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UNIVERSIDAD DE LA SABANA

FACULTAD DE MEDICINA

GUIAS PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Elaboradas por: Sonia Vélez de Salcedo


Sonia Villegas Estrada

Chía, Julio 2006


NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

• Usar siempre blusa blanca, limpia y abotonada para todas las sesiones de laboratorio.
• Colocar sus pertenencias en un lugar apropiado retirado del sitio donde se están manipulando los cultivos.
• No comer, no masticar chicle, ni fumar dentro del laboratorio.
• Mantener siempre el mechero encendido cuando se manipulen microorganismos.
• Tener en cuenta las recomendaciones de su instructora para el manejo del material estéril con el fin de no
contaminarlo
• Manejar las láminas con cuidado ya que los microorganismos en los frotis teñidos no están necesariamente
muertos.
• Atender las recomendaciones acerca del manejo de productos tóxicos, explosivos o de los gérmenes patógenos
• Colocar el material contaminado, dentro de los recipientes con desinfectante dispuestos para tal fin.
• Mantener el microscopio apagado mientras no este usándolo y cuando se termine la práctica dejar el sitio de
trabajo limpio y ordenado, el microscopio apagado y sin láminas en la platina.
• Lavarse las manos con jabón desinfectante antes de salir del laboratorio o cuando durante proceso crea
haberse contaminado al tocar accidentalmente algún cultivo o muestra para estudio.
• En caso de un accidente, como la ruptura de un tubo o caja con cultivo, no alarmarse y comunicarlo
inmediatamente a su instructora.

PARA CADA UNA DE LAS PRÁCTICAS EL ESTUDIANTE DEBE:

• Estudiar la guía correspondiente a la práctica que se va a realizar, su contenido puede ser evaluado en
cualquier momento
• Responder las preguntas y realizar las investigaciones solicitadas, las cuales deben quedar consignadas
en la guía
• Traer al laboratorio:
• La guía debidamente impresa (si la pierde o no la trae al laboratorio se le rebajará la nota asignada para
este Item.
• Marcador indeleble de punta fina, lápices de colores y sacapuntas.
• Guantes desechables, si lo desea para todas las practicas o cuando se especifique como indispensables

Nota: Está prohibido prestarse blusas y sí el día de los exámenes cada estudiante no la trae, no lo puede
ingresar al laboratorio.
INTRODUCCION AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
PRACTICA # 1

Las prácticas de laboratorio tienen por objeto familiarizar a los estudiantes con los procedimientos básicos para el
estudio de los microorganismos y reforzar los conceptos teóricos de la microbiología mediante el conocimiento de
los gérmenes y su comportamiento.

A lo largo de las prácticas se aprenderán las técnicas para colorear los microorganismos, permitiendo conservar
su morfología y agrupación. Se realizarán cultivos de los diferentes microorganismos cuyas características
especiales y reacciones bioquímicas darán las pautas para su clasificación.

Se enseñarán algunas técnicas de la microbiología médica, tales como:

• Toma de muestras para observación directa y cultivos, tanto a pacientes como al medio ambiente
• Forma de reporte e interpretación de los resultados de las pruebas realizadas
• Métodos empleados para esterilización y degerminación de materiales utilizados en el laboratorio, el hospital y
la practica médica.

Objetivos:

• Demostrar los equipos utilizados en el “Laboratorio de Microbiología”, su uso y las normas de seguridad para
su manejo.

Desarrollo del laboratorio:

Observe y describa los siguientes equipos anotando en cada caso las recomendaciones para su manejo y las
normas de seguridad que se deben tener en cuenta para su utilización.
MEC
H ERO
DE

ALCOHOL MECHERO DE GAS


INCINERADOR ELECTRICO

1. Pasos para su correcto encendido_____________________________________________________

___________________________________________________________________________________

2. Como apagarlo___________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

3. Cuidados con la manguera, el cabello y objetos inflamables a su alrededor

_________________________________________________________________________________

SISTEMAS PARA INCUBAR MICROORGANISMOS

INCUBADORA CORRIENTE ATMOSFERA DE CO 2 JARRA PARA


ANAEROBIOSIS
EQUIPOS PARA OBSERVAR LOS MICROORGANISMOS

MICROSCOPIO ESTEREOSCOPIO

HORNO PARA SECADO DE MATERIAL

Temperatura y tiempo para secar material en este equipo

___________________________________________________

Materiales que se pueden esterilizar en este equipo

___________________________________________________

Temperatura y tiempo para esterilizar material en este equipo

____________________________________________________

CENTRIFUGA

Cuidados que se deben tener con las centrifugas:

________________________________
______________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________
OTROS MATERIALES Y ELEMENTOS

En el laboratorio de microbiología se debe contar con otros elementos necesarios para el cultivo de las bacterias,
la elaboración de frotis, las coloraciones y la observación de la morfología microbiana en el microscopio como:

• Cajas de Petri: Ideadas por J. Petri uno de los colaboradores de Koch. Son dispositivos muy planos provistos
de tapa. En la actualidad se usan en diversos materiales: vidrio (reutilizables) o plástico (desechables).

• Asas de inoculación: Frecuentemente constituidas por un alambre de metal unido a un mango, pero existen
alternativas de materiales desechables. Cuando los propósitos deseados lo requieran se pueden calibrar de
modo que tomen cantidades medidas de muestra, por ejemplo para dar los resultados de los cultivos en número
de microorganismos por mL de muestra.

El asa de inoculación es un alambre usualmente metálico unido a un mango. Las hay reutilizables (de platino) o
desechables (plásticas). Existen 2 modalidades: Asa recta y Asa redonda

El asa se usa tomándola como sí fuera un lápiz tanto para sembrar especimenes en los medios de cultivo como
para realizar frotis. Se esteriliza calentándola con un mechero o en el incinerador eléctrico, hasta que se ponga al
rojo.

• Tubos de ensayo: Con o sin tapa rosca; sirven para la recolección de muestras o para depositar en ellos los
medios de cultivo sólidos, líquidos o semisólidos. Vienen también graduados cuando se necesita medir en ellos
algunos productos.

• Láminas portaobjetos: Para realizar frotis o preparaciones húmedas.

• Laminillas cubreobjetos: Se deben utilizar siempre que se realicen preparaciones húmedas


METODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE COLONIAS EN
MEDIOS DE CULTIVO PARA BACTERIAS Y HONGOS

PRACTICA # 2

Introducción

Los microorganismos para su crecimiento y multiplicación, deben tener los nutrientes necesarios como fuente de
energía para desarrollar un nuevo protoplasma. Estos factores de crecimiento o requerimientos para el desarrollo
microbiano están dados por:
• Un medio de cultivo adecuado dependiendo de cada microorganismo.
• Una atmósfera específica que determina la cantidad requerida de oxígeno o de otros gases.
• El pH en el cual se desarrolla mejor cada microorganismo.
• Una Temperatura apropiada para su crecimiento.

Todo material en el cual los microorganismos pueden reproducirse es un medio de cultivo. Estos medios pueden
ser líquidos, semisólidos o sólidos; esta consistencia está dada por la cantidad de una sustancia llamada Agar
que se extrae de algas marinas que no puede ser digerida por los microbios, pero que da una consistencia
suficiente para soportar la adición de nutrientes y permitir su crecimiento.

A este medio base se le pueden agregar nutrientes tales como:


• Peptona, proteína que sirve como fuente de Carbono y Nitrógeno
• Extracto de carne, que proporciona proteínas y carbohidratos
• Sueros bovinos, que contienen proteínas animales
• Sangre humana, de cordero o de otros animales
• Vitaminas y Minerales
• Colorantes como indicadores o inhibidores
• Cloruro de sodio, para mantener una adecuada presión osmótica.

De acuerdo a su utilización en el laboratorio, los medios se clasifican en:

• Básicos: Diseñados para el crecimiento de bacterias y el mantenimiento de poblaciones. Los más comunes son:
Agar Tripticasa Soya, Agar nutritivo, Agar Mueller-Hinton.

• Enriquecidos: Contienen medio básico al cual se le ha agregado algún suplemento nutritivo, por ejemplo
sangre o hemoglobina; la adición de estas sustancias los hace altamente nutritivos.

• Selectivos: A este tipo de medios se adicionan reactivos o sustancias química que permiten la diferenciación
de los distintos tipos de microorganismos o la selección de determinados géneros y especies. Los más comunes
son Agar MacConkey y Agar EMB, selectivos para gérmenes gramnegativos, y Agar Manitol-Sal selectivo
para gérmenes grampositivos.

• Diferenciales: Nos ayudan a clasificar los microorganismos en géneros y especies según su comportamiento
frente a sustancias como azúcares o urea, entre otros; la utilización de carbono, su movilidad y otras
reacciones bioquímicas especificas de cada microorganismo.
Siembras en medios de cultivo y obtención de colonias

En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones


mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de
otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel
que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta
origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia.

Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las denominadas
técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utilizó diluciones
seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación de microorganismos no deseados,
dificultó el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados con agar y las
placas de Petri en Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie del medio
de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies
microbianas.

ASPECTO DE LAS COLONIAS MICROBIANAS EN MEDIO SOLIDO

Objetivos de la práctica

• Reconocer algunos de los medios de cultivo empleados en el aislamiento e identificación bacteriana.


• Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de aislamiento en placa de Petri.
• Aprender a realizar una siembra bacteriana mediante la técnica de agotamiento que se utiliza para obtener
colonias aisladas, que permiten determinar sus características como tamaño, forma y color.
• Observar algunas de las reacciones que producen los microorganismos cuando se cultivan.

Materiales:

• Cultivos puros de microorganismos


• Cajas de Petri con medios de cultivo sólidos
• Mecheros de gas
• Asas redondas y rectas

Procedimiento:
• Realizar la siembra bacteriana en los diferentes medios cultivo, mediante la técnica de siembra por
agotamiento, a partir de los cultivos puros que encuentra en su sitio de trabajo, de la siguiente manera:
- Con un asa redonda, previamente esterilizada por calentamiento del alambre hasta el rojo vivo en el
mechero de gas, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña
de la superficie de la caja con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para
no dañar el agar. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se
extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente,
flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría.
• Incubar las cajas, siempre invertidas, a 37oC durante 24 horas.
• Tras la incubación, se observarán las colonias aisladas en alguna región de la caja inoculada.
• Con esta técnica se logra la separación de los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, o bien
que proceden de muestras homogénea, pero en las que existe un elevado número de microorganismos.

TECNICA PARA SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O ESTRIA PARA EL AISLAMIENTO DE


COLONIAS

Nota importante:

Todos los microorganismos utilizados en la práctica son potencialmente patógenos, por lo tanto es indispensable
seguir cuidadosamente las instrucciones de la profesora, con el fin de evitar contaminación propia y de las
instalaciones del laboratorio.
Inoculación primaria Estrias en ángulos rectos Estrias para producir un
Siembra primaria Siembra par urocultivo crecimiento
Siembra en enrejado.
para antibiograma

Siembra en tubo de ensayo


Principales medio de cultivo para bacterias

Para la mejor comprensión de la práctica, a continuación encontrará una lista de algunos de los medios más
frecuentemente utilizados para el cultivo de bacterias comunes.

MEDIOS DE CULTIVO BASICOS

Nombre del medio Indicado para Componentes importantes

Agar Tripticasa Base para otros medios Caseína , Harina de soya


de Soya Para crecimiento de bacterias grampositivas Cloruro de sodio
y gramnegativas Agar
Mantenimiento de cepas

Agar Mueller Hinton Para la realización de antibiogramas Extracto de carne


por el método de difusión en agar Almidón, Caseína, Agar

MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDOS

Nombre del medio Indicado para Componentes importantes

Agar Sangre Para crecimiento de bacterias Base de Agar tripticasa de soya


grampositivas y gramnegativas Sangre animal o humana

Agar Chocolate Para crecimiento de bacterias Base de Agar tripticasa de soya


grampositivas y gramnegativas Hemoglobina animal

MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS

Nombre del medio Indicado para Componentes importantes

EMB Crecimiento de Bacterias gramnegativas Peptona, Lactosa,, Agar


Azul de Metileno y Eosina

MacConkey Crecimiento de Bacterias gramnegativas Peptona, Lactosa, Sales biliares, Agar


Rojo neutro como indicador

MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES


Nombre del medio Indicado para Componentes importantes

TSI Fermentación de azúcares Lactosa, Sacarosa y Glucosa


Producción de gas Sal de hierro y amonio
Producción de H2 S Tiosulfato sódico, Agar
Rojo de Fenol como indicador

Citrato de Utilización del carbono contenido en el Citrato de Sodio, Agar


Simmons citrato de sodio como fuente de carbono para Azul de Bromotimol como indicador
el crecimiento bacteriano

Agar Urea Determinar la producción de la Urea, Agar


enzima ureasa Rojo de Fenol como indicador

SIM Producción de H2 S Sal de hierro y amonio


Producción de Indol Tiosulfato sódico, Triptófano,
Motilidad de la bacteria Agar suficiente para hacerlo semisólido

MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS

Nombre del medio Indicado para Componentes importantes

Sabouraud Crecimiento de hongos filamentosos y Peptona, Glucosa, Agar


levaduriformes

MEDIOS DE CULTIVO PARA MICOBACTERIAS

Nombre del medio Indicado para Componentes importantes

Lowenstein-Jensen Crecimiento de Mycobacterias Yema de huevo


Verde de malaquita como inhibidor
ELABORACION DE FROTIS Y COLORACION DE GRAM

PRACTICA # 3

Introducción:

Los colorantes se utilizan en microbiología para:


• Teñir los microorganismos y sus estructuras (cápsulas, flagelos, esporas, gránulos)
• Para diferenciarlos en grupos según la forma de tomar dichos colorantes.
• Para adicionarlos a los medios de cultivos con el fin de inhibir el crecimiento de un grupo determinado de
gérmenes.

Los colorantes bacterianos son anilinas que contienen radicales que imparten su propiedad cromógena al colorante
y grupos auxócromos que permiten que el colorante se una a las fibras o tejidos. Si la porción coloreada
(cromógeno) actúa como base, se les denomina colorantes básicos (catiónicos) y sí el cromógeno actúa como ácido
se llaman colorantes ácidos (aniónicos).

Los núcleos de las células se tiñen mejor con colorantes básicos y el citoplasma con colorantes ácidos. Como la
célula bacteriana tiene su material nuclear distribuido por toda la célula se colorea bien con los colorantes básicos.

Las bacterias son células transparentes y por su tamaño (0.1 a 5 µm) se pueden observar al microscopio con
aumento de 40X, pero para su diferenciación y la identificación de algunos de sus organelos, deben emplearse
coloraciones en preparaciones fijas o permanentes y observarse con aumento de 100X.

Objetivos:

Familiarizar al estudiante con las técnicas para:

• La elaboración de frotis a partir de de colonias obtenidas en cultivo o de muestras clínicas


• Realizar correctamente una coloración de Gram
• Observar bacterias en preparaciones fijas coloreadas con la coloración de Gram

Materiales:

• Colorantes para la coloración de Gram:


- Cristal Violeta
- Solución de Lugol
- Alcohol -Acetona
- Safranina
• Cultivos de bacterias (cocos y bacilos)
• Láminas portaobjetos
• Laminillas cubreobjetos
• Solución salina
Procedimiento para elaboración del frotis:

1. Calentar el asa de inoculación hasta que este al


4. Trazar con la muestra una espiral desde el centro a la
rojo. periferia. Si la muestra no es líquida, colocar una
pequeña gota de solución salina sobre el portaobjetos
antes de realizar el frotis y disolver en ella la muestra

2. Tomar la porción de la muestra (o una colonia


del cultivo) que se va a examinar por medio de
una asa o escobillón

5. Calentar nuevamente el asa para desinfectarla.

3. Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio


y sin grasa, debidamente marcado

6. Dejar secar el frotis al medio ambiente.

7. Fijarlo pasándolo tres veces a través de la llama con


la muestra hacia arriba.
Fundamento de la coloración de Gram

La coloración de Gram ideada por Hans Cristian Gram en 1844, permite la diferenciación de los microorganismos
en dos grandes grupos: grampositivos y gramnegativos.

La diferencia de color que presentan los microorganismos tratados con estos colorantes, se debe a la formación de
un complejo Violeta-Yodo que es "atrapado" dentro de la bacteria según las características de su pared:
• Los Gram positivos tienen una pared predominantemente proteica que se deshidrata con la aplicación del
alcohol-acetona y no permite que el colorante violeta salga de la bacteria.
• Los Gram negativos tienen una pared con una capa lipídica que se disuelve con el alcohol-acetona, permitiendo
la salida del complejo violeta-yodo; para poder observar estos microorganismos, se colorean luego con la
safranina que se agrega al final del procedimiento.

Nota: Para que esta reacción ocurra es necesario que las bacterias que se van a colorear tengan su pared íntegra,
para esto se deben utilizar cultivos jóvenes.

Materiales:

• El frotis preparado en la primera parte del laboratorio


• Mechero de gas
• Colorantes y reactivos de Gram:
- Cristal Violeta
- Solución de Lugol
- Alcohol-acetona
- Safranina
• Agua corriente

Procedimiento de la Coloración:

1. Verter el cristal violeta sobre el portaobjetos y dejar actuar por 1 minuto.

2. Enjuagar con agua corriente y dejar escurrir

3. Agregar la solución de Lugol y dejar actuar por 1 minuto


4. Escurrir la solución y enjuagar el portaobjetos con agua corriente

5. Decolorar con el alcohol-acetona por 5 segundos y enjuagar con agua corriente.

6. Agregar la solución de Safranina y dejar actuar por 30 segundos, enjuagar, escurrir y dejar secar

7. Observar la preparación al microscopio y dibujar lo observado, teniendo en cuenta la morfología


bacteriana y su agrupación.

Si su coloración no quedó muy perfecta, pudo haber cometido alguno de estos errores:

Una reacción grampositiva falsa


• Frotis fijado antes de estar seco o demasiado grueso
• Colorante Cristal-Violeta con sedimento (filtrarlo).
• El Lugol no se escurrió completamente.
• No se decoloró suficientemente.
• La solución de Safranina se dejó por demasiado tiempo.

Una reacción gramnegativa falsa


• No se dejo actuar suficiente la solución de yodo.
• La preparación se sobredecoloró.
ESTRUCTURAS BACTERIANAS

PRÁCTICA # 4

Introducción:

Las bacterias son unicelulares, microscópicas y procariotas; poseen un tamaño que oscila entre 1 y 10 µm, su
citoplasma esta repleto de ribosomas y su material genético esta constituido por un cromosoma circular de ADN
que carece de membrana; la membrana citoplasmática esta constituida por una doble capa lipídica sin esteroides y
esta rodeada por una pared dura y elástica de peptidoglicano (glicopéptido, mureina) que le confiere forma a la
célula.

Por su morfología las bacterias se clasifican en cocos, bacilos y espirilos; en función de la estructura de su pared
se clasifican en grampositivas, las cuales tienen una pared rica en peptidoglicano y gramnegativas, que tienen
una membrana externa rica en lipopolisacáridos, adosada a una delgada pared de peptidoglicano.

Algunas bacterias tienen una cápsula que rodea la pared y pueden poseer flagelos que facilitan su movilidad o
producir esporas que son formas de resistencia a las hostilidades del ambiente. Algunas de estas estructuras no se
tiñen con la coloración de Gram y para su visualización es necesario recurrir a coloraciones específicas.

CAPSULA: Material gelatinoso que rodea la pared celular de algunas bacterias. Dependiendo del
microorganismo y de la composición de los nutrientes del medio, la estructura química de la cápsula puede variar
así:

• Polímeros de glucosa, galactosa y ácido glucurónico: se produce en varias especies de Estreptococos como en
Streptococcus pneumoniae.
• Polipéptidos complejos de uno o varios aminoácidos como en Bacillus anthracis.

La cápsula juega un papel importante en las enfermedades y se asocia con:

• Virulencia porque el material celular capsular previene la fagocitosis


• Antigenicidad debido a que la mayoría del material capsular es capaz de inducir la formación de anticuerpos.

ESPORAS: La esporulación es un método bacteriano para sobrevivir a circunstancias adversas de temperatura y


humedad; cuando las condiciones ambientales son más favorables para mantener la viabilidad, la espora puede
volver a la vida vegetativa en un proceso llamado germinación.

Durante la esporulación ocurren una serie de cambios que comprenden la invaginación de la membrana celular, la
duplicación del DNA, la formación de una membrana alrededor de la nueva unidad y la sintetización de un
mucopéptido llamado "cortex" que difiere químicamente de los mucopéptidos de la célula vegetativa y contiene
altas concentraciones de dipicolinato de calcio; finalmente se forma un cuerpo oval en el citoplasma de la célula
resistente al calor, la desecación y los agentes químicos.

Las esporas pueden ser centrales, terminales o subterminales, con respecto al bacilo y las bacterias formadoras
de esporas son bacilos pertenecientes a los géneros Clostridium y Bacillus. Entre los microorganismos formadores
de esporas de importancia médica están: Clostridium botulinum agente causal del botulismo, Clostridium tetani y
Clostridium perfringens agentes causales del tétano y la gangrena gaseosa respectivamente.

La destrucción de las esporas es de obvia importancia para el personal hospitalario y solo se logra a temperaturas
de 1210C (presión de 15 libras) por 15 minutos, estas cifras se usan a nivel mundial como parámetros de
esterilización por calor húmedo.

FLAGELOS: Son estructuras propulsoras en forma de cuerda, formadas por subunidades proteicas enrolladas
helicoidalmente llamadas flagelina, están ancladas en la membrana bacteriana mediante el gancho y el cuerpo
basal y son impulsadas por el potencial energético de la membrana.

Proporcionan movilidad a la bacteria para alcanzar los nutrientes y evitar sustancias tóxicas; pueden ser únicos o
múltiples, polares o peritricos y son especialmente importantes en la familia Enterobacteriaceae.

GRANULOS METACROMATICOS: Son acúmulos de nutrientes de reserva, especialmente de polisacáridos,


lípidos y polifosfatos y también le permiten a la bacteria almacenar enzimas. Son frecuentes en bacilos
grampositivos y se observan con facilidad en los Difteroides.

Objetivos

Observar al microscopio algunas de las estructuras bacterianas con coloraciones especiales.

Materiales:

• Frotis de bacterias capsuladas teñidos con coloración negativa de Tinta China


• Frotis de bacterias flageladas
• Frotis de bacterias esporuladas teñidas con Gram o con Sheaffer-Fulton
• Frotis de bacterias con gránulos metacromáticos teñidas con Gram
• Microscopio óptico
• Aceite de inmersión

Procedimiento:

Observe las diferentes estructuras enfocadas y dibuje lo observado.


ESTRUCTURAS MICOTICAS Y HONGOS AMBIENTALES
PRACTICA # 5

Introducción:

Los hongos son organismos muy abundantes en la naturaleza y constituyen el reino Fungí con unas 200.000
especies diferentes. Son organismos heterótrofos formados por células eucariotas con un ADN organizado en
cromosomas envueltos en una membrana nuclear; el citoplasma es rico en ribosomas y otros organelos
compartimetalizados como las mitocondrias y esta limitado por una membrana rica en ergosterol; rodeando la
membrana se encuentra una pared rígida compuesta mayoritariamente de quitina, mananos y glucanos.

Pueden ser unicelulares formados por células aisladas redondas u ovales llamadas levaduras o pluricelulares
constituidos por células alargadas que crecen por extensión de sus extremos formando filamentos y se llaman
mohos u hongos filamentosos.

La mayoría de los hongos son contaminantes saprofiticos y algunos pueden ser patógenos. Los hongos
contaminantes son muy numerosos en la naturaleza y revisten especial importancia en el estudio de la micología
médica, entre otras razones porque muchos de ellos actúan como oportunistas causando infecciones severas en
pacientes inmusuprimidos, ya que sus esporas se encuentran ampliamente distribuidas en el aire y esto las hace
capaces de contaminar fácilmente productos industriales. Por la simplicidad de sus requerimientos nutricionales
constituyen importantes sistemas biológicos para estudio y su crecimiento produce numerosas sustancias de
importancia en la industria y la medicina (alcoholes, antibióticos, vitaminas); crecen fácilmente en los medios de
cultivo contaminándolos y dificultando la identificación de los gérmenes patógenos y pueden contaminar cereales,
frutas y alimentas en los lugares de almacenamiento; numerosas especies producen toxinas capaces de causar
alteraciones en el hombre y los animales.

Los hongos están formados por diferentes estructuras dependiendo si son levaduras o mohos, su tipo de
reproducción (sexual o asexual), el medio de cultivo y la temperatura de incubación. Las principales estructuras
son:

Hifa: es el elemento principal de crecimiento o forma vegetativa de un moho; es un filamento cuyas ramificaciones
se extienden en todas direcciones esparciéndose sobre y dentro del sustrato. Las hifas pueden ser septadas o
tabicadas, es decir divididas en paredes o septas que forman células individuales, o pueden ser no septadas,
cenocíticas o aseptadas, cuyos núcleos están encajados mas o menos uniformemente dentro de una masa.
Seudohifa: formación propia de los hongos levaduriformes; es una forma exagerada de gemación en la cual las
células recién formadas no se separan de la célula madre y se alargan dando el aspecto de hifa.
Rizoide: es una hifa diferenciada en forma de raíz.
Micelio: es el conjunto de hifas que constituyen el cuerpo o talo de un hongo; si penetra en el medio para
absorber los nutrientes se le denomina micelio vegetativo y si se proyecta sobre la superficie del medio constituye
el Micelio aéreo.
Conidias: son esporas formadas asexualmente en el extremo o al lado de una hifa; se llaman macronidias si
tienen un diámetro mayor que la hifa que les dio origen y microconidias si su diámetro es menor que la hifa de
origen.
Conidióforo: es una hifa especializada que lleva conidias.
Espora: pequeña unidad de propagación que se comporta como una semilla y que se forma dentro de esporangio y
generalmente como producto de gemación en las levaduras. Dependiendo de su forma y localización pueden ser
blastosporas, artrosporas o clamidosporas.
Esporangio: es un saco lleno de esporas.
Esporangióforo: hifa que contiene el esporangio
Estudio de los hongos:

Los hongos levaduriformes forman colonias semejantes a las bacterianas y pueden manipularse o estudiarse de la
misma forma; los hongos filamentosos dan lugar a colonias peludas o pulverulentas por lo cual deben
manejarse de forma diferente y con medidas de bioseguridad para evitar la contaminación con sus esporas
especialmente en el caso de hongos patógenos

El medio mas común para el cultivo de hongos se llama Agar Sabouraud, pero hoy se utilizan otros medios
cromógenos específicos o medios miniaturizados para un diagnostico rápido de las micosis. Aunque todos los
hongos son grampositivos, se pueden utilizar otras coloraciones para su estudio como Hematoxilina-Eosina o
coloraciones a base de Plata; para la observación directa se usa especialmente el Azul de Lacofenol que además
contiene sustancias que protegen de su contaminación o soluciones de KOH al 10% cuando se encuentran en
muestras clínicas como escamas de piel o uñas ricas en queratina.

Objetivos:

• Enseñar a los estudiantes las técnicas básicas para el estudio de los hongos
• Demostrar y enseñar a reconocer las estructuras de los hongos
• Cultivar en el laboratorio y observar al microscopio los hongos contaminantes y resaltar su importancia como
oportunistas.

Materiales:

• Cajas de Petri con Agar Sabouraud


• Azul de Lactofenol
• Solución de Lugol
• Cinta pegante
• Laminas y laminillas

Procedimiento:

• Del micelio aéreo o reproductivo de los hongos filamentosos que crecieron en su caja, realice un montaje con
azul de lactofenol de la siguiente forma:
- Colocar una gota de azul de lactofenol sobre una lamina portaobjetos
- Tocar la superficie de la colonia con la cara adhesiva de una tira de cinta pegante de aproximadamente 3
cm y colocarla sobre una gota del colorante
- Cubrir con laminilla y observar al microscopio con objetivos de 10 y 40 X
• Si la colonia es levaduriforme realizar un montaje húmedo con una gota de solución de Lugol
• Observar y dibujar las estructura observadas
ESTUDIO DE LOS PARASITOS
EXAMEN COPROLOGICO Y COPROSCOPICO

PRACTICA # 6

Nota: Para esta práctica el estudiante debe traer guantes y haber aprendido los conceptos teóricos.

Introducción:

Los parásitos propiamente dichos son heterotrofos, eucariotes, unicelulares o pluricelulares y pertenecen a tres
grandes grupos:

• Los protozoos son microorganismos unicelulares de tamaño mediano, aunque algunos pueden medir tan solo
1-2 µm hay otros de mas de 100 µm; pueden tener diferentes formas de vida: los trofozoitos, formas
vegetativas o activas, generalmente poseen uno o dos núcleos y apéndices de movimiento como seudópodos,
flagelos o cilios y los quistes o formas de resistencia, poseen pared, pueden tener uno o varios núcleos y son
inmóviles.
Taxonómicamente los protozoos de importancia médica se clasifican en varios filum:
− Sarcomastigophora al cual pertenecen las amibas y flagelados que se mueven por seudópodos o flagelos
respectivamente
− Ciliophora al cual pertenecen los ciliados que se mueven por cilios
− Apicomplexa que son intracelulares estrictos y poseen un complejo apical para penetrar las células del
hospedero
− Microspora al cual pertenecen parásitos con un filamento polar para inyectar el material infeccioso a las
celulas blanco.

• Los helmintos. llamados comunmente gusanos, son organismos pluricelulares generalmente visibles
macroscópicamente en su forma adulta, mientras que los huevos y larvas son formas de vida microscópicas,

Taxonómicamente los helmintos de importancia médica se clasifican en dos filum:


− Nematoda al cual pertenecen los gusanos redondos
− Platelmintes al cual pertenecen los gusanos planos que pueden ser acintados o en forma de cinta,
llamados Cestoda, y los aplanados en forma de hoja o duela que pertenecen al subfilum Trematoda

• Los artrópodos son organismos invertebrados con patas articuladas y un exoesqueleto quitinos; pueden ser
parásitos pos sí mismos o vectores biológicos de bacterias, virus y de otros parásitos.

Taxonómicamente los artrópodos de importancia médica se clasifican en clases:


− Insecta a la cual pertenecen organismos que poseen tres pares de patas, algunos sufren metamorfosis, son
vectores de muchas enfermedades especialmente en países tropicales como el nuestro y en otros países en
las estaciones calidas.
− Arachnida al cual pertenecen organismos que poseen cuatro pares de patas y algunos de ellos son
parasitos humanos mediante picaduras venenosas.
− Crustacea a la cual pertenecen pocos parasitos de importancia médica y generalmente poseen cinco pares
de patas.

Todos los parásitos pueden visualizarse fácilmente al microscopio óptico y en general presentan suficientes
diferencias estructurales como para poder identificarlos por las características morfológicas de cada una de sus
formas de vida.
Estudio de los parasitos intestinales en muestras clinicas

Las heces constan normalmente de gran variedad de sustancias como: agua, residuos alimentarios, secreciones
intestinales, bilis, pigmentos, sales de calcio, hierro y otros minerales, bacterias de la flora normal o residente y
sus productos de descomposición, células y moco de la pared intestinal.

Anormalmente se pueden encontrar en las muestras clinicas cantidades aumentadas de estos componentes y otras
estructuras como cálculos biliares o pancreáticos, sangre, leucocitos, parásitos, virus, hongos o bacterias
patógenas.

El examen de las materias fecales se limita en muchos casos solamente a la investigación de parásitos intestinales
en cuyo caso se llama examen coprológico y a la investigacion de bacterias patógenas examen llamado
coprocultivo, pero se pueden determinar también otros parámetros que ayudan al médico en el diagnóstico de los
trastornos intestinales, como es el caso del examen coproscópico.

Examen coprológico

Este análisis consiste tanto en un examen macroscópico, como en la observación microscópica de una porción de
muestra de materia fecal obtenida por evacuación natural o inducida mediante un laxante salino.

Comprende los siguientes exámenes :


• Análisis físico-químico que proporciona algunos datos de importancia clínica como son consistencia, forma,
color, olor y la presencia de parásitos macroscópicos tales como gusanos adultos.
• Examen microscópico para el reconocimiento de elementos como residuos vegetales, cristales, células, moco,
eritrocitos, piocitos o leucocitos y formas parasitarias microscópicas como quistes, trofozoitos, larvas o
huevos.

Examen coproscópico

Además de los análisis anteriores este examen comprende otros parámetros como :
• Determinación del pH
• Presencia o ausencia de azúcares reductores
• Búsqueda y recuento diferencial de leucocitos fecales
• Determinación de sangre o hemoglobina (opcional)

Estos datos pueden ser de gran ayuda para determinar el origen de la diarrea en un paciente y por lo tanto este
examen se solicitará sólo en caso de que el paciente presente este síntoma.

Análisis físico
• Consistencia y forma. Las heces normales son blandas y formadas o formes. En caso de estreñimiento
habitual o patológico se vuelven demasiado duras y con la ingestión de laxantes o purgantes o la presencia de
microorganismos patógenos se producen heces demasiado blandas o líquidas lo que constituye la diarrea.
Cuando la diarrea está acompañada de moco y sangre se llama disentería y cuando contiene restos
alimentarios sin digerir se llama lientería.
• Olor. El olor normal de las materias fecales se debe a la presencia de sustancias aromáticas que se derivan de
la desaminación y descarboxilación del triptófano por acción de las bacterias que habitan el colon; por lo
tanto en dietas cárnicas el olor aumenta y en las dietas a base de lácteos o vegetales, es menos intenso; en
algunos casos pueden tornarse francamente fétidas.
• Color. En condiciones normales, los adultos evacuan heces de color pardo de distinta intensidad; este color se
debe a la urobilina y al urobilinógeno formados por las bacterias, como resultado de la reducción de la
bilirrubina. El color puede cambiar por la ingestión de algunos alimentos como leche, vegetales clorofílicos,
remolacha, o por otras sustancias como hierro, bismuto y bario. También puede variar como consecuencia de
algunas enfermedades como ictericia obstructiva, hemorragias del tracto intestinal alto o melenas, exceso en
el contenido de grasa o esteatorrea como en casos de malabsorción intestinal.
• Moco. Normalmente en las heces se aprecian pequeñas cantidades de moco, pero cuando éste aumenta indica
inflamación o irritación del intestino, especialmente del colon, en cuyo caso se debe examinar la porción de
materia fecal que lo contenga.

Análisis químico
• pH. La reacción de la materia fecal depende en gran parte de los hábitos alimentarios, pues las dietas
proteicas producen alcalinidad, mientras que las dietas con abundancia de carbohidratos producen heces
ácidas. Normalmente el pH es cercano al neutro y varía de 6.8 a 7.2
• Azúcares reductores. La glucosa y la lactosa pueden estar presentes en materia fecal cuando hay un
trastorno en la absorción por parte del intestino delgado. Estos azúcares reducen el reactivo de Benedit y por
esta razón se llaman reductores. Este examen es especialmente útil en caso de Enfermedad Diarreica Aguda
para guiar al clínico en el diagnóstico de la causa etiológica de la diarrea. Las diarreas inflamatorias
generalmente cursan con Azúcares negativos ya que los agentes etiológicos se localizan principalmente en el
intestino grueso, en tanto que las diarreas secretoras pueden presentar azúcares positivos, especialmente
lactosa, azúcar que se absorbe a través del intestino delgado.

En la tabla siguiente se resumen algunos de los parámetros importantes para la clasificacion de las diarreas
en inflamatorias y secretoras:

PARAMETRO DIARREA DIARREA SECRETORA


INFLAMATORIA
pH Acido o alcalino Acido
Azúcares reductores Ausentes Presentes
Localización del agente causal Intestino grueso Intestino delgado
Mecanismo de acción del agente Invasivo Osmótico

• Sangre oculta. Su hallazgo tiene valor en el diagnóstico de cáncer, úlcera péptica o de algunas parasitosis
intestinales; aun muy pequeñas cantidades de sangre se pueden detectar por diferentes métodos, bien sea como
una reacción enzimática inespecífica semejante a la reacción de las peroxidasas o por métodos mas específicos
con anticuerpos monoclonales.

Examen microscópico

En forma rutinaria en el Laboratorio, se realizan montajes en fresco con solución salina fisiológica, lo cual permite
apreciar los movimientos de los trofozoitos y las larvas de los parásitos, así como sus inclusiones citoplasmáticas,
factores útiles para su diferenciación; también se realizan montajes con solución de Lugol o con colorantes como
azul de metileno amortiguado (Azul de Nair) o con eosina, los cuales destacan los núcleos de los trofozoitos para
diferenciarlos de otras estructuras, como células y leucocitos mononuleares o polimorfonucleares que no son
fácilmente distinguibles cuando estan sin teñir.

En otros casos como para aclarar diagnósticos o para demostración, se realizan frotis permanentes para ser
teñidos con colorantes como la hematoxilina-férrica, la coloración Tticrómica o la coloración de Zielh-Neelsen
para acido-alcohol-resistentes.
Materiales:

• Muestras de materia fecal conservadas en formol


• Solución de Lugol
• Laminas y laminillas
• Palillos de madera

Procedimiento de la práctica:

• La profesora realizará un examen fisico-químico de la muestra de materia fecal


• Cada estudiante preparará un montaje en fresco de una muestra de materia fecal conservada en formol al 10%
, de la manera siguiente :
− Con la ayuda de la pipeta de transferencia tomar una pequeña cantidad de materia fecal y colocar dos
gotas separadas sobre un portaobjeto limpio y desengrasado
− Agregar una gota de solución de Lugol sobre una de las gotas de muestra; realizar una emulsión
homogénea y sin partículas gruesas que impidan la visualización de los elemtos (si es necesario puede
utilizar un palillo)
• Cubrir cada gota de la preparación con una laminilla, evitando la formación de burbujas y eliminar el líquido
sobrante con un papel de filtro, si es necesario.
• Observar al microscopio, enfocando primero con objetivo de 10X y luego con objetivo de 40X. No olvide usar
la luz adecuada para poder distinguir los diferentes elementos.
• Dibujar los elementos y estructuras observados en 40X. No olvide identificar cada observación

DIAGNOSTICO DIRECTO DE LOS PROTOZOOS INTESTINALES


PRACTICA # 7

Introducción:

El diagnóstico de las parasitosis es uno de los complementos necesarios para llevar a cabo un tratamiento
adecuado de las mismas. Algunas de las técnicas utilizadas para tal objeto son aquellas en las que se
identifican los parásitos en las muestras clinicas por su morfología y es lo que se conoce como diagnóstico
directo; cuando no se puede llevar a cabo esta identificación morfológica se pueden utilizar otras técnicas
como los análisis inmunológicos para determinar antígenos estructurales parasitarios o para determinar
anticuerpos producidos en el transcurso de una enfermedad parasitaria, bien sea por reaccioones serológicas o
por pruebas de intradermoreacción. Existe tambien el llamado xenodiagnóstico que consiste en alimentar los
vectores biológicos o los animales susceptibles con la sangre del paciente sospechoso (como en la enfermedad
de Chagas) o con una biopsia (en triquinosis) y al cabo de un tiempo buscar las formas reproductivas del
parásito sacrificando el vector o el animal; estos últimos casos se consideran como diagnóstico indirecto.
También se pueden utilizar otras técnicas como sondas genéticas o amplificación en cadena de la polimerasa
(PCR) un poco mas costosas y a veces innecesarias.

Los parásitos intestinales se identifican rutinariamente por sus características morfológicas en los análisis de
laboratorio de la materia fecal, conocidos como examen coprológico y examen coproscópico, mediante
observación microscópica en montajes húmedos con solución salina o con solución de lugol como colorante.
También se pueden hacer extendidos para realizar posteriormente coloraciones permanentes, como la
coloración de hematoxilina férrica o la coloración tricrómica, los cuales facilitan la identificación al revelar
detalles estructurales no detectables en los montajes húmedos. En algunos casos se pueden tomar biopsias
intestinales para identificar la patológia producida por el parásito y observarlo en el tejido, en este caso se
puede utilizar la coloracion de hematoxilina-eosina, que aunque no es una coloración especifica para parásitos
permite detectar algunos detalles del parásito buscado.

Los protozoos intestinales se presentan generalmente bajo tres formas de vida:

1. El trofozoito o forma vegetativa, que generalmente es el que produce la patología

2. El quiste o forma de resistencia que desarrolla el parásito para poder sobrevivir en condiciones adversas

3. El prequiste que es una forma intermedia

Todos los protozoos que se transmiten por vía oro-fecal presentan formas quísticas, mientras los que se
transmiten por contacto íntimo o por vectores, generalmente no presentan esta forma de resistencia.

En el intestino humano se pueden encontrar protozoos patógenos y protozoos comensales, la aparición de


estos últimos puede deberse a varios factores como son las condiciones de salubridad e higiene y factores
inmunologicos; su aparición, aunque no amerita tratamientos para su erradicación, puede dar una idea de estas
condiciones en los pacientes, por lo tanto en los análisis de laboratorio generalmente se informa su presencia.

Los principales protozoos no patógenos del organismo humano son:


ENTAMOEBA COLI

Por su tamaño es la más grande de las amibas intestinales, es un comensal del intestino grueso, no provoca
lisis tisular y se alimenta de bacterias, levaduras y protozoarios; de manera frecuente se observa su
coexistencia con Entamoeba histolytica y en ocasiones puede confundirse con ella, lo que conlleva a prescribir
tratamientos innecesarios o dejar sin tratamiento verdaderas infecciones por E. histolytica.

IODAMOEBA BUTSCHLII

Es una amiba que recibe su nombre debido a la vacuola de glucógeno presente en su fase quística que se tiñe
fácilmente con lugol; es considerada comensal, aunque existe en la bibliografía un caso de muerte atribuible a
este protozoo.

ENTAMOEBA HARTMANNI

Durante mucho tiempo diversos autores la consideraron como raza pequeña de Entamoeba histolytica, pero
hoy se sabe que es una amiba no invasiva puesto que no ingiere eritrocitos y sus trofozoitos tienen un
movimiento lento. Morfológicamente es similar a E. histolytica pero mide menos 10 µm de diámetro, lo que
puede llevar a establecer un diagnóstico equívoco y un tratamiento impreciso.

ENDOLIMAX NANA

Es una amiba de pequeñas dimensiones que se localiza especialmente a nivel del ciego y se alimenta tambien de
bacterias. Por su pequeño tamaño se puede confundir con Entamoeba hartmanni.

CHILOMASTIX MESNILII

Es un flagelado del intestino grueso del hombre y de otros animales, al cual se le atribuyen ciertas formas de
diarrea crónica, aunque no ha sido plenamente demostrada su patogenicidad; igual que los comensales antes
mencionados puede ser transmitido por fecalismo y las medidas profilácticas deben dirigirse al mejoraramiento
de la higiene personal y ambiental.

Objetivo de la práctica:

Conocer microscópicamente las características morfológicas de los principales protozoos del intestino humano
que les permiten su identificación, en coloraciones permanentes de extendidos de materia fecal y biopsias
intestinales.

Procedimiento:

El estudiante encontrará las láminas demostrativas coloreadas, enfocadas en los microscopios y los parásitos
debidamente localizados; para su identificación debe ayudarse con las características morfológicas descritas y
si tiene un texto puede guiarse por las microfotografías consignadas en los atlas.
TROFOZOITOS DE LOS PROTOZOOS COMENSALES INTESTINALES

GENERO Y TAMAÑO Y NÚCLEO Coloración de Hematoxilina férrica


ESPECIE

20-30 µm

Entamoeba 1 núcleo excéntrico


coli con cromatina periférica irregular
1 nucleólo excéntrico
En el citoplasma no se observa
diferencia entre ectoplasma
y endoplasma que contiene
bacterias

6-20 µm

1 núcleo grande
Iodamoeba
butschlii 1 nucleólo muy voluminoso

5 -10 µm

1 núcleo excéntrico
con cromatina periférica regular
Entamoeba
hartmanni 1 nucleólo pequeño central

6-12 µm
Endolimax
nana 1 núcleo grande

1 nucleólo grande y excéntrico

10-15 µm

1 núcleo con uno o


Chilomastix varios bloques de cromatina
mesnilii
3 flagelos anteriores y 1 posterior

Aspecto piriforme con un


citostoma
QUISTES DE LOS PROTOZOOS COMENSALES INTESTINALES

GENERO Y TAMAÑO Y NÚCLEO Coloración de Hematoxilina férrica


ESPECIE

10-30 µm
Entamoeba
coli
8 núcleos con 1 nucleólo
excéntrico

5-18 µm

1 a 2 núcleos grandes
Iodamoeba
butschlii con 1 nucleólo muy voluminoso

una vacuola

5 -10 µm

4 núcleos con

Entamoeba 1 nucleólo pequeño central


hartmanni
Barras cromatoides en el
citoplasma

5 -12 µm
Endolimax
nana 4 núcleos pequeños
con 1 nucleólo excéntrico

6-9 µm

Chilomastix 1 núcleo con 1 filamento oscuro


mesnilii
Aspecto piriforme
ESTUDIO DE LOS COCOS GRAMPOSITIVOS

PRACTICA # 8

Introducción:

Existen tres géneros de cocos grampositivos de interés en patología médica: Streptococcus, Staphylococcus y
Enterococcus, los cuales morfológicamente presentan diferencias en cuanto a su agrupación, ya que los
estafilococos se agrupan en racimos, los estreptococos se agrupan en cadenas o en parejas y los enterococcos en
parejas o cadenas cortas; como no siempre esta diferencia es clara, en el laboratorio se utilizan otras pruebas para
su diferenciación.

Género Staphylococcus

Este género pertenece a la familia Micrococcaceae, la cual comprende otros tres géneros que son Micrococcus,
Stomatococcus y Planococccus, que generalmente no se consideran patógenos y pueden ser ocasionalmente
oportunistas.

Los Staphylococcus son cocos grampositivos que se agrupan en racimos, pares o tétradas, son catalasa positiva
y anaerobios facultativos. El género está compuesto por 19 especies de las cuales solo 3 se asocian frecuentemente
con enfermedades en el hombre:

• Staphylococcus aureus
• Staphylococcus epidermidis
• Staphylococcus saprophyticus

Los Staphylococcus producen una gran variedad de enfermedades:

• Infecciones cutáneas , como forunculosis, foliculitis, celulitis, impétigo, síndrome de piel escaldada
• Endocarditis
• Neumonía
• Artritis séptica
• Septicemia
• Shock tóxico
• Intoxicación alimentaria

Para su identificación y diferenciación en el laboratorio se tienen en cuenta:

• Morfología celular (Gram)


• Color de la colonia.
• Producción de enzimas (Catalasa, Coagulasa, Dnasa)
• Producción de hemólisis
• Susceptibilidad a la Novobiocina

Objetivo:

Estudiar las características del género Staphylococcus “in vitro” y conocer los métodos que se emplean en el
laboratorio para el aislamiento, identificación y clasificación de las especies de importancia médica
Materiales:

• Cajas de Agar con cultivos de Staphylococcus de diferentes especies


• Caja con medio de DNA
• Plasma citratado de conejo
• Cajas con medio de Mueller-Hinton
• Sensidiscos de Novobiocina
• Frasco gotero con agua oxigenada
• Laminas portaobjetos y asas

Procedimiento:

A cada uno de los cultivos que recibió el grupo se le deben practicar las siguientes pruebas:

Prueba de la catalasa: Es un enzima producida por los estafilococos y sirve para diferenciarlos de los
estreptococos y los enterococos. En el laboratorio se determina colocando una colonia en presencia de Peroxido de
Hidrógeno (agua oxigenada) y evidenciando la producción de catalasa por la aparición de burbujas como
resultado de la liberación de oxígeno. Esta prueba se puede realizar en lámina o en tubo.
Prueba de la coagulasa: Es una enzima producida por Staphylococcus aureus y sirve para diferenciarlo de las
otras especies. En el laboratorio se determina colocando una porción de la colonia en una gota de plasma citratado
de conejo y se evidencia su presencia por la aparición de aglutinación producida por el factor “clumping” del S.
aureus.
Prueba de DNAsa: Es una enzima producida por S. aureus y sirve para diferenciarlo de otras especies. Para
determinarla se realiza una siembra en línea recta sobre el medio que contiene DNA. Después del crecimiento a las
24 horas se evidencia la despolimerización del DNA producida por la enzima, mediante la aparición de una zona
transparente o clara (sin DNA) alrededor de la colonia al agregar HCl 1N, o la aparición de un color violeta al
agregar azul de toluidina al 0.1%.
Susceptibilidad a la novobiocina: Este antibiótico se utiliza para clasificar los Staphylococcus saprophyticus los
cuales son resistentes a novobiocina “in vitro”. Para su determinación se coloca un sensidisco de novobiocina
sobre una siembra de la colonia en agar. A las 24 horas se determina la susceptibilidad midiendo el halo de
inhibición alrededor del sensidisco (> de 16 mm es sensible, < de 16 mm es resistente).

Tipo de hemólisis: Beta hemólisis

Coloración de Gram a partir de absceso Coloración de Gram a partir del cultivo


Después de realizar las pruebas anteriores y de observar el tipo de hemólisis, el color de las colonias en agar
sangre y los resultados de los cultivos a las 24 horas de incubación, incluya todos los datos en el siguiente cuadro:

Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 3 Cultivo 4 Cultivo 5

Color de
la colonia

Tipo de
hemólisis

Coagulasa

Catalasa

Dnasa

Susceptibilidad
a la
Novobiocina

Genero
Especie

Género Streptococcus

Los Streptococcus son cocos grampositivos, catalasa negativa, que se agrupan en pares o cadenas de largo
variable. En el hombre su hábitat normal es el aparato respiratorio superior, la piel y las mucosas de las personas
sanas.
Según el tipo de hemólisis los Streptococcus se clasifican en:

Beta hemolíticos: los que producen destrucción total de los glóbulos rojos en el medio de Agar sangre, que se
evidencia por la formación de una zona de decoloración total del Agar alrededor de la colonia.
Alfa hemolíticos: producen destrucción parcial de los glóbulos rojos, evidenciada por una zona con una
coloración verde-marrón alrededor de la colonia
Gama hemolíticos o no hemolíticos: cuando no hay destrucción de los glóbulos rojos y por lo tanto no hay
hemólisis

Según la clasificación antigénica de Lancefield los Streptococcus se dividen en grupos nombrados en orden
alfabético y los principales son: Grupos A, B, C, D, E, F y G

Streptococcus pyogenes (Estreptococo Beta hemolítico del grupo A)

Tipo de hemólisis: Beta hemólisis Coloración de Gram a partir del cultivo

La prueba confirmatoria para su clasificación es la Inhibición por la bacitracina:


Streptococcus pyogenes es sensible a la bacitracina, mientras que los otros
estreptococos son resistentes.

Prueba de identificación rápida por reacción antígeno-anticuerpo: se puede realizar a partir


de la muestra clínica o a partir de las colonias sospechosas en Agar sangre.

• La profesora realizará esta prueba a manera de demostración.


• Realizar un resumen del fundamento de la prueba y dibujar lo observado.
Streptococcus pneumoniae y Streptococcus viridans

Estas dos especies tienen en común el tipo de hemólisis que producen: Alfa hemólisis

Streptococcus pneumoniae posee una cápsula fácilmente demostrable con tinta china y al Gram se observan
como diplococos grampositivos ligeramente lanceolados.

Streptococcus viridans es habitante normal de la faringe de personas sanas. Al Gram se observa como un coco
grampositivo que se agrupa en cadenas.

Coloración de Gram a partir de esputo Coloración de Gram a partir del cultivo

Tipo de hemólisis: Alpha hemólisis

La prueba confirmatoria para su clasificación es la inhibición por la optoquina: Streptococcus pneumoniae es


sensible a la optoquina mientras que S. viridans es resistente.

ESTUDIO DE LOS COCOS GRAMNEGATIVOS


PRACTICA # 9

Introducción:

Existen dos géneros de cocos gramnegativos de interés en patología médica: Neisseria y Branhamella, los cuales
son morfológicamente semejantes en cuanto a su agrupación, diplococos en forma de granos de café enfrentados
por su cara plana. El género Neisseria incluye varias especies comensales de la faringe como son , N sicca,
Neisseria mucosa y N, flavescens y dos especies patógenas de gran importancia, N. meningitidis llamada
meningococo y N. gonorrhoeae llamada gonococo. Por su parte el genero Brahnamella posee una única especie,
B. catarrhalis que se ha asociado con infección de las vías respiratorias. El genero Acinetobacter se presenta
como cocobacilos gramnegativos aerobios estrictos pero a diferencia de los cocos gramnegativos son aerobios
estrictos, oxidasa negativa y crecen muy bien en medios usuales.

Género Neisseria

• Las Neisserias son Catalasa positiva y Oxidasa positiva


• Son muy sensibles a los agentes químicos, al frío, al calor y a la desecación, por lo que la mayor parte de
estos gérmenes mueren en pocos días en los medios de cultivo.
• Las especies patógenas se pueden diferenciar de las no patógenas mediante pruebas bioquímicas de
fermentación de azúcares. Las especies no patógenas crecen en la mayoría de los medios, mientras que las
patógenas son difíciles de cultivar y son indistinguibles morfológicamente de las no patógenas

Infecciones relacionadas:

• Con Neisseria meningitidis: meningitis, septicemia, neumonía y artritis.


• Con Neisseria gonorrhoeae: uretritis, cervicitis, salpingitis, proctitis, septicemia, artritis, conjuntivitis,
faringitis y Enfermedad Pélvica Inflamatoria.
• Neisseria sicca, Neisseria mucosa y Branhamella catarrhalis son microorganismos comensales del tracto
respiratorio, pero en pacientes inmunosuprimidos o ancianos, frecuentemente han sido asociados con otitis
media, sinusitis, infecciones broncopulmonares y bacteremia.

Procedimiento:

Realice prueba de Oxidasa y de Catalasa a partir del cultivo de acuerdo con las indicaciones de la profesora.

Catalasa Oxidasa

Diplococcos gramnegativos intra y extra celulares Diplococos gramnegativos


A partir de secreción uretral Coloración de Gram a partir del cultivo
ESTUDIO DE LAS MICOBACTERIAS Y BACILOS RAMIFICADOS
COLORACION DE ZIELH-NEELSEN

PRACTICA # 10

Introducción:

Las micobacterias son microorganismos aeróbicos grampositivos pero difíciles de teñir, resisten la decoloración
con alcohol-ácido después de ser teñidas inicialmente con fucsina fenicada; por esta particular característica se les
llama "BACILOS ACIDO-ALCOHOL RESISTENTES". La habilidad del bacilo para resistir la decoloración,
radica en la alta concentración de lípidos de su pared celular, que puede representar hasta el 60% del peso total del
microorganismo y el método mas conocido para su tinción es la coloración de Ziehl-Neelsen. Otros bacilos
grampositivos ramificados como Nocardia y Actinomyces también pueden diferenciarse por esta coloración.

Coloración de Ziehl-Neelsen

1. Dejar secar los frotis al aire y fijarlos pasándolos por la llama. Colocarlos sobre un soporte

2. Cubrir la lámina con fucsina fenicada. Sujetar con una pinza metálica, una mota de algodón mojada con
alcohol industrial, encenderla y pasar por debajo del portaobjetos hasta que emanen vapores sin dejar hervir.
Repetir el flameado dos veces hasta dejar actuar el colorante 10 minutos

3. Lavar suavemente con agua hasta arrastrar todo el colorante.

4. Cubrir los portaobjetos con alcohol-ácido, hasta quitar por completo la fucsina y lavar con agua.
5. Cubrir las láminas con azul de metileno y dejar en reposo por 1 minuto, lavar con agua, escurrir y dejar secar.

6. Observar las laminas coloreadas y los cultivos y dibujar lo observado

Mycobacterium tuberculosis

El diagnóstico de laboratorio esta dado por la visualización del bacilo al examen directo con coloración de Ziehl-
Neelsen, cultivo del microorganismo en medio de Lowenstein-Jensen y diferenciación del Mycobacterium
tuberculosis de otros Mycobacterium.

Los medios de cultivo para este germen constan en general de un medio base al cual se le ha adicionado yema de
huevo como nutriente y verde de malaquita como inhibidor de crecimiento de las bacterias contaminantes, el mas
utilizado se llama Lowenstein-Jensen. Dependiendo de la especie las colonias aparecen después de 3 a 6 semanas
de incubación (son de crecimiento lento), son de aspecto rugoso, levantadas y de color crema. Las especies
atípicas a veces producen pigmentos.

Como la tuberculosis es una enfermedad principalmente asociada al pulmón, las secreciones pulmonares, esputo y
lavados bronquiales, serán las muestras más importantes para hallar los bacilos ácido-alcohol resistentes. Otras
muestras donde se pueden encontrar micobacterias son: jugo gástrico, orina, biopsia de órganos afectados y
cualquier líquido orgánico.

Mycobacterium leprae

El bacilo presenta una morfología delgada, con bacilos agrupados en paquetes formando "Globias" características.
La variación en las características microscópicas del bacilo en su morfología o agrupación (bacilos enteros o
fragmentados, agrupados o individuales), es un parámetro determinante para el seguimiento del tratamiento
antibiótico.

El diagnóstico de laboratorio está basado en el hallazgo del bacilo en muestras como moco nasal, linfa de oreja,
rodilla, codo y material extraído del leproma el cual se colorea con la tinción de Ziehl-Neelsen.
M. leprae no se ha podido cultivar en medios artificiales de laboratorio y solo se multiplica en los cojinetes
plantares del ratón y en armadillos de 9 bandas.
Cultivo positivo para M. tuberculosis Bacilos Acido-alcohol-resistentes en
en medio Lowenstein –Jensen muestra de esputo

Géneros Nocardia y Actinomyces

El género Nocardia pertenece a la familia Nocardiaceae. Las nocardias, en las muestras clínicas o en los cultivos
primarios, se caracterizan por ser bacilos ramificados de 0,5 a 1 µm de diámetro, con sub-ramificaciones en
ángulo recto. Son irregularmente grampositivas y parcialmente ácido-alcohol resistentes, inmóviles, no
capsuladas, no esporuladas y productoras de catalasa.

Nocardia asteroides es la especie que causa infección humana con mayor frecuencia, Entre las formas localizadas
se destaca la infección pulmonar, siendo menos importantes las formas cutáneas primarias. La colonización de las
vías aéreas o, excepcionalmente la piel, se ha observado hasta en un 10% de personas asintomáticas.

Las bacterias del género Actinomyces son bacilos grampositivos ramificados, no esporulados, anaerobios
facultativos pero que pueden crecer aeróbicamente en cultivos primarios y son responsables de la enfermedad
conocida como actinomicosis y usualmente causas por A. israelí.
La actinomicosis se caracteriza por la formación de abscesos, fibrosis tisular y presencia de tractos fistulosos en
distintas localizaciones anatómicas, afectando con mayor frecuencia las regiones cervicofacial, torácica y
abdominopélvica . El diagnóstico de actinomicosis se hace más certeramente aislando especies de Actinomyces en
medios de cultivo para anaerobios, pero la demostración de gránulos actinomicóticos (“gránulos de azufre”) en
exudados y cortes histológicos sugiere fuertemente el diagnóstico.
ESTUDIO DE LAS ENTEROBACTERIAS

PRACTICA # 11

Introducción:

Existen varias familias y géneros de interés médico pertenecientes al grupo de los bacilos gramnegativos. Entre
ellos esta la familia Enterobacteriaceae a la cual pertenecen varios géneros que son comensales del intestino del
hombre y otros animales de sangre caliente y que producen infecciones en otros sitios del organismo. Algunos
géneros son patógenos intestinales como Salmonella, Shigella y Yersinia. Todos son bacilos aerobios o
anaerobios facultativos que fermentan la glucosa, son oxidasa negativos y crecen en medios usuales o en medios
selectivos para gérmenes gramnegativos.

El hecho de que la mayoría de estas bacterias sean capaces de reproducirse tan rápidamente indica que poseen una
maquinaria metabólica muy activa. Esta actividad metabólica puede ser medida en el laboratorio por diferentes
métodos permitiendo la caracterización de las especies; algunas de estas pruebas metabólicas son técnicas rápidas
y evalúan la presencia de una enzima preformada, otras pruebas sirven para medir reacciones enzimáticas
especificas o características bioquímicas determinantes del género o de la especie de estos microorganismos de
mucha importancia medica.

Para diferenciar las enterobacterias se utilizan numerosas pruebas que utilizan la capacidad de las bacterias de
utilizar diferentes sustratos y existe una variedad de medios de cultivo diferenciales para la identificación de las
especies que pueden manejarse de diferente manera:
• Baterías para pruebas bioquímicas conformadas por una serie de medios de cultivo diferenciales repartidos en
tubo y cuyos resultados pueden ser analizados en tablas especializadas para la identificación correspondiente.
• Baterías de estos mismos medios repartidos en paneles comerciales miniaturizados que dan excelentes
posibilidades de identificación a un costo mayor que los anteriores, pero a un nivel muy alto de seguridad;
entre ellos cabe mencionar las marcas API, Cristal, Enterotubo, Micro-ID. Estos paneles pueden ser
procesados manualmente o analizados en equipos que efectúan la inoculación, la incubación y la lectura de
manera automatizada, con la evaluación por parte de una computadora que realiza la identificación
correspondiente.

Objetivos:

• Determinar las propiedades fermentativas de las enterobacterias en medios diferenciales que contienen
diferentes azúcares, con la ayuda de un indicador de pH
• Determinar la habilidad o inhabilidad de una especie para hidrolizar una fuente de carbono agregada al medio
de cultivo, como el Citrato
• Determinar la producción de la enzima Ureasa por algunos géneros bacterianos
• Determinar la producción de Sulfuro de hidrógeno, Indol y otras sustancias en medios diferenciales
• Determinar la motilidad de algunos gérmenes en medios semisólidos preparados para este fin.
• Conocer la forma de utilizar las tablas de clasificación de las bacterias de acuerdo a sus reacciones
bioquímicas.

Materiales:

• Cajas de Petri con cultivo puro de bacilos gramnegativos de diferentes géneros y especies, en Agar Tripticasa
de soya
• Cajas con medios selectivos como Agar EMB, Agar MacConkey, Agar Hektoen , Agar XLD y Agar Sangre
• Tubos con Agar TSI, Agar Citrato de Simons, Agar Urea y Medio de SIM.
• Asas rectas y redondas
• Reactivo de Kovac`s
Procedimiento:

Cada grupo realizará una siembra de cada uno de los cultivos recibidos de la siguiente manera:

Caja # 1
• Tocar una colonia con el asa redonda y realizar una siembra por agotamiento en medio Agar EMB
• Tocar otra colonia con el asa recta y realizar una siembra en profundidad y superficie en TSI, Citrato de
Simons, Agar urea y medio SIM (todos con la misma colonia y según las indicaciones de la profesora)

Caja # 2
• Tocar una colonia con el asa redonda y realizar una siembra por agotamiento en medio Agar MacConkey
• Tocar otra colonia con el asa recta y realizar una siembra en profundidad y superficie en TSI, Citrato de
Simons, Agar urea y medio SIM (todos con la misma colonia y según las indicaciones de la profesora)

Caja # 3
• Tocar una colonia con el asa redonda y realizar una siembra por agotamiento en medio Agar Hektoen
• Tocar otra colonia con el asa recta y realizar una siembra en profundidad y superficie en TSI, Citrato de
Simons, Agar urea y medio SIM (todos con la misma colonia y según las indicaciones de la profesora)

Caja # 4
• Tocar una colonia con el asa redonda y realizar una siembra por agotamiento en medio Agar XLD
• Tocar otra colonia con el asa recta y realizar una siembra en profundidad y superficie en TSI, Citrato de
Simons, Agar urea y medio SIM (todos con la misma colonia y según las indicaciones de la profesora)

Caja # 5
• Tocar una colonia con el asa redonda y realizar una siembra por agotamiento en medio Agar Sangre
• Tocar otra colonia con el asa recta y realizar una siembra en profundidad y superficie en TSI, Citrato de
Simons, Agar urea y medio SIM (todos con la misma colonia y según las indicaciones de la profesora)

Marcar todas las cajas convenientemente e incubar a 37 oC durante 18-24 horas

Aspecto de las colonias en los diferentes medios selectivos y diferenciales

AGAR EMB:
- Colonias moradas con brillo metálico: bacilos gramnegativos fermentadores de lactosa (lactosa +) como
Escherichia coli
- Colonias moradas sin brillo metálico: bacilos gramnegativos fermentadores de lactosa (lactosa +) diferentes de
Escherichia coli

AGAR MACCONKEY
- Colonias moradas o rosadas: bacilos gramnegativos fermentadores de lactosa (lactosa +)
- Colonias transparentes o incoloras: bacilos gramnegativos no fermentadores de lactosa (lactosa -)
- Colonias mucoides: bacilos gramnegativos poseedores de cápsula
AGAR HEKTOEN
- Colonias grandes amarillas o naranja: bacilos gramnegativos fermentadores de lactosa (lactosa +)
- Colonias verdes, verde-azul o azules: bacilos gramnegativos no fermentadores de lactosa (lactosa -)
- Colonias con centro negro: bacilos gramnegativos no fermentadores de lactosa y productores de H 2S como
Salmonella y Proteus

AGAR XLD (XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO)


- Colonias grandes amarillas: bacilos gramnegativos fermentadores de lactosa (lactosa +)
- Colonias rojas: bacilos gramnegativos no fermentadores de lactosa (lactosa -)
- Colonias con centro negro: bacilos gramnegativos no fermentadores de lactosa y productores de H 2S como
Salmonella y Proteus

AGAR TRIPLE AZUCAR HIERRO (TSI)


- Aparición de color amarillo en el fondo del tubo: fermentación de glucosa (glucosa+)
- Aparición de color amarillo en la parte superior del agar : fermentación de lactosa (lactosa +). Estas reacciones
se manifiestan por un cambio de color debido a que el indicador Rojo de Fenol vira a amarillo cuando el pH se
acidifica por la fermentación de los azúcares.
- Aparición de color negro: producción de H2S que se manifiesta cuando el tiosulfato es reducido por algunos
gérmenes a ácido sulfhídrico el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro de color negro.
- Ruptura del agar o formación de burbujas : producción de gas

AGAR CITRATO DE SIMMONS


- Aparición de color azul: utilización del carbón contenido en el citrato de sodio para el crecimiento de las
bacterias (citrato +). Al crecer las bacterias alcalinizan el medio haciendo virar el indicador Azul de
Bromotimol de color verde a azul
- No hay crecimiento ni cambio de color: la bacteria no utiliza el citrato como fuente de carbono (citrato -)

AGAR UREA
- Aparición de color fucsia: la bacteria produce ureasa (ureasa+) que desdobla la urea produciendo amoniaco,
el cual alcaliniza el medio y vira el indicador Rojo de Fenol de incoloro a color fucsia
- No hay cambio de color: no hay producción de ureasa (ureasa -)

MEDIO DE SIM
- Enturbamiento del medio: hay motilidad de la bacteria (motilidad+)
- El medio continua transparente: la bacteria es inmóvil (motilidad -)
- Aparición de color negro: hay producción de H2S que se manifiesta cuando el tiosulfato es reducido por
algunos gérmenes a ácido sulfhídrico el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro de color
negro.
- Aparición de un anillo púrpura o rojizo al agregar unas gotas del reactivo de Kovac`s sobre la superficie del
medio: formación de Indol que se manifiesta cuando el triptófano es utilizado por los gérmenes que tienen la
enzima triptofanasa, capaz de desdoblar el triptófano y liberar indol, que se evidencia mediante el reactivo de
Kovac´s (Paradimetil-Amino-Benzaldehido)
RESULTADOS

TSI Citrato de Agar SIM


Simmons Urea
Glucosa Lactosa H2S Gas H2S Motilidad Indol

Colonia # 1

Colonia # 2

Colonia # 3

Colonia # 4

Colonia # 5

Dibujar el
aspecto del
crecimiento
en los
medios
diferenciales
(tubo)
REACCIONES BIOQUIMICAS DE LAS PRINCIPALES ENTEROBACTERIAS

MICROORGANISMO AGAR TSI CITRATO UREA SIM

GLUCOSA LACTOSA GAS H2S MOTILIDAD H2S INDOL


Escherichia coli + + + - - - + - +
Klebsiellapneumoniae + + + - + + - - -
Klebsiella oxytoca + + + - + + - - +
Shigella sonnnei + - - - - - - - -
Salmonella typhi + - - + - - + + -
Serratia marcescens + - - - + - + - -
Proteus mirabilis + - + + + + + + -
Proteus vulgaris + - + + + + + + +
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS O ANTIBIOGRAMA

PRACTICA # 12

Introducción:

Los antibióticos fueron definidos en el pasado como sustancias


químicas producidas por un microorganismo que inhibe el
desarrollo de otros microorganismos. Hoy un agente
antimicrobiano puede ser producido en forma natural como un
subproducto metabólico del microorganismo o sintéticamente.

Para determinar en el laboratorio la susceptibilidad de un


microorganismo a los antibióticos se utilizan varias técnicas y
la mas sencilla es la denominada prueba de antibiograma por
difusión en agar o por sensidiscos (discos de papel de filtro
impregnados con cantidades conocidas de antibióticos) los
cuales se disponen sobre un medio de agar en el que se ha
realizado un cultivo puro de la bacteria del paciente en siembra
masiva. A medida que el antibiótico difunde en el agar, se
produce un gradiente de concentración, que después de una
incubación apropiada, permite determinar la actividad del
antibiótico mediante la medida de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor del disco, llamada
halo de inhibición.
La técnica incluye la utilización de Agar Mueller-Hinton, un inoculo estándar y sensidiscos comerciales de
potencia conocida. Las zonas de inhibición se describen como "Sensibles o Resistentes” según el diámetro de
inhibición en mm, con respecto a unos estándares conocidos. Este método estandarizado se conoce como
"METODO DE KIRBY -BAUER" y es útil para cultivos puros y gérmenes de crecimiento rápido.

Existen comercialmente métodos miniaturizados manuales y automatizados que dan oportunidad de probar un
mayor número de antibióticos y obtener resultados en menor tiempo, lo cual es de gran ayuda para la terapia
dirigida a los pacientes.

Materiales:

• Tubo con 4 mL de caldo Mueller Hinton


• Caja de Petri con Agar Mueller-Hinton con una profundidad de 4 mm
• Sensidiscos con antimicrobianos de acuerdo a las concentraciones estipuladas por el método
• Cultivo puro del germen que se va a probar
• Tubo estandarizado a la escala 0.5 de Mac Farland

Preparación del inoculo:

• Con un asa tocar la superficie de 4 ó 5 colonias aisladas y transferirlas al tubo que contiene el caldo
• Incubar a 37oC por 2 horas
• Comparar la turbidez con el tubo 0.5 de la escala turbidimétrica de Mac Farland
Inoculación de la caja de Mueller-Hinton:

• Con un aplicador estéril obtener la muestra del caldo, impregnándolo bien


• Exprimir el exceso de caldo contra la pared del tubo y sembrar en el Mueller-Hinton en cuatro planos
diferentes, rotando la caja 90 grados cada vez
• Tapar la caja y dejarla en reposo con el agar hacia abajo por 5 minutos para permitir la absorción del exceso
de líquido.

Aplicación de los sensidiscos:

• Con la ayuda de la profesora seleccionar los sensidiscos que se van a utilizar de acuerdo a la bacteria aislada
• Con una pinza (o con un dispensador de sensidiscos) obtener cuidadosamente los discos de los tubos y
disponerlos sobre el Agar, presionando suavemente con la pinza para conseguir completo contacto entre el
antibiótico y el Agar.
• Los discos deben quedar a 15 mm de la orilla de la caja y a 24 mm de otro sensidisco
• Incubar las cajas a 35 oC por 18 a 24 horas
• Realizar las lecturas de las zonas de inhibición con la ayuda de una regla milimetrada, midiendo el diámetro del
halo.
• Comparar con las tablas suministradas el tamaño del halo de cada antibiótico para determinar sí es sensible o
resistente.

Evaluación de la práctica

Germen # 1 ________________________________________________________________________

Antibióticos Diámetro del halo en mm Sensible o resistente


1.
2.
3.
4.
5.
6.

Germen # 2 ________________________________________________________________________

Antibióticos Diámetro del halo en mm Sensible o resistente


1.
2.
3.
4.
5.
6.
Germen # 3 ________________________________________________________________________

Antibióticos Diámetro del halo en mm Sensible o resistente


1.
2.
3.
4.
5.
6.

Germen # 4 ________________________________________________________________________

Antibióticos Diámetro del halo en mm Sensible o resistente


1.
2.
3.
4.
5.
6.
ESTUDIO DE LOS BACILOS GRAMNEGATIVOS DIFERENTES A LAS ENTEROBACTERIAS

PRACTICA # 13

Introducción:

Existen muchas bacterias de interés médico pertenecientes al grupo de los bacilos gramnegativos, algunas de ellas
son aerobias o anerobias facultativas no exigentes, fermentan la glucosa, son oxidasa negativa y que crecen en
medios comunes y pertenecen a la familia Enterobacteriacea; esta familia comprende muchos géneros y especies
de enorme relevancia medica. Otros bacilos gramnegativos son aerobios estrictos y no fermentan la glucosa y
pertenecen a la familia Pseudomonadace, o son oxidasa positivos como los pertenecientes al genero Vibrio.
Existen otras bacterias gramnegativas aisladas en la clínica que son de crecimiento exigente y de notable
trascendencia clínica como son los géneros Haemophilus, Bordetella, Campylobacter, Helicobacter, Brucella y
Legionella; estas bacterias no se aíslan en medios de cultivo usuales y además son de crecimiento lento por lo cual
si no se piensa en ellas y no se usan las técnicas adecuadas para su cultivo, no pueden detectarse.

Género Haemophilus

Son pequeños bacilos gramnegativos pleomórficos que requieren para su crecimiento medios con factores
especiales, algunas especies requieren del factor X, otros del factor V, o ambos; estos factores están presentes en
los medios que contienen eritrocitos lisados como el Agar chocolate. Los Haemophilus también crecen bien
alrededor de colonias de Staphylococcus que les proporcionan factor V para su crecimiento; esta prueba recibe el
nombre de "satelitismo". La especie que se aísla con mayor frecuencia en muestras clínicas es Haemophilus
influenzae que causa diversas patologías como: meningitis, faringitis (en niños y ancianos), otitis, epiglotitis,
sinusitis y neumonía.

Coloración de Gram Cultivo en Agar Chocolate Prueba de Satelitismo


a partir de muestra clínica
Familia Pseudomonadacea:

Son bacilos gramnegativos , no fermetadores de la glucosa y a diferencia de las Enterobacterias su hábitat es


fundamentalmente extraintestinal (el suelo y el agua). Los miembros de esta familia son estrictamente aerobios,
utilizan la glucosa oxidativamente y son oxidasa positivos

Presentan características específicas en su cultivo dando como producto final de su metabolismo pigmento azul
verdoso o amarillo verdoso según la especie. Las colonias despiden olor aromático (a frutas o a jabón).

Se encuentran infectando úlceras, quemaduras, heridas, conjuntivas, oído, producen también afecciones
pulmonares y producen numerosas infecciones nosocomiales que desarrollan resistencia a muchos antibioticos.

Las especies más importantes son:

• Pseudomonas aeruginosa.
• Pseudomonas fluorescens.
• Burkholderia cepacia

Procedimiento:

• Observar el crecimiento de este microorganismo en Agar nutritivo y Agar sangre


• Observar el pigmento que presentan y su olor característico
• Realizar prueba de oxidasa
Bacilos gramnegativos curvos Vibrio, Campylobacter, Helicobacter.

Las especies de estos géneros agrupan bacilos gramnegativos distribuidos ampliamente en la naturaleza. Los
vibriones se encuentran en aguas marinas y superficiales; las campilobacterias habitan en numerosas especies
animales y pueden producir gastroenteritis presentando una morfología característica en muestras de heces; el
genero Helicobacter se ha asociado con gastritis crónica y también posee una morfología característica
ESTUDIO DE LA FLORA NORMAL Y MICROORGANISMOS OPORTUNISTAS

PRACTICA # 14

Introducción:

En el organismo humano existe una población microbiana considerada como flora normal, que solamente
desarrolla su poder agresor sí las condiciones de este huésped se ven alterados por situaciones adversas intrínsecas
o extrínsecas, favoreciendo el desarrollo de procesos infecciosos y la aparición de síntomas clínicos. La mayoría
de estas especies son beneficiosas y cuando desaparecen o disminuyen, el huésped puede infectarse con patógenos
nuevos o por el crecimiento excesivo de microorganismos presentes normalmente en pequeño número.

La mayoría de los microbios de la flora normal, “indígena” o residente corresponden a bacterias, pero también se
encuentran hongos, virus y parásitos en individuos sanos; se adquieren rápidamente durante y después del
nacimiento y cambian de forma continua a lo largo de la vida. El tipo de microorganismos presentes en un
determinado momento puede reflejar la edad, el estado nutricional o el ambiente en el que vive un individuo, por lo
tanto es difícil definir cuales son los microorganismos que pertenecen a la flora normal y cuales no, lo que si se
sabe es que determinados órganos o tejidos tienen una flora normal y otros son estériles. Los que tienen flora
normal se localizan especialmente en las partes del organismo expuestas al ambiente como la piel, la nariz, la
boca, la faringe y los tractos urogenital y gastrointestinal, mientras que los órganos internos y los tejidos son
estériles.
Objetivo:

Estudiar la flora de diferentes sitios del cuerpo y determinar los tipos de microorganismos presentes.

Materiales:

• Cajas de Petri con Agar sangre


• Bajalenguas y Escobillones
• Asas redondas
• Jarras con vela para atmósfera de CO2
• Reactivos para coloración de Gram.
• Láminas

Procedimiento:

• Con un escobillon estéril , tomar muestras de


- Mucosa faringea
- Mucosa nasal
- Conducto auditivo externo
- Superficie dental o encías
- Piel del pliegue del brazo
- Piel del ombligo
• Realizar una siembra por agotamiento en cajas con Agar sangre
• Incubar en una jarra con vela para generar una atmósfera con tensión de CO 2 entre 4 y 7% durante 24-48
horas a 37oC.
• Después de la incubación observar la morfología y color de las colonias desarrolladas
• Realizar un frotis y coloración de Gram de cada tipo de colonias presentes en los diferentes cultivos
• Identificar y clasificar los gérmenes de acuerdo al tamaño y color de las colonia, morfología de las bacterias,
la producción de hemólisis y su reacción frente al Gram, guiándose por la siguiente tabla:

Género Género Género Familia Difteroides


Staphylococcu Streptococcus Neisseria Enterobacteriace
s ae
Tamaño de grandes o pequeñas pequeñas grandes o pequeñas
las medianas cremosas secas y rugosas medianas secas
colonias cremosas cremosas o
mucosas

Color de
las blanco o crema blanco o grisáceo grisáceo grisáceo blanco
colonias

Hemólisis variable de variable de


acuerdo a las acuerdo a las presente o presente o ausente ausente
especies especies ausente

Agrupación solos, en pares solos, en pares en letras


o en racimos o en cadenas en pares ninguna en especial chinas o
empalizada
Morfología bacilos
y reacción cocos cocos cocos bacilos grampositivos
frente al grampositivos grampositivos gramnegativos gramnegativos con gránulos
Gram metacromático
s
Flora en Genero o familia Observaciones

Mucosa
faringea

Mucosa nasal

Conducto
auditivo externo

Superficie dental
o
encías

Piel del pliegue


del brazo

Piel del
ombligo