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ACTIVIDAD ENZIMATICA

I.

INTRODUCCION

Los enzimas son biomolculas especializadas en la catlisis de las reacciones qumicas que tienen lugar en la
clula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones
qumicas mucho ms que cualquier catalizador artificial conocido, y adems son altamente especficos ya que
cada uno de ellos induce la transformacin de un slo tipo de sustancia y no de otras que se puedan
encontrar en el medio de reaccin. (Blanco, 2008)
Las enzimas son los catalizadores de los sistemas biolgicos y se caracterizan por tres importantes
propiedades: incrementan grandemente las velocidades de reaccin, tienen una elevada especificidad y
pueden ser reguladas por diferentes metabolitos, los cuales aumentan o disminuyen su actividad de acuerdo
a las necesidades del proceso (Dugas, 1996; Labdi, 2009).
Para clasificar a las enzimas se emplea el sufijo asa, que identifica a la mayora de las enzimas con
excepcin de algunas, como la tripsina, amilopsina, quimiotripsina, etc.; que por tradicin siguen manteniendo
su nomenclatura. Se han asignado, por la Comisin Internacional de Enzimas, 6 clases:
1. Oxido-reductasas: participan en reacciones de xido-reduccin. En estas reacciones se transfiere un
electrn ( un H+) de un donante a un receptor. Caso del NADH+ que entrega electrones a complejo I en la
membrana interna de la mitocondria.
2. Transferasas: transfieren grupos de un donante a un aceptor. Los grupos transferidos con ms frecuencia
son el metilo, glucosdico y fosfato. Caso de la glucosiltransferasa (transfiere un monosacrido) y protena
quinasa (transfiere un fosfato).
3. Hidrolasas: participan en reacciones de hidrlisis, es decir, rompimiento de enlaces como C-O, C-N y C-C
por adicin de agua. Caso de los enlaces glucosdicos (entre monosacridos) y peptdicos (entre
aminocidos).
4. Liasas: producen dobles enlaces al romper uniones C-O, C-C y C-N.Tambin pueden romper dobles
enlaces agregando grupos. Caso de la piruvato descarboxilasa que elimina un CO2 al piruvato.
5. Isomerasas: catalizan una redistribucin de tomos de los grupos qumicos dentro de la misma molcula.
Caso de la alanina racemasa que convierte L-alanina en D-alanina. Ambos son ismeros.
6. Ligasas: catalizan la unin de 2 molculas por hidrlisis de ATP u otro trifosfato (GTP, por ejemplo).
Por otro lado las enzimas se clasifican de acuerdo a su
complejidad las cuales pueden simples las cuales estn
formadas por una o ms cadenas polipeptdicas o conjugadas
que contiene un grupo no proteico enlazado a la cadena
polipeptdica estando conformada por la apoenzima que es la
parte polipeptdica de la enzima y el cofactor que es la parte no
proteica y la unin de estos dos ltimos forman la holoenzima.
(Kimball, 1986).

(Principios de Bioqumica Lenhinger, 2011)


Algunos enzimas necesitan para llevar a cabo su actividad cataltica de la concurrencia de una o ms
sustancias de naturaleza no proteica que reciben el nombre de cofactores. No debe entenderse que los
cofactores son sustancias que meramente potencian la actividad enzimtica sino que, en determinados
enzimas, son absolutamente imprescindibles para que sta se realice. En ausencia de cofactor el enzima
resulta catalticamente inactivo y recibe el nombre de apoenzima; la combinacin de apoenzima y cofactor da
el holoenzima catalticamente activo. Existen dos tipos de cofactores enzimticos: los iones metlicos y las
coenzimas.
Los iones metlicos que actan como cofactores enzimticos son generalmente cationes mono o divalentes.
Pueden actuar de varias maneras: 1) En algunos enzimas el ion metlico constituye el verdadero centro
cataltico; en estos casos el ion suele presentar por s solo una cierta actividad cataltica, que se ve
incrementada cuando forma parte del enzima. 2) En otros enzimas el ion metlico constituye un grupo puente
para unir el sustrato al centro activo. 3) A veces el ion metlico no forma parte del centro activo sino que se
encuentra en un lugar del enzima muy alejado del mismo, actuando como agente estabilizador de la
conformacin nativa del enzima. (Muoz, 1979)
Cuando el cofactor es una sustancia orgnica de naturaleza no proteica recibe el nombre de coenzima. Las
coenzimas actan generalmente como transportadores intermediarios de grupos funcionales, de
determinados tomos o de electrones, los cuales son transferidos de una sustancia a otra en la reaccin
enzimtica global. A veces las coenzimas se hallan ntimamente unidas a la molcula proteica constituyendo

un verdadero grupo prosttico. En otros casos la unin es dbil y la coenzima acta en realidad como si de un
sustrato ms del enzima se tratase.
Cuando se analiza la estructura qumica de muchos
coenzimas se comprueba que tienen formando parte de ella a
alguna de las sustancias conocidas como vitaminas.
A diferencia de otros catalizadores las enzimas presentan
una regin llamada centro activo en la que se acopla el
sustrato y suele tener forma de hendidura o bolsillo, rodeada
por cadenas laterales de aminocidos que facilitan la unin
del sustrato y por otras cadenas laterales que intervienen en
la catlisis. La compleja estructura terciaria de las enzimas
hace posible que en este bolsillo se ajuste el sustrato de
manera muy estrecha lo que explica la extraordinaria
especificidad de la catlisis enzimtica. . Las enzimas se
mueven ms lentamente que los sustratos y la velocidad de
encuentro va a depender de la concentracin de sustrato
presente. Los aminocidos que constituyen el centro activo
pertenecen a zonas muy distantes de la cadena y representan
una pequea fraccin del nmero total de aminocidos de la
protena. El resto de la molcula es necesaria para mantener
la molcula en posicin correcta y para suministrar lugares de
unin adicionales con funcin reguladora (centros reguladores).
(Nelson, 2000)

La hiptesis del complejo enzima-sustrato explica de modo satisfactorio el efecto de saturacin del enzima por
el sustrato observado en los estudios de cintica enzimtica: cuando la concentracin de sustrato es muy
superior a la concentracin del enzima en el medio de reaccin, todos los centros activos de las molculas de
enzima se hallan ocupados en un momento dado por molculas de sustrato, con lo que aumentos posteriores
de la concentracin de ste no se traducen en aumentos en la velocidad de reaccin. (Stryer, 2003)

Las enzimas poseen varias caractersticas en este aspecto tiene una gran influencia los factores externos que
permiten que se den. Las enzimas se inactivan por el calor esto sucede ya que por ser protenas pueden
desnaturalizarse completamente si se someten a temperaturas altas, otra de las caractersticas es que las
enzimas funcionan ms eficientemente, a ciertas temperaturas optimas, es decir, a ciertas temperaturas las
enzimas realizan una actividad catalizadora, de tal manera que permiten la continuacin de la reaccin
catalizada a la mayor velocidad. A temperaturas por encima o por debajo de la temperatura ptima para la
actividad de la enzima esta disminuye o se detiene. De esta manera la enzima trabaja con mayor eficiencia a
una temperatura de 37C (Baker, 1972).
Cada enzima funciona de una manera ms efectiva a cierta temperatura y pH y, como consecuencia, su
actividad disminuye cuando alcanza valores por encima o por debajo de dichos puntos. Los enlaces de
hidrogeno son fcilmente destruidos por el aumento de la temperatura lo cual, a su vez, puede perjudicar la
estructura terciaria de la enzima que son de gran importancia para la unin con el sustrato. Los cambios de
pH alteran el estado de ionizacin de los aminocidos con carga elctrica. (Tymoczko. 2003)
De esta manera las enzimas adems de que necesitan ciertas condiciones ambientales, como la temperatura
adecuada, el pH, de la concentracin de la enzima que aumenta la velocidad enzimtica hacia cierto lmite, la
concentracin del sustrato se obtiene la velocidad mxima. Tambin necesitan de la presencia de otras
ciertas sustancias antes de poder actuar; un ejemplo claro es la amilasa salivar solo podr actuar
sobre la amilasa si estn presentes iones de cloro (Kimball, 1986).
Sin enzimas, no sera posible la vida que conocemos. Igual que la biocatlisis que regula la velocidad a la
cual tienen lugar los procesos fisiolgicos, las enzimas llevan a cabo funciones definitivas relacionadas con
salud y la enfermedad. En tanto que, en la salud todos los procesos fisiolgicos ocurren de una manera
ordenada y se conserva la homeostasis durante los estados patolgicos, esta ltima puede ser perturbada de
manera profunda.
II

OBJETIVOS

Reconocer la accin de una enzima, en esta ocasin la amilasa y algunos factores que afectan la
actividad enzimtica de esta.
Estudiar algunos factores que afectan la actividad enzimtica: Temperatura, Ph, as como su
especificidad.

III

MATERIALES Y METODOS

Materiales

Mtodos

1) Especificidad Enzimtica
Tubo N/Reactivo
Sol de Almidn
Sol de Sacarosa
Amilasa Salival
Cloruro de Sodio
Lugol
Reactivo de Fehling

1A

3 ml
-------------3ml
2ml
2ml
0,5 ml
0,5 ml
Bao Mara por 20 min a 37C
5 gotas
------2ml

1B
3ml
-----2ml
0,5 ml
2ml

2) Efecto de la T sobre la actividad enzimtica


Tubo N/Reactivo
Buffer pH 6.5
Cloruro de Sodio
Amilasa Salival
Sol de Almidn

1
2ml
0,5 ml
1ml
3ml

2
2ml
0,5 ml
1ml
3ml

3
2ml
0,5 ml
1ml
3ml

3) Efecto del pH sobre la actividad enzimtica


Tubo N/Reactivo
Buffer 3,8
Buffer 6,8
Buffer 8,9
NaCl
Almidn
Amilasa salival
Lugol

1
2
2ml
------2ml
-----0,5 ml
0,5 ml
3ml
3ml
1ml
1ml
Mezclar e incubar por 20 en Bao Mara a 37C
5 gotas
5 gotas

4) Identificacin del cofactor e inhibidor de la amilasa salival

Tubo N/Reactivo
1
2
Cloruro de Sodio
2ml
----Sulfato Cprico
----2ml
Buffer 6,8
0,5ml
0,5ml
Sol de Almidn
3ml
3ml
Amilasa Salival
1ml
1ml
Mezclar e incubar por 20 en Bao Mara a 37C
Lugol
5 gotas
5 gotas

3
-------2ml
0,5 ml
3ml
1ml
5 gotas

IV.

RESULTADOS

1) Especificidad Enzimtica
Despus de someter a los dos tubos en un bao Mara por 20 min a una temperatura de 37C se pudo
apreciar que en el tubo 1, la solucin torna un color amarillento y en el tubo 2 la solucin tiene un color
celeste.

2) Efecto de la T sobre la actividad enzimtica


En el tubo 1 se presenta un color amarillento
En el tubo 2 se presenta un color violeta oscuro
En el tubo 3 se presenta tambin un color violeta oscuro

3)

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica


En el tubo numero 1 se observa un color azul oscuro casi negro
En el tubo numero 2 se observa un color amarillento
En el tubo numero 3 tambin se observa un color azul oscuro casi negro

4) Identificacin del cofactor e inhibidor de la amilasa salival


En el tubo 1 se observa un color amarillento
En el tubo 2 un color violeta oscuro

V. Discusin

Las enzimas presentan propiedades y caractersticas que ningn otro catalizador las tiene, y una de ellas es
la especificidad. La especificidad est determinada por el sitio activo de la enzima, es decir, un sector de la
molcula que contiene los grupos funcionales particulares que le permiten unirse especficamente con el
sustrato. Por ejemplo, la quimiotripsina posee una cadena polipeptdica conformada por 245 aminocidos de
los cuales los nmeros 57 (histidina), 102 (cido asprtico) y 195 (serina) constituyen el sitio activo. El
plegamiento (estructura terciaria) de la cadena provoca el acercamiento de estos 3 aminocidos en una
estrecha regin: este es el sitio activo de la enzima. (Whistler, 1999)

Las enzimas aceleran las reacciones alterando la conformacin de sus sustratos para que logren llegar al
estado de transicin. El modelo ms simple para entender esta interaccin enzimasustrato es el modelo de
la llave y la cerradura, en el cual el sustrato encaja perfectamente en el sitio activo de la enzima.
En muchos casos, las conformaciones tanto de la enzima como del sustrato son modificadas cuando logran
unirse: es el llamado modelo de encaje inducido. Esta alteracin de las conformaciones hace que logren llegar
ms rpido al estado de transicin. (Becker, 2007)

Modelo de llave-cerradura

Modelo de encaje inducido

Cuando la enzima solo puede actuar sobre un tipo de substrato, se dice que la enzima muestra especificidad
absoluta para el substrato. Ese es el caso de la deshidrogenasa succinica, que es especifica para el
succinato, o la L-glutamico deshidrogenasa, especifica para el glutamato.

Si la enzima puede actuar sobre substratos con estructuras muy similares, se dice que la enzima muestra
especificidad relativa para el substrato. La L-aminocido oxidasa, por ejemplo, puede catalizar la oxidacin
de diferentes aminocidos de la serie L.
La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del
almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn esta formado por dos tipos de molculas: la
amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de
glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces,
uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa
como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacaridos) como productos, as como
maltosas. (Koolman, 2004)
Entonces, en los experimentos anteriores el tubo 1 se torna amarillento ya que la amilasa ha
hidrolizado al almidn hasta convertirlo en maltosa y dextrina. Esto demuestra que la amilasa posee
una especificidad absoluta para el substrato que en este caso es el almidn.
En el tubo 2 la solucin es de color celeste debido al reactivo de Fehling, que est comprobando la
presencia de un azcar no reductor, en este caso la sacarosa. Se puede observar que la amilasa no ha
actuado sobre el almidn debido a su especificidad.
Efecto de la temperatura
Al igual que ocurre con la mayora de las reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas se incrementa con la temperatura. La variacin de la actividad enzimtica con la temperatura es
diferente de unos enzimas a otros en funcin de la barrera de energa de activacin de la reaccin catalizada.
Considerando que las enzimas son protenas, estn expuestas a una desnaturalizacin (cambio en la
estructura terciaria) por accin de altas temperaturas. As, puede producirse una inactivacin a causa del
rompimiento de varios enlaces dbiles. Muchas enzimas se inactivan a 45 C y la mayora se desnaturalizan
rpidamente desde los 55 C. Dado que no todas las enzimas son iguales, habr algunas que trabajen a
temperaturas elevadas y otras a temperaturas ms fras. Por ejemplo, hay bacterias termfilas que viven en
aguas termales calientes, alrededor de los 80 C. Sus sistemas enzimticos resisten la desnaturalizacin a
altas temperaturas. (McKee, 2003)

En los experimentos anteriores del efecto de la temperatura, en el tubo 1, se torna de color amarillo
debido a que la amilasa no ha actuado sobre el almidn, por el ende la reaccin del Lugol es negativa.
Esto se debe a que se trabajo a una temperatura baja, y la amilasa trabaja a temperatura ambiente
(37C)
En los tubos 2 y 3 el color es violeta debido a que la amilasa si ha actuado sobre el almidn, por eso la
reaccin con el Lugol es positiva, en este caso si se trabajo a una temperatura adecuada
Efecto del Ph
La mayor parte de las enzimas opera dentro de un margen estrecho de pH: es el pH ptimo. La gran mayora
de las enzimas tiene su pH ptimo dentro del rango fisiolgico de la clula (pH 6.5 a 7.2). Algunas enzimas,
como la pepsina del estmago, poseen un pH ptimo en el rango cido (pH 1.0 a 2.0). Enzimas intestinales
como la tripsina y lipasas, poseen un pH ptimo en rangos alcalinos, cercano a 10. Al ser los enzimas de
naturaleza proteica, al igual que otras protenas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH vara ms
all de unos lmites estrechos. (Mathews, 2002)

Entonces, en los experimentos del efecto de Ph, en el tubo 1 se torna de color violeta debido a que la
amilasa no hidroliza al almidn debido a que se reacciono a un pH de 3,8 (acido), entonces la amilasa
se desnaturalizo y por eso la prueba de Lugol da positivo debido a que no se ha hidrolizado el
almidn.
En el tubo numero 2, se torna de color amarillo debido a que la amilasa en este caso si hidroliza al
almidn debido a que se trabajo con un pH de 6,8 (pH ptimo de la amilasa), hidrolizndola en
maltosa, dando como resultado negativo en la prueba de Lugol.
En el tubo numero 3, el color de la solucin es violeta debido a que no se hidrolizo el almidn, debido
a que se trabajo en un pH alcalino (impidiendo el correcto funcionamiento de la enzima), dando como
resultado positivo a la prueba de Lugol

Inhibidor y cofactor
La inhibicin de la actividad enzimtica es el medio importante en el control de los sistemas biolgicos. La
inhibicin puede ser reversible o irreversible. En el primer caso, el inhibidor no modifica las regiones
funcionales de la enzima; en el segundo caso, el inhibidor modifica la molcula de enzima y se une tan
fuertemente a ella que la disociacin de ambas es muy lenta o nula. Varios venenos que actan sobre el
sistema nervioso, incluyendo insecticidas, lo hacen como inhibidores irreversibles de la actividad enzimtica.
Un inhibidor no-competitivo es el que puede unirse a la enzima en un sitio diferente al sitio activo. As, tanto el
sustrato como el inhibidor pueden unirse simultneamente a la molcula de enzima. La accin del inhibidor
no-competitivo es disminuir el nmero de recambio de una enzima. La inhibicin reversible puede lograrse
mediante 2 mecanismos: competitivo y no-competitivo. Un inhibidor competitivo es el que compite con el
sustrato por el mismo sitio activo de la enzima, ya que el inhibidor y el sustrato poseen una estructura qumica
similar. La velocidad de catlisis del sustrato se reduce dado que la cantidad de sustrato que se une a la
enzima es menor. (Smith, 2005)

Cofactor
Algunos enzimas necesitan para llevar a cabo su actividad cataltica de la concurrencia de una o ms
sustancias de naturaleza no proteica que reciben el nombre de cofactores. No debe entenderse que los
cofactores son sustancias que meramente potencian la actividad enzimtica sino que, en determinados
enzimas, son absolutamente imprescindibles para que sta se realice.
Cuando el cofactor es una sustancia orgnica de naturaleza no proteica recibe el nombre de coenzima. Las
coenzimas actan generalmente como transportadores intermediarios de grupos funcionales, de
determinados tomos o de electrones, los cuales son transferidos de una sustancia a otra en la reaccin
enzimtica global. (Devlin, 2004)
En los experimentos anteriores de identificacin de cofactor e inhibidor, el primer tubo tiene una coloracin
amarilla por que la amilasa ha actuado correctamente sobre el almidn gracias a la ayuda de un cofactor (en
este caso el cloruro de sodio) que activa la enzima y permite realizar la actividad enzimtica, dando negativo a
la reaccin de Lugol.
En el tubo numero 2, la solucin es de color azul oscuro debido a que la amilasa no ha actuado sobre el
almidn debido a la presencia de un metal fuerte que actu como inhibidor e impidi la actividad enzimtica
(sulfato de cobre), dando positivo a la reaccin de Lugol.

VI CONCLUSIONES

Las enzimas necesitan una temperatura, un pH y un cofactor adecuado para que puedan realizar
actividades enzimticas.

VII BIBLIOGRAFIA

Kimball, John. (1986). Biologa. Editorial: Addison - Wesley Iberoamericana, S. A. Cuarta Edicin.
Blanco, Antonio. (2008) Qumica Biolgica 5ta edicin Ed. Mdica Panamericana
Baker, J. y Allen, G. (1972) Materia, Energa y Vida. Editorial: Fondo Educativo Interamericano S.A.
Muos, E. (1979) Biologa Celular y Molecular. Editorial: H. Blume Ediciones- Rosario, 17.
Nelson, L. D. y M. M. Cox. 2000. Lenhinger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega, S. A.,
Barcelona, Esp.
Stryer, L., J. M. Berg y J. L. Tymoczko. 2003. Bioqumica, 5a edicin. Editorial Reverte, S. A.
Barcelona, Esp.
Whistler, R. L. y J. N. BeMiller. 1999. Chemistry for Food Scientists. Eagan Press, St. Paul,
Minnesota, USA.
Becker, Wayne M. El mundo de la clula, Madrid Pearson Educacin 2007.
Mathews, C.K., Van Holde, K.E. y Ahern KG (2002). Bioqumica. 3 edicin. Ed. Addison
Wesley/Pearson Education. Madrid.
McKee, T. y McKee J. R. (2003). Bioqumica. La base molecular de la vida. 3 edicin. Ed. McGrawHill

Koolman, J. y Rohn, KH (2004). Bioqumica. Texto y atlas. 3 edicin. Ed. Mdica Panamericana

Smith, C., Marks, A.D., Lieberman, M. (2005). Bioqumica bsica de Marks. Un enfoque clnico. 2
edicin. Ed. McGraw-Hill

Devlin, T. M. (2004). Bioqumica. Un texto con aplicaciones clnicas. 4 edicin. Ed. Reverte.