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Universidad Autnoma Metropolitana

Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas de la Salud
Licenciatura en Qumica Farmacutica Biolgica
Obtencin de Metabolitos de Inters Industrial para la Salud

OBTENCIN DE
-FRUCTOFURANOSIDASA POR
K l u y v e r o m i c e s m a r x i a n u s A PA R T I R
DE SACAROSA COMO FUENTE DE
CARBONO

Rosa Eugenia Reyes Reyes


Juan Esteban Barranco Florido
Alavez R. C; Garca P. D; Mungua L. R; Osorio S. A; Rodrguez N. S.

Contenido
Introduccin ............................................................................................................... 1
Marco terico ............................................................................................................. 1
Enzimas.............................................................................................................................. 1
Levadura ............................................................................................................................ 2
Kluyveromices marxianus ............................................................................................... 2
-fructofuranosidasa o invertasa (EC 3.2.1.26)............................................................. 2
Produccin y regulacin catablica de enzimas .......................................................... 3
Mtodos analticos ........................................................................................................... 4
Cintica enzimtica ................................................................................................................................. 4
Concentracin de substrato................................................................................................................... 4
VMX ........................................................................................................................................................... 6
KMX ........................................................................................................................................................... 6
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica ....................................................................................... 7
Temperatura ............................................................................................................................................ 8
Concentracin de enzima ...................................................................................................................... 9
Inhibicin enzimtica .............................................................................................................................. 9

Hiptesis................................................................................................................... 10
Objetivos .................................................................................................................. 10
Metodologa ............................................................................................................. 10
Microorganismo .............................................................................................................. 10
Medios de cultivo ............................................................................................................ 10
Inculo .................................................................................................................................................... 10
Fermentacin ......................................................................................................................................... 11

Condiciones de cultivo .................................................................................................. 11


Determinacin del crecimiento. .................................................................................... 11
Mtodos analticos. ........................................................................................................ 11
Determinacin de azcares reductores ............................................................................................. 11
Cuantificacin de protenas. ................................................................................................................ 12
Actividad enzimtica ............................................................................................................................. 13

Caracterizacin parcial de la -fructofuranosidasa de Kluyveromyces marxianus.


.......................................................................................................................................... 14
Determinacin del efecto del pH. ....................................................................................................... 14
Efecto de la temperatura. .................................................................................................................... 15
Catalizadores inicos de la enzima. ................................................................................................... 16

Determinacin de Km y Vmx aparente de la -fructofuranosidasa o Invertasa en clulas


libres. ...................................................................................................................................................... 16

REFERENCIA ........................................................................................................... 18

Introduccin
La importancia de las enzimas en la biotecnologa ha ampliado su campo de aplicacin en
la industria utilizndolas como herramientas para mejorar la produccin y la obtencin de
metabolitos.
Para la produccin de estos metabolitos se utilizan microorganismos los cuales pueden
ser bacterias, hongos y levaduras.
De estas ltimas podemos localizar al Kluyveromices marxianus, que forma parte de la
clase Ascomicetos, familia Saccharomycetaceae, sub-familia Saccharomycetoideae, del
gnero Kluyveromices y de la especie marxianus.
K. marxianus es una levadura utilizada en la industria debido a que una de sus
propiedades ms importante es la produccin de enzimas nativas, como fructofuranosidasa, -galactosidasa y pectinasas. La -fructofuranosidasa es un tipo de
enzima reprimible con actividad de invertasa.

Marco terico
Enzimas
Las enzimas presentan diversas ventajas sobre los catalizadores qumicos. Una de las
ms importantes es su especificidad para determinadas reacciones. Esta especificidad se
limita a una sola o a un grupo muy restringido de sustancias qumicas relacionadas con
ella, y excluye reacciones colaterales, con lo que se eliminan subproductos indeseables;
traducindose esto en un incremento de la productividad.
Estas catalizan las reacciones bajo condiciones moderadas de temperatura, presin y pH.
Esto disminuye los requerimientos energticos, y por tanto, los costos de produccin.
Las enzimas se encuentran en cualquier organismo vivo: plantas, animales o
microorganismos. Estos ltimos son la fuente preferida a nivel industrial, debido a que
presentan ventajas importantes en su produccin, como:
La sntesis de enzimas es ms predecible y controlable
Se cuenta con un amplio espectro de caractersticas, tales como intervalos de pH,
resistencia a altas temperaturas
Existe suficiente disponibilidad de materias primas con una composicin
relativamente constante
Su produccin no est sujeta a variaciones estacionales, ni existe riesgo de
escasez por cambios climticos o situaciones geogrficas
La manipulacin gentica ha incrementado considerablemente las posibilidades de
optimizar los rendimientos a travs de mutaciones, de seleccin de cepas y de
condiciones de crecimiento y ms recientemente, mediante la tecnologa del DNA
recombinante.

Diseo de enzimas mejoradas por ingeniera de protenas.


Las levaduras constituyen un importante grupo en cuanto a la produccin de diversas
enzimas comerciales.

Levadura
Las levaduras son los microorganismos ms importantes desde el punto de vista
industrial, porque muchas de las especies pueden convertir los azucares en alcohol etlico
y dixido de carbono. Participan en la produccin de cerveza, vino, glicerol y dems. Las
clulas de levadura se utilizan tambin en la industria de la panificacin y como alimento
animal y humano, por su alto contenido proteco. (Hernndez, 2001)
Las levaduras son hongos microscpicos que, en un estadio de su ciclo biolgico, se
presentan en forma unicelular y se multiplican por gemacin. Este grupo de
microorganismos comprende unos 60 gneros y unas 500 especies. Se agrupan
principalmente en dos clases Ascomycotina y Basidiomycotina.
Entre las levaduras de uso industrial se encuentran Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces ellipsoideus, Kluyveromices marxianus. Siendo esta ultima el eje de la
investigacin.

Kluyveromices marxianus
Kluyveromices marxianuses una de las dos levaduras que ms abundan en los productos
lcteos. Produce -galactosidasa y son fermentadoras potentes de los azcares, incluida
la lactosa (Jay, 1999), es capaz de hidrolizar la lactosa y de fermentar la galactosa. Posee
estatus GRAS (Generally Recognized As Safe) y QPS (Qualified Presumption of Safety),
es decir, se considera segura para su uso en la industria de alimentos.
K. marxianus sintetiza dos tipos de invertasa; interna y externa, ambos tipos de enzima
presentan la misma actividad especfica sobre sacarosa.

-fructofuranosidasa o invertasa (EC 3.2.1.26)


La invertasa cataliza la hidrolisis de restos terminales no reductores -Dfructofuranosdicos de fructofuransidos.
La denominacin trivial de invertasa, con la que tambin se conoce, hace referencia al
hecho de que los productos de la reaccin son conocidos desde antiguo como azcar
invertido ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de
glucosa y fructosa que resulta de su hidrlisis es levorrotatoria, por lo que en el
proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de rotacin
ptica.
Un mecanismo de regulacin en la sntesis de la invertasa, en el cual existe interaccin de
molculas de sacarosa con el receptor en la membrana celular generando seales

qumicas que podran ser trasladadas y amplificadas por monofosfato de adenina cclico
(cAMP) en el ncleo celular comenzando la induccin de la sntesis de invertasa a nivel
de ADN. El ARNm podra trasladar la informacin de la sntesis de invertasa a los
ribosomas, para despus ser sintetizada y secretada al espacio periplsmico, o bien en la
pared celular. (Figura 1)

Figura 1. Sntesis de la invertasa


Estas enzimas, tienen actividad sobre los enlaces de tipo -fructosdico hidrolizando la
molcula de sacarosa a glucosa y fructosa (Figura 2)

Figura 2. Hidrlisis de la sacarosa

Produccin y regulacin catablica de enzimas


La expresin gentica es un mecanismo en los microorganismos, la glucosa y otras
fuentes de carbono (rpidamente metabolizables) reprimen la expresin de genes de
enzimas relacionadas con el metabolismo de otras fuentes de carbono. El grado de
represin causado por glucosa depende fuertemente de la enzima afectada y la cepa
usada. La represin por glucosa es el principal sistema de regulacin en levaduras en la
3

expresin de un gran nmero de enzimas involucradas en el metabolismo de


carbohidratos. En presencia de glucosa, la sntesis de las enzimas de la gluconeognesis,
del ciclo de Krebs, la respiracin y otras especficas para la asimilacin de galactosa,
maltosa y sacarosa son fuertemente reprimidas.

Mtodos analticos
Cintica enzimtica
La cintica enzimtica estudia el mecanismo, velocidad y los factores que modifican las
reacciones catalizadas por enzimas. Los factores que estudiaremos son la concentracin
de substrato, temperatura, pH, concentracin de enzima, e inhibidores enzimticos.

Concentracin de substrato
La concentracin del substrato tiene un efecto importante en la velocidad de las
reacciones enzimticas. El anlisis del efecto del cambio de concentracin de substrato,
proporciona informacin respecto del mecanismo de reaccin, especificidad y
propiedades cinticas de las enzimas.
En 1902, al estudiar la cintica de la hidrlisis de Sacarosa, Adrian Brown descubre la
saturacin de la enzima Invertasa (EC 3.2.1.26) y propone que la reaccin se efecta en
dos etapas, primero la enzima (E) y el sustrato (S), se unen para formar un complejo (ES):

Que se disocia liberando el producto (P)

En 1913, Leonor Michaelis y Maude L. Menten corrigieron el trabajo de Brown y Henri.


Aplican condiciones estrictas para la medicin de la actividad enzimtica, y suponen que
la formacin del complejo ES, es rpida y reversible, mientras que la liberacin del
producto es lenta.
Rpida Lenta

Con base en este supuesto, proponen el modelo del Equilibrio Instantneo para
determinar la relacin entre la concentracin de substrato y la velocidad de las reacciones
enzimticas y obtienen una relacin matemtica que describe dicho efecto, la cual se
conoce como la ecuacin de Michaelis y Menten:
Donde:
v = velocidad de la reaccin
[S] = Concentracin de substrato
VMAX = Mxima actividad enzimtica
KM = Constante de Michaelis

La ecuacin de Michaelis y Menten es una hiprbola; para valores pequeos de [S] la


cantidad del substrato limita la velocidad; mientras que con valores grandes el lmite es la
cantidad de enzima. (Monroy, 2004)
Las condiciones de equilibrio instantneo, propuestas por Michaelis y Menten consisten
en suponer que E y S reaccionan muy rpidamente para formar ES mientras que la
disociacin del complejo hacia producto es relativamente lenta porque k2 es muy
pequea. Por lo tanto, el complejo ES se encuentra en equilibrio con E y S. En estas
condiciones, KM es igual a la constante de equilibrio de la disociacin del complejo ES:
Ya que k2 es pequea, a menudo es el factor que limita la velocidad y por ello se conoce
como la constante cataltica (kcat) de la enzima.

Grfico 1. Cintica de Michaelis


Aos despus, en 1925 George E. Briggs y John B. S. Haldane corrigieron el trabajo de
Michaleis al establecer que la suposicin de que k1 y k-1 son mucho mayores que k2 no
siempre se cumple, por lo tanto no se alcanza el equilibrio de la disociacin de ES. En su
lugar proponen que la concentracin de ES se encuentra en un Estado Estacionario en el
que la velocidad de formacin de ES, es igual a la de descomposicin por disociacin y
por formacin de producto. Con esta suposicin la ecuacin no cambia de forma pero KM
ya no es igual a la constante de disociacin de ES, ahora es:

Grfico 2. Variacin de la concentracin de E, S y es durante una reaccin enzimtica.

VMX
Es la mxima actividad que puede alcanzar una enzima, tericamente se logra en
condiciones de [S] grande, porque entonces la enzima se satura y trabaja tan rpido como
es posible. En la prctica es imposible que la enzima alcance el valor de VMAX, debido a
limitaciones de difusin de productos y sustratos, desde y hacia el sitio activo. (Aldave,
2004)

KMX
Si la suposicin de Michaelis y Menten es vlida, KM es la constante de disociacin de ES
a E + S, igual a k-1/k1. Por lo tanto, es una medida de la afinidad de la enzima por su
substrato. Si KM es grande significa que k-1 es grande o que k1 es pequea por lo que la
reaccin inversa es ms favorecida que la reaccin directa y con ello la afinidad de la
enzima por su substrato es baja. Por el contrario, si KM es pequea, la afinidad de la
enzima por el substrato es grande.
Por otro lado, segn Briggs y Haldane, KM representa el cociente (k-1 +k2)/k1, este
cociente sigue siendo la constante de disociacin de ES, pero ahora tanto hacia S como
hacia P, porque se supone que k2 contribuye en forma significativa a la desaparicin de
ES. De cualquier manera, valores de KM grandes representan baja afinidad por el
substrato y valores pequeos afinidad alta.
El valor de KM tambin corresponde a la concentracin de S en la cual v = V MAX/2, que se
interpreta como la concentracin a la cual la enzima est saturada slo a la mitad.

Cuando ms de una enzima cataliza una reaccin, o si no estamos seguros de cul es el


substrato verdadero de una enzima, los valores de KM indican la relacin ms apropiada.
Tpicamente, si la enzima trabaja con varios substratos podra suponerse que el substrato
con el KM ms bajo es el substrato verdadero. (Monroy, 2004)

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica


La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la reaccin. La
curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima (Fig. 2). En el caso ms
general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es mxima se
denomina pH ptimo; dicho pH no tiene porque coincidir con el pH intracelular. La relacin
entre el pH y la actividad depende del comportamiento cido-base del enzima y del propio
sustrato. Sustrato y enzima (centro activo) pueden contener grupos funcionales cidos y
bsicos, siendo su grado de disociacin dependiente del pH, lo que determinar, entre
otros aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de unin del sustrato al
centro activo del enzima (Km). Los estudios cinticos a diferentes valores de pH nos
proporcionan informacin sobre el mecanismo cataltico de los enzimas y la naturaleza de
los aminocidos ms directamente implicados en la catlisis. (Aldave, 2004)

Grafico3.Efecto del pH sobre la actividad de diversos enzimas.


El pH del medio afecta la actividad de las enzimas, porque muchos de los aminocidos
tiene restos ionizables. Los cambios de pH modifican el grado de ionizacin de todos o
alguno de estos grupos, lo que repercute en la ionizacin total de la molcula de enzima
modificando su actividad al menos por tres mecanismos.
1. Los pH extremos, por debajo de 4.0, o por arriba de 10.0, cambian el grado de
ionizacin de casi todos los restos de aminocidos de la enzima, de forma que
puede alterarse su estructura tridimensional. Si este cambio es suficientemente
grande, se desnaturaliza la enzima y se pier- de su actividad de forma irreversible.
Incluso, la disminucin del pH, que se presenta en las muestras de fluidos

corporales o de tejidos por dao o muerte celular, puede ocasionar la desnaturalizacin de las enzimas.
2. Las variaciones de pH ms pequeas, entre 4 y 10, afectan a un nmero menor de
grupos ionizables, pero si stos estn presentes en el sitio activo, la actividad
enzimtica cambia en forma importante. Sin embargo, este cambio normalmente
es reversible.
3. La variacin del pH tambin puede alterar la ionizacin del substrato, y modificar la
unin enzima substrato.
Para muchas enzimas, el efecto del pH tiene forma de campana con un valor de pH
ptimo bien definido, pero para otras, la forma de la curva es muy diferente; por ejemplo,
cuando en la interaccin enzima substrato participan muchos grupos ionizables. Los
puntos de inflexin de la curva pH/actividad corresponderan a los pK de los grupos
responsables de la dependencia frente al pH. Este tipo de informacin se ha utilizado para
identificar de los aminocidos del sitio activo.

Grfico 4. Efecto del ph sobre la actividad enzimtica.


Algunas enzimas estn adaptadas para funcionar al pH propio de su ambiente. Por
ejemplo, la Pepsina tiene un pH ptimo de 2.0, que corresponde aproximadamente al pH
del jugo gstrico. Por otro lado, el pH ptimo de ciertas enzimas intracelulares est muy
alejado del pH intracelular; por ejemplo, la Glicerato cinasa (EC 2.7.1.31) tiene un pH
ptimo de 9.8, y la Fosfogliceratomutasa (EC 5.4.2.1) de 5.9. Esto puede deberse a que
las enzimas manifiestan propiedades di- ferentes in vitro e in vivo, donde la interaccin
con los componentes celulares pueda modificar su dependencia del pH. (Monroy, 2004)

Temperatura
Igual que ocurre en las reacciones qumicas, al aumentar la temperatura aumenta la
velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Esto se debe a que un mayor
nmero de molculas alcanzan la energa cintica necesaria para superar la energa de
activacin de la reaccin. Sin embargo, el aumento de temperatura tambin disminuye la
estabilidad de la estructura de las protenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse,

de modo que a medida que aumente la temperatura la actividad enzimtica tiende a bajar.
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura, existe una
Temperatura ptima en la cual la actividad enzimtica tiene un mximo. Es de suponer
que a la temperatura normal de los organismos las enzimas sean estables, y por lo tanto
estn por debajo de su temperatura ptima. (Aldave, 2004)

Grfico 5. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.


La mayora de enzimas se desnaturalizan rpidamente a 100 C y pierden mucha de su
actividad al ser expuestas a temperaturas superiores a 60 C, an por perodos de tiempo
cortos.

Concentracin de enzima
Como se explic antes, la velocidad de la actividad enzimtica, depende de la constante
cataltica y la concentracin del complejo enzima substrato

S la enzima se encuentra en condiciones de [S] constante, o de saturacin, su actividad


depende solamente de la concentracin de enzima con una cintica de orden 1 esto es, al
aumentar la concentracin de enzima la actividad enzimtica aumenta en la misma
proporcin. Este efecto tiene relevancia biolgica en los procesos de induccin
enzimtica, cuando la actividad de una enzima que no exista o estaba a un nivel muy
bajo, aumenta por la sntesis de la misma, provocada por la acumulacin de su sustrato.
(Hestrin, 1998)

Inhibicin enzimtica
Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a las enzimas y disminuyen su
actividad. Las clulas emplean como inhibidores molculas de intermediarios metablicos

o iones, para controlar la actividad enzimtica como parte de la regulacin del


metabolismo. En investigacin se usan inhibidores para estudiar las propiedades de las
enzimas. Muchos inhibidores enzimticos son usados como medicamentos, venenos,
pesticidas, etc. Existen dos tipos generales de inhibidores enzimticos: Reversibles e
Irreversibles.
Los inhibidores irreversibles se combinan o destruyen un grupo funcional de la enzima,
necesario para la actividad cataltica. Los inhibidores irreversibles se disocian muy
lentamente de la enzima porque se unen con fuerza, ya sea en forma covalente, la
mayora, o no covalente, por tal motivo se dice que no se pueden eliminar. (Lampen,
1980)

Hiptesis
La enzima -fructofuranosidasa producida por K. marxianus a partir de un medio rico en
sacarosa, presenta actividad enzimtica. Si se cambian las condiciones ptimas de
temperatura, pH y efecto de cationes modificara su actividad enzimtica

Objetivos
Analizar la actividad de la enzima -fructofuranosidasa mediante ensayos enzimticos y
parmetros cinticos de crecimiento.
Obtencin de la enzima -fructofuranosidasa.
Compara la actividad enzimtica mediante dos fuentes de carbono (sacarosa y
glucosa)
Modificar y evaluar las condiciones de la -fructofuranosidasa (pH, temperatura y
efecto de cationes).
Determinar parmetros cinticos y obtencin de Vmx y Km.

Metodologa
Microorganismo
Para este estudio se utilizara la levadura Kluyveromyces marxianus.

Medios de cultivo
Inculo
Se prepararan 50 mL del medio. Con una composicin de 5% de sacarosa, 0.5% de
extracto de levadura y 5 mg de ampicilina.

10

Fermentacin
Se utilizaran 2 medios de cultivo para la fermentacin, de acuerdo al control que se
requiere:
Control negativo
Se prepararan 150 mL con una composicin de 0.5 % de extracto de levadura y 1% de
glucosa.
Control positivo
Se prepararan 150 mL con una composicin de 0.5% de extracto de levadura y 1% de
sacarosa.
Todos los medios de cultivo se preparan en matraces de 250 mL con tapn de algodn, y
se ajustan a un pH de 4.5, esterilizar a 10 lb de presin por 10 minutos.

Condiciones de cultivo
Todos los medios de incuban a 30C con agitacin de 180 rpm.

Determinacin del crecimiento.


Cada hora tomar de 10 mL de la muestra a partir del tiempo cero durante 12
horas. Posteriormente guardar 5 mL en refrigeracin y con los 5 mL restantes
centrifugar a 5000 rpm a 4C. Al sobrenadante se le mide pH y azcares totales, el
paquete celular se resuspender en 5 mL de agua y se medir su absorbancia a una
DO de 660 nm, calcular a travs de acuerdo con la curva estndar de peso seco
vs. DO.
Los cinco mL de muestra para congelacin se colocarn en tubos falcon para
posteriormente medir la actividad enzimtica.

La curva estndar nos proporciona la ordenada al origen (b), la pendiente (m) y la


lectura (y)

Mtodos analticos.
Determinacin de azcares reductores
Realizar una curva de calibracin y cuantificar los azucares reductores por el
mtodo propuesto Miller,G.L.(1959)

Preparar curva estndar. Tabla 1

11

Preparar una mezcla de reaccin con un volumen final de 1.5 ml en agua


destilada
1 ml del reactivo de DNS
Hervir las muestras por 5 minutos
Dejar enfriar a temperatura ambiente
Llevar a volumen final de 10 ml con agua destilada
Agitar y leer a 550 nm de UV/Vis
Tabla 1. Curva estndar azucares reductores
Conc. Final
Reactivo
Vol final
DNS
Hervir
glucosa
(ml)
(ml)
(g/ml)

Glucosa

H2O

H2O

(ml)

(ml)

0.0

1.5

1.5

5 min

7.5

0.1

1.4

1.5

100

5 min

7.5

0.2

1.3

1.5

200

5 min

7.5

0.4

1.1

1.5

400

5 min

7.5

0.6

0.9

1.5

600

5 min

7.5

0.8

0.7

1.5

800

5 min

7.5

1.0

0.5

1.5

1000

5 min

7.5

(ml)

Cuantificacin de protenas.
Realizar la curva de calibracin con BSA como estndar y cuantificar las protenas
mediante la tcnica propuesta por Lowry,H y cols. (1951) Tabla 2.
Preparar la solucin estndar y procedimiento:

Albmina 1mg/ml. 10 mg para 10 ml de agua destilada.


Tomar 0.3 ml de esta solucin y agregar 2.7 ml de agua destilada para una
solucin de 100 g/ml
Colocar en un tubo alcuota de estndar de protena
Llevar a 1 ml con agua destilada
Agregar 3 ml reactivo E y agitar vigorosamente
Dejar reposar 10 min. a T. ambiente
Agregar 0.3 ml reactivo fenol 1:1, agitar
Dejar reposar a T. amb.
Leer a 540 nm UV-Vis

12

Std albmina
(ml)

Tabla 2. Curva estndar cuantificacin de protenas


H2O
Reactivo E
Conc. Final
albmina
(ml)
(ml)

Folin 1:1
(ml)

0.3

0.125

12.5

0.875

0.3

0.250

25

.750

0.3

0.500

50

.500

0.3

0.750

75

.250

0.3

1.0

100

0.3

Actividad enzimtica

Establecer el tiempo para una segunda fermentacin.


Determinar la actividad enzimtica con las muestras en congelacin.
Centrifugar las muestras a 5000 rpm a 4 C.
Resuspender el extracto enzimtico en 5 mL de agua destilada (realizar 2
veces el lavado).
Preparar una solucin estndar de sacarosa 5% en amortiguador de
acetatos pH 5.0. esta reaccin deber realizarse a 50 C. durante 30 min,
con agitacin constante.
Medir los productos de la reaccin enzimtica por la tcnica de azcares
reductores.

Realizar la reaccin como se indica en la siguiente tabla. Tabla 3.


Tabla 3. Condiciones para la determinacin de la actividad enzimtica
Muestra Agua
Sol.
Temperatura Muestra Muestra
de
destilada Estndar
de incubacin T=0
T=30
clulas
de
(mL)
min
min
(mL)
sacarosa
(mL)
5%(mL)
(mL)
0.2

0.8

4.0

50 C

0.1

DNS
despus
de
30
min

3
0.1

13

Leer las muestras a 550 nm. En el espectrofotmetro de UV/Vis.


Realizar las diluciones necesarias para que los valores de la absorbancia
obtenidos queden dentro de la curva estndar de calibracin.

Caracterizacin parcial de la -fructofuranosidasa de Kluyveromyces


marxianus.
Determinacin del efecto del pH.
El pH es determinado por medio de soluciones amortiguadoras en una escala de pH =
3.5 hasta pH= 8.5. Tabla 4.

Preparar las siguientes soluciones amortiguadoras:


Buffer de citrato-fosfato 0.1M pH 4-5.
Buffer de fosfatos 0.1 M pH 6-8.
Disolver en cada caso la sacarosa al 5%.
Realizar por duplicado.
Tabla 4. Determinacin de pH

pH

4.0

Muestra Agua
de
destilada
clulas
(mL)
(mL)

0.2

0.8

Sol.
Estndar
de
sacarosa
5%(mL)

Temperaura
de
incubacin

4.0

50 C

Muestra
T=0
min
(mL)

Muestra
T=30
min
(mL)

0.1

3
0.1

5.0

0.2

0.8

4.0

50 C

0.1

0.2

0.8

4.0

50 C

0.1

0.2

0.8

4.0

50 C

0.1

0.2

0.8

4.0

50 C

3
3

0.1
8.0

3
3

0.1
7.0

3
3

0.1
6.0

DNS
despus
de
30
min

0.1

3
3

0.1

14

Efecto de la temperatura.
Preparar una solucin estndar de sacarosa 5% en amortiguador de acetatos pH
5.0. Esta reaccin deber realizarse a diferentes temperaturas, durante 30 min,
con agitacin constante. Tabla 5.
Tabla 5.Determinacin de temperatura
Muestra
de
clulas
libres
(mL)

Agua
destilada
(mL)

Sol. Std
Sacarosa
(mL)

Temperatura

Muestra
1

Muestra
2

T=0 min

T=30 min

(mL)

(mL)

0,1

0.1

DNS
despus
de 30
min (mL)

3
0.2

0.8

40 C

3
3
0.2

0.8

50 C

0.1

0.1
3
3

0,2

0.8

60 C

0.1

0.1
3
3

0.2

0.8

70 C

0.1

0.1
3
3

0.2

0.8

80 C

0.1

0.1
3

15

Catalizadores inicos de la enzima.

Preparar una solucin estndar con un amortiguador de acetatos a pH con


sacarosa al 5%.
Agregar los cationes con una concentracin de 5mM para cada catin
estudiado.

Tabla 6.Determinacin de catalizadores inicos de la enzima


Cationes Muestra Agua
Sol.
Temperaura Muestra Muestra DNS
de
destilada Estndar de
T=0
despus
(mL)
T=30
clulas
de
incubacin
de 30 min
(mL)
min
min
(mL)
sacarosa
(mL)
5%(mL)
(mL)

Mg2+

0.2

0.8

4.0

50 C

0.1

3
0.1

Fe3+

0.2

0.8

4.0

50 C

0.1

3
0.1

Cu2+

0.2

0.8

4.0

50 C

0.1

0.2

0.8

4.0

50 C

0.1

3
3

0.1

3
3

0.1
Zn2+

El control tendr amortiguador de acetatos a pH 5.0 con sacarosa al 5 % sin


ningn catin. La actividad enzimtica del control se tomar como 100 % y
se compararn con los resultados de actividad enzimtica en presencia de
cationes porcentualmente

Determinacin de Km y Vmx aparente de la -fructofuranosidasa o


Invertasa en clulas libres.

Preparar soluciones de acetatos pH 5.0 con diferentes concentraciones de


sacarosa. (5%,2.5%,1%,0.5%,0.25%)
Medir la actividad a 3 diferentes tiempos.

Observar Tabla 7.

16

Tabla 7. Determinacin de Km y Vmax


Concentracin de
sacarosa en %

t1

t2

t3

10

2.5

0.5

0.25

17

REFERENCIA
1. Hernndez, A. (2001) Microbiologa Industrial Ed. Trillas, 1ra Ed. pg. 7
2. Jay, M. (1999) Microbiologa moderna de los alimentos 4ta edicin Editorial
ACRIBIA, S.A.
3. Monroy. M, Ordorica, M. A. (2004), Termodinmica, Cintica y Enzimas
file:///C:/Users/V5%20Touch/Documents/Unidad41.pdf Actual 06/03/14 1:47 p.m.
4. Aldave, M. Jorrn J. (2004) Estudio cintico de la actividad invertasa de levadura
de panadera. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular.
5. Hestrin S, Feingold DS, Schramm M (1998): -Fructofuranosidade (invertase) from
yeast. Methods in Enzymology 1: 251-257.
6. Lampen JO (1980): Yeast and Neurospora invertases. En: Boyer PD (ed): The
Enzymes, 3 ed. Vol V. Academic Press (New York, USA), pp 291-305.

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