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es alterada en linfocitos B y NK en
humanos obesos y diabticos tipo
2
Objetivo. La obesidad est asociada con inflamacin de bajo grado y la filtracin de
dculas inmunes en tejidos insulino-sensitivos, llevando a una discapacidad
metablica. Los mecanismos epigenticos controlan la determinacin del linaje de
clulas inmunes, su funcin y migracin, y estn implicados en la obesidad y
diabetes tipo 2 (T2D). El enfoque de este estudio fue determinar el perfil de
metilacin global de ADN de clulas inmunes en individuos obesos y T2D de manera
especfica para clulas.
Materiales y mtodos. Fueron reclutados 14 sujetos obesos y 11 sujetos delgados de
misma edad, as como 12 obesos T2D y 7 sujetos delgados de la misma edad. Los
niveles globales de metilacin de ADN fueron medidos de manera especfica para
clulas por citometra de flujo. Validamos el ensayo contra medidas de
espectrometra de masa del contenido total de 5-metilcitosina (5meC) en clulas
cultivadas tratadas con el agente de hipometilacin decitabina (r = 0.97, p <
0.001).
Resultados. La metilacin global de ADN en clulas mono-nucleares de sangre
perifrica (PBMC), monocitos, linfocitos o clulas T no estuvo alterada en obesos o
sujetos T2D. Sin embargo, los anlisis de fracciones de la sangre de sujetos
delgados, obesos y T2D mostraron altos niveles de metilacin en clulas B
provenientes de sujetos obesos y T2D; y en clulas asesinas naturales (NK) de
pacientes T2D. En estos tipos de clulas, los niveles de metilacin de ADN fueron
correlacionados positivamente con resistencia a la insulina, sugiriendo una
asociacin entre cambios de metilacin de ADN, funcin inmune y disfuncin
metablica.
Conclusiones. Tanto obesidad como T2D fueron asociados con alteradas firmas
epigenticas del sistema inmune de manera especfica para clulas. Estos cambios
podran contribuir a las funciones inmunes alteradas asociadas con obesidad e
insulino-resistencia.
Introduccin
El sistema inmune est compuesto por una amplia variedad de clulas, cada una
con una firma especfica de expresin de genes determinada por procesos
epigenticos como la metilacin de ADN y modificacin de histonas. A lo largo del
control de la estructura de cromatina, los procesos epigenticos modulan el acceso
a los factores de transcripcin de unin al ADN, de este modo seleccionando para
activacin o represin transcripcional, por ejemplo, genes especficos del linaje. Los
estudios que investigaron la metiloma de ADN de PBMCs han mostrado patrones de
metilacin especficos a genes importantes para la funcin inmune y adems han
sugerido que la alteracin en la metilacin de ADN probablemente sea un
importante mecanismo que contribuye a la variacin inter-individual en la funcin
de clulas inmunes.
La obesidad, caracterizada por una elevada adiposidad sobre masa magra, est
asociada con variabilidad epigentica en la sangre. Hoy est claro de que las clulas
inmunes participan en la inflamacin sistmica de bajo grado crnica que se
observa en la obesidad, con filtracin de macrfagos en el tejido adiposo
promoviendo la inflamacin. Los macrfagos del tejido adiposo contribuyen a la
etiologa de la resistencia a la insulina a travs de la secrecin de citocinas proinflamatorias como el factor- de necrosis tumoral o la interleucina-6, conocidos
reguladores hacia abajo de sealizacin de insulina. El rol de las clulas inmunes en
el desarrollo de la insulino-resistencia no se limita a los macrfagos. Tanto linfocitos
B como T han mostrado ser importantes contribuidores del proceso inflamatorio y la
resultante insulino-resistencia en tejidos metablicamente activos, y en particular
en el tejido adiposo.
En estudios investigando la metilacin de ADN en la sangre de sujetos con
disfuncin metablica, la metilacin de ADN fue exclusivamente analizada en
fracciones enteras de PBMC, las cuales se componen de numerosos tipos de clulas.
Sin embargo, las medidas globales de metilacin de ADN hechas de fracciones
enteras de PBMC pueden ser oscurecidas por potenciales cambios en los recuentos
de tipos de clulas en la sangre. Dado que la obesidad y la diabetes tipo 2 fueron
asociadas con una remodelacin de los recuentos de las clulas en la sangre y que
las sub-poblaciones de leucocitos exhiben una especfica firma de metilacin global
de ADN, la alterada metilacin de ADN en las fracciones enteras de PBMC podran
simplemente reflejar un cambio en la frecuencia de determinadas sub-poblaciones
de leucocitos.
En este estudio, apuntamos a usar un ensayo especfico de clulas para
determinar el perfil de metilacin global de ADN de los diferentes sub-tipos de
PBMC en individuos obesos y T2D. Usando un anticuerpo monoclonal a 5meC y
citometra de flujo, proporcionamos la primera medida de niveles relativos de
metilacin global de ADN en tipos de clulas individuales dentro de las PBMC de
sujetos delgados, obesos y T2D.
Materiales y mtodos
Estudio de la poblacin
Este proyecto fue aprobado por el Comit de ticas de la Regin Capital de
Dinamarca. 44 sujetos hombres de 18 a 60 aos fueron reclutados por anuncios
locales en campus de universidades u hospitales locales y se obtuvo el
consentimiento informado de los participantes. Los participantes estaban libres de
enfermedades recientes o males infecciosos o inflamatorios, fuera de desrdenes
Recoleccin de muestra
Las muestras de sangre se obtuvieron por venopuncin de una vena antecubital y
recolectados en tubos tratados con cido etilendiamina tetracetico o tratados con
cido citrato dextrosa, seguido por aislamiento de PBMCs por gradiente de
centrifugacin Ficoll como previamente dicho.
Recuento completo de clulas de sangre e ndice de insulino-resistencia
En pequeos subgrupos, el recuento diferencial de clulas fue realizado usando un
analizador de hematologa automatizado Sysmex XE-2100 para la determinacin de
la frecuencia de neutrfilos, monocitos, linfocitos y T cooperadores (CD3/CD4 doble
positivo), clulas citotxicas T (CD3/CD8 doble positivo), clulas B
(CD45/CD19/CD20 triple positivo) y clulas NK (CD3 negativo, CD45/16/56 triple
positivo). Los niveles de glucosa e insulina en ayuno fueron medidos usando
analizadores automatizados y el nivel de insulino-resistencia fue calculado usando
el Modelo de Evaluacin de la Homeostasis (HOMA-IR).
Cultivo de clulas
La lnea celular de cncer colorrectal RKO fue mantenido en el medio Eagle
modificado de Dulbecco, complementado con 25 mM de glucosa, 10% de suero
bovino fetal (FBS), 100 U/ml penicilina, 100 ug/mL estreptomicina y 2 mM de
glutamato y se dej crecer a 37C en 5% CO 2. Las clulas fueron tratadas cada 24h
por un perodo de 72h reemplazando el medio complementado con 2.5 uM de
decitabina fresca preparada en un filtro de 50% de cido actico esterilizado. Las
clulas fueron cosechadas en puntos diarios antes y durante el tratamiento, y a los
3 das tras la retirada de las drogas.
La lnea celular del linfocito T Jurkat en humanos fue mantenida en RPMI 1640
complementada con 100 U/mL de penicilina, 100 ug/mL estreptomicina , 100 U/mL
L-glutamina y 10% FBS. El medio de cultivo fue refrescado cada tercer da y la
densidad celular fue mantenida 1 milln de clulas/mL. 24h despus del ltimo
pasaje, las clulas fueron tratadas con 2.5 uM de decitabina como se dijo antes y
cosechadas a diferentes puntos temporales hasta 52h.
Anlisis estadstico
Resultados
Para determinar el perfil de metilacin global de ADN de tipos de clulas
individuales dentro de las PBMCs, usamos un mtodo previamente desarrollado en
lneas celulares. Probamos este mtodo, que se basa en la evaluacin de metilacin
de ADN usando un anticuerpo monoclonal para la 5-meC detectada por citometra
de flujo, contra un espectrmetro de masa de alta definicin, el cual representa
para nuestro conocimiento el ensayo teniendo la sensibilidad y precisin ms altas
para la cuantificacin de 5-meC. El anlisis de metilacin de ADN fue realizado en
clulas RKO no tratadas, as como clulas expuestas al agente decitabina de
hipometilacin del ADN por 24, 48, 72h y 3 das despus de la retirada de las
drogas. El anlisis de correlacin de Pearson del total de los niveles de metilacin
de citosina medidos usando ambas tcnicas revelaron una estrecha asociacin (r =
0.97, p = 0.001, Fig. 1 A y B). Esto fue confirmado en clulas Jurkat donde el efecto
de la decitabina fue exitosamente detectado por citometra de flujo (Fig. 1 C),
adems validando el uso de citoetra de flujo para monitorear la metilacin global
de ADN.
Despus usamos este ensayo para determinar los niveles de metilacin global
de ADN en las PBMCs de obesos e individuos T2D. Importante, ya que la metilacin
global sangunea de ADN ha mostrado variar con la edad, hemos emparejado por
edad a los participantes obesos y T2D a 2 cohortes de control separados de sujetos
delgados y tolerantes normales a la glucosa. En adicin, se ha planteado la
hiptesis de que una variacin en el recuento de clulas sanguneas podra
potencialmente enmascarar una alteracin en la metilacin global de manera
especfica para tipos de clulas. As hemos investigado frecuentemente los subtipos
de leucocitos. Sin embargo, en nuestra poblacin, los recuentos de clulas
sanguneas mostraron un perfil similar a travs de los grupos (Tabla 1, p > 0.05).
Obeso
(n = 12)
52.7 8.2
T2D
(n = 12)
58.7 10.6
Neutrfilos
(% total de leucocitos)
Monocitos
8.9 2.1
7.7 1.7
6.6 1.3
(% total de leucocitos)
Linfocitos
35.5 4.7
35.6 6.5
31.2 10.5
(% total de leucocitos)
Clulas cooperadoras T 16.6 3.6
16.2 3.8
15.8 8.4
(% total de leucocitos)
Clulas citotxicas T
6.4 1.8
10.1 4.1
8.1 3.0
(% total de leucocitos)
Clulas B
4.6 1.4
5.4 2.1
4.0 2.9
(% total de leucocitos)
Clulas NK
5.9 2.5
4.7 2.8
3.8 1.7
(% total de leucocitos)
T2D: grupo de diabetes tipo 2, NK: asesina natural. Ninguna
diferencia significativa se observ entre los diferentes grupos para
alguna de las sub-poblaciones mostradas aqu.
Luego comparamos a los sujetos obesos y T2D con sus respectivos grupos de
control y no encontramos diferencia en los niveles de metilacin global de ADN en
la fraccin de PBMCs (que comprenden tanto linfocitos como monocitos) o en las
poblaciones de linfocitos o monocitos evaluadas separadamente (Fig.2 A y B para
delgado vs obeso, n = 11 y n = 14 respectivamente, Fig.2 C y D para delgado vs
T2D, n = 7 y n = 12 respectivamente, p > 0.05).
Discusin
Numerosos estudios han reportado que los perfiles de metilacin global y
especfica de genes del ADN son alterados en la sangre de individuos obesos,
sin enfocarse en sub-poblaciones de clulas sanguneas especficas. Aqu,
hemos usado un ensayo basado en citometra de flujo para determinar ms, de
manera especfica para tipos de clulas, el perfil de metilacin global de ADN de
la sangre obtenida de sujetos obesos y T2D. Proveemos evidencia de que la
aunque slo en la diabetes tipo 2, mostraron una elevada metilacin global. Las
funciones de las clulas NK tambin pueden ser reguladas epigenticamente y
estas clulas se han asociado con la obesidad e inflamacin inducidas por dieta,
llevando adems a la insulino-resistencia. Nuestros resultados que muestran
que la metilacin global de ADN es elevada en clulas B y NK sufiere que los
cambios epigenticos estn involucrados en la alterada funcin inmune descrita
en la obesidad y T2D. Esto es adems apoyado por la correlacin positiva que
observamos entre el nivel de insulino-resistencia y la metilacin global de ADN
en clulas B y en cierta medida en clulas NK.
Colectivamente, nuestros resultados muestran que la insulino-resistencia
est asociada con dramticos cambios epigenticos en especficas subpoblaciones de linfocitos, contribuyendo potencialmente a la alterada funcin
inmune reportada en desrdenes metablicos. Interesantemente, diferencias en
la metilacin global de ADN no fueron encontradas en todo el nivel de PBMCs
salvo en tipos especficos de clulas. Esto estresa la relevancia de usar ensayos
de tipos especficos de clulas al investigar firmas epigenticas en muestras
clnicas de tejidos caracterizadas por una alta heterogeneidad en la frecuencia
de los tipos de clulas y el fenotipo, como la sangre.
Referencias
[1] Thiele M Bass y cols. Odio crnico a metodologas de estudios. Iquique, Chile
2011.
[2] Thiele M Bass, Thiele M Tebi. Traduccin de juegos de N64 con diccionario.
Iquique, Chile
1999.
[3] Thiele M Bass. Manual para matar el tiempo que no tienes. Colegio Corona
School. Iquique, Chile 2001.
[4] Thiele M Bass et al. Aprendiendo ingls con burlas paternales: un estudio
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[5] Thiele M Bass, Risso P Valentina. Lo que hacemos por amor. Iquique, Chile
2012.
[6] Thiele M Bass. Cmo quedarse en Iquique, Chile. Iquique, Chile 2012.