PRACTICA N 03

NUMERACION DE COLIFORMES, DETERMINACION DEL NMERO MS

PROBABLE

I.

INTRODUCCION:
Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el
intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es
decir, homeotermos, pero tambin ampliamente distribuidas en la
naturaleza,

especialmente

en suelos, semillas y vegetales.Loscoliformes se introducen en gran

nmero al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por
tal motivo suele deducirse que la mayora de los coliformes que se
encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen
muchos coliformes de vida libre.

II.

OBJETIVOS:
Encontrar la mayor cantidad de numeracin ms probable de
coliformes.
Determinar la calidad de limpieza de aguas residuales.

III.

FUNDAMENTO TEORICO:

La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del

Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al
incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que
contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase
presuntiva y la fase confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril
sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos
daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de
utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se
emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es
selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces
de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinacin

del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza

a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en
la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas
cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de
24 a 48 h.
La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de
caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y
diferenciales

(Agar

Mac

Conkey,

Agar

eosina

azul

de

metileno)

posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las

colonias tpicas.
El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia
fecal, sin embargo, las caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para
multiplicarse fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por
lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminacin fecal
en agua; conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser
la probabilidad de esta frente a una contaminacin reciente.

COLIFORMES:
No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario
desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como
indicadores de contaminacin. Se distinguen, por lo tanto, los coliformes
totales que comprende la totalidad del grupo y loscoliformes fecales
aquellos de origen intestinal.
Desde el punto de vista de la salud pblica esta diferenciacin es
importante puesto que permite asegurar con alto grado de certeza que la
contaminacin que presenta el agua es de origen fecal.Las bacterias
coliformes fecales forman parte del total del grupo coliforme. Son definidas
como bacilos gram-negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con
produccin de cido y gas a 44.5 C +/- 0.2 C dentro de las 24 +/- 2 horas.
La mayor especie en el grupo de coliforme fecal es el Escherichia coli.
La presencia de coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el
suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo
de desechos en descomposicin. Generalmente, las bacterias coliformes se
encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los
sedimentos del fondo.

La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies

bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e
importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y los
alimentos.

LOS NIVELES RECOMENDADOS DE BACTERIAS COLIFORMES FECALES

SON:

Agua potable: menos de 0 colonias por 100 ml de la muestra de

agua.

Natacin: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua

Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra

de agua.

BACTERIAS COLIFORMESTERMOTOLERANTES:Las bacterias del grupo

de los coliformes totales que son capaces de fermentar lactosa a 44-45 C
se conocen como coliformestermotolerantes. En la mayora de las aguas, el
gnero predominante es Escherichia, pero algunos tipos de bacterias de los
gneros Citrobacter,
Klebsiella y
Enterobacter tambin son
termotolerantes.
Escherichiacoli se puede distinguir de los dems
coliformestermotolerantes por su capacidad para producir indol a partir
de triptfano o por la produccin de la enzima -glucuronidasa. E. coli est
presente en concentraciones muy grandes en las heces humanas y
animales, y raramente se encuentra en ausencia de contaminacin fecal,
aunque hay indicios de que puede crecer en suelos tropicales. Entre las
especies de coliformes termotolerantes, adems de E. coli, puede haber
microorganismos ambientales.

Coliformes e Higiene de alimentos: En la higiene de alimentos los

coliformes no se consideran indicadores de contaminacin fecal sino
solamente indicadores de calidad. Los coliformes totales se usan para
evaluar la calidad de la leche pasteurizada, leche en polvo, helados, pastas
frescas, frmulas para lactantes, fideos y cereales para el desayuno.
Los coliformes fecales se usan para evaluar los mariscos frescos. Por ltimo,
la E. coli se usa como indicador en quesos frescos, quesillos, cereales,
masas con relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas.

COLIFORME Y AGUAS SERVIDAS:

La prueba de coliformes totales y fecales tambin se utiliza para determinar
la calidad bacteriolgica de los efluentes de los sistemas de tratamiento
de aguas servidas.
Coliformes totales y coliformes fecales:No todos los coliformes son de
origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para
diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminacin.
Se distinguen, por lo tanto, los coliformes totales que comprende la
totalidad del grupo y los coliformes fecales aquellos de origen
intestinal.Desde el punto de vista de la salud pblica esta diferenciacin es
importante puesto que permite asegurar con alto grado de certeza que la
contaminacin que presenta el agua es de origen fecal.
Coliformes fecales: Las bacterias coliformes fecales forman parte del total
del grupo coliforme. Son definidas como bacilos gram-negativos, no
esporulados que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a
44.5 C +/- 0.2 C dentro de las 24 +/- 2 horas. La mayor especie en el
grupo de coliforme fecal es el Escherichia coli.
E. coli: El aislamiento de esta bacteria en el agua da alto grado de certeza
de contaminacin de origen fecal, alrededor del 99%. No es absoluta porque
se han aislado cepas de E. coli que no tienen origen fecal, pero es un grado
de certeza ms que razonable para certificar contaminacin con ese origen.
Sin embargo, el aislamiento de este microorganismo no permite distinguir si
la contaminacin proviene de excretas humana o animal, lo cual puede ser
importante, puesto que la contaminacin que se desea habitualmente
controlar es la de origen humano. Esto no significa menospreciar la de
origen animal, especialmente dada la existencia de zoonosis, enfermedades
que son comunes al hombre y animales, que tambin se pueden transmitir
por el agua.

COLIFORMES E HIGIENE DE ALIMENTOS:En la higiene de alimentos los

coliformes no se consideran indicadores de contaminacin fecal sino
solamente indicadores de calidad. Los coliformes totales se usan para
evaluar la calidad de la leche pasteurizada, leche en polvo, helados, pastas
frescas, frmulas para lactantes, fideos y cereales para el desayuno.
Los coliformes fecales se usan para evaluar los mariscos frescos.Por ltimo,

la E. coli se usa como indicador en quesos frescos, quesillos, cereales,

masas con relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas.
1. CALDO BRILA VERDE:

Es de color verde brillante

COMPOSICION:

Peptona.... 10 g.
Lactosa.10 g.
Bilis de buey....20 g.
Verde brillante.....0,0133 g.
Agua destilada.. 1.000 ml.
pH a 7,4

2. AGAR BILIADO-ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA (VIOLET RED

BILE AGAR: VRBA).
Extracto de levadura ..3g.
Peptona.7g.
Cloruro sdico..5g.

IV.

Sales biliares..10g.
Lactosa..5g.
Rojo neutro..0.03g.
Cristal violeta...0.02g.
Agar..15g.
Agua destilada ...1000g.
pH a 7,4

MATERIALES Y EQUIPOS:
Matraz, cocina, tubos de ensayo, pipetas, caldo brila (verde),
incubadora.
Incubadora a 37C, pipetas bactereologicas de 1ml, aguja de
inoculacin con alambre de nicron,

V.

PROCEDIMIENTO:

Se prepara la muestra y se base a los tubos de 10-2 a 108

.luego se baja 1ml por cada tubo para realizar el proceso.

Moler la muestra(carne),+ agua

peptonadabasear en el matraz.

Filtrar trabajar con la

muestra.

NMERO MS PROBABLE (NMP) DE BACTERIAS: TRES TUBOS DE

CADA DILUCIN NMERO DE TUBOS POSITIVOS EN CADA NIVEL
DE DILUCIN LMITE DE CONFIANZA

a) Calculado a partir de los datos de Man (1975)

b) En cada nivel de dilucin, inocular i ml en cada uno de tres tubos de
medio.
Para calcular el NMP de las diluciones mayores que las que sealan,
multiplicar el NMP por el factor de dilucin apropiado de 10, 100,
1000, etc. Por ejemplo, si se han seleccionado tubos provenientes de

las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, multiplicar por 10, si las diluciones 10 -3,
10-4, 10-5 multiplicar por 100.

VI.

RESULTADOS:
NEGATIVO:
Color verde botella , translucido,
no hay gas en la campana

POSITIVO:
Color verde olivo, opaco o
turbio, si hay presencia de gas
en la campana.
Los tres tubos de 10-1 muestran produccin de gas, ningn tubo de
10-2 muestra algn gas y un tubo de la 10-3, donde se observa que
la campana de Durganesta flotando por el gas (CO2).
Segn el nmero ms probable el resultado es: 301 multiplicando por
10 (ya que son de las diluciones 10-1,10-2 y 10-3) lo que significa que
hay ms de 301 de coliformes por gramo de lechuga. El cual nos
indica que hay muy poca contaminacin por microorganismos en el
producto analizado (carne de supermercado).
VII.

RECOMENDACIONES:
Tener buena limpieza en los baos especialmente ya que estos se
dispersen rpidamente, produciendo diarrea, es la bacteria con la que
constantemente estamos tratando en todo sentido.
Esterilizar el ambiente.
Es recomendable trabajar con 3 muestras consecutivas y con esos
valores se encuentra el resultado.
Se necesario trabajar con MERCK es mas HOMOGENEA en caldo
caldobrila.

VIII.

CONCLUCIONES:
Cuando hablamos de coliformes totales nos referimos a casi todas su
familia como lactosa positivo se le denomina con el nombre de
coliforme,
Estas bacterias se elimina con tratamiento trmico a 60 65C
aunque es miy bajo y se puede aumentar la temperatura.

 Cuando hablamos coliformes totales estamos respondiendo si hubo

tratamiento trmico, buena limpieza, si alcanzaron la T adecuada o
esterilizacin del ambiente.
Coliforme lactosa positiva ocurre fermentacin y se obtiene CO 2 es
decir el medio de cultivo esta dentro va a salir en forma de gases
quiere decir que la reaccin es positiva y si no ocurre nada la reaccin
es negativa.
Para trabajar con el echeria coli en un producto terminado o
INDUSTRIAL solo tendramos que trabajar con los positivos y el que
tenga mayor presencia de gas.
IX.

BIBLIOGRAFIA:

P. Anderson / V. Caldern - Microbiologa alimentara - Metodologa

analtica para alimentos y bebidas - Editorial Daz santos S.A.
(Espaa) 1999

Manual de medios de cultivo Merck

http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/GUIA.htm