmente realizado em 3etapas: (i) identifica
o do paciente com possvel DvW, baseado na histria clnica e em testes
laboratoriais; (ii) diagnstico e definio do tipo de DvW e (iii) caracterizao
do subtipo da doena (Figura 1).
9.1.4 Testes laboratoriais

Os testes laboratoriais necessrios para o diagnstico da DvW so divididos
em:
Testes de triagem
Tempo de sangramento (TS)

Contagem de plaquetas
TTPA
Testes confirmatrios
Determinao do fator VIII:C
Determinao plasmtica do FvW antgeno (FvW:Ag)
Determinao da atividade do FvW (FvW:RCo)
Ligao do FvW ao Colgeno (FvW:CB)
Testes especiais
Agregao plaquetria induzida pela ristocetina (RIPA)
Capacidade de ligao ao FVIII (FvW:FVIIIB)
Anlise multimrica do FvW
43
Figura 1 Fluxograma para interpretao dos testes para diagnstico da doena

de von Willebrand
FVIII:C
FVW:Ag N ou
FVW:RCo
DVW tipo1
RIPA
FVIII:C N ou
FVW:Ag N ou
FVW:RCo
FVW:CB
Ausncia de MAPM
DVW subtipo 2B
DVW subtipo 2A
RIPA
FVW:CB ou
Presena de MAPM
FVIII:C = 10-40%
FVW:Ag N
FVW:RCo N
FVIII:C = 0.5-1%
FVW:Ag
FVW:RCo
FVW:FVIII alterado
DVW subtipo 2M
DVW subtipo 2N
DVW subtipo 3
Abreviaes: FvW:Ag, fator de von Willebrand antgeno; FvW:RCof, cofator de ristocetina; FVIII:C, fator
VIII coagulante; FvW:RCof/FvW:Ag, relao da atividade do fator de ristocetina e fator de von Willebrand
antgeno; FvW:VIII, teste de ligao do fator VIII:C ao fator de von Willebrand; FvW:CB, ligao do fator de
von Willebrand ao colgeno; RIPA, agregao plaquetria com ristocetina; MAPM, multmero de alto peso
molecular; N, normal;,diminudo; , muito diminudo; , aumentado.
Fonte: Brasil. Ministrio da Sade. Manual de diagnstico e tratamento da doena de Von Willebrand,
2006, adaptado
9.1.4.1 Testes de triagem

A investigao laboratorial da DvW tem incio com os seguintes testes de
triagem: TS, contagem de plaquetas e o tempo de tromboplastina parcial
ativado.
44
Muitos centros europeus e americanos abandonaram o TS, substituin

doo pelo teste de anlise da funo plaquetria atravs do emprego do
analisador de funo plaquetria, que um equipamento, que simula, in vi
tro, a alta fora de cisalhamento do vaso. Este apresenta maior sensibilidade,
principalmente para o diagnstico da DvW.
No Brasil, a disponibilidade deste equipamento recente e devido ao seu
alto custo, poucos centros o utilizam.
Tempo de sangramento
O TS um teste laboratorial realizado in vivo que avalia a funo hemost
tica das plaquetas, vasos e FvW. O TS se refere ao tempo de durao do san
gramento de uma pequena inciso provocada com o auxlio de uma lanceta.
H duas tcnicas comumente utilizadas, a primeira foi desenvolvida por
Duke, sendo posteriormente modificada por Ivy e colaboradores atravs
da introduo do esfignomanmetro para manuteno da presso arterial
a 40mm de Hg durante o teste. Mais tarde, uma empresa farmacuti
ca desenvolveu um dispositivo com tamanho e profundidade de inciso
padronizados (Ivy modificado).
Infelizmente, a maioria dos laboratrios no Brasil utiliza o TS pelo mtodo
de Duke, devido ao alto custo do dispositivo mencionado.
Tempo de sangramento de Ivy modificado
O teste realizado na regio anterior do antebrao
Material
Algodo em lcool 70%

Esfigomomanmetro
Papel de filtro
Dispositivo estril e descartvel para a inciso (que permite inciso de 1mm

de profundidade para adulto e 0.5mm de profundidade para crianas abaixo
de 9anos de idade)
45
Cronmetro
Procedimento
Com o auxlio do esfingomanmetro aplicada uma presso constante de

30mm Hg em crianas e 40mm Hg em adultos. Aps assepsia da regio
anterior do antebrao, feita uma inciso padronizada quatro dedos abaixo
da prega do cotovelo atravs de um dispositivo descartvel, sendo, ento, o
cronmetro imediatamente acionado. A cada 30segundos o sangue liberado
deve ser absorvido com o papel de filtro sem que este entre em contato com
a inciso. O teste dever ser controlado no mximo at 15minutos. Caso o
sangramento no pare, o teste deve ser interrompido, o local comprimido
com uma gaze seca e o resultado reportado como superior a 15minutos. O
valor normal depende do dispositivo utilizado.
Interpretao
O TS prolongado reflete as alteraes quantitativas e/ou qualitativas das

plaquetas, vasos e do FvW. Apesar da tcnica de Ivy modificada ser mais
sensvel quando comparada de Duke, aquela no reprodutvel, sendo
pouco sensvel para o diagnstico de disfunes leves a moderadas. No caso
da DvW, o teste no deve ser utilizado para diagnstico, podendo apresentar
resultados normais ou prolongados, uma vez que dependente do FvW
intraplaquetrio.
Quanto ao teste realizado em analisadores de funo plaquetria, os
resultados so anormais na maioria dos pacientes com DvW, exceto no
subtipo 2N. Porm, pacientes com o tipo 1leve e moderado e tipo 2podem
apresentar resultados normais.
A contagem de plaquetas por mtodo manual ou automatizado auxilia no
diagnstico de plaquetopenia que pode ocorrer na DvW do subtipo 2B.
Contagem de plaquetas por mtodo manual
Coleta
O sangue para a contagem de plaquetas deve ser colhido preferencialmente

em EDTA. Em casos de suspeita de pseudoplaquetopenia, o sangue deve
46
ser colhido tambm em citrato de sdio 3.2% e ao resultado devem ser

acrescidos 10% ao nmero de plaquetas obtido.
Soluo de lise dos eritrcitos e diluio das plaquetas:
Oxalato de amnio 1%
Oxalato de amnio 10g
gua destilada q.s.p. 1000ml
Aps a solubilizao completa, a soluo deve ser filtrada para a retirada

de qualquer resduo que possa interferir na contagem. A soluo pode ser
mantida em geladeira por at 2meses. Essa soluo facilita a contagem
de plaquetas em cmara de Neubauer por deixar a membrana da plaqueta
brilhante, diferenciandoa de outras partculas.
Procedimento
Aspirar 100l de sangue com pipeta automtica, enxugando a

ponteira, sem absorver o sangue do interior da ponteira.
Dispensar o volume no tubo plstico contendo 1,9ml de oxalato
de amnio 1%.
Tampar o tubo e homogeneizar o sangue diludo 5vezes e aguardar
10minutos para a hemlise completa.
Preparar a cmara de Neubauer. A lamnula deve ficar totalmente
fixada na cmara.
Aps 10minutos da lise, preencher a cmara com o material, sem
permitir a formao de bolhas ou extravasamento do lquido para
fora da lamnula
Deixar a cmara preenchida em repouso por 10 minutos...em c
mara mida (recipiente fechado com bolas de gaze umedecidas.)
Fazer contagem das palquetas presentes em 5dos 25quadrantes
centrais (mesmo local de contagem de hemcias e plaquetas).
Se nmero de plaquetas for abaixo de 10.000/mm3, as plaquetas
presentes nos 25campos devem ser contadas.
Valor normal: 150.000 450.000/mm3
47
Interpretao
Geralmente, o nmero de plaquetas na DvW normal, com exceo do

subtipo 2B que pode apresentar plaquetopenia leve.
Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (TTPA)
O TTPA o teste de triagem dos fatores da via intrnseca da coagulao.
utilizado como teste de triagem na DvW por ser sensvel a diminuio do
fator VIII. Nos tipos e subtipos da doena que cursam com nveis reduzidos
do FvW detectado o prolongamento do teste. A tcnica de execuo do
TTPA foi descrita no captulo 8, seo 8.2.
Interpretao
Na DvW, o TTPA pode estar normal ou prolongado, o que depende dos n

veis plasmticos de fator VIII:C. Nas formas mais graves do tipo 1, tipo 3e
subtipo 2N ocorre o prolongamento do teste.
9.1.4.2 Testes confirmatrios
Determinao da atividade do fator VIII
Usualmente a determinao do fator VIII:C realizada pelo mtodo coagulo
mtrico de um estgio baseado na gerao de trombina induzida por adio
de cefalina ativada (TTPA). Este mtodo descrito no captulo 9 seo 9.2.1.2.
Interpretao
Na DvW tipo 3, os nveis plasmticos do fator VIII:C so de 1% a 5% devido

a grande reduo ou ausncia da sua protena transportadora. J na DvW
tipo1, os nveis de fator VIII:C so ligeiramente mais elevados em relao ao
FvW:Ag, podendo ser normais.
No tipo 2(exceto o tipo 2N com fator VIII:C diminudo), os nveis de fator
VIII:C so duas a trs vezes maior que a atividade do FvW.
Determinao do fator de von Willebrand
A determinao da concentrao plasmtica do FvW:Ag essencial para
o diagnstico da DvW. A determinao deve ser acurada, caso contrrio, a
distino entre defeitos quantitativos e qualitativos tornase praticamente
impossvel.
48
Atualmente, diferentes mtodos imunolgicos esto disponveis, porm com

diferentes sensibilidade e especificidade.
O mtodo de eletroimunodifuso foi o primeiro a ser desenvolvido.
Brevemente, seu mtodo envolve a adio de gel de agarose a 1% contendo
anticorpo antiFvW a uma placa de vidro. Posteriormente, um pequeno
volume de plasma calibrador em vrias diluies e de plasmas testes
adicionado nos orifcios feitos no gel de agarose. A placa submetida a
uma corrente eltrica e com a migrao do FvW ocorre a precipitao ant
genoanticorpo. Formamse picos, que so visualizados atravs de corantes
especficos de protenas, cuja altura diretamente proporcional concen
trao do antgeno na amostra.
Apesar de ser um mtodo simples, ele foi substitudo por outros mtodos
mais sensveis e melhor padronizados, tal como o mtodo de Elisa.
Recentemente, foram desenvolvidos mtodos automatizados com base em
aglutinao com partculas de ltex (LIA). Segundo Budde, o LIA apresenta
sensibilidade e especificidade comparveis ao mtodo Elisa. Alm de rpi
da determinao, possibilita, ainda, a avaliao de uma nica amostra em
situao de urgncia.
De acordo com estudos realizados em laboratrios europeus, americanos
e asiticos, comparandose os diferentes mtodos de quantificao
do FvW:Ag, o mtodo de eletroimunodifuso apresenta grande varia
o dos resultados e pouca sensibilidade a baixos nveis do FvW quando
comparado ao mtodo Elisa. Esses fatores tambm foram encontrados
no mtodo que utiliza partculas de ltex, alm da interferncia do fator
reumatide. O mtodo Elisa foi considerado o mais sensvel e com baixa
variabilidade entre os ensaios, tanto os desenvolvidos in house quanto os
comerciais. Porm, a confiabilidade dos resultados dependente da pro
cedncia dos reagentes utilizados e, principalmente, da curva de calibra
o. O Comit Internacional de Hemofilia e Doena de von Willebrand
recomenda a utilizao do plasma referncia da Organizao Mundial
de Sade por apresentar nveis acurados no somente do FvW, mas
tambm de fator VIII:C, cofator de ristocetina e ligao FvWcolgeno.
49
Mtodo Elisa
Princpio
Consiste da reao do anticorpo capturante (anticorpo especfico antiFvW)

e um segundo anticorpo ligado enzima peroxidase (anticorpo secundrio).
Quando o complexo equimolar anticorpo capturante antgeno anticorpo
secundrio formado na presena de um substrato especfico, ocorre o
desenvolvimento de cor que diretamente proporcional concentrao
do antgeno.
Materiais e reagentes
microplacas de 96orifcios
micropipeta automtica de 12canais (100l)
micropipeta automtica de 100l
lavadora de microplaca de Elisa
leitora de microplaca de Elisa com filtro 492nm
anticorpo de coelho policlonal antivon Willebrand humano
anticorpo de coelho anti von Willebrand humano conjugado com
peroxidase
albumina de soro bovino (BSA)
Ortodiamino fenileno (1,2benzenodiamino) OPD tabletes de 5mg
Perxido de hidrognio (H2O2) 30%
Cloreto de sdio (NaCl)
Trisma base
Bicarbonato de sdio (Na2CO3)
Carbonato de sdio (NaHCO3)
Na3C6H6H5O7. 2H2O
Fosfato de sdio dihidratado (NaH2PO4. 2H2O)
Tween 20
cido fosfrico (H3PO4)
cido clordrico (HCl concentrado)
cido sulfrico (H2SO4)
50
Quadro 4 Preparo de solues para o teste FvW:Ag

Preparo das solues para FvW:Ag
Tampo de sensibilizao da microplaca de Elisa (pH 9.6) Soluo A
Bicarbonato de sdio Na2CO30.43g
Carbonato de sdio NaHCO30.72g
gua H2O q.s.p. 250ml
Tampo de lavagem Soluo B
Tris 4.85g
Cloreto de sdio NaCl 11.68g
Solubilizar os sais em 1litro de gua H2O destilada
Adicionar cido clordrico HCl concentrado at pH 7.4
Tween 202ml
gua H2O q.s.p. 2litros
Tampo de revestimento Soluo C
Tris 1.21g
Soro de albumina bovina BSA 25g
Tampo de diluio (amostras e plasma padro) (10vezes concentrado)
Soluo D
Trisma base 4.84g
Soro de albumina bovina BSA 20g
Tween 202ml
Tampo do anticorpo secundrio (10vezes concentrado) Soluo E
Tris 1.21g
Albumina bovina BSA 0.5g
gua H2O q.s.p. 50ml
Tampo do substrato (10vezes concentrado) Soluo F
Na3C6H6H5O7. 2H2O 3.25g
Fosfato de sdio NaH2PO4. 2H2O 3.90g
Adicionar H3PO4at pH 5.9
Soluo de bloqueio da reao Soluo G
cido sulfrico H2SO43M
Fonte: Federici AB, 1996
51
Procedimentos:
Sensibilizao da microplaca em cada orifcio da microplaca adi

cionase 125l do anticorpo primrio diludo em soluo A (5a
10g/ml). A seguir, vedase a placa para evitar a evaporao.
Incubar a microplaca por 12horas a 40C (podese deixar a micro
placa por at 10dias em geladeira)
Lavar a microplaca 2vezes com a soluo B (volume de 200l)
Adicionar 170l da soluo C em todos os orifcios e em seguida
mantla sob agitao constante (a 200rpm) por 2horas
Diluir o plasma referncia com a soluo D
1:50(100%) (10l plasma + 490l soluo D) diluio 1
1:100(50%) (100l diluio 1+ 100l soluo D) diluio 2
1:200(25%) (100l diluio 2+ 100l soluo D) diluio 3
1:400(12,5%) (100l diluio 3+ 100l soluo D) diluio 4
1:800(6,25%) (100l diluio 4+ 100l soluo D) diluio 5
1:1.600(3,12%) (100l diluio 5+ 100l soluo D) diluio 6
1:3.200(1,56%) (100l diluio 6+ 100l soluo D) diluio 7
As amostras teste devem ser diludas na mesma soluo D com
base na atividade do fator VIII:C. Por exemplo, os pacientes que
apresentarem atividade do fator VIII:C entre 60150%, a diluio
deve ser 1:200; nos com menos de 60%, as diluies sero 1:50e
1:100e com a atividade maior que 150%, as amostras devem ser
diludas 1:400.
Obs. Tanto a curva referncia quanto as amostras teste devem ser
realizadas em duplicata.
Incubar 100l de cada diluio da curva referncia e das amostras

teste por 2horas temperatura ambiente.
Adicionar 100l de anticorpo secundrio diludo em soluo E na
concentrao de 5g/ml
Agitar a microplaca temperatura ambiente por 60minutos
Lavar a microplaca 3vezes com a soluo B
Preparar o substrato por adio de 5mg de OPD em 12ml de tam
po F e 10l de perxido de hidrognio 30%
52
Adicionar 100l da soluo em cada orifcio e manter a microplaca

temperatura ambiente, no abrigo da luz, por 10minutos
A reao bloqueada por adio de 50l de H2SO43M
A leitura espectrofotomtrica realizada a 492nm
A curva de referncia deve ser traada em papel semilogartmico
(densidade ptica versus % de FvW)
Os resultados das amostras teste devero ser obtidos a partir da curva referncia.
Se a amostra teste foi diluda 1:100e 1:200, o resultado obtido a partir da
curva deve ser multiplicado por 2e 4, respectivamente
Interpretao
Na DvW tipo 1o nvel plasmtico do FvW:Ag pode estar leve ou modera

damente reduzido; no tipo 3 indetectvel ou muito baixo (< 1%). Esses
nveis de FvW:Ag so descritos por Manucci. J nos subtipos 2A, 2B e 2M os
nveis so levemente reduzidos. No subtipo 2N, o FvW:Ag pode estar normal.
Determinao da atividade do fator de von Willebranddiferentes
mtodos
O primeiro mtodo de avaliao da atividade do FvW foi o cofator de risto
cetina (FvW:RCo) desenvolvido por Macfarlane em 1975. O teste se baseia na
aglutinao de plaquetas lavadas e formolizadas na presena de ristocetina
e FvW, com a utilizao de agregmetro. Mais tarde, Evans e colaboradores
descrevem a mesma metodologia, porm com deteco visual da aglutina
o das plaquetas, possibilitando a execuo do teste em laboratrios que
no dispem de equipamento. Embora os mtodos apresentem um alto
coeficiente de variao ainda assim, so considerados padro ouro para
avaliao da atividade do FvW.
Devido aos altos ndices de erros no diagnstico da DvW por problemas tc
nicos apresentados no teste de cofator de ristocetina, foram desenvolvidos
outros mtodos de avaliao funcional do FvW. Inicialmente foram os testes
funcionais imunolgicos por tcnica de Elisa com fragmentos da glico
protena lb (GPlb) da plaqueta capturados na microplaca, na presena de
ristocetina. Outra tcnica de Elisa a utilizao de anticorpo monoclonal
antidomnio A1do FvW ligados microplaca.
53
Com o avano tecnolgico dos coagulmetros, testes automatizados de

leitura turbidimtrica de partculas de ltex sensibilizadas com anticorpo
monoclonal contra o domnio A1do FvW (LIA) tem tido bastante destaque
na rotina laboratorial.
Apesar da rapidez, do baixo coeficiente de variao e grande utilizao pelos
laboratrios, a literatura apresenta poucos estudos comparando a eficincia
desses testes em relao ao mtodo padro ouro.
Um estudo americano recente comparou o limite de deteo, a linearidade e
preciso entre os testes FvW:RCo por agregometria e LIA em 492pacientes
com DvW. Os resultados obtidos mostraram que os dois testes apresentam
excelente correlao e que o teste LIA tem sensibilidade e especificidade
superior ao FvW:RCo em discriminar a doena do tipo 1grave para 2M,
assim como a DvW adquirida.
Mas, segundo Favaloro, os testes imunolgicos de atividade que utilizam
anticorpo monoclonal refletem melhor a especificidade de ligao do
anticorpo ao FvW do que propriamente a atividade do fator. Isto no
se aplica ao teste funcional FvW:CB, desenvolvido nos anos 80tambm
por Elisa, que avalia a ligao do domnio A3do FvW ao Colgeno. Sua
capacidade de ligao depende da presena dos multmeros de alto peso
molecular. A discriminao do teste entre FvW normal e com ausncia dos
altos pesos moleculares do FvW de cerca de 90%.
At recentemente, o teste FvW:CB era apenas realizado in house, devido a
dificuldade de ligao estvel do colgeno placa de Elisa por um longo pe
rodo. Atualmente, encontramse no mercado dois kits comerciais com mi
croplacas sensibilizadas com o colgeno tipo III de sensibilidade comparada
ao teste in house, porm de alto custo.
O teste FvW:CB utilizado como teste complementar ao FvW:RCo e FvW:Ag
no somente para a diferenciao dos subtipos 2A e 2M, mas tambm dos
subtipos 2A e 2B.
Uma outra avaliao funcional do FvW o teste de ligao FvW e FVIII
(FvW:VIIIB). considerado um teste especial e realizado em servios
especializados de diagnstico da doena de von Willebrand e outras coagu
lopatias. Tratase de um teste importante para diferenciar a DvW tipo 2N da
54
hemofilia A leve ou moderada. A intensidade do defeito de ligao do fator

VIII:C ao FvW varia com diferentes tipos de mutaes, que at o momento,
foram identificadas nos domnios D e D3do gene que codifica o FvW.
Os mtodos utilizados para a avaliao da afinidade entre o fator VIII:C e o
FvW podem ser: cromognico, imunolgico ou ambos.
FvW:RCo Mtodo agregomtrico
Princpio
O FvW:RCo por mtodo agregomtrico avalia a atividade do FvW na pre

sena de plaquetas humanas normais lavadas e fixadas com formalina. As
plaquetas tratadas so adicionadas aos plasmas teste ou de referncia, em
vrias diluies, e a ristocetina em concentrao constante. No passado, a
ristocetina foi utilizada como antibitico, tendo sido retirada do mercado
por causar plaquetopenia. A ristocetina promove mudanas estruturais no
FvW facilitando a sua ligao com a GPIb plaquetria com conseqente
aglutinao.
A reao de aglutinao das plaquetas detectada atravs do agregmetro
de sistema ptico acoplado a um registrador com velocidade do papel de
5cm/minuto.
Preparo das plaquetas formolizadas
Coletar o sangue em ACD ou utilizar 1a 2bolsas de concentrado

de plaquetas dentro do prazo de validade.
Centrifugar o concentrado de plaquetas a 1.500x g por 1minuto
temperatura ambiente para retirada de hemcias contaminantes
da bolsa.
Centrifugar o concentrado durante 15 minutos a 1.500 x g
temperatura ambiente.
Durante o tempo de centrifugao, preparar os tampes de
lavagem I e II.
Descartar o sobrenadante utilizando bomba de vcuo e ressuspen
der as plaquetas (sem formao de bolhas) no tampo de lavagem
do tipo I (30ml) e manter a 37C por 10minutos.
55
Centrifugar as plaquetas incubadas no tampo de lavagem do tipo

I por 15minutos a 1.500x g a 37C.
Descartar o sobrenadante e ressuspender o boto plaquetrio no
tampo de lavagem do tipo II (20ml).
Obs. Caso o boto plaquetrio ainda estiver contaminado com

hemcias tentar retirlas.
Incubar por 10minutos a 37C.
Enquanto as plaquetas estiverem incubadas, preparar a soluo de
formaldedo a 2% em tampo Tyrode Plain.
Adicionar 20ml de formaldedo 2% aps os 10minutos de incuba
o das plaquetas ressuspensas no tampo de lavagem do tipo II.
Incubar a mistura por 60minutos a 37C (Obs. certificar se o nvel
de gua do banhomaria cobre todo o volume da mistura).
Aps o tempo de incubao, deixar em geladeira at o dia seguinte.
O contedo transferido para dois tubos de 20ml e, se aps o dia

seguinte houver sedimentao de hemcias, tentar desprezlas
com o auxlio de ponteira plstica.
Completar com Tampo Plain Tyrode at 50ml.
Centrifugar por 15minutos a 1.500x g temperatura ambiente.
Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 50ml de Tampo
Plain Tyrode
Incubar por 10minutos a 37C.
Enquanto as plaquetas estiverem incubadas, preparar a soluo

de formaldedo a 2% em tampo Tyrode Plain.
Adicionar 20ml de formaldedo 2% aps os 10minutos de incuba
o das plaquetas ressuspensas no tampo de lavagem do tipo II.
Incubar a mistura por 60minutos a 37C (Obs. certificar se o nvel
de gua do banhomaria cobre todo o volume da mistura).
Aps o tempo de incubao, deixar em geladeira at o dia

seguinte.
56
O contedo transferido para dois tubos de 20ml e, se aps o dia

seguinte houver sedimentao de hemcias, tentar desprezlas
com o auxlio de ponteira plstica.
Completar com Tampo Plain Tyrode at 50ml.

Centrifugar por 15minutos a 1.500x g temperatura ambiente.
Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 50ml de Tampo
Plain Tyrode
Preparo da ristocetina
Soluo estoque (50mg/ml)

Ressuspender frasco de 100mg de monosulfato de ristomicina (>90% ris
tocetina A balanceada com ristocetina B) em 2ml de gua destilada.
Curva de referncia
O plasma referncia deve ser diludo 1:2(100%), 1:4(50%), 1:8(25%),

1:16(12.5%) e 1:32(6.25%) com tampo Plain Tyrode
O plasma teste deve ser diludo 1:2ou 1:4dependendo dos nveis de FvW:Ag
Teste
300l de plaquetas lavadas

100l das diferentes diluies do plasma referncia ou plasma teste diludo
8l de ristocetina 50mg/ml (concentrao final de 1mg/ml)
Quadro 5 Preparo de solues para o teste FvW:RCo
Preparo das solues para FvW:RCo
Soluo ACD, pH 4.5
Citrato de sdio dihidratado 10g
cido ctrico monohidratado 6g
Dextrose 8g
H2O q.s.p. 400ml
Solues estoques de Tyrode (se mantidas a 4C, podem ser conservadas por
2meses)
Estoque I
NaCl 16g
Continua
57
Continuao
KCl 0.4g
NaHCO32g
NaH2PO40.1g
H2O q.s.p. 100ml
Estoque II
MgCl2.6H2O 2.033g (0.1M)
H2O q.s.p. 100ml
Estoque III
CaCl2.6H2O 2.191g (0.1M)
H2O q.s.p. 100ml
Tampo Plain Tyrode pH 7.35
Soluo estoque I5ml
H2O q.s.p. 100ml
Soluo de albumina bovina (BSA)
Albumina bovina 17.5g
Soluo fisiolgica (NaCl 0.9%) 100ml
Estocar 80C em alquotas de 1ml
Creatinina Fosfo Quinase (CPK) tipo I de msculo de coelho frasco de 500U
(liofilizado)
Fosfocreatina (CP) 500mM
Preparar em tampo Tyrode Plain, aliquotar vrios tubos de 500l
e manter a 20C
Mistura de CP + CPK (preparar imediatamente antes do uso)
500U CPK + 500l CP
Heparina 5.000U (manter alquotas a 20C)
Formaldedo 37%
Tampo de lavagem das plaquetas pH 7.35(soluo A)
Estoque I 2.5ml
Estoque II 0.5ml
Estoque III 1.0ml
Dextrose 0.05g
BSA 17.5%1.0ml
H2O q.s.p. 50ml
HCl 0.5N para o acerto do pH
Tampo de lavagem tipo I
Soluo A 30ml
Heparina 0.3ml
CP/CPK 0.3ml
Continua
58
Continuao
Preparar na hora do uso e manter a 37C

Tampo de lavagem tipo II
Soluo A 20ml
CP/CPK 0.2ml
Preparar na hora do uso e manter a 37C
Fonte: Federici AB, 1996
Calibrao do aparelho
0% de transmitncia: 300l de plaquetas lavadas + 100l de

plasma diludo
100% de transmitncia: 250l de plaquetas lavadas + 250l de
PT (branco)
Cada vez que se adiciona a ristocetina, o aparelho deve ser

recalibrado.
Velocidade de reao de 5cm/minuto

A curva de referncia deve ser traada em papel semilogartmo
FvW:RCo mtodo visual

O mtodo descrito uma associao do ensaio macroscpico de aglutinao
e a tcnica de fixao de plaquetas descrita por Evans e Austen
Princpio
Plaquetas normais so fixadas com soluo de formaldedo e misturadas
com plasma contendo FvW. A essa mistura acrescentada a Ristocetina,
antibitico que auxilia a interao do FvW e as glicoprotena lb (GPlb) das
plaquetas.
59
Figura 2 Representao esquemtica da reao de aglutinao

GPIb
+ FVW + Ristocetina
GPIb
FVW
GPIb
Plaquetas formolizadas
Plaquetas formolizadas aglutinadas
Reagentes necessrios
Plasma referncia
Plaquetas fixadas
Ristocetina
100mg do reagente Ristocetina so diludos em 3,3mL de soluo
fisiolgica (SF).
Soluo estoque 30mg/mL congelada a 70C em volumes de
100L.
Soluo de uso: 0,65mL de SF em 0,1mL da soluo estoque =
4mg/mL
Albumina 6g % em tampo citratosalina (tampo albumina)
20mL de tampo citratosalina (uma parte citrato Trissdico 0,11M : cinco
partes de soluo salina) com 1,2g de albumina de soro bovino
Procedimento
Diluir o plasma referncia e plasmas testes com tampo albumina

-- Plasma referncia: 1/2(100%); 1/4(50%); 1/8(25%)
-- Plasmas testes: 1/2; 1/4; 1/8
Realizar o teste em temperatura ambiente para cada uma das di
luies
60
Em um tubo de vidro adicionar:

-- 0.2mL de plaquetas lavadas e fixadas contendo 800x 109 plaquetas /L
-- 0.1mL plasma diludo
-- Homogeneizar, evitando a formao de bolhas
-- Adicionar 0.1mL de Ristocetina (4mg/mL)
Obs.: a concentrao final da ristocetina na reao ser de 1mg/mL
Acionar o cronmetro e inclinar o tubo de um lado para o outro

Obs.: para melhor visualizao colocar o tubo sobre um fundo
escuro e ao lado de uma fonte luminosa.
Registrar o tempo em que se formou um aglutinado visivelmente

grande
Fazer cada diluio em duplicata, ou em triplicata quando a diferena
entre as duplicatas for maior que 10%.
Controle: 0,2mL de plaquetas + 0,1mL ristocetina + 0,1ml tampo > 60min

Clculos
Utilizar papel em escala loglog de dois ciclos. Plotar os tempos de agluti

nao do plasma referncia versus a concentrao.
A atividade do cofator de ristocetina do plasma do paciente obtida a partir
da curva referncia e corrigida pela diluio.
O valor normal deve ser estabelecido em cada laboratrio, mas geralmente
se encontra entre 50a 150%.
61
Grfico 2 Clculo do cofator de ristocetina do paciente a partir da curva de

calibrao
T(s)
3 diluies do plasma do paciente
Curva referncia
25
50
100%
Preparo de plaquetas formolizadas

Quadro 6 Solues utilizadas para o preparo de plaquetas fixadas
Soluo de EDTA 0.2%
Soluo de fixao
Soluo de lavagem das

plaquetas
Soluo de suspenso
das plaquetas
2g EDTA disdico
8.5g NaCl
H2O destilada q.s.p. 1L
Acertar o pH da soluo para 6.4
20ml de soluo de formaldedo a 40% ou 22,2ml de
soluo de formaldedo a 36%
0.2g EDTA disdico;
8.5g NaCl;
0.4g fosfato hidrognio disdico;
1.1g fosfatodihidrogniosdico dihiddratado
1parte de soluo de citrato Trisdico 3.8%
5partes de soluo fisiolgica
Soluo de lavagem em pH = 7.4
Continua
62
Continuao
Soluo de estocagem
das plaquetas
0.2g EDTA disdico;

8.5g NaCl; 0.1g azida sdica
Fonte: Kitchen, S., 2010
Procedimento
Coletar o sangue em citrato de sdio 0.109M e preparar o plasma

rico em plaquetas (PRPcentrifugar o sangue total citratado
a150g por 10minutos).
Transferir o PRP para um tubo plstico, tampar, deixar em repouso
a temperatura ambiente por uma hora,
Transferir o tubo tampado para o banhomaria a 37C e incubar
por uma hora.
Misturar nove partes do PRP com uma parte de soluo de EDTA
e deixar por dez minutos a temperatura ambiente.
Adicionar o mesmo volume contido no tubo de soluo de fixao
e manter a 4C overnight.
Centrifugar a 280g por 20minutos.
Descartar o sobrenadante.
Ressuspender as plaquetas em 2% do volume inicial do PRP com
soluo de lavagem.
Acrescentar soluo de lavagem um volume equivalente a 25% do
volume inicial do PRP.
Manter a plaquetas ressuspensas a 4C por uma hora.
Centrifugar a 280g por 20minutos, descartar o sobrenadante,
ressuspender as plaquetas com a soluo de suspenso para uso
imediato. Caso contrrio, ressuspender as plaquetas com soluo
de estoque e manter a 4C at o uso.
A concentrao de ressuspenso deve ser de aproximadamente
800x 109plaquetas/l.
Obs: As plaquetas estocadas a 4C naturalmente se sedimentam.

Antes de iniciar o experimento, remover a soluo estoque por
centrifugao e reconstituir, com igual volume, com a soluo de
suspenso. As plaquetas fixadas mantidas a 4C tm estabilidade
de aproximadamente dois meses
63
Interpretao
O FvW:RCo na DvW tipo 3 indetectvel por todos os mtodos citados

devido ausncia ou a baixa quantidade do FvW:Ag. Nos pacientes com
estrutura normal do FvW (tipo 1), os valores so proporcionais aos do
FvW:Ag. Nveis plasmticos do FvW:RCo desproporcionais em relao aos
de FvW:Ag (normalmente encontrase relao <0.70) so caractersticos do
tipo 2da doena com exceo do subtipo 2N.
A determinao da atividade do cofator de ristocetina um teste impres
cindvel para o diagnstico da DvW, pois todos os tipos e subtipos (exceto
2N) apresentam atividade abaixo da normalidade.
Teste de ligao do fator de von Willebrand ao colgeno
Princpio
O FvW do plasma teste se liga ao colgeno ligado aos orifcios da micro

placa de Elisa que foi previamente sensibilizada. A segunda reao a de
ligao dos multmeros do FvW, capturados pelo colgeno, ao anticorpo
secundrio antiFvW conjugado enzima peroxidase. A atividade de ligao
determinada por adio do substrato especfico da enzima. A intensidade
de cor desenvolvida na reao proporcional quantidade de multmeros
de alto peso molecular presente no plasma teste.
Reagentes e materiais
64
Colgeno tipo I + III

Anticorpo de coelho antiFvW humano conjugado com peroxidase
Tris bsico
NaCl
Tween 20
Albumina
Citrato Trissdico
Na2HPO4
H3PO4
H2O230%
H2SO43M
Ortodiamino fenileno (1,2benzenodiamino) OPD
Microplaca com 96orifcios

Micropipetas de 1.000l e 200l
Micropipeta multicanal 200l
Quadro 7 Preparo de solues para o teste FvW:CB

Tampo de cobertura para sensibilizao da microplaca de Elisa, pH 7.4
Tris bsico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20mM
NaCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100mM
Albumina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5%
Tampo de lavagem da placa, pH = 7.4
Tris HCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20mM
NaCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100mM
Tween 20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.1%
Tampo de diluio das amostras e plasma calibrador
Tampo de lavagem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50ml
Albumina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.1%
Tampo do substrato OPD, pH 5.5reajustado com H3PO4
Citrato Trissdico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22mM
Na2HPO4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50mM
Fonte: Silva, S. S. S. C, 2002
Procedimento
Revestir a microplaca com 110l da soluo de colgeno (25g/ml)

Incubar por 18horas temperatura ambiente
Lavar a placa 3vezes com o tampo de lavagem
Revestir a microplaca com 220l de tampo de cobertura
Agitar a 150rpm por 1hora temperatura ambiente
Lavar a microplaca 3vezes com o tampo de lavagem
Preparar as amostras e curva referncia (ver a seguir)
Curva de referncia
Diluir o plasma referncia com o tampo de diluio
1:50(10l do plasma + 490l de tampo de diluio)
1:100(100l 1:50+ 100l de tampo de diluio)
1:1.600(100l 1:800+ 100l de tampo de diluio)
1:3.200(100l 1:1.600+ 100l de tampo de diluio)
65
Diluio das amostras teste

Se os nveis do FvW:Ag da amostra teste forem normais, diluir
1:100e 1:200com o tampo de diluio; se os nveis do FvW:Ag
da amostra teste forem baixos, diluir 1:50e 1:100com tampo
de diluio; se os nveis do FvW:Ag da amostra teste forem muito
baixos, diluir 1:20e 1:40com tampo de diluio; se os nveis
do FvW:Ag da amostra teste forem muito altos, diluir 1:200e
1:400com tampo de diluio.
Adicionar, na microplaca, em duplicata, 100l de cada diluio do
plasma referncia e das amostras teste.
Incubar por 2horas temperatura ambiente.
Lavar a microplaca 3vezes com tampo de lavagem.
Preparo do anticorpo secundrio
-- Diluir o anticorpo secundrio com o tampo de diluio (1g/ml)
-- Adicionar em todos os orifcios 100l de anticorpo secundrio
diludo.
-- Incubar a placa por 1hora temperatura ambiente sob agitao
(a 150rpm).
-- Lavar a microplaca 3vezes com tampo de lavagem
Preparo do substrato cromognico (no momento do uso)
Soluo de OPD 400g/ml em tampo do substrato cromognico
Adicionar 5l de H2O2para cada 12,5ml de soluo de OPD
Adicionar 100l do substrato em todos os orifcios.
Incubar a microplaca ao abrigo de luz por aproximadamente
20minutos.
Parar a reao com adio de 50l de H2SO43M em todos os
orifcios.
Aps 15minutos fazer a leitura colorimtrica a 492nm
Calcular a percentagem do FvW:CB a partir da curva referncia
traada em papel monolog (atividade versus densidade ptica)
Interpretao
Os pacientes com mutao no domnio A3do FvW, apresentam a relao dos

testes dos testes FvW:CB/FvW:Ag desproporcional (< 0.7) e proporcionalidade
na relao FvW:RCo/FvW:Ag (0.7 1.2).
66
A DvW do subtipo 2A apresenta relao FvW:CB/FvW:Ag e relao FvW:RCo/

FvW:Ag menor que 0.7. Isso devido ausncia dos multmeros de alto
peso molecular.
O subtipo 2M (presena de todos os multmeros) apresenta a relao FvW:CB/
FvW:Ag proporcional, porm desproporo na relao FvW:RCo/FvW:Ag.
9.1.4.3 Testes especiais
Agregao plaquetria com ristocetina
A RIPA avaliada por adio de diferentes concentraes de ristocetina ao
plasma rico em plaquetas do paciente em investigao. O teste realizado
com o auxlio de agregmetro de leitura ptica acoplado a um registrador.
Os resultados so expressos como a concentrao de ristocetina (mg/ml)
capaz de induzir 30% de agregao.
Outra forma de avaliao a utilizao de duas nicas concentraes finais
de ristocetina (0.6e 1.2mg/ml ) para a diferenciao de DvW subtipo 2B ,
pseudo von Willebrand ou DvW plaquetria do subtipo 2B
Tcnica
Materiais e reagentes
Tubos plsticos de 10ml
Pipetas automticas de 1.000l e 20l
Agregmetro acoplado a um registrador
Ristocetina 25mg/ml
Rgua de 30cm
Procedimento
Para a realizao do teste, o sangue do paciente e do controle do dia deve

ser colhido em citrato de sdio 3.2% (1volume de anticoagulante para
9volumes de sangue). Aps homogeneizao, o sangue centrifugado a
150x g por 10minutos temperatura ambiente para obteno do plasma
rico em plaquetas (PRP) e colocado em tubo plstico. O tempo entre a coleta
da amostra e a realizao do teste no deve exceder de 3a 4horas.
67
O registrador acoplado ao agregmetro deve ser reajustado velocidade de

corrida do papel de 2cm/minuto e o agregmetro calibrado para 100% de
transmitncia com plasma pobre em plaquetas (PPP) e 0% com o plasma
rico em plaquetas (PRP).
Um volume de 400ul de PRP adicionado no tubo de agregao e em
seguida a ristocetina 25mg/ml em concentraes finais que variam de 0.7a
1.2mg/ml para induzir 30% de aglutinao, que em papis convencionais
de registrador de agregmetro, corresponde a 4.8cm.
Interpretao
A agregao plaquetria dos pacientes que apresentam 30% de agregao

com concentraes acima de 1.2mg/ml so consideradas hipoaglutinantes
(a maioria dos tipos e sub tipos da doena). J os que apresentam 30% de
agregao com concentraes abaixo de 0.7mg/ml so consideradas hipe
raglutinantes (subtipo 2B e pseudo DvW).
A obteno de resposta normal ristocetina no descarta a doena, pois a
DvW tipo1plaqueta normal apresenta agregao normal com ristocetina.
Diferenciao laboratorial entre DvW 2B e pseudo doena de von
Willebrand
A DvW subtipo 2B e a pseudo DvW ou DvW tipo plaquetrio so heredi
trias com padres fenotpicos e sintomas clnicos semelhantes, mas com
diferentes etiologias.
A DvW subtipo 2B est associada a mutaes que levam a um ganho de
funo do FvW. Essas mutaes aumentam a ligao do FvW ao receptor
plaquetrio GpIb, resultando na interao espontnea do FvW a plaquetas,
na circulao, o que no ocorre com o FvW normal. J na pseudo DvW ocorre
uma maior ligao de FvW normal ao receptor Ib anormal da plaqueta.
Ambas as patologias apresentam resposta aumentada de agregao pla
quetria induzida pela ristocetina (0.3a 0.6mg/ml).
A diferenciao laboratorial pode ser feita por teste de agregao plaque
tria ou biologia molecular.
Teste de agregao plaquetria com 0.5mg/ml de ristocetina
68
Verificar se as plaquetas do paciente em investigao no apresen

tam agregao espontnea. Caso haja agregao espontnea, as
duas doenas esto descartadas.
Centrifugar o sangue do paciente e de um indivduo normal a 120x
g por 10minutos para a obteno do PRP, que deve ser mantido a
temperatura ambiente.
O restante do sangue, tanto do paciente quanto do indivduo
normal, deve ser centrifugado a 1.200x g para a obteno do PPP.
Transferir os PRPs com auxlio de pipeta plstica para dois tubos
cnicos distintos e ajustar o pH a 6.4com cido ctrico 0.2M
Retirar 1ml de PRP, tanto do paciente quanto do indivduo normal,
lavar 3vezes por centrifugao a 1.200x g com tampo Tyrode pH
6.4(8.0g NaCl; 0.2g KCl; 0.065g; NaH2PO4.2H2O; 0.415g MgCl2.
6H2O; 1.0g NaHCO3)
Cuidadosamente ressuspender as plaquetas lavadas do paciente
em 1ml de plasma do indivduo normal e as plaquetas lavadas do
indivduo normal em 1ml do plasma do paciente
Repetir a agregao plaquetria com ristocetina na concentrao
final de 0.5mg/ml, tanto das plaquetas ressuspensas no plasma do
indivduo normal quanto s plaquetas do indivduo normal ressus
pensas no plasma do paciente
Quadro 8 Diferenciao laboratorial de doena de Von Willebrand subtipo 2B e

pseudo doena de von Willebrand por agregao plaquetria com ristocetina na
concentrao final de 0.5mg/ml
PRP paciente
+
PPP paciente
Positivo
Positivo
Plaquetas lavadas do paciente

+
PPP do indivduo normal
Negativo
Positivo
Plaquetas lavadas do normal

+
PPP do paciente
Positivo = DvW 2B
Negativo = Pseudo DvW
Abreviao: DvW: doena de von Willebrand; PRP: plasma rico em plaquetas; PPP: plasma pobre em
plaquetas
Fonte: Kitchen S. e Col., 2010
69
Ligao do fator de von Willebrand ao fator VIII

Princpio
A avaliao da ligao do fator VIII:C ao FvW realizada por mtodos imu

nolgico e cromognico. O teste realizado em duas microplacas distintas.
Na primeira determinado o FvW:Ag e na segunda avaliada a ligao do
fator VIII:C ao FvW.
O teste de ligao fator VIII:CFvW se inicia pela captura do FvW do paciente
atravs de anticorpo policlonal, na microplaca. Em seguida, o fator VIII:C en
dgeno removido e substitudo por fator VIII recombinante em concentra
o definida. A quantidade de fator VIII recombinante pode ser determinada
por mtodo cromognico.
Os nveis de fator VIII recombinante que foram ligados ao FvW so
relacionados com a quantidade de FvW:Ag do paciente.
Tcnica
Preparo das microplacas para as reaes

Dia 1
Revestir duas microplacas (1e 2) de Elisa com anticorpo antiFvW
(7a 10g/ml)
Pipetar 125 l do anticorpo em cada orifcio, na microplaca
2deixando as duas ltimas colunas vazias.
Manter a microplaca em geladeira a 4C at o dia seguinte
Dia 2
Lavar a microplaca 3vezes com o tampo de lavagem (1), o mesmo
utilizado para determinao do FvW:Ag
Pipetar 250l do tampo de cobertura, o mesmo utilizado na de
terminao do FvW:Ag adicionado de 3% de albumina bovina
Incubar 3horas temperatura ambiente
Lavar a microplaca 3vezes com o tampo de lavagem (1)
Diluir as amostras (1/25) e o plasma referncia para a execuo da
curva de calibrao em tampo de diluio utilizado na determi
nao do FvW:Ag 1/25; 1/50; 1/100; 1/200; 1/400; 1/800; 1/1600o
que corresponde a 100%; 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,15% e
1.07%, respectivamente
70
Dia 3
Determinao de FvW:Ag e ligao FVIII:C FvW:
Na placa 1fazer a determinao do FvW:Ag
Na placa 2adicionar 100l de CaCl20,35M
Incubar temperatura ambiente por 60minutos sob agitao a 100rpm
Lavar a microplaca com tampo de lavagem (1) 6vezes
Adicionar 125l de anticorpo de coelho antiFvW humano na con
centrao de 0.43mg/ml de protena diludo em tampo de diluio
de anticorpo, o mesmo utilizado na determinao do FvW:Ag
Incubar a microplaca sob agitao a 370C por 30minutos
Lavar a microplaca com o tampo de lavagem (1) por 3vezes
Adicionar 100l de fator VIII recombinante de concentrao de 1U/
ml diludo 1:400em PBS contendo albumina a 2% e 0.1% de Tween 20
Incubar a microplaca por 2horas a 370C
Lavar a microplaca 3vezes com tampo de lavagem (1)
Adicionar 25l do tampo de diluio de amostra que acompanha o
kit de determinao de fator VIII:C por substrato cromognico
Nas duas ltimas colunas, que at ento estavam vazias, adicionar
25l, em duplicata, das seguintes diluies do plasma referncia no
mesmo tampo de diluio das amostras: 1/5; 1/10; 1/20; 1/40; 1/80;
1/160; 1/320e 1/640. Reservar dois orifcios para o branco (somente
tampo de diluio)
A seqncia de determinao deve ser seguida de acordo com o kit
comercial cromognico de determinao do fator VIII:C
Interpretao
Os pacientes com DvW 2N apresentam nveis normais de FvW:Ag e FvW:RCo

e estrutura multimrica normal, porm baixos nveis de fator VIII:C. O fen
tipo semelhante ao da hemofilia A, mas a herana gentica no ligada
ao cromossomo X, sendo autossmica recessiva.
Padro multimrico do fator de von Willebrand
O FvW composto por subunidades dimricas ligadas entre si por pontes
disulfeto formando complexos multimricos de baixo, intermedirio e alto
peso molecular variando de 8x 105a 15x 106daltons.
71
A separao eletrofortica em gel de agarose dos multmeros do FvW e a

visualizao so utilizadas para distinguir os diferentes subtipos da doena,
principalmente os subtipos 2A, 2B e 2M.
Princpio
O estudo do padro multimrico do FvW realizado por diferentes metodo

logias complexas com utilizao de equipamentos sofisticados e reagentes
caros, tornandoo vivel apenas aos laboratrios especializados.
De forma geral, o padro multimrico avaliado atravs de eletroforese
utilizando gel de agarose de 1% a 3% na presena de sulfato de dodecil
sdico (SDS). Os multmeros so separados, inicialmente, de acordo com o
peso molecular. Em seguida so transferidos para uma membrana de PVDF
ou nitrocelulose, onde ser realizada a reao com anticorpo primrio
(coelho antihumano) e secundrio (antiFvW conjugado com peroxida
se). At h pouco tempo, os multmeros eram visualizados diretamente no
gel de corrida com a adio de anticorpo radioativo, mas atualmente esta
tcnica est sendo abandonada, e substituda por substratos cromognicos
para enzimas conjugadas (luminol). O padro multimrico normal apresenta
uma srie de bandas divididas em grupos de baixo, intermedirio e alto peso
molecular.
Reagentes, materiais e equipamentos utilizados para anlise do padro mul
timrico.
Reagentes
Agarose SeaKem HGT (P) HGT

SDS (sulfato de duodecil sdico
EDTA
Citrato de sdio
Fosfato dissdico
Glicerol
Tris base
Glicina
Metanol
Tween 20
NaCl
72
Azul de bromofenol
Glicerol
Iodoacetamina
ECL Western blotting detection 1e 2(Amerrsham Life Science Ltda)
Anticorpo de coelho antihumano
Anticorpo de camundongo (ou equino) anticoelho conjugado com
peroxidase
Leite desnatado
Equipamentos
Cuba de eletroforese com refrigerao

Fonte de eletroforese
Cuba de transferncia (horizontal) com refrigerao
Agitador orbital de placa
Materiais
Membrana de PVDF 0.45 (polyvinylidene fluoride)
Cassete para autoradiografia
Papel filtro 3mm
Tcnica
Krizek DR e Rick ME descrevem um mtodo de visualizar os multmeros do

FvW que, segundo os autores, rpido em relao aos mtodos descritos
anteriormente.
Interpretao
Tipo 1 presena de todos os pesos moleculares, porm com quantidades

reduzidas
Tipo 2 ausncia dos multmeros de alto peso molecular, exceto no subtipo
2M, que apresenta padro multimrico normal
Tipo 3 ausncia ou reduo significativa de todos os pesos moleculares
Consideraes
Vrios fatores podem alterar os nveis plasmticos do FvW e conseqente

mente dificultar o diagnstico da doena. Um deles o grupo sanguneo
ABO. Indivduos com tipo sanguneo O apresentam nveis plasmticos de
73
FvW:Ag, fator VIII:C e FvW:RCo reduzidos em aproximadamente 25% em re

lao aos dos outros tipos sanguneos e, muitas vezes, so equivocadamente
diagnosticados como DvW do tipo 1. O maior determinante do diagnstico,
nesses casos, a manifestao hemorrgica.
Situaes como estresse, cirurgia, exerccio fsico, processo inflamatrio,
gravidez, uso contraceptivos orais, podem aumentar os nveis plasmticos do
FvW mascarando seus valores basais. Foi tambm demonstrado que os nveis
de FvW variam com o ciclo menstrual e valores mais baixos so detectados
entre os dias 1a 4do ciclo.
Diante das possveis variaes do FvW, a repetio dos testes laboratorial
quase uma constante, principalmente nos casos em que o paciente apresenta
sinais e sintomas caractersticos da doena.
Alm disso, as etapas pranalticas como, coleta e processamento do
sangue, podem comprometer significativamente os resultados.
9.1.5 Recomendaes para coleta e processamento da amostra

para os teste de diagnstico de doena de von Willebrand
Condies de flebotomia: A flebotomia deve ser a menos traumtica poss
vel e com garroteamento por at um minuto. Isto limita a liberao de fator
tecidual no stio de puno e, conseqentemente, a ativao dos fatores de
coagulao e liberao de FvW.
Estresse do paciente: crianas que se debatem, choram durante a coleta de
sangue ou adultos ansiosos podem apresentar nveis falsamente elevados
de FvW e fator VIII:C.
Alm das etapas pranalticas que podem alterar os resultados, os testes
laboratoriais utilizados no diagnstico da DvW tambm apresentam
variabilidades considerveis.
O teste FvW:RCo apresenta um coeficiente de variao (CV) de 20a 30%,
sendo este ainda maior quando a atividade do FvW estiver entre 12%15%.
Altos CV tambm so detectados nos testes de determinao do FvW:Ag e
FVIII:C (10 20%).
74
As vrias condies do paciente que podem levar a nveis aumentados de

FvW e fator VIII:C associadas aos possveis erros de coleta e processamento
da amostra e aos altos CV das determinaes desses fatores, podem dificultar
o diagnstico da DvW assim como na sua tipagem e subtipagem.
9.2 Hemofilia
A hemofilia uma doena hemorrgica hereditria caracterizada pela de
ficincia dos fatores VIII (hemofilia A) ou IX (hemofilia B). Da totalidade
dos casos, as hemofilias A e B compem 70%85% e 15%30% dos casos,
respectivamente. Os genes que codificam os fatores VIII e IX esto localizados
no cromossomo X. Desta forma, a doena afeta quase que exclusivamente
indivduos do sexo masculino, enquanto que a mulher portadora
habitualmente assintomtica. A apresentao clinica semelhante para as
duas deficincias e caracterizada por sangramento intraarticular (herma
trose), hemorragia muscular ou em outros tecidos ou cavidades e sistema
nervoso central. De acordo com os nveis circulantes dos fatores VIII ou IX, se
<1%, 15% ou >5a >40%, a hemofilia classificada como grave, moderada
ou leve, respectivamente.
Uma complicao que pode ser decorrente do tratamento da hemofilia
o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes da funo coagulante
do FVIII ou FIX. A presena destes anticorpos, conhecidos como inibido
res, dificulta a induo de hemostasia teraputica com concentrado de
fatores prejudicando o tratamento do paciente. A prevalncia de inibidores
varia de 1% a 5% entre pacientes com hemofilia B e de 10% a 30% entre
pacientes com hemofilia A. Pacientes com hemofilia e inibidor apresentam
sangramento mais duradouro e potencialmente de maior gravidade, alm
de requerer o uso de concentrados de fatores do tipo bypassing, que so
mais onerosos. A determinao dos inibidores deve ser realizada em todos os
pacientes com hemofilia ao diagnstico, antes e depois de procedimentos ci
rrgicos e com periodicidade mnima a cada 6meses se o paciente estiver em
tratamento com reposio de concentrado de fatores ou hemocomponentes.
75
9.2.1 Diagnstico laboratorial da hemofilia

O diagnstico laboratorial das hemofilias A e B consiste na realizao dos
testes. TTPA (teste de triagem), determinao de FVIII: C e/ou FIX: C, pesquisa
e quantificao de inibidor. Os testes seguem caractersticas especficas que
sero abordadas em tpicos distintos a seguir.
9.2.1.1 Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado
Como j descrito no captulo 8.2, o teste de TTPA consiste na recalcificao
do plasma na presena de grande quantidade de fosfolipdio e de um ativa
dor do sistema de contato. Desta forma um teste de triagem universalmen
te aceito para identificar anomalias no sistema intrnseco da coagulao, e,
portanto, para o diagnstico das hemofilias A e B.
9.2.1.2 Determinao da atividade coagulante dos fatores VIII e IX
A determinao dos nveis de FVIII: C ou FIX: C fundamental para o diag
nstico das hemofilias. A determinao dos nveis permite a classificao de
gravidade das hemofilias, que orientar o acompanhamento e tratamento.
Para a determinao do FVIII:C h atualmente dois mtodos disponveis:
(1) o mtodo de um estgio, conhecido como coagulomtrico e (2) m
todo de dois estgios, substitudo pelo mtodo cromognico. Para o FIX: C
encontrase disponvel apenas o mtodo (1).
O mtodo cromognico o mais recomendado para o diagnstico de
hemofilia devido a sua melhor reprodutibilidade quanto ao limite inferior da
curva. Este mtodo no depende de substrato deficiente de fator, eliminado,
assim, possveis interferncias de fator VIII residual. Alm disso, o teste no
influenciado pela presena de anticoagulante lpico e pode ser utilizado para
distinguir entre inibidor de fator VIII e anticoagulante lpico em pacientes
com deficincia de fator VIII adquirido. Por ltimo, o teste no sofre influ
ncia de reagentes especficos do mtodo coagulomtrico, tal como o TTPA.
Aproximadamente 30% de pacientes com hemofilia A leve causada por
mutao missense apresentam discrepncia de resultado quando os dois
mtodos so comparados. Normalmente, a atividade de fator no mtodo
cromognico menor comparada com o resultado no mtodo de um est
76
gio. Pelo menos 17mutaes diferentes foram identificadas em associao

com esta discrepncia entre os testes. Contudo, os reagentes para teste
cromognico do fator VIII tm um custo maior quando comparado ao m
todo de um estgio. Assim, o teste de um estgio ainda o mtodo mais
amplamente utilizado para a determinao dos nveis do FVIII:C. Para que
se possa diminuir todas as interferncias do teste, pontos relevantes para
uma melhor qualidade da anlise sero abordados a seguir.
O mtodo de um estgio baseado na habilidade de uma amostra do
paciente diluda encurtar o tempo de coagulao em um meio que adiciona
plasma deficiente em fator VIII ou IX, reagente para TTPA (fosfolipdio e
ativador de contato) e clcio. Devido a todos os fatores estarem em excesso
em relao ao fator VIII ou IX, o tempo de coagulao desta mistura
principalmente afetado pela atividade de fator VIII ou IX. Neste caso, o tempo
de coagulao reflete o resultado em uma linha linear entre o tempo de coa
gulao (escala linear) e diluio do plasma padro (escala logartmica). Um
importante prrequisito para este ensaio o paralelismo das diluies do
calibrador com as diluies do plasma do paciente. O noparalelismo pode
indicar a presena de um inibidor ou a presena de algum fator que no faz
parte da reao normal. Neste caso, o resultado desta anlise no deve ser
considerado. Conseqentemente, o resultado do FVIII:C deve ser realizado
em pelo menos trs diluies diferentes para anlise deste paralelismo.
Muitas variveis podem influenciar este ensaio e contribuir para um inde
sejvel alto coeficiente de variao e um desacordo na exatido do teste.
Para a minimizao deste problema, devese avaliar:
A Plasma de referncia
A atividade do FVIII: C lida atravs de uma curva de calibrao de um
plasma de referncia, que representa a correlao entre o tempo de coa
gulao e o FVIII:C. A atividade de FVIII:C no plasma expressa em UI dL1,
onde 100UI definido como atividade que presente em 1dL de pool de
plasma normal. A estimativa pode alterar o verdadeiro nvel de FVIII:C. Por
isso, fortemente recomendado a calibrao do plasma de referncia contra
um padro internacional de fator VIII da Organizao Mundial de Sade, que
pode ser obtido atravs do NIBSC. A calibrao deve ser realizada por uma
leitura paralela do plasma padro (NIBSC) e plasma padro local em pelo
77
menos quatro diluies. A potncia do padro local pode ser derivada destes
ensaios quando as duas curvas mostram paralelismo.
B Plasma deficiente
Uma importante caracterstica do teste de FVIII:C a qualidade do plasma
deficiente de fator VIII. No passado, plasmas de pacientes com hemofilia
grave foram bastante utilizados para este fim. Atualmente, o fator VIII pode
ser removido do plasma por procedimentos qumico ou imunolgico. A
primeira condio, e a mais importante para o plasma substrato deficiente,
a absoluta certeza da ausncia de fator VIII. Alguns estudos indicam
que o processo de retirada imunolgica pode conter maior quantidade de
fator residual, sendo esta, portanto, uma das causas da dificuldade de se
identificar a hemofilia A grave. H uma forte recomendao para que se
analise o FVIII:C residual do plasma deficiente e se rejeite os fabricantes com
FVIII: C residual igual ou maior que 1UI dl1.
O segundo requerimento a presena de excesso de todos os outros fatores,
exceo feita ao fator para o qual se deseja que o substrato seja deficiente.
A falta de um ou outro fator pode influenciar as informaes do resultado
e levar a uma curva no paralela entre o plasma referncia e o plasma do
paciente. A cada novo lote de reagente, devese testar estes dois reagentes.
Mtodo Manual. Neste manual optouse em descrever a tcnica manual
para a realizao do teste, pois entendese que a mesma deve ser o teste
principal para a validao dos processos realizados no laboratrio. Desta
forma, a automao deve seguir a mesma caracterstica da tcnica manual.
Material:
Tubos de vidro;
Banho Maria a 37C;
Micropipetas automticas de 100l, 200l e 1.000l;
Cronmetro.
Reagentes:
Plasma deficiente em fator VIII ou IX;

Cefalina (com slica como ativador);
Cloreto de clcio 0,025M;
78
Tampo imidazol, ph 7,4ou tampo Veronal ou NaCl 0,9% (o tam

po utilizado dever ser o mesmo para a curva padro e pacientes)
Curva de calibrao:
A curva de calibrao deve ter o mesmo tempo de validade que o lote do

reagente utilizado. Ao se abrir um novo lote de cefalina ou de plasmas
deficientes, ou ainda, se os controles normais e patolgicos no estiverem
dentro dos valores esperados, uma nova curva de calibrao deve ser
realizada.
Procedimento do teste
Diluir o plasma padro de referncia com tampo de escolha. A di

luio inicial especfica para cada fabricante do reagente de fator
VIII. Sendo assim, antes de se proceder diluio, devese consultar
as determinaes do fabricante. Veja o exemplo no quadro9 para
uma diluio inicial 1:5recomendada por um fabricante.
Quadro 9 Calibrao para dosagem de fator VIII

Tubos
Tampo
Calibrador
Misture e transfira
Diluio
Atividade do fator
1
0,8ml
0,2ml
0,5ml
1: 5
100%
2
0,5ml
0,5ml
1: 10
50%
3
0,5ml
0,5ml
1: 20
25%
4
0,5ml
0,5ml
1: 40
12,5%
5
6
7
0,5ml 0,5ml 0,5ml
0,5ml 0,5ml
1: 80 1: 160 1: 320
6,25% 3,12% 1,5%
Fonte: Montalvo S.A.L, 2011
A atividade de fator da diluio inicial ser correspondente a da bula do

calibrador (plasma padro de referncia).
Pipetar 0,1mL de cada diluio do calibrador em um tubo;
Adicionar 0,1mL do plasma deficiente de fator VIII ou IX e 0,1mL
de cefalina. Misturar e incubar por 3minutos a 37C;
Adicionar 0,1mL de cloreto de clcio 0,025M pr aquecido a 37
C e disparar, simultaneamente, o cronmetro;
Observar a formao do cogulo e parar o cronmetro ao primeiro
sinal de formao da fibrina. O teste dever ser realizado em
duplicata;
79
Colocar o valor encontrado (mdia da duplicata) no grfico, em papel

monolog, com as percentagens das diluies na abscissa e o tempo
em segundos na ordenada;
Marcar os pontos, traando uma reta. Esta ser a curva de calibrao.
Para a amostra teste realizar as trs primeiras diluies (1/5, 1/10,
1/20) e proceder conforme os passos anteriores. A amostra teste,
como j descrito, dever ser realizada em triplicata, sendo elas em
diferentes diluies.
Resultados: o valor obtido das trs diluies da amostra teste dever
ser interpolado na curva de calibrao obtida. Um paralelismo entre
os pontos calibrador x paciente dever ser encontrado. Ento, devese
calcular a mdia dos resultados em percentagem, respeitando um
coeficiente de variao de 5% entre as diluies. O Grfico3ilustra
um exemplo de curva de calibrao e o paralelismo.
Grfico 3 Curva de calibraoparalelismo na determinao de fator especfico

Tempo em
segundos
200
Teste
Calibrador
100
60
1/40
1/20
1/10
40
20
10
20 30 50
% Atividade de FVII:C
100
Fonte: Adaptado do Diagnosis of haemophilia and other bleeding disorders: a laboratory manual World
Federation of Hemophilia, 2000
9.2.1.3 Inibidores
Os testes de triagem/determinao de inibidor devem, sempre que poss
vel, ser realizados quando os nveis plasmticos de fator estiverem mais
80
baixos, isto , de preferncia, aps pelo menos trs dias da ltima infuso de
concentrado de fator. Altos nveis de fator podem mascarar a deteco do
inibidor. Uma vez constatada a presena de inibidor, para confirmao diag
nstica, imprescindvel uma segunda dosagem, que dever ser realizada
dentro de 34semanas aps a primeira dosagem. O sangue a ser colhido
para o teste NO deve ser proveniente de veia heparinizada, cateter ou de
sistemas de infuso tipo porthacath. Para que se determine se o paciente
desenvolveu um inibidor de baixa ou alta resposta de suma importncia
que se faam titulaes do inibidor mensalmente ou, pelo menos, a cada trs
meses. Esta conduta particularmente importante quando o tratamento do
paciente envolve a infuso de concentrado de fator VIII ou IX. A existncia de
um laboratrio capacitado para realizao de testes de triagem e de titulao
de inibidores essencial para que haja o acompanhamento e tratamento de
pacientes com hemofilia.
Tcnicas de deteco de inibidor
So trs as tcnicas que podem ser realizadas para a deteco de inibidor
em pacientes com hemofilia: teste de mistura, pesquisa de inibidor (ambos
testes de rastreamento) e quantificao de inibidor
Deteco do inibidor pelo teste de mistura
Inibidores da coagulao que afetam o teste TTPA podem ter uma ao

imediata ou ser tempodependente. O plasmateste, que contm um inibidor
de ao imediata, quando misturado com plasma normal (pool de plasma
normal), apresenta pouca ou nenhuma correo do tempo de coagulao.
No caso de inibidores tempodependente, que so a maioria dos inibidores
em pacientes com hemofilia A congnita, a incubao por 2horas a 37C
antes da realizao do teste de mistura fundamental para confirmao ou
excluso da presena do inibidor.
Uma boa correo (em segundos) do TTPA, aps a mistura com plasma
normal, dever ser maior que 50% da diferena entre o TTPA do paciente
prmistura e o TTPA do pool de plasma normal, conforme o exemplo do
Quadro 10. Valores limtrofes podem requerer repetio do teste, pesquisa e/
ou quantificao de inibidor, alm de anlise conjunta com os dados clnicos.
81
Quadro 10 Exemplo de clculo da correo do TTPA pela mistura com pool de

plasma normal
Amostra
Pool de plasma normal (A)
Plasma Teste prmistura (paciente) (B)
Plasma teste aps mistura (C)
Clculo
Correo em segundos
Diferena entre B e A
Anlise: correo em segundos (18s)
deve ser maior que 50% da diferena
entre B e A
TTPA em segundos
35segundos
60segundos
42segundos
B C 6042=18
6035=25
18> (25/2=12,5)
Concluso. correo eficaz
Fonte: WFH, 2000, adaptado
Deteco do Inibidor pelo teste de pesquisa de inibidor
Neste tipo de teste, o pool de plasma normal e o plasmateste so incubados

separadamente a 37C por 2horas, assim como a mistura (volume/volume) do
pool de plasma normal com o plasmateste. O TTPA ento determinado: (1)
no pool de plasma normal, (2) no plasmateste, (3) na mistura incubada e (4)
em uma nova mistura com partes iguais de plasmateste e do pool de plasma
normal (volume/volume) preparada depois da incubao (mistura imediata).
A no correo do TTPA nas misturas 3ou 4sugere a presena de um inibi
dor que poder ser de deteco imediata (mistura 4) ou tempodependente
(mistura 3).
Mtodo
4tubos plsticos so preparados: A, B, C e D.

Adicionar um volume de plasma normal (pool) no tubo A, um
volume de plasmateste no tubo B e uma proporo (volume/
volume) de cada tubo (A e B) no tubo C.
Incubar por 2horas a 37C.
Fazer uma nova mistura (volume/volume) do plasma do tubo A e B
adicionando esta mistura ao tubo D (Mistura imediata).
Realizar o TTPA em duplicata no material dos tubos A, C, D e B
(nesta seqncia).
82
Resultados e Interpretao
Tendo em vista os possveis resultados, alguns exemplos esto descritos no

Quadro 11.
Quadro 11 Exemplos de resultado de testes para deteco de presena de
inibidores
Amostra (tempo em segundos)
Exemplo 1 Exemplo 2 Exemplo 3
A Plasma Normal (pool)
40
40
40
B Plasma Teste
90
90
90
C Plasma teste e plasma normal (mistura incubada)
45
70
70
D Plasma teste e plasma normal (mistura imediata)
45
48
70
Fonte: World Federation of Hemophilia. Diagnosis of haemophilia and other bleeding disorders: a labo
ratory manual, 2000, adaptado
Exemplo 1: Houve correo na mistura incubada e na mistura imediata. Isto

sugere deficincia de fatores da via intrnseca ausncia de inibidor.
Exemplo 2: Houve correo na mistura imediata, mas no houve correo
na mistura incubada. Isto sugere presena de inibidor tempo e temperatura
dependente presena de inibidor.
Exemplo 3: No houve correo em nenhuma das misturas. Isto sugere
presena de um inibidor de ao imediata presena de inibidor.
Obs. Para anlise dos resultados, a seo Deteco do inibidor pelo teste de
mistura, (p. 81) pode ser utilizada.
Quantificao de inibidor
Uma vez detectada a presena do inibidor pelos testes de rastreamento
relatados no captulo anterior, tornase imperativa a quantificao do
mesmo. Vrios mtodos tm sido descritos para se realizar a quantificao
de inibidor em hemofilia. No entanto, o mtodo de Bethesda, inicialmente
descrito por Kasper e cols. em 1975 e recentemente modificado pelo
protocolo de Nijmegen (Verbruggen et al., 1995) o mais utilizado e o
recomendado pela Federao Mundial de Hemofilia.
Mtodo Bethesda
A verso original ou o mtodo clssico de Bethesda envolve a mistura da

amostra do paciente com um mesmo volume de pool de plasma normal
83
(plasma com nvel de fator VIII conhecido). Como a maior parte dos
anticorpos associados a hemofilia A congnita so tempo e temperatura
dependentes, a mistura deve ser incubada por 2horas a 37C antes de se
realizar a dosagem de fator VIII. Simultaneamente, o mesmo volume do pool
de plasma normal (plasma com nvel de fator VIII conhecido) misturado
com o tampo diluente para uma anlise em paralelo (Figura 3A).
Figura 3 Ilustrao esquemtica dos testes de Bethesda (A) e Bethesda
modificado por Nijmegen (B).
Teste Clssico de Bethesda
Plasma
normal
Plasma do
paciente
Tampo
imidazol
(pH 7,3)
Mistura 50/50
Incubao
2h a 37C
Testes FVIII
Teste de Bethesda modificado por Nijmegen
Plasma do
paciente
Plasma
normal
tamponado
(pH 7,4)
Plasma
deficiente
de FVIII
Reagente A
Reagente B
Reagente C
Mistura 50/50
Incubao
2h a 37C
Mistura 1
Mistura 2
Testes FVIII
Fonte: Brasil. Ministrio da Sade. Manual de diagnsticos e tratamento de eventos hemorrgicos, 2008
Mtodo Nijmegen (Bethesda modificado)
A variao de Nijmegen do mtodo de Bethesda envolve duas modificaes

(Figura 3B): (1) o pool de plasma normal tamponado e estabilizado com
84
imidazol e (2) o plasma controle misturado com o plasma deficiente em

fator VIII ao invs de tampo com o pool de plasma normal tamponado.
Estas modificaes, alm de diminuir a possibilidade de falso positivo,
reduzem o coeficiente de variao, em comparao com o teste clssico
de Bethesda, melhorando, assim, a confiabilidade do teste. Adicionalmente,
estudos mostraram que as diferentes maneiras de se obter o substrato de
fator VIII comercial (por meio imunolgico ou qumico), quando utilizado
nesta tcnica, tm influncia significativa nos valores obtidos de ttulos de
inibidor. Sendo assim, foi demonstrado que o substrato de fator VIII pode
ser substitudo por uma soluo a 4% de soro de albumina bovina (BSA,
Sigmafraction V).
A mesma tcnica poder ser utilizada para a determinao do inibidor de
fator IX, mas o tempo de incubao para esta determinao poder ser de
apenas 10minutos, uma vez que o inibidor de fator IX no apresenta carter
tempodependente.
Tcnica para realizao do teste Bethesda Modificado por Nijmegen
Preparo do plasma Controle (mistura 2)
Preparar o pool de plasma normal tamponado (reagente A): adicionar imi

dazol slido (Merck, Damstadt, Germany) ao pool de plasma normal na con
centrao final de 0.1M. Ajustar para o pH 7.4com adio lenta de HCl 1N
em constante agitao do plasma a 4C.
Mistura 2: misturar 1parte do pool de plasma normal tamponado (reagente
A) com 1parte de plasma deficiente em FVIII ou soluo a 4% de BSA
(reagente B) (volume/volume).
Preparo da amostrateste (mistura 1):
Mistura 1: misturar 1parte do plasma do paciente (reagente C) com 1parte

de pool de plasma normal tamponado (reagente A) (volume/volume)
Repetir o procedimento anterior a fim de obter diluies 1:2, 1:4, 1:8do
plasma do paciente. Estas diluies devem ser realizadas com o plasma
deficiente em fator VIII quando este for utilizado no controle (reagente B) ou
a soluo de 4% BSA quando esta for utilizada como controle (reagenteB).
85
Caso haja suspeita de inibidor de alto ttulo, estas diluies podem ser
aumentadas. Exemplo:
Tubo 1: 1volume do plasma teste diludo 1:2com plasma deficiente em fator
VIII ou soluo a 4% de BSA + 1volume do pool tamponado (reagente A).
Anlise:
Incubar a mistura 1com as suas possveis diluies (exemplificadas acima

como tubo 1, tubo 2, tubo 3) e a mistura 2por 2horas a 37C.
Realizar a dosagem da atividade de FVIII:C de cada diluio (exemplificadas
acima como tubo 1, tubo 2, tubo 3)
Clculo da Quantidade de Inibidor:
Clculo da atividade de fator residual: o valor da atividade de fator VIII de

cada diluio (mistura 2) dever ser dividido pelo valor da atividade de fator
VIII encontrado no plasma controle (mistura 1) e multiplicado por 100. A
atividade residual de fator VIII versus a unidade Bethesda plotada em papel
mono log em uma escala aritmtica (Grfico 4).
Por definio, uma unidade Bethesda corresponde quantidade de inibidor
capaz de neutralizar 50% da atividade de fator VIII plasmtico, aps incu
bao por 2horas a 37C. A atividade residual de 100% o mesmo que
0unidade Bethesda, sendo possvel ter um grfico que tenha correlao
entre atividade de fator VIII residual e o ttulo de inibidor. importante notar
que o ttulo de inibidor dever ser plotado em um grfico quando a atividade
de fator residual estiver entre 25e 75% (Grfico 4). Para o clculo final de
unidades Bethesda, devese considerar a diluio cujo fator residual estiver
mais prximo de 50%.
Os pontos so plotados em um grfico log linear com valores prximos de
100%, 50% e 25% de atividade residual, correspondendo a 0, 1e 2Unidades
Bethesda, respectivamente.
86
No exemplo anterior, o plasma A testado nas diluies 1:10, 1:20e 1:40(estas

diluies, assim como da figura a seguir so apenas um exemplo, podendo
ser realizadas as diluies 1:2, 1:4, 1:8, conforme descrito anteriormente).
O ttulo final obtido multiplicandose o valor obtido pelo fator de diluio
correspondente. Notar que as amostras evidenciaram unidades semelhantes
de inibidor nas diversas diluies. Este resultado o mais freqentemente
encontrado. No entanto, como a cintica de reao dos anticorpos pode
ser varivel, ttulos muito diferentes de inibidores podem ser obtidos numa
mesma amostra. A Grfico 5demonstra esse cenrio.
Grfico 4Ilustrao
Exemplogrfica
1do clculo
da atividade
residual
do fator VIII
da atividade
coagulante
de FVIII
FVIII
Residual
(%)
Plasma Diluio
100
75
FVIII % Unidade X Unidade

Residual Diluio Bethesda
1:10
30
1.75 x 10
1:20
55
0.87 x 20
17.5
17.4
1:40
70
0.45 x 40
18.0
50
25
10
1.0
2.0
Unidade Bethesda por ml de plasma
Ref.: WFH Laboratory Sciences Communittee
Em casos como este, o resultado deve ser baseado na menor titulao, isto
, 1:10. Valores menores que 0,6UB por ml de plasma so considerados
negativos. No entanto, importante que se estabelea o valor de refern
cia negativo em cada laboratrio, atravs da determinao plasmtica de
inibidor de fator VIII em um nmero representativo de indivduos normais.
87
Grfico 5Ilustrao
Exemplogrfica
2do clculo
da atividade
residual
do fator VIII
da atividade
coagulante
de FVIII
FVIII
Residual
100
(%)
Plasma Diluio
B
75
50
FVIII % Unidade X Unidade

Residual Diluio Bethesda
1:10
50
1.00 x 10
10
1:20
47
1.10 x 20
22
1:40
45
1.20 x 40
40
25
10
1.0
2.0
Unidade Bethesda por ml de plasma
Ref.: WFH Laboratory Sciences Communittee
Observao sobre os volumes usados nas reaes:
Vrios fatores influenciam o volume a ser usado nas reaes descritas acima,
entre eles mtodo (manual x automatizado), volume de plasma disponvel
(adulto x criana), etc. Desta forma, o volume deve ser definido em cada
laboratrio, devendo ser respeitada a proporo volume a volume. Em geral,
volumes na ordem de 0,2a 1ml so adequados para os testes.
9.3 Coagulopatias raras

A anlise dos resultados dos testes de triagem orienta a escolha do teste de
diagnstico (dosagem especfica de fator) a ser realizado subsequentemente,
conforme descrito no Quadro 12.
88
Quadro 12 Correlao do teste de triagem com a dosagem especfica de fator

Deficincias
TP
TTPA
Teste da
Mistura
Via Extrinseca
Deficincia de fator VII
prolongado
Normal
no se aplica
Via Intrnseca
Deficincias de fator VIII, IX ou XI
Anticorpo antifosfolipdeo
Anticorpos antiVIII ou IX
Normal
prolongado
Freqentemente
prolongado
Normal
prolongado
Normal
Via Comum
Deficincias Congnitas
Fatores X, V ou protrombina
A/Hipo/Disfibrinogenemia
Hepatopatia/carncia de vitamina K
Moderada
Grave
Anticoagulantes
Heparina
Antivitamina K
Superdosagem de Heparina/
antivitamina K
prolongado
prolongado
prolongado
prolongado
Normal
prolongado
prolongado
prolongado
prolongado
Normal
prolongado
prolongado
Normal
prolongado
Corrige
No h
correo
Pode ou no
haver correo
Corrige
Corrige
Corrige
Abreviaes: TP, tempo de protrombina; TTPA, tempo de tromboplastina parcial ativada; TTPA (1/2),
Teste da Mistura
Fonte: Hmatologie en pratique clinique: guide de diagnostic et de traitement. Robert S. Hillman;
Kenneth A. Ault; Henry M. Rinder. Mdecine-Sciences Flammarion, 2007
Neste captulo, as deficincias de fatores consideradas raras sero abordadas

de forma sucinta, evidenciando os mtodos laboratoriais disponveis para
seu diagnstico.
9.3.1 Deficincia de fator VII

A deficincia hereditria de fator VII uma doena rara, transmitida de
forma autossmica recessiva, resultando em uma doena hemorrgica de
gravidade varivel. A suspeita da deficincia de fator VII levantada pelo
prolongamento do TP com TTPA normal.
O nvel de fator VII pode ser avaliado por meio de ensaios funcionais, como o
mtodo por coagulao em uma etapa. A leitura minuciosa das orientaes
89
do fabricante dos reativos importante para a realizao do procedimento

de acordo com as Boas Prticas de Laboratrio de Coagulao (BPLC).
Mtodo funcional
Tcnica em uma etapa:
Fundamento:
Consiste em medir o TP em uma mistura contendo a diluio do plasma
a testar, um plasma substrato deficiente em fator VII, com concentrao
normal de todos os demais fatores da coagulao, na presena de fosfolpi
des e clcio. Pode ser realizada em banhomaria a 37C pelo mtodo manual,
bem como, em equipamentos semi e totalmente automatizados.
Realizase uma curva de calibrao com diluies sucessivas do pool de
plasma de referncia em tampo. O tipo de tromboplastina pode influenciar
no resultado do teste.
Material e mtodos
Plasma Substrato deficiente em fator VII

Tampo Imidazol, ou Veronal, ou Owren
Plasma de referncia
Amostra teste
Devese reconstituir o reativo de tromboplastina de acordo com as indica

es do fabricante e praqueclo a 37C;
Curva de calibrao: devese realizar diluies seriadas do plasma de refe
rncia, em tampo, partindo de uma diluio de 1/5ou 1/10(de acordo com
o fabricante), equivalendo a 100%. aconselhvel que a curva de calibrao
possua no mnimo 6pontos.
Os tubos com as diluies para a curva de calibrao e as do paciente a testar
no devem permanecer alm de 30minutos em temperatura ambiente,
podendo ser mantidos em banho de gelo.
90
Colocar em tubo de vidro a 37C.

Cada diluio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Substrato deficiente em fator VII . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Misturar e incubar por 1minuto a 37C e adicionar:
Tromboplastina clcica pr aquecida a 37C . . . . . . . . . . . . 200l
Medir o tempo para formao do cogulo. Realizar testes em duplicata.
Resultados
Plotar a percentagem da diluio na abscissa em papel dilogaritmo, e o

tempo em segundo na ordenada.
Valores de referncia
O valor de referncia deve ser estabelecido localmente.
9.3.2 Deficincia de fator V

A deficincia do fator V foi descrita em 1947, por Owren. uma defici
ncia rara, transmitida de forma autossmica recessiva, com prevalncia
de 1:1.000.000. O quadro clnico varivel. A condio heterozigtica
geralmente no apresenta sintomatologia clnica, enquanto, a homozigtica
apresenta sintomas leves, moderados ou graves. O diagnstico suspeitado
pelo prolongamento do TP e do TTPA. O nvel de fator V avaliado em um
laboratrio por meio de ensaio funcional, como o mtodo por coagulao
em uma etapa, semelhante ao TP e por mtodo imunolgico.
91
Mtodo funcional
Fundamento:
Consiste em medir o TP em uma mistura contendo a diluio do plasma a
testar, um plasma substrato deficiente em fator V, com concentrao normal
de todos os demais fatores da coagulao, na presena de fosfolpides e
clcio. realizada em banhomaria a 37C por mtodo manual, bem como,
em equipamentos semi e totalmente automatizados.
Realizase uma curva de calibrao com diluies sucessivas do plasma
de referncia em tampo. O tipo de tromboplastina pode influenciar no
resultado do teste.
A leitura minuciosa das orientaes do fabricante dos reativos importante
para a realizao do procedimento de acordo com as BPLC.
Material e mtodos
Plasma Substrato deficiente em fator V

Plasma de referncia
Amostra problema: plasma citratado pobre em plaquetas
Antes da realizao dos testes, caso as amostras plasma de referncia e

problema estejam congeladas, devem ser descongeladas rapidamente a
37C, principalmente em se tratando dos fatores VIII e V, que so fatores da
coagulao termolbeis.
Devese reconstituir o reativo de tromboplastina de acordo com as indica
es do fabricante, e praqueclo a 37C.
Curva de calibrao: devese realizar diluies seriadas do plasma de refe
rncia, em tampo, partindo de uma diluio de 1/5ou 1/10(de acordo com
o fabricante), equivalendo a 100%. aconselhvel que a curva de calibrao
possua no mnimo 6pontos.
92
Os tubos com as diluies para a curva de calibrao e as do paciente a

testar no devem permanecer alm de 30minutos a temperatura ambiente,
podendo ser mantidas em banho de gelo.
Cada diluio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Substrato deficiente em fator V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Misturar e incubar por 1minuto a 37C, e adicionar.
Tromboplastina clcica pr aquecida a 37 C . . . . . . . . . . . .200l
Medir o tempo para formao do cogulo. Realizar em duplicata.
Resultados
Plotar a percentagem da diluio na abscissa em papel dilogaritmo, e o

9.3.3 Deficincia de fator X

O fator X ocupa uma posio nica na cascata da coagulao como a
primeira enzima envolvida no mecanismo comum de formao do cogulo.
O fator X foi identificado na dcada de 50por dois grupos independentes.
Em 1956, Teifer et al. descreveram uma tendncia a sangramento em uma
mulher de 22anos de idade. Ela apresentou um tempo alterado do teste
de gerao de tromboplastina e TP prolongado. Aps um ano, Hougie et
al. descreveram parmetros anormais da coagulao em um homem de
36anos, que apresentava TTPA prolongado, teste de gerao da trombo
plastina alterado e prolongamento do teste do veneno da vbora Russell.
um distrbio raro, de herana autossmica recessiva, com uma incidncia
de 1:1.000.000na populao geral.
Vrios polimorfismos, que parecem no afetar os nveis do fator, foram
identificados no gene que codifica o fator X. H pouca correlao entre a
93
atividade de fator X e o risco de sangramento. Classicamente, o TP e o TTPA

apresentamse prolongados.
O nvel de fator X pode ser determinado por 5diferentes exames. Exames
baseados no TP, de 1etapa, ou no TTPA so suficientes para o diagnstico.
Mtodo Funcional
Tcnica em uma etapa
Este o mtodo mais utilizado para dosagem de fator X, que consiste na de

terminao do tempo de coagulao, na presena de tromboplastina, em um
sistema no qual todos os fatores esto presentes, constantes e em excesso,
com exceo do previsto na amostra a testar.
Material
Plasma substrato deficiente em fator X

Plasma de referncia
Reconstituir o reativo de tromboplastina de acordo com as indicaes do

fabricante e praqueclo a 37C;
Curva de calibrao: realizar diluies seriadas do plasma de referncia, em
tampo, partindo de uma diluio de 1/5ou 1/10(de acordo com recomen
dao do fabricante), equivalendo a 100%. aconselhvel que a curva de
calibrao possua no mnimo 4pontos.
Cada diluio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Substrato deficiente em fator X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Medir o tempo para formao do cogulo. Realizar teste em duplicata.
94
Resultados
Os resultados se expressam em unidades/ml (U/ml) ou em %. A cada lote de

reativos deve ser realizada uma nova curva de calibrao com diluies de
plasma de referncia em tampo.
Plotar a percentagem da diluio na abscissa em papel dilogaritmo e o
9.3.4 Deficincia de fator XI

A deficincia de fator XI, tambm chamada de doena de Rosenthal,
transmitida por herana autossmica recessiva, afetando assim, homens e
mulheres. Muito mais rara que as hemofilias A e B, apresenta incidncia de
5% na populao de judeus Ashkenazes da Europa Central.
Geralmente apresenta um quadro hemorrgico de moderada gravidade,
podendo ser diagnosticado somente durante interveno cirrgica, mediante
sangramento per ou psoperatrio.
Mtodo Funcional
Tcnica em uma etapa
Baseiase na tcnica do TTPA cujo principio medir o tempo de coagulao

de uma mistura de ativador, substrato deficiente em fator XI, plasma a testar,
fosfolpides e clcio.
Materiais e mtodos:
Plasma deficiente em fator XI

Tampo Imidazol, pH 7,3
Reativo para realizao de TTPA
Cloreto de Clcio 0.025M
Plasma de referncia
95
Curva de calibrao: realizar diluies seriadas do plasma de referncia, em

tampo imidazol, partindo de uma diluio de 1/10, que equivale a 100%.
aconselhvel conservar estes tubos em banho de gelo at a realizao do
procedimento.
Colocar em tubo.
Substrato deficiente em fator XI . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50l
Plasma do paciente diludo 1/10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50l
Reativo para realizao de TTPA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Incubar a 37C por 1minuto e adicionar:
Cloreto de Clcio 0.025M pr aquecida a 37 C . . . . . . . . . . 100l
9.3.5 Deficincia de fator XII

A deficincia de fator XII um distrbio autossmico recessivo cujas impli
caes clnicas continuam controversas.
Apesar de esta deficincia resultar em TTPA prolongado, os pacientes no
apresentam hemorragia, nem risco hemorrgico. Existem relatos de asso
ciao desta deficincia com trombose.
Mtodo Funcional:
Materiais e mtodos Plasma deficiente em fator XII

Tampo Imidazol, pH 7,3
Reativo para realizao de TTPA
Cloreto de Clcio 0.025M
Plasma de referncia
Curva de calibrao: realizar diluies seriadas do plasma de referncia em

tampo imidazol, partindo de uma diluio de 1/10, equivalendo a 100%.
96
aconselhvel conservar estes tubos em banho de gelo at a realizao do

procedimento.
Colocar em tubo
Substrato deficiente em fator XII . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50l
Plasma do paciente diludo 1/10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50l
Reativo para realizao de TTPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Incubar a 37C por 1minuto e adicionar:
Cloreto de clcio 0.025M pr aquecida a 37C. . . . . . . . . . . 100l
9.3.6 Deficincia de fator XIII

A deficincia congnita de fator XIII um distrbio raro da coagulao,
primeiramente descrito por Duckert et al., em 1960. O fator XIII respons
vel pela estabilizao do cogulo. A deficincia de fator XIII est associada
a sangramento clnico. Nos casos graves, com menos de 5% de atividade
do fator, os pacientes podem apresentar sangramento de coto umbilical
ao nascimento e hemorragia intracraniana, sendo ambas as manifestaes
caractersticas da forma grave da doena.
O modo de herana gentica parece ser autossmica recessiva, com pre
valncia de 1caso para cada 15milhes de habitantes. Os resultados dos
testes de TP, TTPA, fibrinognio e contagem de plaquetas esto dentro dos
parmetros de normalidade. A mensurao indireta do fator XIII atravs do
mtodo do princpio da solubilidade em soluo de uria 5M ou soluo
de cido actico a 1% aceitvel como um teste de triagem simples e es
pecfico, embora de metodologia demorada. Alm disso, estes testes so de
baixa sensibilidade, estando alterados somente nas deficincias graves de
fator XIII. Assim, desejvel que testes enzimticos de maior sensibilidade
sejam realizados para confirmao, deteco de casos leves/moderados da
deficincia e estudos familiares.
97
O quadro hemorrgico aparece somente em pessoas homozigotas com

atividade de fator XIII inferior a 5%, enquanto que as heterozigotas so
assintomticas.
Procedimento teste de solubilidade do cogulo em uria 5M ou cido actico 1%
Fundamento:
A fibrina formada, na ausncia de fator XIII, se dissolve em uria 5M ou em
cido actico 1%.
Colocar em um tubo de Kahn:
Plasma do paciente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200l
Soluo de cloreto de clcio 0.025M . . . . . . . . . . . . . . . . 200l
Trombina (10UI/ml) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Misturar e incubar por 30minutos a 37C. Retirar do banho e adicionar:
Soluo de uria 5M ou cido actico 1% . . . . . . . . . . . . . 3ml
Estas solues devem ser preparadas no momento do uso.
Aps tampar os tubos, misturar por inverso para favorecer que o cogulo
se desprenda da parede do tubo, deixandoo em seguida em temperatura
ambiente.
Observar a dissoluo do cogulo aps 30minutos, 1, 2, 4e 24horas, aps a
dissoluo do cogulo. Em se tratando da soluo de cido actico, observar
o cogulo aps 10e 30minutos.
O tempo de dissoluo diretamente proporcional a concentrao de
fator XIII presente no plasma. Este tempo de observao no deve exceder
24horas aps adio das solues citadas.
9.3.7 Deficincia de fibrinognio (fator I)

Alteraes na molcula de fibrinognio comprometem a fase final da coa
gulao. Estas alteraes podem ser de natureza quantitativa ou qualitativa.
A hipofibrinogenemia e a afibrinogenemia so relacionadas com uma altera
o quantitativa de fibrinognio. So doenas hereditrias raras transmitidas
98
de modo autossmico recessivo. A disfibrinogenemia, anomalia qualitativa

que resulta na produo de fibrinognio anormal, mais freqente.
A classificao da deficincia facilitada aps a comparao dos resultados
obtidos pelo mtodo de Clauss, que determina a quantidade de fibrinognio
funcional. Este o mtodo mais utilizado, estando disponvel para determi
nao manual ou automatizada.
Mtodo de Clauss
Fundamento:
Em presena de um excesso de trombina, o tempo de coagulao de um
plasma diludo de forma adequada inversamente proporcional concentra
o de fibrinognio plasmtico. O tempo de coagulao obtido comparado
posteriormente com uma preparao de fibrinognio padronizada.
Material e mtodo
Plasma citratado pobre em plaquetas

Tampo de Owren pH 7.35
Calibrador para fibrinognio
Trombina
Plasma diludo (calibrador ou paciente) . . . . . . . . . 200l
Incubar a 37C por 2minutos

Acionando o cronmetro, adicionar a trombina . . . . . . . . . 200l
Registrar e plotar os valores em segundos encontrados em papel dilog das
diluies da amostra, do calibrador e do paciente.
As diluies da curva de calibrao devem ser escolhidas de forma que o
tempo de coagulao obtido fique compreendido entre 8e 25segundos.
Este intervalo freqentemente obtido em diluio 1:10do calibrador em
tampo Owren pH 7,35, equivalente a uma concentrao de fibrinognio
de 1,5a 4g/l.
Caso a concentrao de fibrinognio do paciente seja inferior ao tempo de
8segundos ou superior a 25segundos, devese repetir o teste utilizando
diluies de 1:20e 1:5, respectivamente, fazendo os ajustes em funo dos
fatores de concentrao.
99
9.3.8 Deficincia de fator II (protrombina)

A deficincia de fator II transmitida de modo autossmico e recessivo,
sendo a forma grave muito rara. A deficincia pode ser quantitativa, na qual
concentrao e atividade so comparveis, tal como na hipoprotrombinemia
ou qualitativa com concentrao normal e atividade diminuda, tal como na
disprotrombinemia.
O diagnstico da deficincia sugestivo a partir de um prolongamento do TP,
discreto prolongamento do TTPA e TT normal. O diagnstico realizado com
a determinao do TP e a dosagem imunolgica da protrombina, que permite
distinguir uma hipoprotrombinemia do quadro de uma disprotrombinemia.
Material e Mtodo
Plasma substrato deficiente em fator II

Tampo Michaelis pH 7.35
Plasma de referncia
Antes da realizao dos testes, caso as amostras, plasma de referncia e

plasma teste, estejam congelados, as mesmas devem ser descongeladas
rapidamente a 37C. Reconstituir o reativo de tromboplastina de acordo
com as indicaes do fabricante e praqueclo a 37C.
Curva de calibrao: realizar diluies seriadas do plasma de referncia,
em tampo, partindo de uma diluio de 1/5ou 1/10, equivalendo a 100%.
aconselhvel que a curva de calibrao possua no mnimo 6pontos. Os
tubos com as diluies para a curva de calibrao e as do paciente a testar
no devem permanecer alm de 30minutos a temperatura ambiente, sendo
aconselhvel manter em banho de gelo.
Cada diluio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
Substrato deficiente de fator II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100l
100

Medir o tempo para formao do cogulo. Realizar teste em duplicata.
Resultados
Plotar a porcentagem da diluio na abscissa em papel dilogaritmo, e o

tempo em segundos na ordenada. Em coagulmetros automatizados, os
volumes utilizados so diferentes, alguns aparelhos realizam diluies das
amostras automaticamente e a padronizao depende dos mesmos.
Valores de referncia:
101
10 Plaquetopatias
10.1 Introduo
As plaquetas so fragmentos citoplasmticos, anucleados, derivados dos
megacaricitos. Circulam na periferia do vaso na forma discide com di
metro que varia de 2a 4 e com espessura de 0.9. Quando ativadas
emitem pseudpodes e mudam para a forma esfrica. No sangue perifrico,
o nmero dessas clulas pode variar de 150.000a 450.000/mm3.
No mecanismo hemosttico, as plaquetas participam tanto da hemostasia
primria (adeso, agregao e secreo) quanto da hemostasia secundria,
fornecendo fosfolpides de membrana para o ancoramento e ativao dos
fatores de coagulao.
Adeso plaquetria
Quando o vaso lesado ocorre exposio dos componentes subendoteliais

(colgeno, fibronectina e laminina). O FvW circulante facilita a adeso inicial
se ligando ao complexo glicoprotico plaquetrio Ib/IX/V, em condies de
alta fora de cisalhamento. Essa interao favorece outras ligaes ao co
lgeno subendotelial atravs dos receptores GPIa IIa e GPVI que tambm
promovem a ativao plaquetria.
Agregao plaquetria
A resposta da ativao plaquetria inclui mudanas da forma (esferide)

com emisso de pseudpodes e exposio de fosfolpides de carga negativa
na superfcie plaquetria, facilitando a interao com as protenas da coa
gulao. Alm disso, h a exposio do stio ligante do complexo GP IIbIIIa
ao fibrinognio e a interao plaquetafibrinognioplaqueta e plaque
taFvWplaqueta (em local de alta fora de cisalhamento) resultando na
agregao plaquetria.
103
Secreo plaquetria
Durante o processo de ativao, o contedo dos grnulos alfa, densos e

lissossomais plaquetrios secretado, amplificando o recrutamento e
ativao de outras plaquetas circulantes para o local prximo a leso. A
partir dos grnulos alfa so liberados FvW, fatores de coagulao tais como
fibrinognio, fator V, fator XI, fator XIII, a protena de adeso Pseletina,
fator plaquetrio 4, tromboglobulina, fatores de crescimento derivados
de plaquetas, inibidor do plasminognio, vitronectina e trombospondina.
Dos grnulos densos so liberados ADP, ATP, ons clcio e serotonina e
dos lisossomos as glicosidases e proteases, enzimas crticas para a funo
plaquetria. Concomitantemente, liberado o cido araquidnico ligado
fosfatidilcolina da membrana plaquetria, por ao da fosfolipase A2. O
cido araquidnico livre metabolizado pela enzima ciclooxigenase (COX)
tendo como produto o eicosanide tromboxano A2(TXA2), potente agente
agregante e quimiottico para outras plaquetas e leuccitos. Esse produto,
assim como o contedo dos grnulos, secretado para fora da plaqueta
atravs do seu sistema canicular aberto.
Outros processos bioqumicos envolvidos na agregao e secreo plaquetria
O ADP liberado, a trombina gerada no incio da cascata da coagulao,

colgeno e TXA2se ligam aos receptores transmembrana especficos das
plaquetas circulantes. O sinal de ativao para o interior da clula (trans
duo de sinal) transmitido pelas protenas G (mensageiros primrios) que
ativam outras enzimas envolvidas na via metablica, tal como a fosfolipase
C e protena C quinase, resultando na elevao citoplasmtica de ons clcio
e fosforilao de protenas. A ativao enzimtica leva a mudanas no cito
esqueleto favorecendo a emisso de pseudpodes, reao de liberao dos
contedos intragranulares, ativao da fosfolipase A2e produo do TXA2,
exposio da membrana prcoagulante e do complexo glicoprotico IIbIIIa .
Alteraes na funo plaquetria ou do nmero de plaquetas causam dese
quilbrio nas fases iniciais do sistema hemosttico, resultando em manifes
taes hemorrgicas ou trombticas de varivel gravidade na dependncia
do grau e tipo de alterao
104
Alteraes plaquetrias quantitativas (plaquetopenias e plaquetoses)

Plaquetopenias
As plaquetopenias so classificadas de acordo com o nmero de plaquetas

circulantes, sendo leve, moderada e grave se contagem for acima de 50.000/
mm3, entre 20.000e 50.000/mm3e abaixo de 20.000/mm3, respectivamente.
As plaquetopenias podem ser de causa adquirida ou hereditria.
Plaquetopenias adquiridas
Uma das principais causas de plaquetopenia adquirida devida a condi

o conhecida como pseudoplaquetopenia, plaquetopenia laboratorial ou
plaquetopenia factcia, que acomete at 2% dos pacientes hospitalizados.
A diminuio do nmero de plaquetas devido presena de plaquetas
aglutinadas, que formam grumos e no so, ento, reconhecidas (contadas)
pelos contadores eletrnicos. A confirmao pode ser realizada atravs de
contagem das plaquetas em cmara de Neubauer ou esfregao de sangue
em lmina. Esse fenmeno devese a modificao antignica na superfcie
plaquetria ocasionada pelo anticoagulante EDTA. Na maioria das vezes, a
coleta de sangue com citrato de sdio, ao invs do EDTA, evita a aglutinao
plaquetria com a normalizao na contagem. Outra reao imunolgica,
o satelitismo em que ocorre a adeso das plaquetas aos leuccitos, tam
bm cursa com contagem plaquetria bastante reduzida quando avaliada
por contadores eletrnicos. Assim, mediante um resultado de contagem de
plaquetas evidenciando plaquetopenia, devese sempre repetir a contagem
atravs de coleta de sangue em EDTA com processamento rpido aps a
coleta, coleta de sangue em citrato e/ou contagem de plaquetas em c
mara ou esfregao de sangue perifrico. Caso o novo resultado evidencie
plaquetas normais, o diagnstico sugestivo de pseudoplaquetopenia.
Mediante manuteno do nmero reduzido, devese investigar outras
causas de plaquetopenia.
Outras causas de pseudoplaquetopenia so: a coagulao do sangue devido
coleta inadequada levando ao aumento do consumo de plaquetas, presena
de crio aglutininas e presena de plaquetas gigantes que, em equipamentos
eletrnicos, so confundidas com leuccitos.
105
As plaquetopenias adquiridas podem tambm estar presentes em doenas

autoimunes, coagulao vascular disseminada, esplenomegalia, em doenas
que levam a supresso da medula ssea por infeces (virais e bacterianas),
drogas, infiltrao medular (leucemia, linfoma, neoplasia metasttica), em
doenas que levam a reduo de produo de plaquetas pela medula ssea
(anemia aplstica), por efeito dilucional (como por exemplo, aps transfuso
de grande volume de concentrado de hemcias ou sangue total), dentre
outras.
Plaquetopenias hereditrias
Embora raras, as plaquetopenias hereditrias so classificadas tendose

como base o tamanho da plaqueta ou geneticamente, atravs da determina
o da mutao gentica que ocasionou sua reduo. Alm de apresentarem
nmero reduzido, algumas plaquetopenias tambm apresentam funo
alterada.
Plaquetas pequenas: podem estar presentes na sndrome de WiskottAldrich
(pool de estoque diminudo) e trombocitopenia relacionada ao cromossomo X.
Plaquetas de tamanho normal: podem estar presentes na trombocitopenia
amegacarioctica congnita e anemia aplstica de Fanconi.
Plaquetas gigantes: podem estar presentes na sndrome de Bernard Soulier,
pseudoDvW, anomalias relacionadas ao gene MYH9(MayHegglin, sndro
mes de Sebastian, Fechtner e Epstein) e sndrome da plaqueta cinza (ausn
cia de grnulo ).
Plaquetoses
A plaquetose a presena de nmero aumentado de plaquetas no sangue

perifrico. Pode ser primria (tambm denominada de essencial e relacionada
a doena mieloproliferativa) ou reativa que freqentemente assintomtica,
mas pode causar trombose em alguns pacientes.
106
10.2 Testes laboratoriais para a quantificao das

plaquetas e caracterizao de plaquetopenias
hereditrias
Contagem do nmero de plaquetas do sangue perifrico
Anlise microscpica de esfregao de sangue em lmina corada
com Leishman ou corantes especiais como May Grunwald, no caso
de investigao de plaqueta cinza.
Testes especiais (moleculares e bioqumicos)
Mtodos manuais
Cmara de Neubauer
Mtodo de Fnio
Mtodo de Fnio ou mtodo indireto

Princpio
As plaquetas so contadas em esfregao de sangue em lmina e posterior

mente so relacionadas com o nmero de eritrcitos por mm3de sangue.
Alm quantificar o nmero, o mtodo de Fnio possibilita a avaliao da
morfologia da plaqueta. Entretanto, este no um mtodo com boa exatido.
Tcnica
Coletar o sangue com EDTA

Fazer o esfregao de sangue em lmina e corla com o corante
apropriado
Contar as plaquetas existentes em, no mnino 10campos que
contenham cerca de 200eritrcitos por campo
Contar o nmero absoluto de eritrcitos e relacionar com o nmero
de plaquetas.
Interpretao
Alteraes morfolgicas das plaquetas

Plaquetas gigantes e macroplaquetas: a presena de macroplaquetas
no sangue perifrico sugere um turnover acelerado de plaquetas. Esto
107
presentes quando ocorre destruio perifrica exagerada, como na pr

pura trombocitopnica imunolgica e tromboses extensas. J as plaquetas
gigantes so encontradas nas sndromes de Bernard Soulier, plaqueta cinza,
anomalia de MayHegglin, sndromes de Sebastian, Fechtner e Epstein.
Anisocitose plaquetria. plaquetas pequenas, normais e grandes sem predo
mnio de tamanho. encontrada em situaes nas quais existe acelerao
do processo de produo de plaquetas, tal como nas sndromes mieloproli
ferativas e mielodisplsicas.
Mtodo eletrnico
Atualmente um grande nmero de equipamentos eletrnicos tem sido

empregado na rotina de contagem plaquetria, sendo que a maioria deles
utiliza o mtodo de impedncia eltrica ou sinal ptico. Os mais modernos,
so baseados na deteco imunolgica por citometria de fluxo como auxlio
de fluorocromos conjugados com o monoclonal CD61.
Alm da acurcia na contagem, os mtodos eletrnicos permitem a ava
liao de alguns parmetros plaquetrios, tal como o volume plaquetrio
mdio (VPM) e a amplitude de distribuio das plaquetas (PDW) ou ndice
de anisocitose plaquetria.
O VPM tem sido utilizado para distinguir as plaquetopenias por reduo da
sobrevida das plaquetas (VPM alto) das causadas por deficincia de produ
o medular (VPM baixo).
Apesar da sensibilidade dos equipamentos eletrnicos, os de leitura por im
pedncia apresentam limitaes quanto descriminao de plaquetas de
outras partculas de mesmo tamanho como o caso de plaquetas gigantes.
Alm disso, estes equipamentos podem apresentar erros em contagens pla
quetrias abaixo de 30.000/mm3.
Alteraes plaquetrias qualitativas (plaquetopatias)
As plaquetopatias podem ser de causa hereditria ou adquirida, sendo que

as ltimas so mais freqentes.
108
10.3 Plaquetopatias hereditrias

As plaquetopatias hereditrias podem ser diagnosticadas de acordo com
alteraes de funo:
Defeitos primrios na interao plaquetaparede de vaso (doenas
de adeso): estas so a DvW e sndrome de Bernard Soulier (dimi
nuio ou ausncia do complexo glicoprotico plaquetrio Ib/IX/V)
Defeitos primrios na interao plaquetaplaqueta (doena de
agregao): estas so a afibrinogenemia (ausncia de fibrinognio
plasmtico) e trombastenia de Glanzmann (alterao do complexo
glicoprotico plaquetrio IIbIIIa)
Defeitos de estoque dos grnulos, secreo e transduo de sinal:

Doena de pool de estoque
grnulo , densos ou ambos

doena de Quebec (estoque aberrante de ativador do plasminog
nio tipo uroquinase degradando o contedo dos grnulos )
Doena de secreo plaquetria e transduo de sinal

defeitos de interao plaqueta agonista devido a anormalidades
nos receptores de TXA2, ADP e colgeno
alterao da metabolizao do cido araquidnico e sntese de
TXA2, devido diminuio da liberao do cido araquidnico, de
ficincia das enzimas cicloxigenase ou tromboxano sintetase
defeito na ativao das protenas G (mensageiras primrias)
defeito no metabolismo do fosfatidilinositol ligado membrana
celular
defeito na mobilizao de clcio intra citoplasmtico
deficincia da protena C quinase
Doena de funo procoagulante
defeito na membrana fosfolipdica sndrome de Scott

fator V plaquetrio anormal (fator V New York)
109
Defeitos na estrutura e componentes do citoesqueleto plaquetrio

doenas relacionadas com o gene MYH9
sndrome de WiskottAldrich
esferocitose plaquetria
A prevalncia das doenas plaquetrias hereditrias na populao geral

no est bem estabelecida. Contudo, em indivduos com ditese hemorr
gica (por exemplo menorragia), a DvW, alterao de secreo e sinalizao
plaquetria so mais comuns que as deficincias de grnulos, defeitos na
produo de TXA2e outras.
10.4 Plaquetopatias adquiridas

Ao contrrio das plaquetopatias hereditrias, que so raras, as doenas
de funo plaquetria adquiridas so comumente encontradas na prtica
hematolgica. Algumas doenas sistmicas e vrias drogas podem estar
envolvidas. Entre as doenas destacamse mieloma mltiplo, insuficincia
renal, doenas mieloproliferativas, cirrose heptica, lpus eritematoso sis
tmico e situaes como a circulao extracorprea. Quanto s drogas
citase os antinflamatrios no esteroidais como o cido acetil saliclico
(AAS), ibuprofeno, acetominofeno, antiinflamatrios esteroidais, clopido
grel, ticlopidina, antibiticos em altas doses, anestsicos, tranquilizantes
fenotiaznicos e outros.
Os principais mecanismos associados disfuno plaquetria induzida por
medicamentos so a inibio da sntese das prostaglandinas, aumento dos
nveis de AMP cclico (cAMP) plaquetrio, e interferncia com a funo
receptora da membrana plaquetria. Porm, a disfuno plaquetria se
cundria a doenas sistmicas est mais relacionada presena de protenas
plasmticas anormais (por exemplo, paraprotenas do mieloma), protenas
como produtos de degradao da fibrina (PDFs) e diminuio do contedo
intragranular.
110
10.5 Testes laboratoriais

Os testes laboratoriais, alm de auxiliar no diagnstico da disfuno pla
quetria, so empregados para monitorao de drogas antiplaquetrias, de
terapia prhemostticas, preveno de trombose ou sangramento e no
controle de qualidade de plaquetas estocadas para transfuso.
Testes iniciais ou de triagem
TS
Testes especficos
Agregao plaquetria por sistema ptico

Agregao plaquetria por impedncia
Testes especiais
Avaliao da secreo do contedo intragranular ( e densos)

-- Determinao plasmtica de fator plaquetrio 4
-- Determinao plasmtica de tromboglobulina
-- Captao de serotonina plaquetria
-- Luminescncia (liberao de ATP)
Citometria de fluxo para deteco das glicoprotenas de membrana

plaquetria
Microscopia eletrnica
Estudos moleculares
Estudos de fosforilao de protena, expresso de receptor e outros
At os anos 80eram utilizados, na prtica clnica, apenas os testes tradicionais

de funo plaquetria como. TS, agregao plaquetria por sistemas ptico
e impedncia, alm de alguns testes bioqumicos. Desde o ltimo manual
do Comit Britnico de Padronizao em Hematologia (BCSH) de 1988, uma
variedade de novos testes de funo plaquetria foram desenvolvidos que
incluram a citometria de fluxo e outros equipamentos.
111
Novos equipamentos
Os novos equipamentos utilizam pequenos volumes de sangue total, so

rpidos, permitem a avaliao da funo plaquetria beira do leito do
paciente e alguns deles simulam a alta fora de cisalhamento in vitro. Com
exceo dos analisadores de funo plaquetria, a maioria dos equipamentos
no est completamente validada. So equipamentos disponveis:
Analisador de funo plaquetria (ex, PFA100)
VerifyNow utilizado exclusivamente para monitorao de antia
gregantes
Impact R avalia a adeso e agregao sob alta fora de cisalha
mento
Tromboelastgrafos avaliam a funo plaquetria interrelacio
nada coagulao
Plateletworks
Devese enfatizar que ainda faltam estudos de evidncia cientfica

comprovando a eficcia da utilizao destes equipamentos.
10.5.1 Testes de triagem

Contagem de plaquetas: vide sesso 10.2
TS Ivy
O princpio e tcnica do TS foram discutidos no captulo 9.1.4.1.1.
Interpretao
O TS est prolongado na:
plaquetopenia (com plaquetas abaixo de 100.000/mm3)
sndrome de Bernard Soulier
trombastenia de Glanzmann
DvW (alguns tipos e subtipos)
plaquetopatias adquiridas: uremias, mielomas, hipo ou disfibrino
genemias, drogas.
O teste apresenta vrias desvantagens, motivo pelo qual est sendo des
continuado na prtica clnica como teste de triagem das plaquetopatias.
112
invasivo, pode formar cicatriz e quelide, pouco reprodutvel, dependente

do operador, apresenta baixa sensibilidade disfuno leve e pouca corre
lao com a tendncia a sangramento.
O TS influenciado por vrios fatores como, idade, sexo, temperatura,
elasticidade da pele, hematcrito, local e a direo da inciso. H vrios
anos o TS vem sendo substitudo pelos analisadores de funo plaquetria.
Analisador de funo plaquetria
Princpio
O sangue total aspirado por um sistema fechado a vcuo atravs de um
capilar de 147m de abertura. Esse sistema simula a alta fora de cisalhamen
to alterando a estrutura do FvW. Para o funcionamento, o equipamento requer
cartuchos contendo colgeno e ADP (CADP) ou colgeno e epinefrina (CEPI).
As plaquetas interagem com o FvW modificado e aderem espontaneamente
ao colgeno presente na membrana e agregam por estmulo de ADP ou
adrenalina. O equipamento mede o tempo de ocluso, tempo esse requerido
para o agregado plaquetrio obstruir a abertura e cessar o fluxo de sangue.
Interpretao
O tempo de ocluso (TO) prolongado, na maioria dos pacientes com dis

funo plaquetria hereditria ou adquirida. Defeitos nos receptores de
membrana das plaquetas como GPIIbIIIa (trombastenia de Glanzmann) e
GPIb (sndrome de Bernard Soulier) esto associados a um prolongamento
do TO tanto no CADP quanto no CEPI.
Na DvW, o analisador de funo plaquetria tem grande sensibilidade em
detectar particularmente os tipos 2e 3. Porm, nas doenas hemorrgicas
leves e moderadas tais como doena de estoque e defeitos de secreo, a
sensibilidade diminui consideravelmente.
Outra indicao de uso do equipamento para monitorao de drogas an
tiagregantes como cido acetil saliclico.
113
10.5.2 Testes especficos

Agregao plaquetria por sistema ptico
O teste de agregao plaquetria por sistema ptico ou turbidimtrico
considerado o mtodo padro ouro para a avaliao da funo plaquetria.
Utiliza um equipamento capaz de detectar a transmisso luminosa atravs
do plasma rico em plaquetas em suspenso. medida que as plaquetas se
agregam por adio de um agente agregante ocorre diminuio da turbidez
e um aumento proporcional da transmisso de luz que captada por um
registrador acoplado ao equipamento.
A agregao plaquetria por sistema ptico revela as diferentes fases da
cintica de agregao quando o agonista adicionado ao plasma rico em
plaquetas.
Agregao plaquetria por sistema de impedncia
O mtodo de impedncia eltrica permite a avaliao da funo plaquetria
em condies fisiolgicas, quando realizada em sangue total. Baseiase na
quantificao do aumento progressivo da impedncia eltrica entre dois
eletrodos introduzidos no tubo contendo sangue total ou plasma rico em
plaquetas. Na medida em que as plaquetas se aderem aos eletrodos por
adio do agente agregante, estas ativam e recrutam outras clulas para o
local (outras plaquetas, leuccitos e eritrcitos) aumentando da resistncia
eltrica. Diferente do sistema ptico, na agregao plaquetria por impe
dncia no h distino de primeira e segunda onda.
Protocolo de coleta, processamento e execuo de agregao plaquetria
por mtodo ptico
As variveis pranalticas e analticas determinam a confiabilidade dos
resultados. A manipulao inadequada das plaquetas leva uma maior ati
vao in vitro com a perda do contedo intragranular com muita facilidade.
A qualidade, o armazenamento e as concentraes dos agentes agregantes
so muito importantes para o diagnstico das doenas plaquetrias.
114
Coleta
Puno e agulhas
Para a coleta de sangue importante que o flebotomista tenha muita
experincia, pois o excesso de manipulao da agulha danifica o tecido
ocasionando uma maior exposio do subendotlio, liberao de fator teci
dual e ativao plaquetria.
recomendvel o uso de agulhas de calibre 21 para os adultos, por
promoverem menor leso tecidual e hemlise. Para crianas recomendase
o de nmero 23devido ao calibre da veia.
No caso de veia de difcil acesso, deve ser adotada a tcnica de duas
seringas para facilitar o descarte dos trs primeiros mililitros de sangue.
Alternativamente, se o sangue for colhido em tubo a vcuo, o primeiro tubo
deve ser descartado.
Tubos
Os tubos de coleta devem ser de plstico ou de vidro revestido com silicone

para evitar a adeso e ativao das plaquetas promovida pela carga negativa
da superfcie do vidro.
Aps a realizao de vrios testes foi demonstrado que o uso de tubos a
vcuo no ativa as plaquetas, portanto podem ser utilizados.
Anticoagulante
O citrato de sdio 3.2% na proporo de 1volume de anticoagulante para

9volumes de sangue deve ser o anticoagulante utilizado para a coleta dos
testes de agregao plaquetria. Nos casos em que o hematcrito estiver
acima de 55%, fazse necessrio a correo do volume de anticoagulante
tal como descrito no captulo 6.1.1.1.
Aps a coleta, mesmo em tubos a vcuo, devese homogeneizar as amostras
delicadamente, sem a formao de espuma, de 4a 5vezes para evitar a
ativao da coagulao e hemlise.
Alm do hematcrito anormal, vrios medicamentos podem interferir na
funo plaquetria, principalmente as drogas contendo cido acetil saliclico,
antiinflamatrios no esteroidais, corticides, antihistamnicos, antibiticos,
115
antidepressivos e outros. Nos casos em que o paciente no fizer uso con

tnuo, principalmente de medicamentos contendo cido acetil saliclico, a
droga deve ser suspensa nos 10dias que antecedem a coleta. Caso contrrio,
o laboratrio deve ser informado para melhor interpretao dos resultados.
Envio e processamento da amostra
Aps a coleta, o material deve ser identificado e enviado imediatamente

ao laboratrio temperatura ambiente. Se for colhido em local distante ao
laboratrio, com necessidade de transporte motorizado, deve ser envolvido
em plstico bolha e enviado temperatura ambiente com o mnimo de
agitao. A agitao do sangue leva a ativao das plaquetas com perda do
contedo intragranular e conseqentemente uma resposta com resultado
hipoagregante. O tempo entre a coleta da amostra e a realizao do teste
no deve exceder 3a 4horas.
Preparao do plasma rico em plaquetas
Aps a coleta, o sangue centrifugado a 200x g por 10a 15minutos

temperatura ambiente (sem a opo brake da centrfuga para evitar a
ressuspenso das plaquetas) para a obteno do PRP. Nota importante: os
tubos devem ser centrifugados com tampa para a manuteno do pH entre
7.7 8.0.
O PRP removido cuidadosamente com auxlio de pipeta plstica e colocado
em tubo de polipropileno ou tubo siliconizado para evitar a ativao das
plaquetas. Devese evitar tambm a formao de espuma e contaminao
com eritrcitos e leuccitos, uma vez que a contaminao com eritrcitos
pode levar a valores falsamente baixos.
Uma pequena alquota deve ser retirada para a contagem das plaquetas do
PRP, devendo o tubo ser tampado novamente.
O PRP com nmero de plaquetas inferior a 150.000/ mm3pode apresentar
resposta diminuda. A concentrao de plaquetas por centrifugao no
recomendvel por induzir a ativao. Nesses casos, devese reajustar o
nmero de plaquetas do controle normal para o mesmo da amostra teste e
comparar o padro de resposta.
116
O reajuste do nmero de plaquetas do PRP com o PPP autlogo aceito

por alguns centros e rejeitado por outros. De acordo com alguns autores, a
resposta de agregao sofre pouca influncia quando o nmero de plaquetas
do PRP varia entre 200.000/mm3a 600.000/mm3. Porm, acima desses
valores aconselhase o reajuste para 300.000/mm3. Cattaneo e colaboradores
mostraram que durante a centrifugao da amostra em alta velocidade, para
a obteno do PPP, ocorre a ativao das plaquetas decorrente da liberao
de ADP por eritrcitos e pelas prprias plaquetas, portanto em nenhuma
hiptese devese reajustar o nmero de plaquetas com o PPP autlogo.
Reajuste do nmero de plaquetas do plasma rico em plaquetas com o plasma
pobre em plaquetas
Aps a obteno do PPP do paciente, o reajuste do nmero de plaquetas
deve ser calculado atravs de regra de trs.
Exemplo:
PRP = 800.000plaquetas/mm3para chegar a 300.000plaquetas/mm3
800.000 300.000= 2.6
Portanto, o PRP dever ser diludo 2.6vezes
1volume de PRP + 1.6volumes de PPP
Se o volume obtido do PRP for 4ml
1ml de PRP 1.6ml de PPP
4ml de PRP X ml de PPP
X = 6.4ml
Portanto, a adio de 6.4ml de PPP a 4ml de PRP reajustar o nmero de
plaquetas para 300.000/mm3
Tempo
A resposta plaquetria aos agonistas se altera com o tempo. Logo aps a

preparao do PRP, as plaquetas so hiporresponsivas, provavelmente devido
a desensibilizao dos receptores de ADP, que liberado por plaquetas e eri
trcitos durante a centrifugao do sangue total. A verdadeira resposta se
inicia aps 15minutos, aumenta aos 30minutos e permanece estvel at a
terceira hora aps o preparo do PRP. Aps esse tempo, a resposta diminui
117
novamente em conseqncia da exausto da reserva de energia da plaqueta.

Portanto, a agregao plaquetria por sistema ptico deve ser realizada
entre 15a 30minutos aps a preparao do PRP e finalizada dentro de
2a3horas.
Agentes agregantes plaquetrios
O teste de agregao plaquetria, tanto por sistema ptico como por impe
dncia, emprega vrios agentes agonistas para o diagnstico de plaqueto
patias e para o controle de drogas antiagregantes.
Os agentes mais empregados so. ADP (adenosina 5 difosfato), epinefrina
ou adrenalina (ADR), colgeno, cido araquidnico (AA), ristocetina e plasma
bovino ou crioprecipitado.
Embora as concentraes finais dos agonistas adicionadas s plaquetas
sejam de extrema importncia no esclarecimento da alterao da plaqueta,
at hoje no existe nenhuma padronizao internacional referente s doses
que devem ser empregadas rotineiramente.
Quanto escolha dos agonistas, deve ser dependente da suspeita clnica. Um
exemplo a investigao laboratorial de trombastenia de Glanzmann que
apresenta diminuio ou ausncia do complexo glicoproteco IIbIIIa pla
quetrio. Para seu diagnstico, os agonistas empregados so ADP, ADR, AA
e colgeno cuja agregao dependente do complexo GPIIbIIIa. O teste de
agregao com ristocetina no indicado neste caso, pois o seu mecanismo
de ao modificar a estrutura do FvW para melhor interagir com a glico
protena lb (GPlb) da plaqueta. Esse agonista utilizado nos diagnsticos
laboratoriais de sndrome de Bernard Soulier (deficincia ou ausncia do
complexo GPIbIXV), DvW e pseudoDvW.
Concentraes dos reagentes
As solues estoque devem ser mantidas conforme instrues do fabricante.

ADP as concentraes da soluo estoque so variveis. So dependentes
da marca do reagente e equipamento utilizado. Vrios laboratrios utilizam,
para uma maior estabilidade, a soluo estoque de ADP na concentrao de
3mM. A soluo deve ser mantida a 20C e descongelada na hora do uso
para posterior diluio com soluo fisiolgica 0,9%.
118
Concentraes finais de 1M a 10M, em indivduos normais, promovem

duas ondas distintas de agregao. A primeira onda representa a interao
do ADP com os seus receptores especficos (P2Y12e P2Y1) e a presena das
glicoprotenas IIbIIIa; a segunda onda se refere a resposta de liberao
endgena de ADP e metabolizao do cido araquidnico em TXA2, potente
agente agregante.
Concentraes finais abaixo de 1M induzem a primeira onda de agregao
e segunda onda reversvel (desagregao).
Concentraes finais entre 5M a 10M, em indivduos normais, promovem
a fuso da fase primria e secundria.
Concentraes finais de ADP recomendadas: 10M (dose alta); 0,7M (dose
baixa)
importante a utilizao de pequenos volumes do agonista (at 20l) para
no ocorrer diluio do PRP durante a reao de agregao plaquetria.
Adrenalina ou epinefrina as doses de adrenalina empregadas na agregao
plaquetria variam de 5M a 10M.
A adrenalina interage com os receptores adenrgicos e, assim como o
ADP, dependente do complexo GPIIbIIIa.
A curva de agregao clssica com adrenalina consiste de uma primeira
onda curta seguida de uma grande resposta secundria.
Concentraes finais de adrenalina recomendadas: 5M (dose alta); 1M
(dose baixa)
Colgeno a suspenso mais estvel derivada de tendo de eqino
(1mg/ml) e deve ser estocado a 4C.
As concentraes finais de uso variam entre 1/ml a 5g/ml. O colgeno
na concentrao final de 1g/ml utilizado na monitorao de inibio da
cicloxigenase promovida pelo cido acetil saliclico, como antiagregante. J
a concentrao de 5g/ml avalia a via da fosfolipase C plaquetria.
A resposta plaquetria in vitro ao colgeno definida inicialmente por
interao com os receptores plaquetrios (GPIa/IIa; GPVI) que promove
119
um aumento de densidade ptica devido mudana de forma seguida a

uma fase de latncia, onde as plaquetas se aderem s fibras do colgeno e
posteriormente com intensa agregao.
Concentraes finais de colgeno recomendadas: 5 g/ml (dose alta);
1g/ml (dose baixa)
cido araquidnico (AA) o reagente deve estar na forma de sal sdico
para melhor solubilidade e a diluio deve ser com carbonato de sdio 0.1M.
A soluo estoque (50mM) deve ser protegida da luz, no ter contato com
oxignio para preveno de oxidao e mantida a 20C.
Quando as plaquetas so estimuladas com o agonista AA em concentraes
finais de 0.5mM a 1mM avaliada a via enzimtica da cicloxigenase. Ocorre
uma rpida metabolizao deste composto pela cicloxigenase a endoper
xidos cclicos e TXA2, com formao de uma nica onda de agregao. Alm
de ser empregado para o diagnstico laboratorial de deficincia hereditria
da cicloxigenase e trombastenia de Glanzmann (deficincia ou ausncia do
complexo GPIIbIIIa), utilizado no controle teraputico do antiagregante
plaquetrio, cido acetil saliclico (AAS) na concentrao final de 1mM.
Concentraes finais de cido araquidnico recomendadas: 0.5mM (dose
alta); 0.06mM (dose baixa)
Ristocetina um antibitico que atua como cofator da ligao FvW plas
mtico GIb plaquetrio.
Para investigao da DvW, as concentraes finais de ristocetina devem ser:
0.6mg/ml e 1.2mg/ml. A ristocetina tambm utilizada na investigao da
sndrome de Bernard Soulier. Devido a deficincia ou ausncia do complexo
GPIb/IX plaquetrio, a resposta ristocetina diminuda na concentrao
final de 1.2mg/ml. Para a diferenciao laboratorial de DvW e sndrome
de Bernard Soulier adicionado um volume de 15l de plasma bovino ou
crioprecipitado (ricos em FvW) a 400l de PRP. Se houver agregao pla
quetria, significa que no plasma teste havia deficincia de FvW, presente no
plasma bovino. Caso contrrio, se caracteriza que a ausncia ou deficincia
da GPIb/IX para interagir com o FvW.
120
Agregao espontnea: deve ser realizada para todos os pacientes. O mesmo

volume de PRP, que utilizado para os agonistas plaquetrios, colocado
no agregmetro sem nenhum estmulo. Se positiva (> 15%), revela hipera
gregao plaquetria mesmo se com os outros agentes agonistas a resposta
for diminuda. Nesse caso indica que as plaquetas estavam sensibilizadas
por contato prvio na circulao com os agonistas. A Figura 5mostra as
curvas caractersticas de agregao plaquetria com os agentes agonistas
ADP, adrenalina, colgeno e cido araquidnico.
Figura 5 Curvas de agregao plaquetria por sistema ptico com os agonistas
ADP, adrenalina, colgeno e cido araquidnico
(A) ADP 5 M (duas ondas distintas)
ADP
(B) ADP 10 M (duas ondas fundidas)

ADP
(C) adrenalina 5 M
(D) colgeno 5 g
(A)
(E) cido araquidnico 0.5 M

(B)
adrenalina
colgeno
(E)
fase de
latncia
cido araquidnico
(C)
(D)
Fonte: Zhou L. e Col., 2005
Tcnica de agregao plaquetria por sistema ptico
O volume de PRP e dos agentes agregantes so variveis e dependem do

equipamento utilizado. Porm, a concentrao final dos reagentes deve ser
padronizada.
121
Interferncias e limitaes: O teste sofre interferncia da presena de lpides,

quanto s limitaes, o sistema ptico perde a sensibilidade se o nmero de
plaquetas for inferior a 100.000/mm3.
Resultados: Os resultados de agregao plaquetria por sistema ptico
podem ser expressos em amplitude de agregao (%), com estabelecimento
prvio da variao normal de amplitude para cada agente e concentrao
ou qualitativos (normoagregante, hipoagregante, ausncia de agregao
ou hiperagregante).
Interpretao: Devido ao grande nmero de fatores interferentes, os
resultados de agregao plaquetria requerem certa cautela quanto in
terpretao. Os medicamentos que contm aspirina no devem ser ingeridos
durante 10dias que antecedem a prova, a no ser que seu efeito sobre as
plaquetas esteja sendo investigado. Alm da aspirina outras substncias
podem interferir na funo plaquetria como outros antiinflamatrios
no esteroidais e esteroidais, antihistamnicos, antibiticos, antidepressi
vos, diurticos, vasodilatadores, betabloqueadores e bloqueadores de canal
de clcio. Alguns componentes que fazem parte da dieta normal quando
ingeridos em excesso como lcool, cebola, alho, gengibre podem diminuir
a agregao plaquetria. O quadro 13lista vrias drogas, alimentos e com
plementos que interferem na funo plaquetria.
Quadro 13 Drogas, alimentos e complementos que intereferem na funo
plaquetria
Agente
Abciximab (ReoPro)
Ticlopidina, clopidogrel
Epoprostenol
Antiinflamatrios no esteroidais (AAS)
Bloqueadores de canais de clcio
Antidepressivos tricclicos, fluoxetina
Estatinas
Fenotiaznicos
leos de peixe
Vitamina E, cebola
Mecanismo de ao
Inibio GPIIbIIIa
Inibio receptores de ADP
Ativao da adenil ciclase
Inibio da gerao de TXA2
Inibio dos canais de clcio
Inibio da captao de serotonina
Interferncia na via de sinalizao
Diminuio da agregao
Reduo da gerao de TXA2
Inibio do metabolismo do AA
Fonte: World Federation of Hemophilia. Disponvel em: <www.wfh.org>. Acesso em: 2008.
122
Avaliao qualititativa de Agregao Plaquetria pelo sistema tico
Avaliandose qualitativamente os resultados de agregao plaquetria,

quando empregados os agentes agonistas ADP, adrenalina e cido araqui
dnico considerase resposta normal quando as plaquetas apresentam a
primeira (resposta primria) e segunda (resposta secundria) onda de agrega
o com as doses mais altas e apenas a primeira onda nas doses mais baixas
do agonista. Quanto a resposta ao colgeno, devese valorizar a fase de
latncia e a presena da segunda onda nas doses finais de 1g/ml a 5g/ml.
Avaliao quantitativa da agregao plaquetria por sistema ptico
A avaliao por amplitude de agregao deve estabelecer previamente

os valores normais para cada agente e as suas respectivas doses. Se a
amplitude de agregao plaquetria do paciente estiver dentro dos valores
estabelecidos, considerada normal. importante observar o perfil das
curvas de agregao, sendo possvel que a amplitude de agregao esteja
dentro dos valores de referncia, mas com a ausncia da segunda onda de
agregao.
A resposta hipoagregante, tanto para o ADP, adrenalina, cido araquidnico
e colgeno resultado da ausncia da segunda onda de agregao plaque
tria com altas doses do agonista. Em relao amplitude de agregao,
os resultados esto abaixo do valor normal estabelecido pelo laboratrio.
A ausncia da segunda onda de agregao pode ser devido a vrios fatores
como deficincia de grnulos ou de seu contedo, deficincias de ciclo
xigenase, tromboxano sintetase, contedo granular, outras alteraes
relacionadas com o metabolismo plaquetrio e drogas, sendo este o mais
freqente.
Alguns estudos mostram que cerca de 16% da populao normal apresenta
hipo ou ausncia de agregao plaquetria com adrenalina.
A ausncia de agregao plaquetria pode ser decorrente deficincia ou au
sncia de receptores especficos como P2Y12e P2Y1(alterao dos receptores
de ADP), GPIaIIa e GPIV (receptores de colgeno), GPIIbIIIa (receptor de
fibrinognio de FvW Trombastenia de Glanzmann), deficincia das prote
nas G e transduo de sinal.
123
A agregao plaquetria com ristocetina diminuda na DvW (tipos 2A, 2M

e 3) e tambm na sndrome de Bernard Soulier. J na DvW do tipo 2B (FvW
apresenta grande afinidade pelo receptor GPIb) e pseudoDvW (plaquetas
com grande afinidade pelo FvW) as baixas doses de ristocetina (0.6mg/ml)
promovem intensa agregao plaquetria.
A agregao plaquetria com plasma bovino normal na DvW e ausente na
sndrome de Bernard Soulier.
A resposta hiperagregante detectada quando se utiliza baixas doses do
agente agonista. Enquanto que as plaquetas normais apresentam apenas
uma pequena onda primria de agregao, as plaquetas hiperagregantes
secretam normalmente.
Agregao plaquetria por sistema de impedncia
A agregao por sistema de impedncia no requer processamento do

sangue total, portanto as plaquetas no so ativadas. Em casos de hema
tcrito normal, o sangue total diludo 50% com soluo fisiolgica. Se o
hematcrito estiver abaixo de 25% recomendase utilizar a amostra sem
diluio. Esse mtodo favorece a investigao da agregao em crianas
devido ao pequeno volume de sangue utilizado, bem como a interao das
plaquetas com eritrcitos e leuccitos. Diferentemente ao sistema ptico
apresenta apenas uma onda de agregao plaquetria.
Concentrao dos reagentes
ADP a agregao em sangue total requer concentraes finais de 5M

e 10M. Alm de auxiliar no diagnstico de plaquetopatias hereditrias,
o agonista de escolha para monitorao teraputica das tienopiridinas
(clopidogrel e ticlopidina).
Adrenalina no utilizada em sangue total por ser um agonista muito
fraco.
cido araquidnico da mesma forma que no sistema ptico, utilizado
no controle teraputico do AAS, na concentrao final de 0.5M.
124
Colgeno quando utilizado em baixas concentraes (1a 2g ml),

inibido por AAS e em concentraes mais altas (5g/ml), a agregao pla
quetria com colgeno no afetada.
Trombina apesar de ser um agente agonista forte, mais utilizado na
investigao de secreo plaquetria. Na rotina laboratorial de agregao
plaquetria pouco utilizada por induzir a formao de fibrina.
Ristocetina na concentrao final de 1.0mg/ml, indivduos normais
apresentam impedncia eltrica maior que 5ohms e tempo de latncia <
que 70segundos. J os pacientes com DvW tipo 2B, apresentam impedncia
eltrica maior que 20ohms, em baixas concentraes (0.5e 0.25mg/ml) de
ristocetina.
Interferncias e limitaes. A agregao em sangue total por impedncia
sofre interferncias de drogas que atuam no metabolismo plaquetrio, he
matcrito baixo e limitada em amostras contendo plaquetas abaixo de
50.000/mm3
Resultados: a amplitude de agregao expressa em Ohms
Interpretao
Cada laboratrio deve estabelecer os seus valores de referncia para cada

um dos agentes agregantes em diferentes concentraes.
Consideraes finais sobre agregao plaquetria
O tempo entre a coleta e execuo do teste deve ser de no mnimo
15minutos (tempo suficiente degradao de prostaciclina liberada
na coleta de sangue) e no mximo 3horas (acima desse tempo, o
citrato de sdio retira clcio intracelular)
O tempo de reao deve ser no mnimo de 5minutos
Os reagentes devem ser mantidos em banho de gelo durante a
reao
Tanto o PRP quanto o sangue total devem ser mantidos
temperatura ambiente
O PRP deve ser adicionado no tubo de reao imediatamente antes
da reao
125
A resposta de agregao plaquetria alterada deve ser repetida

outras vezes para a confirmao do diagnstico
A agregao plaquetria do paciente deve ser sempre comparada
ao pool de PRP de indivduos normais sem uso de medicamentos
O diagnstico laboratorial das alteraes de funo plaquetria
dependente das variveis pranalticas e analticas
O perfil de curva de agregao plaquetria por sistema ptico deve
ser sempre considerado.
At hoje no h CQE de agregao plaquetria com o uso de
plaquetas frescas no teste. Para tal, devese utilizar, como controle,
em paralelo ao teste do paciente, um pool de PRP de indivduos
normais (n=10), obtido nas mesmas condies.
10.5.3 Testes especiais

Esses testes so complementares para o diagnstico, porm so realizados
apenas em centros especializados.
Avaliao de secreo plaquetria
Para dar continuidade investigao das plaquetopatias, principalmente

em pacientes que apresentam sangramento e ausncia de segunda onda
de agregao, a avaliao da secreo plaquetria tornase necessria para
o diagnstico.
Podese avaliar a secreo dos grnulos atravs da determinao plas
mtica do fator plaquetrio 4(PF4) e tromboglobulina (TG) por kits
comerciais de reao por Elisa. Outro marcador, que amplamente utilizado
a Pseletina, que pode ser determinada no plasma como Pseletina solvel
ou ligada membrana plaquetria por citometria de fluxo.
Para avaliao da secreo dos grnulos densos podem ser utilizados dois
marcadores distintos, a serotonina e o ATP.
A serotonina um agonista plaquetrio natural e rapidamente seqestrada
pelos grnulos densos. O mtodo se baseia na incubao das plaquetas em
sangue total ou em PRP durante 30minutos com serotonina marcada com
carbono14. Posteriormente, as plaquetas so ativadas e radioatividade
medida na secreo.
126
Por utilizar material radioativo, essa metodologia, embora bastante sensvel,

tem sido evitada.
O mtodo alternativo de avaliao de secreo de grnulo denso a libe
rao do nucletdeo ATP em paralelo agregao plaquetria. O mtodo
emprega o agregmetro de luminescncia e o sistema enzimtico, luciferina/
luciferase, podendo ser realizado tanto em PRP como em sangue total.
O ATP liberado dos grnulos densos, em resposta a um agonista, reage com
luciferina na presena da enzima luciferase emitindo luz que rapidamente
captada. A resposta comparada a um padro de ATP de concentrao
conhecida.
Os agonistas utilizados para a avaliao de secreo de ATP so. o ADP (5M
e 10M), colgeno (2g/ml e 5g/ml) e trombina (1U/ml). A ausncia ou
diminuio da secreo de ATP de plaquetas estimuladas principalmente
com trombina indica doena de estoque de grnulos densos. Em casos em
que a liberao de ATP normal somente em concentraes muito altas do
agente agregante, sugere defeito de liberao.
Citometria de fluxo
A citometria de fluxo tem sido amplamente utilizada tanto na confirmao

de plaquetopatias hereditrias quanto na avaliao de funo plaquetria
em diferentes condies clnicas.
Para a investigao so utilizados anticorpos monoclonais marcados com
fluorescncia direcionados a antgenos glicoproticos de membrana plaque
tria ou a protenas que so liberadas durante a ativao, tais como Psele
tina (grnulo ) e granulofisina (grnulos lisossomais). Alm de anticorpos,
outras substncias fluorescentes, como a mepacrina, podem utilizadas para
a avaliao do contedo dos grnulos densos.
Anticorpos monoclonais utilizados
GIIb IIIa: CD41a para investigao de trombastenia de Glanzmann

GPIb: CD42b para investigao de sndrome de Bernard Soulier
Pseletina: CD 62P para investigao da doena de estoque de grnulo e
avaliao de ativao plaquetria
127
Granulofisina: CD63 (ausente na sndrome de HermanskyPudlak e

aumentada na ativao plaquetria)
Anexina V: para avaliao da atividade prcoagulante das plaquetas e
pesquisa de sndrome de Scott
Avaliao do contedo dos grnulos densos: mepacrina
Microscopia eletrnica
A metodologia bastante sofisticada e somente disponvel em centros
altamente especializados. til no diagnstico de investigao de secreo
plaquetria, revelando a presena ou ausncia de grnulos e o seu contedo.
Concluses
O diagnstico laboratorial das alteraes de funo plaquetria
dependente das variveis pranalticas e analticas
Os testes de agregao plaquetria no esto padronizados,
principalmente no que refere s doses dos agonistas
O perfil de curva de agregao plaquetria por sistema ptico deve
ser sempre considerado
As disfunes plaquetrias encontradas por agregao plaquetria
devem ser sempre repetidas para a confirmao do diagnstico
128
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131

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MINISTRIO DA SADE

Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

2012 Ministrio da Sade.

Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2012/0116

Ttulos para indexao:

7 Preparao e calibrao de Pool de plasma normal . . . . . . . . . 29

2 Condies mnimas para

Reagentes para determinao dos testes de triagem e de diagnstico de coagulao,

O projeto arquitetnico da rea laboratorial deve observar s normas sani

3 Tcnica manual e equipamentos

4 Coleta de amostra para coagulao

A proporo sangue/anticoagulante deve ser exatamente de 9:1 (por

5 Validao dos testes de

5.2 Porque validar?

5.3 Determinao de um intervalo normal de referncia

frequentemente, doadores de sangue ou funcionrios da instituio podem

5.4 Caractersticas de desempenho de uma rotina validada

programa de controle de qualidade externo, assunto que ser abordado com

5.4.2 Determinar a preciso

5.4.3 Determinar a sensibilidade dos fatores da coagulao

Preparar diluies que avaliam diferentes nveis de concentraes

Testar cada amostra em duplicata;

Fazer uma curva correlacionando o resultado de TTPA ou TP obtido

Identificar em qual ponto est o seu intervalo de referncia para

Grfico 1 Curva para deteco da sensibilidade de reagente

Abreviao: TTPA tempo de tromboplastina parcialmente ativado

6 Implantao dos controles de

potenciais de erro. Assim, recomendase considerar as seguintes etapas para sua

6.1 Controle de qualidade interno no

importante que o laboratrio tenha documentado, para cada amostra, a

Forrar o fundo da caixa de isopor com uma camada de gelo seco

Cobrir os containers depois de lacrados com gelo seco, formando

6.1.1.3 Processamento e estocagem de amostra de plasma

Quadro 2 Tempo de estocagem de amostras para testes de coagulao

TA 25C Refrigerado Congelado TA 25C Refrigerado

TTPA para anlise

Alquota de plasma e processamento

6.1.1.4 Descongelamento das amostras de plasma citratado

6.1.2 Controle de qualidade na etapa analtica

6.1.2.1 Material para controle de qualidade Interno

Os controles de origem comercial so teis devido estabilidade que apresen

a utilizao do controle normal e anormal comercial previsto como uma

Prever a avaliao do desempenho de mtodos, equipamentos

Fornecer informaes sobre exatido e preciso de cada mtodo;

As amostras para CQI comerciais so providas com bulas que fornecem

determinado por cada laboratrio, sendo a bula do controle utilizado apenas

6.1.3 Controle de qualidade na etapa psanaltica

6.2 Controle de qualidade externo no

realizada uma avaliao dos resultados de cada laboratrio e emitido ao

Tubos plsticos com anticoagulante citrato de sdio a 3,2%;

Recomendase que todo o procedimento, desde a coleta at o congelamento,

pool. Devese observar, ainda, a presena de hemlise ou lipemia, devendo

7.1.1 Preparo do pool para teste de inibidor de fator VIII

Tubos para coletacom anticoagulante citrato de sdio a 3,2%;

Rolhas de borracha siliconadas;

Outra forma de preparar este pool atravs da adio de tampo imidazol

7.1.2 Calibrao do pool

Tubos de ensaio de vidro 12x 75mm

Micropipetas automticas (100a 200l)

Incubar a 37 C por 60segundos 100l de plasma citratado pobre em

8.1.1 Curva de calibrao para tempo de protrombina

Fonte: Autoria prpria

Os tempos de coagulao de cada diluio so relacionados graficamente