ANTIOXIDANTES NATURALES

OH
HO
HOOC

H3C

CH3
CH
CH3

CH3

Carnosic acid

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Area Industrial 150.000 m2

Facturacin 10 M Eur
Empleados 60

Dos Plantas de Fabricacin

2000 Tm/Ao M. Vegetal
200 Tm de Extractos/Ao

Planta de Extraccin
1999

Nueva Planta de Extraccin

2009

Area
Almacenamiento
Disolventes

4 Doctores
6 Licenciados/Ingenieros
4 Diplomados

GC

HPLC

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Acabado en Salas Blancas

8 Salas Clase D
Garanta Sanitaria

Gama de Productos

NUTRAFUR Extractos Botnicos

NUTRAFUR Bioflavonoides y flavonoides puros
NUTROX Antioxidantes para Alimentacin
NutraT Ingredientes Funcionales

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

1)
2)
3)
4)
5)

Objetivo
Bsqueda Bibliogrfica
Seleccin de las posibles fuentes vegetales
Mtodos de extraccin y purificacin
Tcnicas de identificacin y cuantificacin

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
1) Objetivo
Obtener una sustancia contenida en una matriz animal o
vegetal manteniendo dicha sustancia inalterada
Emplearemos Procesos Fsicos que no alteren la estructura
molecular de la sustancia.
Estos procesos estarn basados en dos propiedades
fundamentales: estabilidad y solubilidad de la sustancia en
diferentes medios.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Procesos Fsicos

Agua Caliente

Agua Fra

Solubilidad

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
Estabilidad de la sustancia
A la oxidacin
- Ac. Carnsico a Carnosol. Inertizacin con N2
A la temperatura
-Deshidratacin o hidrlisis
-Cinarina a Ac. clorognico
Al pH (solo en medios que contengan agua)
-Oleuropeina a Hidroxitirosol
A enzimas de la matriz (oxidasas, hidrolasas,etc)
-fenoles a quinonas
Al disolvente
-Metilaciones, etilaciones o acilaciones

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
1) Objetivo
En algunos casos concretos podemos emplear Procesos
Qumicos, siempre que sean reversibles.

H+
OH-

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

OH-

H+

Flavanona

Chalcona

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
1) Objetivo

Mxima eficacia energtica

Vapor

Electricidad
Mnimo Coste

Mximo aprovechamiento
Mxima pureza

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
2) Bsqueda Bibliogrfica
Obtener la mxima informacin posible en relacin a los
siguientes aspectos:
Posibles fuentes de la sustancia : Plantas, origen, condiciones
Contenidos: Partes de la planta, variedades
Mtodos de medicin
Estabilidad
Actividad biolgica
Toxicidad

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

2) Bsqueda Bibliogrfica

Fuentes bibliogrficas:
Libros y Monografas
Farmacopeas
Artculos cientficos
Internet
Medline
Scirus
Ingenta Connect

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
3) Seleccin de la fuente vegetal
En base a los siguientes criterios:

Abundancia

Accesibilidad

Localizacin

Estacionalidad

Contenido en activos

Gasto Disolvente

Horas de trabajo

Coste

Facilidad de manejo

Densidad aparente

Humedad

Estabilidad al almacenamiento

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
UA DE GATO
Amazona Peruana

ROMERO
Pradera Murciana

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

4) Mtodos de Extraccin

Preparacin del material vegetal:

1) Extraccin en fresco

Cortado

Inactivacin de enzimas
2) Extraccin en Seco

Secado

Molienda

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

4) Mtodos de Extraccin

Preparacin del material vegetal:

1) Secado

Natural

Forzado

Aire caliente

Vaco
2) Tamao de partcula

Molienda

Tamizado

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
Secado del Material Vegetal

Secado a sol

Secado por
aire

Secado a vaco

Largo tiempo
de secado

Corto tiempo
de secado

Corto tiempo
de secado

Baja
temperatura

Alta
temperatura

Baja
temperatura

Bajo coste
Energtico

Alto coste
Energtico

Alto coste
Energtico

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

4) Mtodos de Extraccin
Preparacin del material vegetal:
1) Secado

Natural

Forzado

Aire caliente

Vaco
2) Tamao de partcula

Molienda

M. Martillos

M. Cuchillas

Tamizado

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Molino de Martillos

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Molino de Cuchillas

Mtodos de Extraccin
Principales tcnicas de separacin

1)

2)

Extraccin con disolventes

1) Lquido-lquido
2) Slido-lquido
3) En fase slida
4) Extraccin
con
fluidos
supercrticos
Mtodos de Purificacin
1) Precipitacin y Filtracin
2) Destilacin
3) Columna de adsorcin
4) Fermentacin

Mtodos de Extraccin
Principales tcnicas de separacin y anlisis

3) Cromatografa
En capa fina y en papel
En columna
Cromatografa de lquidos
Cromatografa de gases
Cromatografa
con
supercrticos

fluidos

Extraccin con disolventes

Definicin: proceso por el cual se transfiere uno o ms solutos de una fase a

otra, generalmente entre dos lquidos o entre un lquido y un slido.

Fundamento: Diferencia de afinidad de una sustancia entre la muestra y el

disolvente extractante.

Objetivos:
1) Separacin de una sustancia de la matriz
2) Separacin de varias sustancias entre s (empleando varios disolventes)
Mejor con cromatografa
3) Preconcentracin (utilizando un pequeo volumen de disolvente afn a la
sustancia)

Eleccin del disolvente

Propiedades deseadas:
No txico
Bajo punto de ebullicin (50-70 C)
Miscible con agua (sol-liq) o
inmiscible (liq-liq)
Baja tendencia a formar emulsiones

Disolventes comunes:
Agua
Metanol CH3OH
Etanol CH3CH2OH
Isopropanol CH3CHOHCH3
Acetona CH3COCH3
ter dietlico CH3CH2OCH2CH3
Cloroformo CHCl3
Benceno C6H6

Parmetros a optimizar

Eleccin del disolvente

Rendimiento

Pureza
Relacin entre matriz y disolvente

Vehiculacin

Relacin solubilidad activo vs impurezas

Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

Tiempo
Temperatura
pH
Numero de operaciones

Parmetros a optimizar
Rendimiento y Pureza

Rendimiento. Cantidad de extracto obtenido

por cada 100 g de matriz.
Pureza. Cantidad de principio(s) activo(s) por
cada 100g de extracto.
Estn relacionados entre s y limitados por el
contenido en activos de la matriz original.
Rendimientos por encima del contenido en
activos de la matriz reducen la pureza del
extracto.

Eleccin del disolvente

Experiencia 1. Para la primera experiencia se fijaron las siguientes
condiciones: relacin slido lquido 1/10, temperatura 50 C, tiempo de
extraccin 3 horas. La tabla 1 muestra la cantidad y pureza del extracto
obtenido con los distintos disolventes estudiados:
Disolvente

gr. de extracto

% Pureza

Metanol 98%

15.3

79.6

Etanol 98%

14.2

79.9

Isopropanol 98%

17.5

61.2

Acetona 99%

6.7

58.6

Eleccin del disolvente

Experiencia 1. Para la primera experiencia se fijaron las siguientes
condiciones: relacin slido lquido 1/10, temperatura 50 C, tiempo de
extraccin 3 horas. La tabla 1 muestra la cantidad y pureza del extracto
obtenido con los distintos disolventes estudiados:
Disolvente

gr. de extracto

% Pureza

Metanol 98%

15.3

79.6

Etanol 98%

14.2

79.9

Isopropanol 98%

17.5

61.2

Acetona 99%

6.7

58.6

Isopropanol da mayor rendimiento pero con una pureza muy baja.

10.71 gr de sustancia pura frente a 12.18 gr del metanol 98%.

Eleccin del disolvente

Experiencia 1. Para la primera experiencia se fijaron las siguientes
condiciones: relacin slido lquido 1/10, temperatura 50 C, tiempo de
extraccin 3 horas. La tabla 1 muestra la cantidad y pureza del extracto
obtenido con los distintos disolventes estudiados:
Disolvente

gr. de extracto

% Pureza

Metanol 98%

15.3

79.6

Etanol 98%

14.2

79.9

Isopropanol 98%

17.5

61.2

Acetona 99%

6.7

58.6

De los resultados anteriores se deduce que los alcoholes ms polares

metanol y etanol obtienen purezas suficientes con buenos rendimientos.

Eleccin del disolvente

Experiencia 2. Para la siguiente experiencia se mantuvieron las
condiciones y se utilizaron diferentes purezas de metanol y etanol.
Los resultados se muestran en la tabla 2:
Disolvente

gr. de extracto

% Pureza

Metanol 98%

15.3

79.6

Metanol 95%

15.2

80.3

Metanol 90%

14.4

79.3

Etanol 98%

14.2

79.9

Etanol 96%

15.8

80.6

Etanol 90%

13.7

79.8

Eleccin del disolvente

Experiencia 2. Para la siguiente experiencia se mantuvieron las
condiciones y se utilizaron diferentes purezas de metanol y etanol.
Los resultados se muestran en la tabla 2:
Disolvente

gr. de extracto

% Pureza

Metanol 98%

15.3

79.6

Metanol 95%

15.2

80.3

Metanol 90%

14.4

79.3

Etanol 98%

14.2

79.9

Etanol 96%

15.8

80.6

Etanol 90%

13.7

79.8

De estos resultados se deduce que el mejor solvente de extraccin es el etanol

96%, tanto por rendimiento como por la pureza del extracto obtenido. A partir de
ese momento todas las experiencias se realizaron con etanol 96%

Parmetros a optimizar

Relacin entre matriz y disolvente

Vehiculacin

Relacin solubilidad activo vs impurezas

Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

Tiempo
Temperatura
pH
Numero de operaciones

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Parmetros a optimizar
Relacin disolvente matriz
0,6
0,5

Rendimiento

0,4
0,3
0,2
0,1

Pureza

0
0

10

Ratio disovente/matriz

La pureza puede disminuir a partir de una relacin determinada debido

a una mayor solubilidad relativa de alguna de las impurezas.

Experiencia 3. Para la optimizacin de la relacin slido/solvente se

realizaron extracciones con etanol 96% y diferentes relaciones
slido/lquido, manteniendo el resto de las condiciones como en la
experiencia 1, 3 hr y 50 C.
Relacin
slido/solvente

gr. de extracto

% Pureza

1:4

12.6

79.1

1:6

14.2

79.9

1:8

15.9

80.2

1:10

15.8

80.6

Hasta una relacin slido/lquido 1/4, el slido no se puede vehicular con el

agitador, por lo que sta es la menor relacin slido/lquido a ensayar.

Experiencia 3. Para la optimizacin de la relacin slido/solvente se

realizaron extracciones con etanol 96% y diferentes relaciones
slido/lquido, manteniendo el resto de las condiciones como en la
experiencia 1. Hasta una relacin slido/lquido 1/4, el slido no se
puede vehicular con el agitador, por lo que sta es la menor relacin
slido/lquido a ensayar.
Relacin
slido/solvente

gr. de extracto

% Pureza

1:4

12.6

79.1

1:6

14.2

79.9

1:8

15.9

80.2

1:10

15.8

80.6

De los resultados se observa que a partir de relaciones 1/8 los resultados son
idnticos. Esto se confirm analizando el residuo vegetal y comprobando que no
quedan prcticamente activos en l. Para las siguientes experiencias se us la
relacin 1/8, en funcin del ahorro de disolvente.

Parmetros a optimizar

Relacin entre matriz y disolvente

Vehiculacin

Relacin solubilidad activo vs impurezas

Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

Tiempo
Temperatura
pH
Numero de operaciones

Parmetros a optimizar

Concentracion

0,6
0,5
0,4
0,3

0,2
0,1
0
0

10

Tiempo

El disolvente se satura de solutos. Incluso en ocasiones

puede disminuir la concentracin debido a degradacin
del activo. Influyen temperatura, pH y tamao de
partcula.

Parmetros a optimizar

Tiempo de Extraccin

El disolvente se satura de solutos. Incluso en ocasiones

puede disminuir la concentracin debido a degradacin
del activo. Influyen temperatura, pH y tamao de
partcula.

Experiencia 4. En esta experiencia se estudi el tiempo mnimo de

extraccin necesario para obtener todos los activos presentes en la
materia prima. Las condiciones experimentales fueron: etanol 96%,
relacin slido/lquido 1/8 y temperatura 50 C. Los resultados obtenidos
para diversos tiempos de extraccin se muestran en la tabla 4:
Tiempo Extraccin
(hr)

gr. de extracto

% Pureza

15.3

80.4

15.9

80.8

15.9

80.2

15.6

80.7

Los resultados obtenidos no presentan variaciones significativas con el tiempo

de extraccin por lo que se utiliz en lo sucesivo tiempos de extraccin de una
hora.Mayor aprovechamiento de los equipos industriales.

Parmetros a optimizar

Relacin entre matriz y disolvente

Vehiculacin

Relacin solubilidad activo vs impurezas

Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

Tiempo
Temperatura
pH
Numero de operaciones

Extraccin con disolventes

T 25 C

T 50 C

El calentamiento suele favorecer la extraccin (sl/lq)

Experiencia 5. Por ltimo se optimiz la temperatura de extraccin

sobre las condiciones del experimento 4. Los resultados se muestran en
la tabla 5:
Temperatura
Extraccin (C)

gr. de extracto

% Pureza

20

11.9

81.1

30

14.1

80.8

40

15.1

80.2

50

15.3

80.4

60

15.6

80.6

70

15.5

80.2

Los resultados demuestran muy poca diferencia entre 50 y 70 C.

Experiencia 5. Por ltimo se optimiz la temperatura de extraccin

sobre las condiciones del experimento 4. Los resultados se muestran en
la tabla 5:
Temperatura
Extraccin (C)

gr. de extracto

% Pureza

20

11.9

81.1

30

14.1

80.8

40

15.1

80.2

50

15.3

80.4

60

15.6

80.6

70

15.5

80.2

Se eligi 50 C, para minimizar las perdidas de disolvente por evaporacin.

Punto ebullicin del disolvente en torno a 60 C..

Parmetros a optimizar

Relacin entre matriz y disolvente

Vehiculacin

Relacin solubilidad activo vs impurezas

Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

Tiempo
Temperatura
pH
Numero de operaciones

Parmetros a optimizar
pH

Altera la ionizacin de grupos funcionales

tanto de los principios activos, como de las
impurezas, modificando sus propiedades de
solubilidad.
Puede hidrolizar azucares y otros grupos
lbiles en la molcula del principio activo,
degradndolo. Tambin pH altos pueden
favorecer la oxidacin de grupos fenol.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

OH-

H+

Flavanona

Chalcona

Parmetros a optimizar

Relacin entre matriz y disolvente

Vehiculacin

Relacin solubilidad activo vs impurezas

Coste (gasto en disol. vs aumento rend.)

Tiempo
Temperatura
pH
Numero de operaciones

Lo ideal es una sola operacin. Esto es lo normal cuando

se usa un tanque agitado. En sistemas de percolacin se
requiere un nmero mayor de operaciones para agotar la
matriz.

Extraccin convencional
Material
Vegetal
Extractor

Disolvente

Solubilizacin de la
sustancia en el
disolvente
extracto = solvente + soluto

Centrfuga o Filtro

Residuo = Material vegetal

empobrecida en soluto.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Extractor y Centrfuga

Extraccin por percolacin

extracto

extracto

extracto
A Ext 1
A Ext 2

Mat. Prima
Ext. 1

Disolvente

Limpio

Ext. 2

Ext. 3

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Percolacin

Material Vegetal esttico

Disolvente circula a travs del material
vegetal
Filtracin en el mismo reactor

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Percolacin

Material Vegetal esttico

Disolvente circula a travs del material
vegetal
Filtracin en el mismo reactor

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Percolacin-Extraccin de Caf

Ventajas comparativas de la extraccin

en tanque y por percolacin

Tanque
Menor Gasto disolvente
Menor tiempo de proceso
Mas selectivo
Sin caminos
preferenciales

Percolacin
Menor coste de separacin
Residuo con menos
disolventes

Procesado de slidos con fluidos

supercrticos:percolacin
extracto

fractionamiento

Mat. prima

P1, 1

producto 1
SC-CO2
(P, )

P2, 2

CO2 gas

P3, 3

producto 2 producto 3
Presin: P > P1 > P2 > P3
Densidad: > 1 > 2 > 3

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Extractor Supercrtico en Altex

CO2 Supercritico como extractante

Granos de caf tostados y

secados hasta el 30 50% de
humedad.
CO2 Supercrtico es generado a
temperatura y presinde 40 80 C y
120 180 atm respectivamente.
CO2 Supercrtico pasa a travs de
los granos de caf en contracorriente.
CO2 Supercrtico es capaz de
extraer las pequeas moleculas de
cafena pero deja otras ms grandes
responsabes del aroma y sabor de
caf.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

Extractor Supercrtico Descafeinado

Ventajas y desventajas de la
extraccin con SC-CO2
Ventajas
GRAS
Ecolgico
No deja residuos
No es inflamable
Barato

Desventajas
Poco util para grandes moleculas
Necesidad de Co-solventes
Instalacin cara
Mayor gasto energtico

Cromatografa y extraccin con fluidos

supercrticos
SECTORES SUSCEPTIBLE DE APLICACIN DE ESTA
TECNOLOGA:
Los resultados de la investigacin tendran aplicacin industrial
en los siguientes sectores:
PRODUCTOS NATURALES:
Aceites esenciales y aromas.
Extraccin
de
pigmentos
naturales.
Extraccin de cafena, nicotina,
etc.
TEXTILES:
Extraccin del lanolina.
Impregnacin con SFC.
Acabado de fibras textiles.

NUTRACETICOS:
Extraccin del licopeno.
Extraccin de
betacarotenos.
Extraccin
de
bioflavonoides.

ALIMENTACIN:
Extraccin del lpulo.
Extraccin de colesterol.
Extraccin de semillas.
Extraccin
de
cidos
grasos.

FARMACETICO:
Purificacin de frmacos.
Separacin de ismeros.
Microcristalizacin.
Presntesis

OTROS:
Limpieza
de
productos
electrnicos.
Recuperacin de Plastificadores.
Medio de reaccin.
Nuevos materiales.

Mtodos de Purificacin

1) Precipitacin y Filtracin
pH
Salting Out
2) Destilacin
Simple
Fraccionada
3) Adsorcin en columna
4) Fermentacin

Separaciones por precipitacin

R puede ser un cido o una base (obtencin hesperidina) o

bien una sal neutra soluble en el medio (obtencin
chalconas)

Separaciones por precipitacin

R puede ser un cido o una base (obtencin hesperidina) o

bien una sal neutra soluble en el medio (obtencin
chalconas)

Separaciones por filtracin

Medios filtrantes: tela, placa porosa o malla metlica

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
Separaciones por filtracin

Separaciones por filtracin

Filtro de placas

Filtros a Vaco
Filtro de Tambor

Filtros a Vaco

Filtro Nutcha

Separaciones por destilacin

Separaciones por destilacin

DESTILACION
ARRASTRE

SIMPLE
FRACCIONADA

LIQUIDOS
NO VOLATILES

UN COMPONENTE
VOLATIL
2 COMPONENTES
VOLATILES

CONCENTRACIN Y PRECIPITACIN

Cromatografa en Capa Fina

Cromatografa en Capa Fina

CROMATOGRAFA
DE AFINIDAD

Producto A

Eluyente

Molec. NO INTERACCIN RPIDAS

* No se unen al ligando de la fase
estacionaria.

Extracto

Molec. INTERACCIN LENTAS

* Se unen al ligando de la f. estacionaria.
Elucin especfica.
Eluyente

PERFIL DE ELUCIN
ELUCIN
ESPECFICA

APLICACIN
MUESTRA
LAVADO
ELUCIN
ESPECFICA

respuesta del detector

LAVADO

molcula

8
9
fraccin

Cromatografa en Columna

Cromatografa en Columna

Fermentacin

Eliminacin

Concentracin
Cristalizacin

Condiciones:
1. Aireacin continua
2. Control de pH y temperatura
3. Eliminacin CO2 producido
4. Tiempo

Filtracin
Secado

Mtodos de Purificacin
Fermentacin

Hesperidina

Hesperetina +

Rhamnosa

Glucosa

Mtodos de Purificacin
Fermentacin

Fermentacin

Escalado

20 ml

2 lts

300 lts

30000 lts

3000 lts

Fermentacin

Fermentacin

Para procesos
industriales, se usan
fermentadores de hasta de
400.000 litros de
capacidad
Los fermentadores son
construidos de acero
inoxidable y tienen una
camisa externa la cual
puede ser esterilizada
inicialmente y enfriadada
durante la fermentacin.

Mtodos de medida
Espectrofotometra UV

Mtodo inespecfico basado en la medida de la

absorbancia de una solucin de concentracin
conocida del extracto a una longitud de onda
determinada.
No es un mtodo adecuado cuando la sustancia a
medir no es prcticamente pura. Ejemplo Extracto
de Cacao.
Normalmente usa factores de correccin para el
clculo de la pureza muy afectados por las
condiciones experimentales.

Mtodos de medida
Espectrofotometra UV

Mtodos de medida
Espectrofotometra UV

Mtodo inespecfico basado en la medida de la

absorbancia de una solucin de concentracin
conocida del extracto a una longitud de onda
determinada.
No es un mtodo adecuado cuando la sustancia a
medir no es prcticamente pura. Ejemplo Extracto
de Cacao.
Normalmente usa factores de correccin para el
clculo de la pureza muy afectados por las
condiciones experimentales.

Espectrofotometra UV

Teobromina

Procianidina

Mtodos de medida
Espectrofotometra UV

Mtodo inespecfico basado en la medida de la

absorbancia de una solucin de concentracin
conocida del extracto a una longitud de onda
determinada.
No es un mtodo adecuado cuando la sustancia a
medir no es prcticamente pura. Ejemplo Extracto
de Cacao (incluir espectros).
Normalmente usa factores de correccin para el
clculo de la pureza muy afectados por las
condiciones experimentales.

Espectrofotometra UV

Tcnicas de medicin adecuadas:

cromatografa HPLC y GC (HPLC-MS y GCMS)
Necesitan de:

1
300

Standares adecuados

200

Adecuados mtodos de
preparacin de las
muestras analticas
Buena elucidacin

Absorbance 280 nm

5
100

300

200
6
100

Mtodos Repetitivos

0
0

10

20
T im e (m in )

Mtodos Validables

30

40

Anlisis Cromatogrfico
*La cromatografa, permite no slo separar los componentes
de una muestra, sin tambien su identificacin y cuantificacin.
Anlisis cualitativo
Esta basado en la medida de parmetros cromatogrficos
( tiempos y volmenes de retencin)
Anlisis cuantitativo
Est basado en la medida de alturas u reas de picos
cromatogrficos que se relacionan con la concentracin.

La columna cromatogrfica y la forma con la que

se disea, constituye el corazn de la separacin.
El detector situado al final de la columna es el
que garantiza la respuesta de los componentes
que se separan ( los hay de muy diversos tipos)

Anlisis cualitativo cromatogrfico

Los parmetros cromatogrficos que se utilizan en el anlisis
cualitativo
son dos: tiempo de retencin (tR) y volumen de retencin (vR)
Procedimiento: ambos parmetros han de ser comparados con los de una
sustancia patrn
Inconvenientes: No se tiene siempre certeza de que ambos parmetros
sean reproducibles, ni an manteniendo condiciones de trabajo constantes.
Es preferible utilizar valores relativos, en vez de absolutos.
Bajo condiciones de flujo
de fase mvil Fc constante:

Tiempo de retencin

tiempo de retencin ajustado = tr = tr - tm

retencin relativa = = tr2 / tr1

HPLC

(Detector de ndice de refraccin)

Detectores HPLC

Deteccin: Cuando la sustancia a medir tiene un grupo

cromforo:
Ultravioleta
Array de Diodos (DAD)
Fluorescencia
MS
ELSD

Deteccin: Cuando la sustancia a medir no tiene un grupo

cromforo hay que usar otro tipo de detector como son:
ndice de refraccin
Electroqumico
Fluorescencia
MS
ELSD

Detector Ultravioleta

Celda de flujo:
0.5 cm de camino ptico
y 10 L de capacidad

Detectores HPLC
Detector Ultravioleta
Es el detector ms utilizado, porque muchos solutos absorben
dicha radiacin y es bastante sensible a ella.
El sistema ms simple emplea la emisin a 254 nm de una
lmpara de mercurio y deteccin a una sola longitud de onda.
Tambin se utilizan una lmpara de deuterio y un monocromador
para mediciones a longitud de onda variable.
El intervalo lineal comprende cinco rdenes de magnitud de
concentracin de soluto (ejem 0.001 hasta 10).

Detectores HPLC
Detector Array de Diodos
En el detector de fotodiodos
toda las longitudes de onda de
la luz pasan a travs de la
celda de muestra. A
continuacin cada longitud de
onda particular incide en un
sensor concreto. Sus ventajas
son mltiples: velocidad,
sensibilidad, medicin en
mltiples longitudes de onda a
la vez.
Su desventaja es que la
resolucin es 1 nm, vs 0.1 nm
para el UV normal.

Detectores HPLC

Detectores: ndice de refraccin. Est basado en los cambios de

refraccin que el soluto provoca en la fase mvil. Es casi universal,
responde a cualquier soluto.

La sensibilidad es unas mil veces menor que la de un

detector ultravioleta, y no es til en gradiente.

Detectores HPLC

Detectores: Electroqumico. Est basado en la electrolisis de

los distintos solutos que se eluyen de la columna. El eluido
pasa por un una delgada clula donde hay un electrodo
mantenido a un potencial fijo. Si el potencial es mayor (ms
positivo para oxidacin, ms negativo para reduccin) que el
requerido para la electrolisis de la sustancia, una carga
medidle pasa del electrodo a la sustancia (o viceversa). La
corriente

resultante

es

directamente

proporcional

la

concentracin del soluto que pasa a travs de la ceda.

Es bastante selectivo, porque slo ciertos analitos se oxidan o
se reducen con facilidad.
Pueden detectarse por oxidacin: fenoles, aminas aromticas,
perxidos y mercaptanos. Y por reduccin: cetonas, aldehdos
y nitrilos.

Detectores HPLC
Detector Electroqumico

Detectores HPLC

Detectores: Fluorescencia. Este detector solamente puede

detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o
inducida por derivatizacin. Consiste en un haz de luz de
una determinada longitud de onda que al pasar a travs de
la celda de muestra excita los grupos fluorescentes de la
molcula que a su vez emite luz de una longitud de onda
caracterstica del compuesto. El detector debe estar
colocado perpendicular al haz de excitacin.
Es muy sensible y se usa mucho en anlisis farmacutico,
anlisis clnicos, productos naturales, etc.

Detectores HPLC

Detectores: Masas. El espectrmetro de masas usa la relacin masacarga (m/z) de molculas ionizadas. La fase mvil se introduce en una
cmara de vaco, donde se evapora el solvente y los solutos se ionizan
mediante un termo vaporizador-ionizador.
Es aplicable a compuestos termoestables y no voltiles. Se obtienen
espectros de impacto electrnico. Es una tcnica muy poderosa que
permite cuantificar, identificar y da informacin acerca de la estructura
de compuestos desconocidos.

HPLC-MS Schematic
ABC

Ionization
Source

Liquid
Chromatograph

A+ B + C +

Ion
Accelerating
Region

C+
B+
+
A
Ion

Detector

El detector registra todos los iones segn su relacin

m/z (relacin masa/carga) y los cuantifica segn su
abundancia relativa. (como generalmente se forman
iones con una sola carga m/z se trata simplemente de la
masa del Ion).
El ion molecular M+. generalmente no es el ms abundante
(porque se fragmenta) permite obtener el peso molecular de
la sustancia
Pico base: ion mas abundante del espectro(100 % abundancia relativa)
Los espectros de masa se registran como abundancia relativa vs.
relacin m/z

Espectro de masa del n-dodecano

Las molculas se fragmentan por determinados

lugares los fragmentos permiten obtener
informacin estructural de un compuesto.
Ejemplo:
Espectro de masa interpretado de 4-metil-3-penten-2-ona

Detectores HPLC

Detectores: Detector de Luz dispersa evaporadora (ELSD). Es un

detector universal porque su respuesta no depende de las
caractersticas pticas de a muestra. As, cualquier compuesto no
voltil, cromforo o no cromforo puede ser detectado. A respuesta est
basada en la masa y en la cantidad de luz dispersada, no habiendo
diferencias entre la fase mvil y la muestra. Esto da una ms precisa
medida de la concentracin de la muestra lo que hace que sea ideal
para anlisis de pureza. El detector ELSD da una lnea de base estable
y es compatible con gradientes. Sin embargo posee algunas
limitaciones ya que la fase mvil debe ser voltil puesto que esta es
evaporada. Si no lo es, el excesivo ruido de la lnea de base dificulta la
medida. Esto limita el uso de modificadores no voltiles tales como
tampones fosfato, cido fosfrico y reactivos de par inico.

Otros detectores:

Detector
ultravioleta
ndice de refraccin
electroqumico
fluorescencia
conductividad
espectrofotometra de masa
infrarrojo de trasformada de Fourier

Lmite de
deteccin
0.1 - 1
100 - 1000
0.01 - 1
0.001 - 0.01
0.5 - 1
0.1 - 1
1000

til con
gradiente?
si
no
no
si
no
si
si

Procedimiento para anlisis LC/UV/MS

y LC/NMR

INJECCION
- Extracto
- Fraccin
- Mezcla

Adicin postcolumna
de los
aditivos
LC/MS

Bomba
HPLC

columna HPLC

Computer
control of pump,
UV and NMR for
stop-flow experiments

espectro
MS

desecho

1
Bomba
HPLC

Splitting dependiente
de la interfase LC/MS
usada

MS
LC/MS
INTERFACE

UV

UV

2
NMR
Electrodo
NMR
LC
desecho

Cromatografa con fluidos supercrticos

Descripcin del proceso industrial:

Caractersticas de los cromatogramas

Definicin: Un cromatograma es el grupo de seales
obtenidas por un detector tras la separacin cromatogrfica

Caractersticas de los cromatogramas

Efecto de la composicin del disolvente en la
Resolucin

Caractersticas de los cromatogramas

Posicin del pico Informacin cualitativa
rea del pico Informacin cuantitativa
Forma del pico:
- Interesa alto (> sensibilidad) y estrecho (> selectividad)
- Depende de tres efectos:
a) Mltiples caminos: Diferencia de caminos seguidos por cada
molcula en la f.e.
b) Difusin en ambas fases
c) Transferencia de masa entre fase mvil y fase estacionaria.

Fig 5.4

Caractersticas de los cromatogramas

Efecto de los mltiples caminos

Eficacia de la separacin cromatogrfica

Ecuacin de van Deemter:

B
H A Cu
u
Mltiples
caminos

Transferencia
de masa
Difusin

H Eficacia

H=altura de plato

Resolucin de picos
cromatogrficos

Separacin Separacin buena

ideal

Separacin deficiente