U N I V E R S I D A D C E N T R A L D E L E C UA D O R

FA C U LTA D D E C I E N C I A S Q U I M I C A
L A B O RAT O R I O D E B I O T E C N O LO G I A
Nomb re : Gab ri e l a Pi t a
Fe c h a : 1 8 - 0 4 - 2 0 1 1
Consulta 3

Dispersin de la Luz
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en
suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es
absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por
una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un
decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la
longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de
dispersin.
Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para
monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y
poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan
informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular).
Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz
debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual
transmitida.
Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de
diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular,
tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco.
Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao
celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy
diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando
los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para
estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de
microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una
"curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma
es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de
microorganismos totales o con UFC.

Absorbancia

en

funcin

del

Peso

Seco

Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la
inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10
veces en el valor de la absorbancia (1/W 0).
Medida de la Biomasa
La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es
utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad
metablica, o de un constituyente metablico o qumico.
Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables,
pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud.
Peso hmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es
pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin.
Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra.
La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido
retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas
muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta
entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular. Para
corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda
retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se
utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden
ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes
bacterianas.

Peso seco: El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas

que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un
volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Esta tcnica es til
para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de
los miligramos representan el peso de un gran nmero de bacterias.
La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula
pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin
la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente
si el ambiente tiene una humedad relativa alta.
Determinacin de cidos nucleicos: Es una tcnica que permite
determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se
determina la cantidad existente de un determinado cido nucleico
(generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la
poblacin.
Determinacin de nitrgeno: Es una tcnica que permite determinar
indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Existen distintas
tcnicas para determinar la cantidad de nitrgeno que contiene una
muestra con relacin al compuesto que se quiera determinar. Puede
analizarse el nitrgeno no proteico mediante el NO 2-, NO3-, NH4+, el nitrgeno
proteico mediante absorcin en UV, Reaccin de Biuret, Reaccin de Lowry,
o el nitrgeno total mediante la Digestin de Kjeldahl.
Incorporacin de precursores radiactivos: Es una tcnica que permite
determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. En esta
tcnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que
puede ser incorporado a la clula, y luego se determina la cantidad de
marca incorporada por toda la poblacin.
Curva del Crecimiento Bacteriano
La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representacin grfica de
la determinacin peridica del nmero de clulas viables por mililitro que
existen en un lquido inoculado con clulas microbianas provenientes de un
cultivo que ha crecido previamente hasta la saturacin.
Dicha curva se divide en seis fases, como se representa en la figura, mismas
que se simbolizan con letras de la A a la F. A continuacin tambin se
muestra un cuadro con las caractersticas principales de cada fase y se
desarrollan las fases ms relevantes.

Parte de la Curva Fase

Tasa de Crecimiento.

Cero

Rezago

Aceleracin

Creciente

Exponencial

Constante

De retraso

Decreciente

Estacionaria mxima

Cero

Declinacin

Negativa (muerte)

A : Fase de Rezago.
Este periodo consiste en la adaptacin de las clulas microbianas a su
nuevo ambiente. En esta fase, las clulas microbianas se envuentran
empobrecidas en cuanto a metabolitos y enzimas, esto debido a las
condiciones desfavorables que representaba el cultivo previo.
Por lo anterior, en este lapso de tiempo se forman las enzimas y los
metabolitos intermedios hasta alcanzar las concentraciones necesarias para
reiniciar el crecimiento.
Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo
previo y las condiciones actuales resulten tan diferentes que las clulas
sean genticamente incapaces de sobrevivir, por lo que slo unas cuantas
mutantes podrn subsistir, y obviamente se requerir ms tiempo para que
stas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de clulas.
C : Fase Exponencial.
Como el nombre lo indica, en esta fase las clulas se encuentran en un
estado de crecimiento sostenido.
Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante, pero ste material
es en s cataltico y la masa aumenta de manera exponencial. Lo anterior
continua hasta que uno o ms nutrimentos se agoten, o hasta que se
acumule tal cantidad de metabolitos txicos que se inhiba el crecimiento. El
nutrimento limitante para los organismos aerobios suele ser el oxgeno :
cuando la concentracin bacteriana es de aproximadamente 1 x 107 / ml es
necesario incrementar el ingreso de oxgeno mediante agitacin o
burbujeo ; pero cuando la concentracin alcanza 4 o 5 x 109 bacterias por

ml, la tasa de difusin de oxgeno no puede satisfacer las demandas aun en

un medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye progresivamente.
Durante el crecimiento exponencial, la tasa de crecimiento de las clulas
(medida en gramos de biomasa producida por hora), cuando el crecimiento
no es limitado por los nutrimentos, se puede obtener multiplicando la
constante de la tasa de crecimiento (k) por la concentracin de biomasa. La
constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cul las clulas producen
ms clulas, y el valor que esta toma se interpreta como los gramos de
biomasa producidos por cada gramo de biomasa preexistente creados en
una hora.
El crecimiento se denomina exponencial porque la biomasa se incrementa
exponencialmente con respecto al tiempo. De lo anterior se deriva que, si
graficamos el logaritmo de la concentracin de la biomasa (o celular) en
funcin del tiempo, como ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos
una lnea recta como representacin de esta fase.
Esta fase puede prolongarse indefinidamente si las clulas se transfieren
repetidamente a un medio nuevo (fresco) de composicin idntica al
anterior, lo cual se logra de manera automtica mediante dos aparatos : el
quimiostato y el turbidostato.
E : Fase Estacionaria Mxima.
Como se explic en la descripcin de la fase anterior, ante el agotamiento
de nutrimentos en el medio o la acumulacin de metabolitos txicos el
crecimiento cesa por completo despus de un periodo de decrecimiento en
la tasa de crecimiento, lo cual corresponde a la fase D o de retraso.
No obstante, por lo general en esta fase se puede observar recambio
celular, lo cual se debe a que, aunque existe una prdida lenta de clulas
por muerte, dicha prdida se compensa exactamente por la formacin de
nuevas clulas a travs de crecimiento y divisn. As, la cifra de clulas
viables se mantiene constante, aunque en realidad en el conteo aumente
poco a poco el nmero de clulas, si se cuentan tambin las muertas.
Para comprender lo anterior debemos considerar que, para una clula
microbiana, muerte significa la prdida irreversible de la capacidad para
reproducirse (crecer y dividirse), lo cul se comprueba cuando una clula es
incapaz de producir una colonia en cualquier medio. De lo anterior se deriva
que designar a una clula microbiana como muerta no implica su
destruccin fsica.
La duracin de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de
las condiciones del medio.
F : Fase de Declinacin.
Esta fase, tambin conocida como fase de muerte, representa el
decremento de clulas debido al aumento progresivo de la tasa de
mortalidad, misma que tarde o temprano alcanza un valor sostenido.

Por lo general, una vez que la mayora de las clulas ha muerto, la tasa de
mortalidad disminuye bruscamente, por lo que un nmero pequeo de
sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o aos. Dicha
persistencia puede deberse a que las clulas consiguen crecer gracias a los
nutrimientos liberados por las clulas que mueren y se lisan, observndose
recambio celular.

Bibliografa
www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/Semina
Brooks, et. al., Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 16a
ed., Manual Moderno, Mxico, 1999.