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Ao de la Diversificacin Productiva y Fortalecimiento de la

Educacin

FACULTAD DE
INGENIERA,
ARQUITECTURA Y URBANISMO
ESCUELA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL Y COMERCIO EXTERIOR

INFORME DE MICROBIOLOGA APLICADA

Aislamiento de Bacterias y diferenciacin mediante la


tincin de gram

Docente:

Integrantes:

Erika Pamela Sanchez Zapata


Lelis Yakeline Bustamante Snchez
Marianghella Salazar vsquez

Tincin de Gram
Pimentel - Per
2014

INTRODUCCIN
De gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes
grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin.
El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos
grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su
pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano
ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer
colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al
colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante
queda retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se
teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan
observarse.

Objetivos
Utilizacin de tcnicas sencillas para la observacin de microorganismos
Conocer o manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias
(importancia del objetivo de inmersin)
Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer
comparaciones entre tamaos de procariotas y de eucariotas
Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.

Procedimiento experimental:

Materiales:
- Mechero de bunsen o de alcohol
- Ansa Bacteriolgica
- Porta objetos
- Muestras bacterianas previamente cultivadas de diferentes medios:
al medio ambiente por 15 minutos, hisopado de manos sin lavarse,
hisopado de manos limpias, muestra de un cultivo puro
- Aceite de inmersin
- Soporte de Tinciones
- Goteros
- Colorantes para Tincin: Solucin de cristal Violeta, Lugol ,Safranina
Etanol 95%
- Agua destilada
- Microscopio
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Grupo 1:
Grupo 2:
Grupo 3:
-

Grupo 4:

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Procedimiento:
- Prepare un frotis de cada uno de los microorganismos, Para preparar
los frotis se sigue el siguiente procedimiento:
Colocar una pequea gota de agua en el centro de un
portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua,
por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el
extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima
gota de agua, que es suficiente.
Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en
condiciones aspticas, una pequea cantidad del cultivo
bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua.
Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una
suspensin homognea que quede bastante extendida para
facilitar su secado. Nota: Si la muestra se toma de un cultivo
en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros
pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la
suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra,
directamente sobre el portaobjetos.
Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su
evaporacin acercando el portaobjetos a la llama del mechero.
En este caso hay que tener muchas precauciones de no
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calentar demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden


deformarse o romperse.
coloque una gota de agua en el portaobjetos, y luego
transfiriendo cada organismo separadamente a la gota de
agua usando un asa de siembra esterilizada y enfriada
-

Permita que los frotis se sequen al aire y luego fjelos con calor.
Tia con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que
acte durante 1 minuto.
Lave suavemente con agua.
Inunde suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y deje actuar
durante 1 minuto.
Lave suavemente con agua.
Decolore con alcohol etlico al 95%. Nota: no sobre decolore, agregue
el alcohol gota a gota hasta que este salga casi claro, solo
ligeramente azul.
Lave suavemente con agua.
Agregue la safranina para la tincin de contraste.
Lave suavemente con agua
Seque la preparacin.
Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersin de aceite.

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Conclusiones y resultados
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Observamos y procedimos a aislar la bacteria de los mtodos


anteriormente realizados.
Realizamos la tincin de Gram en la bacteria aislada anteriormente.
Visualizamos en el microscopio y delimitamos la estructura y morfologa
bacteriana.
Se identific las bacterias Gram positivas y Gram Negativas.

resultados

M1 (Mtodo de Estra) Grupo 4

Observacin: Result fallas no se pic bien la muestra.


Forma: No se tom bien la muestra
Color: No se tom bien la muestra (no cogi el
tinte).

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M2 (Mtodo de Exposicin al Medio Ambiente) Grupo 4


Observacin: Se observ diplococos y ttradas
Forma: cocos
Color: Violeta azulado (Gram Positivas)

M3 (Mtodo de Hisopado de Mano Limpia) Grupo 4


Observacin: Se observ bacterias separadas
Forma: cocobacilos
Color: rosado tenue (Gram Negativas)

M1 (Mtodo de Hisopado de Mano Limpia) Grupo 2

Observacin: Se observ levaduras


Forma: levaduriformes
Color: morado (Gram Positivas)

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M2 (Mtodo de Exposicin al Medio Ambiente) Grupo 2


Observacin: Se observ bacilos
Forma: bacilos
Color: morado (Gram Positivas)

M1 (Mtodo de Hisopado de Mano sin Lavar) Grupo3

Observacin: Result bacilos


Forma: bacilos
Color: Morado (Gram Positiva).

M2 (Mtodo de Exposicin al Medio Ambiente) Grupo3

Observacin: Result cocobacilos.


Forma: cocobacilos.
Color: Rosado Tenue.

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M1 (Mtodo de Estra) Grupo1

Observacin: Result bacilos en la muestra


Forma: bacilos
Color: Rosado Tenue (Gram Negativa)

M2 (Mtodo de Exposicin al Medio Ambiente) Grupo1

Observacin: Result staphylococos.


Forma: Cocos
Color: Morado (Gram Positivas).

Cuestionario

1.

Por qu en la tincin Gram se utiliza el lugol?

En microbiologa se emplea en la tincin de Gram para retener el colorante


cristal violeta. El lugol entra en las clulas y forma con el colorante cristal
violeta un complejo insoluble en agua.
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Se utiliza esta disolucin como indicador en la prueba del yodo, que sirve para
identificar polisacridos como los almidones, glucgeno y ciertas dextrinas,
formando un complejo de inclusin termolbil que se caracteriza por presentar
distintos colores segn las ramificaciones que presente la molcula de
polisacrido. El lugol no reacciona con azcares simples como la glucosa o la
fructosa.
2.

Cul es el fundamento de la tincin de Gram?

Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes


celulares de las bacterias Gram Positivas y Gram Negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos. Anclado en la cara
interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el
acido lipoteicoico, y ms en la superficie, el acido teicoico que est anclado
solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram Negativas es delgada,
y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de
composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa
delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La
membrana exterior esta hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas
diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es
el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram
positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram Negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la coloracin, se debe a que la
membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que
posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal
violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa,
perdindose la coloracin azul violcea. Pero pr el contrario, las Gram
positivas, al poseer una pared celular mas resistente y con mayor proporcin
de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino
que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo crista violeta/yodo, y manteniendo la coloracin
azul/violcea

Bibliografa_
Pimentel - Per
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Pelczar and Chan. 1977. Laboratory Exercises in Microbiology. Fourth


edition. Mc Graw-Hill Book Company.
Tortora, Funke and Case. Introduccin a la Microbiologa. 9na Edicin
2007. Editorial Mdica Panamericana.
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de
Mtodos Generales (segunda edicin). Facultad de Farmacia.
Universidad Central de Venezuela.

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