I.S.T.TPAC AMARU TCNICAS EN LABORATORIO CLNICO U.

D: MICROSCOPA

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

DEFINICIN:
La microscopia de campo oscuro es
una tcnica de contraste donde
solo la luz difractada desde el
espcimen se usa para formar la
imagen. El espcimen aparece
brillante contra un fondo oscuro.
De manera similar a un cielo
nocturno en el cual brillan las
estrellas o al iluminar con una
linterna un cuarto oscuro y las
partculas de polvo flotantes en el
aire se tornan visibles porque
reflejan o difractan la luz, los
especmenes observados al microscopio de campo oscuro se ven blancos y
brillantes sobre un fondo oscuro (negro).
La iluminacin de campo oscuro se puede realizar tanto mediante luz
transmitida (trans-iluminacin) como con luz incidente (epi-iluminacin). En el
primer caso, para lograr el efecto se requiere bloquear la parte central del rayo
de luz que normalmente pasa a travs y alrededor del espcimen, de tal
manera que slo sea iluminado por rayos oblicuos. La manera ms fcil y
econmica de lograrlo consiste en colocar un filtro circular opaco (por ejemplo
crculos de cartulina negra o una moneda adherida a un crculo de vidrio o
plstico transparente) bajo el condensador de un microscopio compuesto
ordinario. Esta maniobra funciona bien con objetivos de 10x-40x; el dimetro del
circulo opaco debe ser de aproximadamente 16-18mm para un objetivo de 10x
cuya apertura numrica sea de 0.25. Para un objetivo de 20x o 40x con una
apertura numrica de 0.65, el dimetro del crculo opaco debe oscilar entre 2024mm. Para la iluminacin con luz incidente o iluminacin oblicua se emplea un
filtro en forma de luna en cuarto decreciente (en forma de C), obtenindose una
interesante imagen con relieve.
El mtodo ms apropiado consiste en el empleo de un condensador
caracterstico que adems mejora la resolucin. Con este dispositivo se forma
un cono hueco de luz (cuyo centro es oscuro) que incide lateralmente sobre la
muestra y slo los rayos que son difractados o reflejados por las estructuras
penetran en la lente objetivo y la clula aparece como un objeto luminoso sobre
un fondo.
Las imgenes en autentico fondo negro son remarcables por un efecto de borde
,con numerosas franjas de difraccin muy brillantes si le objeto es refringente.
Los planos ,en el centro de una estructura parecen pticamente vacos . es por
ello que deben adoptarsen grandes precauciones en el momento de interpretar
las imgenes . Dado que la imagen solo se forma con las luz difractada, siempre
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ms dbil que la luz directa deben formarsen fuentes lumnicas muy intensas, lo
que no siempre es fcil sobre todo cuando los objetos son vivos y, por
consiguiente, sensibles a fuertes iluminacione

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FUNDAMENTO:

El filtro opaco es de forma circular y forma un cono de luz vaco que incide sobre el espcimen en f

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Micrografas de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste

entre los diversos tipos de iluminacin. En la parte inferior se aprecia el tipo de
filtro empleado, en campo claro (derecha) el haz de luz pasa sin interrupcin. En
campo oscuro, an muchos detalles ms pequeos son visibles. En iluminacin
oblicua se obtiene contraste con relieve. En campo claro el contraste es
limitado.

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CONDENSADORES UTILIZADOS EN MICROSCOPIOS DE CAMPO OSCURO

Condensador Cardiode

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Condensador Paraboloide

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Cardiode
Paraboloide.
Ambos son utilizados con el mismo fin, pero el cardiode tiene mayor
aplicabilidad en la investigacin con Treponemas

Iluminacin Rheinberg
Inventada alrededor de 1895 por un microscopista ingls llamado Julius
Rheinberg. Se basa en la iluminacin de campo oscuro (15) y se emplea con
objetivos de bajo y mediano aumento. Es una forma de coloracin ptica que
emplea filtros de colores para iluminar tanto el espcimen como el fondo
oscuro, obtenindose imgenes con efectos muy atractivos y espectaculares,
pero con la definicin y datos de la iluminacin de campo oscuro. Se utiliza un
filtro central rodeado de otros filtros en uno o varios colores que contrastan con
l. El dimetro de la mscara central depender del objetivo y debe ser del
mismo tamao que
para campo oscuro.
La
iluminacin
Rheinberg combina
la
iluminacin
convencional
de
campo claro en un
color
con
la
iluminacin de campo
oscuro
en
otro
color.

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Algunos ejemplos de modelos de filtros

empleados para la iluminacin Rheinberg que
pueden ser fabricados con plstico de colores o
pintados con marcadores permanentes para
transparencias. Un filtro de color verde en la
periferia incrementa los detalles porque el ojo
humano visualiza muy bien ese color. Es
importante que el filtro central sea ms oscuro
que el filtro perifrico. Se pueden emplear los
colores que se deseen. Tomado de Wim van
Egmond (2002). 'Easy to make' contrast
enhancement filters for the microscope darkfield, oblique and Rheinberg illumination (96).

Micrografas de la superficie de una hoja que

muestran
el
aspecto
obtenido
con
la
iluminacin
Rheinberg. En la parte inferior
se aprecia el
tipo de filtro empleado.

Microfotografa de un nematodo
la tcnica de Rheinberg. El
aparece de color azul claro
violceo.

iluminado con
parsito
sobre un fondo

Aplicaciones del microscopio de campo oscuro

Estudio de especmenes de tamao pequeo no coloreados, tales como
microorganismos acuticos, ovocitos, clulas en cultivo (cuyos ndices de
refraccin oscilan en un rango de 1.2 a 1.4 y no hay una diferencia notable con
el ndice de refraccin de 1.3 de la solucin acuosa en la cual se encuentran).
Observacin de clulas mviles, como el Treponema pallidum, una espiroqueta
causante de la sfilis, la cual con la microscopa ptica ordinaria es muy difcil de
visualizar.
Estudio de procesos fisiolgicos como mitosis y migracin celular.
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VENTAJAS
Permite
ver
partculas
dipersas
en
un
medio
homogneo.
Hace posible la observacin del movimiento Browniano de las partculas.
Se puede utilizar para la observacin de preparaciones sin colorear.
Visualiza
los
bordes
destacados
delas
muestras.
Tcnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema
pallidum, espiroquetas con dimetros superior a 0.2 um.
DESVENTAJAS

Inadecuada preparacin de la muestra.

Difcil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su
alto costo.
No deja visualizar estructuras celulares especficas, solo bordes de clulas
o partculas.

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