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Pruebas bioqumicas.

VP-RM.
FUNDAMENTO:
El cido pirvico es un compuesto formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, se
metaboliza an ms a travs de cierto nmero de vas metablicas. Una de esas vas da como
resultado la produccin de acetoina (acetil metil carbinol) a travs de la accin de KOH y
oxgeno atmosfrico. El diaceril es convertido en un complejo rojo bajo la accin cataltica de alfa
naftol y creatina.
GENERALIDADES:
Esta prueba es usada con el propsito de distinguir entre Escherichia coli y Entorobacter de
Klebsiella, aun cuando otros miembros de los Entorobacteriacecae son capaces de producir una
reaccin de Voges Proskauer positiva. El medio comercial RM VP utiliza una concentracin de
peptona y glucosa al 1% aunque resulta satisfactoria una concentracin inferior con un mnimo de
no menos del 0.5% de glucosa. La menor concentracin reduce la concentracin del in hidrgeno
que requieren los organismos VP positivos. Adems una concentracin del 0.5% de peptona da
menos color al medio, haciendo ms fcil interpretar la reaccin de color.
INTERPRETACIN:
Reaccin VP positiva: color rojo o Rosado en la superficie del medio.
Reaccin de VP negativa: color amarillo en la superficie del medio (el mismo color del reactivo)
puede formarse un color cobrizo, pero aun as la reaccin es negativa.
REDUCCION DE NITRATOS.
FUNDAMENTO:
Los microorganismos que reducen nitratos tienen la capacidad de extraer oxgeno de nitratos para
formar nitritos y otros productos de reduccin.
NO3

+ 2e

+ 2H NO2

Nitrato

H2O

Nitrito

La presencia de nitritos en el medio se detecta mediante el agregado de alfa naftilamina y cido


sulfanilico con la formacin de un colorante de diazonio rojo p-sulfobenceno-azo-alfa-naftilamina.
GENERALIDADES:
La capacidad de un microorganismo para reducir nitratos a nitritos es una caracterstica importante
en la identificacin y diferenciacin de microorganismos esto es debido a que estas bacterias
poseen una enzima llamada nitrato reductasa o nitrito reductasa.
La secuencia de produccin de nitrito o de nitrgeno a partir del nitrato permite a ciertas bacterias
oxidar la glucosa sin necesidad del oxgeno atmosfrico. Esta propiedad permite a algunas
bacterias aerobias de forma obligada desarrollarse minimamente en condiciones anaerobias

estrictas, ya que la energa que se libera de la reduccin es casi similar al ATP producida por la
respiracin del oxgeno.
Todas las enterobacterias, excepto ciertos tipos de Enterobacter agglomerans y algunas especies
de Erwinia reducen los nitratos. Es til para la identificacin de miembros de los gneros
Haemophilus, Neisseria y Branhamella.
INTERPRETACIN
El desarrollo de un color rojo que puede tornarse caf rpidamente dentro de los 30 segundos
indica la presencia de nitritos dando una reaccin positiva. Si no se produce color la reaccin se
considera negativa.
Es necesario a las pruebas negativas de adicionarle una pequea cantidad de zinc reducen los
nitratos a nitritos y si se forma el color rojo despus de la adicin del zinc ello indica la presencia de
nitratos residuales con los que se confirma la reaccin negativa.
FUNDAMENTO:
Se identificar a las bacterias mediante la deteccin de los productos resultantes de la
fermentacin o utilizacin de los hidratos de carbono, polihidroxialcoholes, glucsidos o sales de
cidos carbnicos, denominados carbohidratos.
GENERALIDADES:
Todos los microorganismos de importancia clnica, aunque no todas las bacterias necesitan una
fuente de carbono de cuyo metabolismo la bacteria obtiene la mayor parte de toda la energa que
necesita para sintetizar sus elementos y regular los procesos metablicos.
Las bacterias patgenas normalmente se limitan a metabolizar azcares simples o aminocidos. La
demanda energtica microbiana se clasifica en tres categoras principales: quimiotrofia, fototrofias y
paratrofias.
La quimiotrofia es aquella donde la energa biolgica se obtiene a partir de reacciones que se
llevan a cabo fuera de la luz; se conocen dos tipos fundamentales de quimiotrofia en las bacterias:
La quimioorganotrofia y quimiolitotrofia. La primera de ellas es la que comparten todos los
animales, significa que la energa es obtenida por la oxidacin o fermentacin de compuestos
orgnicos exgenos. La quimiolitotrofia es un proceso mediante el cual las bacterias producen
todos sus componentes reduciendo el anhdrido carbnico en la energa liberada durante la
oxidacin inorgnica.
La fototrofia es aquella donde la energa proviene de las reacciones fotoqumicas. Por ltimo la
paratrofia es aquella donde la energa se obtiene a partir de la clula del husped ya sea animal,
planta o microorganismos (los virus se encuentran dentro de esta clasificacin).

La fermentacin es un proceso metablico de oxidacin anaerobia por accin enzimtica de


microorganismos en donde el oxgeno gaseoso no participa y en su lugar se encuentra un sustrato
orgnico.

En los sistemas de prueba bacteriolgica, este proceso se detecta al observar cambios de color en
indicadores de pH contenidos en los medio cuando la formacin de productos cidos aumenta.
La acidificacin de un medio ocurre generalmente por la degradacin de los hidratos de carbono,
sin embargo tambin pueden ocurrir por vas no fermentativas como es el caso de algunos medio
que no contienen hidratos de carbono en su composicin y que tambin dan como resultado final
compuestos cidos. Generalmente el proceso que utilizan las bacterias para metabolizar es la va
de Embden Meyer Hof, donde la glucosa es dividida en una serie de compuestos de tres
carbonos del cual el ms importante es el cido pirvico. Tambin utilizan la fermentacin mixta en
la cual el cido pirvico deriva finalmente en una variedad de cidos orgnicos.
Las diferencias bioqumicas entre bacterias originan patrones especficos que se utilizan en la
identificacin de ellas, ayudando como complemento de otros estudios bacteriolgicos.
MEDIOS DE CULTIVO COMUNMENTE USADOS EN LAS PRUEBAS BIOQUMICAS

AGAR HIERRO TRIPLE AZCAR (TSI)


AGAR HIERRO DE KLIGER (KIA)
TSI y KIA son los medios ms utilizados para observar la fermentacin de carbohidratos en la
familia Enterobacteriaceae. Para su utilizacin el medio debe estar en forma de pico de flauta.
Se han incorporado a estos medios cuatro derivados proteicos: extracto de carne, extracto de
levadura, peptona y proteosa, que hacen que los medios sean muy ricos nutricionalmente. La
ausencia de inhibidores en el medio permite el crecimiento de todas las especies bacterianas
excepto anaerobios obligados y otras bacterias exigentes. Por su contenido de sulfato ferroso se
puede detectar cido sulfihdrico.
De acuerdo a la actividad metablica del microorganismo se pueden obtener diferentes
posibilidades de fermentacin. Como un mtodo para simplificar la interpretacin de las reacciones,
se recomienda el uso de las siguientes siglas:
K.- Designa una reaccin alcalina. (color rojo).
A.- Designa una reaccin cido. (color amarillo).
G.- Indica formacin de gas (burbujas en el medio).
H2S.- Indica produccin de Sulfuro de hierro. (color negro).
INTERPRETACIN DE LAS REACCIONES:
Pico de flauta alcalino / profundidad alcalina (K / K).- No hay fermentacin de hidratos de carbono.
Bacteria no fermentadora.

Pico de flauta alcalino / profundidad cida (K / A).- Glucosa fermenta; sacarosa (lactosa en KIA) no
fermentada.

Pico de flauta alcalino / profundidad cida (negro) (K / A H2S).- Glucosa fermentada, sacarosa
(lactosa en KIA) no fermentada con produccin de H2S.
Pico de flauta cido / profundidad cida (A / A).- Glucosa y sacarosa (lactosa en KIA) fermentadas.
MEDIO DE AGAR HIERRO LISINA.
Muchas especies de bacterias poseen enzimas capaces de descarboxilar aminocidos especficos
en el medio, con lo cual liberan aminas de reaccin alcalina y dixido de carbono. En este caso la
enzima lisina descarboxilasa al actuar sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina.
En este medio se puede detectar la produccin de la lisina descarboxilasa, ya que se produce una
reaccin coloreada por un cambio en el pH del medio que contiene como indicador prpura de
bromocresol. Un cambio del color original del medio (prpura) hacia amarillo en el fondo indica una
reaccin cida por la fermentacin de una pequea cantidad de glucosa en el medio, si el
microorganismo produce lisina descarboxilasa la accin de esta sobre la lisina dar lugar a la
cadaverina la cual producir un cambio en el pH que sobrepasa la acidez debida a la glucosa
dando un color prpura, as pues un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa
y un color prpura que si es producida.
Indicador de pH:
pH cido:

Prpura de Bromocresol
Vire del indicador a amarillo

pH alcalino:

Vire del indicador a prpura

Descarboxilacin positiva:

Fondo del tubo prpura

Descarboxilacin negativa:

Fondo del tubo amarillo sin


cambio

Desaminacin positiva:

Superficie del tubo rojo vino

Desaminacin negativa:

Superficie
del
tubo
prpura o sin cambio

LIA al igual que en TSI o KIA se puede detectar la produccin de sulfuro de hierro. El medio se
utilizar en forma de pico de flauta.
INTERPRETACIN:
Positiva: color violeta en la superficie
Negativa: sin cambio de color
MEDIO DE CITRATO DE SIMMONS.

Esta prueba se basa en la capacidad de un microorganismo de utilizar citrato de sodio como nica
fuente de carbono para metabolismo y crecimiento.

Una prueba positiva est representada por la aparicin de un color azul oscuro en 24 o 48 horas,
en el medio originalmente de color verde, que indica que el microorganismo ha sido capaz de
utilizar el citrato contenido en el medio, con la produccin de productos alcalinos. La prueba
tambin es considerada positiva si hay crecimiento en la lnea de inoculacin, si se incube 24
horas ms aparecer el color azul.
Al inocular el medio se debe tener cuidado de no arrastrar con el inculo residuos del medio
anterior o que el inculo sea demasiado grande, ya que se pueden arrastrar compuestos orgnicos
del medio anterior o compuestos orgnicos preformados dentro de la pared celular de las bacterias
ya que se puede liberar suficiente carbono y nitrgeno como para dar un resultado falso positivo.
El medio se utiliza en forma de pico de flauta.
REACCIN:
Citrato - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - >

Oxalacetato +

Acetato

Oxalacetato - - - - - - - - - - - - - - - - ->

Piruvato +

CO2

2 Piruvato - - - - - - - - - - - - - - - - - - >

Acetato + CO2 + Lactato.

Los cidos orgnicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos y
bicarbonatos alcalinos.
INTERPRETACIN:
Positiva: color azul
Negativa: verde.
MEDIO SIM (SULFURO, INDOL, MOVILIDAD)
Este medio sirve para observar la produccin de sulfuro, indol y la movilidad del microorganismo. El
color original del medio es blanco y de consistencia semislida.
PRODUCCIN DE INDOL
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y deaminar triptfano
con la produccin de indol, cido pirvico y amonaco en un medio enriquecido con triptfano.
La prueba para la identificacin de indol se basa en la formacin de un complejo rojo cuando el
indol reacciona con el grupo aldehdo de p-dimetilaminobenzaldehido. (reactivo de Kovac o de
Erlich).
PRODUCCIN DE SULFURO DE HIERRO.

El cido sulfhdrico se detecta por la aparicin de un color negro, ya que se produce sulfuro de
hierro debido a la capacidad de ciertas bacterias de liberar azufre de aminocidos. En este medio
la fuente de azufre es el tiosulfato de sodio.
MOTILIDAD.
Algunas bacterias se mueven por medio de flagelos, la motilidad es una caracterstica importante
para la identificacin final de una especie. La motilidad se interpreta por observacin macroscpica
del medio observando si hay una zona difusa de crecimiento que se ensancha a partir de la lnea
de inoculacin. El medio se utiliza en tubo.
INTERPRETACIN:
Positiva: anillo rojo en la superficie
Negativa: anillo amarillo
PRUEBA DE LA UREASA.
La hidrlisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima especfica, la
ureasa dando lugar a dos molculas de amonio, agua y dixido de carbono produciendo un color
rosado mexicano.
REACCIN:
O
II
NH C NH2 + 2HOH

CO2 + H2O + 2NH3 (NH4)2 CO3

El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio lo que da como resultado
alcalinizacin y aumento del pH del medio. El caldo urea se inocula con un asa de cultivo puro del
microorganismo.
INTERPRETACIN:
Positiva: color rosa intenso
Negativa: sin cambio de color