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Esquema A5 de norma IRAM

29111

Octubre de 2004

Calidad ambiental - Calidad del agua


Mtodo de ensayo de inhibicin del crecimiento de algas verdes unicelulares de
agua dulce.
Environmental quality. Water quality.
Fresh water unicellular green algal growth inhibition test.
PREFACIO
El Instituto Argentino de Normalizacin (IRAM) es una asociacin civil sin fines de lucro cuyas
finalidades especficas, en su carcter de Organismo Argentino de Normalizacin, son establecer
normas tcnicas, sin limitaciones en los mbitos que abarquen, adems de propender al
conocimiento y la aplicacin de la normalizacin como base de la calidad, promoviendo las
actividades de certificacin de productos y de sistemas de la calidad en las empresas para brindar
seguridad al consumidor.
IRAM es el representante de la Argentina en la International Organization for Standardization (ISO),
en la Comisin Panamericana de Normas Tcnicas (COPANT) y en la Asociacin MERCOSUR de
Normalizacin (AMN).
Esta norma IRAM es el fruto del consenso tcnico entre los diversos sectores involucrados, los que
a travs de sus representantes han intervenido en los Organismos de Estudio de Normas
correspondientes.
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN
Esta norma IRAM describe un mtodo para la determinacin de los efectos txicos de sustancias
qumicas sobre el crecimiento de algas planctnicas de agua dulce aplicables a:
a) sustancias solubles en agua, que no se degradan o se eliminan significativamente del sistema
en el transcurso del mismo;
b) efluentes industriales o urbanos, tratados o no, despus de decantacin, filtracin o
centrifugacin, si es necesario;
c) aguas superficiales o aguas subterrneas;
d) lixiviados o agua de poro.
NOTA 1: Con modificaciones a este mtodo de ensayo se pueden evaluar, tal como est descripto en ISO 14442 y en
IRAM 29012-16, los efectos inhibitorios de sustancias poco solubles orgnicas e inorgnicas, compuestos voltiles y
metales pesados.
NOTA 2: En el anexo A se incluye, a nivel informativo, una metodologa de evaluacin rpida de aguas residuales.

2 DOCUMENTOS NORMATIVOS PARA CONSULTA


Los documentos normativos siguientes contienen disposiciones, las cuales, mediante su cita en el
texto, se transforman en disposiciones vlidas para la presente norma IRAM. Las ediciones
indicadas son las vigentes en el momento de su publicacin. Todo documento es susceptible de ser

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revisado y las partes que realicen acuerdos basados en esta norma se deben esforzar para buscar
la posibilidad de aplicar sus ediciones ms recientes.
Los organismos internacionales de normalizacin y el IRAM mantienen registros actualizados de
sus normas.
IRAM 29012-16:2003 Calidad ambiental. Calidad del agua. Muestreo. Parte 16: Gua para el
bioensayo de muestras.
ISO 14442:1999 Water quality. Guidelines for algal growth inhibition test with poorly soluble
materials, volatile compounds, metals and waste water.
3 DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
Para los fines de esta norma se aplican las definiciones siguientes:
3.1 densidad celular. Nmero de clulas por unidad de volumen.
3.2 crecimiento. Incremento de la densidad celular.
3.3 tasa de crecimiento. ndice de crecimiento de la densidad celular en funcin del tiempo como
se indica en el apartado 9.2.2.
3.4 lote de ensayo. Agua de dilucin, medio nutritivo y muestra de ensayo en la cual se incuban
las clulas algales.
3.5 lote control. Agua de dilucin, medio nutritivo y clulas algales sin muestra de ensayo.
3.6 concentracin efectiva 50 (CE5o). Concentracin de la muestra de ensayo que da lugar a una
disminucin del 50 % del crecimiento o de la tasa de crecimiento con respecto a los lotes control en
un tiempo dado.
NOTA : Con el objetivo de distinguir estas concentraciones efectivas, determinadas a partir de variables mtricas, de
aquellas mencionadas anteriormente, algunos autores sugieren conveniente denominarlas como CI x (Concentracin
Inhibitoria correspondiente a un x % de efecto).

3.7 concentracin de efecto no observado (NOEC). Concentracin ms elevada de la muestra


de ensayo para la cual no hay ninguna disminucin estadsticamente significativa del crecimiento o
de la tasa de crecimiento con respecto a los lotes control.
4 PRINCIPIO
Se cultiva una cepa monoespecfica del alga por varias generaciones en un medio nutritivo que
contiene una serie de diluciones de la muestra de ensayo preparada con un inculo de las clulas
algales en fase exponencial de crecimiento. Las soluciones de ensayose incuban durante un
perodo mnimo de 72 h, durante el cual se mide la densidad celular de cada una de ellas al menos
cada 24 h.
Se mide la inhibicin como la disminucin del crecimiento o de la tasa de crecimiento en relacin
con los cultivos control realizados en condiciones idnticas.
NOTA: Para cierto tipo de muestra se puede observar un aumento del crecimiento de las algas respecto de los
controles. Este tipo de resultado debe mencionarse en el informe de ensayo.

5 MATERIALE
5.1 Organismos de ensayo
2

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Se utiliza como alga planctnica de agua dulce las siguientes:


a) Desmodesmus subspicatus 1 (86.81 SAG)
o
b) Pseudokirchneriella subcapitata Hindak 2 (ATCC 22662, CCAP 278/4 61.81 SAG).
NOTA 1: Estas dos especies son algas verdes planctnicas que pertenecen al orden de las Chlorococcales (Chlorophyta,
Chlorophyceae) y se mantienen generalmente unicelulares en cultivo.

Se pueden obtener las cepas mencionadas en forma de cultivos mono-especficas y no axnicos en


las siguientes colecciones:
86.81 SAG:

Collecton of Algal Cultures


Inst. Plant Physiology
University of Gttingen
Nikolaisberger Weg 18
D-3400 Gottingen
Germany, F.R.

ATCC2 22662:

American Type Culture Collection


12301 Parklane Drive
Rockville
Maryland 20852
USA

CCAP 278/4:
Coleccin de Cultivos de Microalgas de los Laboratorios de Ficologa
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires (UBA)
Ciudad Autnoma de Buenos Aires
Ciudad Universitaria-Pabelln2
CP: 1428
Argentina
Culture Centre of Algae and Protozoa
Freshwater Biological Association
The Ferry House
Ambleside
Cumbria LA22 OLP, UK
UK
Algothque du Laboratoire de Cryptogamie
Museum d'histoire naturelle
12. rue Buffon
F- 75005 Paris, France
NOTA: Se pueden mantener los cultivos de reservaen el medio descripto en los apartados 5.3 y 7.4. Sin embargo, es
necesario un frecuente subcultivo (una vez por semana) para prevenir problemas en el crecimiento. Se puede mantener el
cultivo de reserva por periodos extensos en medios ricos en algas tal como aquellos recomendados por la coleccin de
cultivos.

Esta especie se denominaba anteriormente Scenedesmus subspicatus Chodat


Esta especie se denominaba anteriormente Selenestrum capricornutum Prinz y tambin se lleg a denominar
Raphidocelis subcapitata Korsikov.
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1
2

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Alternativamente, se pueden almacenar las algas por varios meses en perlas de alginatos, sin
perder su viabilidad 1. Cuando se necesite utilizar las algas para efectuar ensayos de toxicidad las
mismas pueden liberarse fcilmente de las perlas de algas.
5.2 Agua
El agua utilizada para la preparacin del medio nutritivo y para las diluciones de las muestras de
ensayo debe ser deionizada o de calidad equivalente (menor a 10S/cm). Se debe tomar especial
cuidado en evitar cualquier contaminacin del agua por sustancias inorgnicas u orgnicas durante
el tratamiento y el almacenamiento de la misma. No debe utilizarse ningn material de cobre.
5.3 Medio nutritivo
Se prepararan cuatro soluciones madre en agua, de acuerdo con las composiciones dadas en la
tabla 1.
Estas soluciones deben ser diluidas (ver 7.1 y 7.4) para obtener las concentraciones finales en
nutrientes de las soluciones de ensayo. No obstante, los macronutrientes, en cambio, se pueden
agregar directamente al agua.
Todos los reactivos utilizados deben ser de calidad analtica.
Se esterilizan las soluciones madre por filtracin en membrana (dimetro promedio de poro de 0,2
m) o en autoclave (120 C, 15 min). Se conservan las soluciones en oscuridad a 4 C.
La solucin madre 4 (NaHCO3) no debe esterilizarse en autoclave, solamente se esterilizar por
filtracin en membran.
Tabla 1
Compuesto

Concentracin en
la solucin madre

Solucin madre 1: macronutrientes


NH4CI

1,5 g.l-1

15 mg.l-1

MgCI2.6H2O

1,2 g.l-1

12 mg.l-1

CaCI2.2H2O

1,8 g.l-1

18 mg.l-1

MgSO4.7H2O

1,5 g.l-1

15 mg.l-1

KH2PO4
Solucin madre 2: Fe-EDTA
FeCI3.6H2O

0,16 g.l-1

1,6 mg.l-1

80 mg.l-1

80 g.l-1

Na2EDTA.2H2O

100 mg.l-1

100 g.l-1

Solucin madre 3: elementos traza


H3BO3 (a)

185 mg.l-1

185 g.l-1

MnCI2.4H2O

415 mg.l-1

415 g.l-1

3 mg.l-1

3 g.l-1

CoCI2.6H2O

1,5 mg.l-1

1,5 g.l-1

CuCI2.2H2O

0,01 mg.l-1

0,01 g.l-1

7 mg.l-1

7 g.l-1

ZnCI2

Na2MoO4.2H2O
Solucin madre 4: NaHCO3
NaHCO3 I
(a)

Concentracin final en
la solucin de ensayo

50

Se puede disolver el H3BO3 adicionando 0,1 mol/L de NaOH.

g.l-1

50

mg.l-1

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6 INSTRUMENTAL Y MATERIAL NECESARIO


Todo el material en contacto con el medio de ensayo debe ser de vidrio o de material qumicamente
inerte.
Material corriente de laboratorio, y en particular el siguiente:
6.1 Cmara o cuarto de temperatura controlada, provista de una luz fluorescente blanca que
garantice una iluminacin uniforme continua para satisfacer los requisitos de iluminacin
especificados en el apartado 6.6.
6.2 Instrumento para medir la densidad celular de algas, preferentemente un contador de
partculas o un microscopio con cmara de recuento. El estado de crecimiento de los cultivos de
algas puede tambin determinarse por un mtodo indirecto utilizando por ejemplo un
espectrofotmetro o un fluormetro (por ejemplo: fluorescencia in vitro [2] o magnificacin por DCMU3
de fluorescencia in vivo [3] ) de sensibilidad suficiente si se establece una correlacin aceptable con
la densidad celular. El instrumento utilizado debe medir con precisin densidades celulares tan
bajas como 10 4 clulas por mililitro y diferenciar el crecimiento algal de los efectos perturbadores,
como por ejemplo la presencia de material particulado y el color de la muestra. Los
espectrofotmetros deben ser lo suficientemente sensibles para medir 10 4 clulas/mL y se los
puede utilizar con un camino ptico de hasta 10 cm. Sin embargo, esta tcnica es particularmente
sensible a interferencias que provengan de material en suspensin y sustancias coloreadas a bajas
densidades celulares.
6.3 Frascos de cultivo, por ejemplo Erlenmeyers de 250 ml con tapones permeables al aire.
6.4 Equipo para filtracin en membrana, utilizando filtros de dimetro medio de poro de 0,2 m.
6.5 Autoclave
6.6 Aparato para medir pH
7 PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
7.1 Preparacin del concentrado de nutrientes
Se prepara el concentrado de nutrientes como se indica a continuacin (para 1 000 mI):
Se aade a 100 mI de solucin madre 1 (ver 5.3);

10 mI de solucin madre 2 (ver 5.3);


10 mI de solucin madre 3 (ver 5.3);
10 mI de solucin madre 4 (ver 5.3).

Se completa a 1 000 mI con agua deionizada y esterilizada.


Se prepara el concentrado de nutrientes inmediatamente antes de cada ensayo. Antes de su
utilizacin, este concentrado debe alcanzar el estado de equilibrio permaneciendo al aire durante
una noche o mediante burbujeo de aire esterilizado por filtracin durante 30 min. Despus de
obtener el estado de equilibrio, se ajusta el pH a 8,3 0,2, si es necesario utilizando soluciones
estriles diluidas de cido clorhdrico o de hidrxido sodio (1 mol/L).
7.2 Preparacin del inculo
3

DCMU: Diclorofenildimetil UREA (CAS N 330-54-1)


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El inculo de algas para el ensayo debe tomarse de un precultivo en fase exponencial de


crecimiento. Se prepara el precultivo 3 das antes del inicio del ensayo como se describe a
continuacin.
Se mezcla una parte en volumen de concentrado nutritivo (ver 7.1) con ocho partes de agua. Se
aaden clulas provenientes del cultivo algal madre; despus de haber completado hasta 10
volmenes con agua, la densidad celular debe ser del orden de 10 4 clulas por mililitro.
Se mantiene el precultivo en las mismas condiciones que las del ensayo (ver 7.6) durante 3 das,
despus de los cuales debe estar en fase exponencial de crecimiento y la densidad celular debe ser
suficiente para que el precultivo sea utilizado como inculo para el ensayo.
Se mide la densidad celular del precultivo inmediatamente antes del ensayo (ver 7.7) a fin de
calcular el volumen de inculo necesario.
7.3 Eleccin de las concentraciones de ensayo
Las concentraciones de la muestra a ensayar, deben seguir normalmente una progresin
geomtrica, por ejemplo 10; 3,2; 1,0; 0,32; ...; 0,01 mg/l.
Si es posible, las concentraciones deben elegirse para obtener varios niveles del efecto (4 a 5) que
permitan una inhibicin del crecimiento comprendida entre el 10 % y el 90 %.
NOTA: El intervalo de concentraciones aceptable se determina realizando un ensayo preliminar de "bsqueda del
intervalo", cubriendo varios rdenes de magnitud de diferencia entre las concentraciones de ensayo. No es necesario
hacer rplicas de cada concentracin en el ensayo preliminar.

7.4 Preparacin de las soluciones madre de la sustancia de ensayo


Se prepara una solucin madre de la sustancia a ensayar en agua en la que la concentracin de
sustancia de ensayo sea al menos igual a dos veces la concentracin de ensayo ms elevada. Se
diluye esta solucin madre para obtener una serie de soluciones madre correspondiente al intervalo
de concentraciones de ensayo.
Normalmente el ensayo debe efectuarse sin ajuste de pH. Sin embargo, ciertas sustancias pueden
tener un efecto txico debido a una acidez o a una alcalinidad demasiado fuerte. Con objeto de
determinar la toxicidad de una sustancia no debida al pH, se ajusta el pH de la primera solucin
madre (antes de la dilucin en serie) a 7,0 utilizando soluciones diluidas de cido clorhdrico o de
hidrxido sdico (1 mol/L).
NOTA: El ajuste del pH no debe provocar ninguna reaccin qumica con la sustancia a ensayar (precipitacin,
complejacin, por ejemplo) y no debe modificar significativamente la concentracin de la sustancia a ensayar.

7.5 Preparacin de las soluciones de ensayo


Se preparan las soluciones de ensayo mezclando los volmenes apropiados de las soluciones
madre de la sustancia a ensayar, de agua, de concentrado de nutrientes (ver apartado 7.1) e
inculo (ver apartado 7.2) en los recipientes de ensayo.
El volumen total debe ser el mismo en todos los recipientes.
La cantidad de concentrado de nutrientes (ver 7.1) aadida a cada recipiente debe ser igual a una
dcima parte del volumen total.
La cantidad de inculo (ver 7.2) aadida a cada recipiente debe ser suficiente para que la densidad
celular inicial en las soluciones de ensayo sea 10 4 clulas por ml.
En varios recipientes, al menos 6, se aade slo agua, el concentrado de nutrientes y el inculo, sin
sustancia de ensayo. Estos recipientes sirven de control.
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Se preparan tres rplicas de cada concentracin de sustancia a ensayar y seis rplicas de una
muestra control.
Se mide el pH de una muestra de las soluciones de ensayo a cada concentracin y de una muestra
control.
7.6 Incubacin
Se deja incubar los recipientes de ensayo tapados, permeables al aire, a 23 C 2 C bajo luz
blanca continua. La intensidad luminosa en el nivel medio de las soluciones de ensayo debe estar
comprendida en el intervalo de 60 E/M2/s a 120 pE/M2/s (35x10 18 fotones/m2/s a 70x10 8
fotones/m2/s) cuando se mide en el intervalo de longitud de onda de 400 nm a 700 nm utilizando un
detector apropiado.
NOTA: Es importante tener en cuenta que el mtodo de medida, en particular el tipo de detector (colector), influye en el
valor medido. Los detectores esfricos (que responden a la luz incidente y reflejada de todos los ngulos por debajo y por
encima del plano de medicin) son preferibles a los receptores unidireccionales (que responden a la luz de todos los
ngulos por encima del plano de medicin) y dan resultados ms elevados para una fuente luminosa no puntual del tipo
descripto a continuacin.

La intensidad especificada anteriormente puede obtenerse mediante lmparas fluorescentes de


4 W a 7,30 W del tipo luz blanca universal (natural) [por ejemplo un patrn de color 2 especificado
(de una temperatura de color de 4 300 K) conforme a la Norma CEI 81] a una distancia de
aproximadamente 0,35 m de los medios de cultivo de algas.
Para los instrumentos de medida de la luz calibrados en lux, se acepta para el ensayo un intervalo
equivalente de 6 000 lux a 10 000 lux.
Se mantienen las clulas algales en suspensin removindolas, agitndolas y o airendolas por
burbujeo con objeto de mejorar los intercambios de gas y de reducir la variacin del pH en las
soluciones de ensayo.
7.7 Mediciones
Se mide la densidad celular en cada recipiente (incluidos los recipientes control) al menos cada
24 h.
Estas mediciones deben efectuarse en volmenes pequeos (5 mI por ejemplo), tomados con una
pipeta de cada solucin de ensayo, sin volverse a introducir en los recipientes.
El ensayo debe durar como mnimo un perodo de 72 h.
Se mide el pH de una muestra de las soluciones de ensayo a cada concentracin (y del control) al
final del ensayo.
8 CRITERIOS DE VALIDEZ
Considerar el ensayo no vlido si no se alcanzan las condiciones siguientes:
a) la densidad celular de las soluciones control debe haberse multiplicado por un factor superior a
16 en 72 h. Este aumento corresponde a una tasa de crecimiento (ver apartado 9.2) de 0,9 d-1
En condiciones normales de ensayo, pueden obtenerse tasas de crecimiento de 1,5 d -1 a 1,9 d1
.
b) el pH de las soluciones control no debe haber variado ms de 1,5 unidades durante el ensayo.
NOTA: Las variaciones de pH durante el ensayo pueden influir significativamente en los resultados y, consecuentemente,
se fija un lmite de 1,5 unidades. Sin embargo, las variaciones de pH deben ser lo ms pequeas que se puedan obtener,
por ejemplo, manteniendo una agitacin continua durante el ensayo.

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9 EXPRESIN DE LOS RESULTADOS


9.1 Curvas de crecimiento
Se presenta en forma de tabla las medidas de la densidad celular o de otros parmetros en
correlacin con la densidad celular en funcin de la concentracin de la sustancia de ensayo y del
tiempo.
Se traza una curva de crecimiento por cada una de las concentraciones de ensayo y de las
soluciones control que represente el logaritmo de la densidad celular media en funcin del tiempo.
9.2 Clculo del porcentaje de inhibicin
La evaluacin de la inhibicin del crecimiento en el transcurso del ensayo se basa en uno de los
dos parmetros siguientes:
9.2.1

rea bajo la curva de crecimiento (biomasa integral)

Se calcula el rea, A, situada bajo la doble curva de crecimiento lineal, para cada cultivo de ensayo,
mediante la ecuacin:

N1 N 0
N N 2 2N 0
N N n 2N 0
t1 1
(t 2 t1 ) ... n 1
(t n t n 1 )
2
2
2

siendo:
t1

el tiempo transcurrido desde el inicio del ensayo y la realizacin de la primera medida;

tn

el tiempo al que se realiza la n-esima medida tras el comienzo del ensayo;

No

la densidad celular nominal inicial;

N1

la densidad celular medida a tiempo t1;

Nn

la densidad celular medida a tiempo tn .

Se calcula los valores medios de A para cada concentracin de ensayo y cada solucin control. A
partir de estos valores, se calcula el porcentaje de inhibicin para cada concentracin de ensayo,
mediante la ecuacin:

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I Ai

AC Ai
100
AC

siendo:
IAi

el porcentaje de inhibicin (rea) para la concentracin de ensayo i;

Ai

el rea media para la concentracin de ensayo i;

Ac

el rea media para el cultivo control.

9.2.2 Tasa de crecimiento. Se calcula la tasa de crecimiento, , para cada cultivo de ensayo,
mediante la ecuacin:

ln N n ln N 0
tn

siendo:
tn

el tiempo transcurrido entre el comienzo del ensayo y la ltima medida;

No

la densidad celular nominal inicial;

Nn

la densidad celular final medida.

Alternativamente, se determina la tasa de crecimiento a partir de la pendiente de la recta de


regresin obtenida que represente el logaritmo de la concentracin celular en funcin del tiempo.
Se calculan los valores medios de para cada concentracin de ensayo y las soluciones control. A
partir de estos valores, se calcula el porcentaje de inhibicin para cada concentracin de ensayo,
mediante Ia ecuacin:

I i

C i
C

100

siendo:
li

el porcentaje de inhibicin (tasa de crecimiento) para la concentracin de ensayo i;

la tasa de crecimiento media para la concentracin de ensayo i;

la tasa de crecimiento media de los cultivos control.

9.3 Determinacin de la CE50


Se presenta en forma de tabla los valores de IAi o lui en funcin de las concentraciones de ensayo
correspondientes y se representa estos valores en un papel semilogartmico o logartmico probit
(concentraciones de ensayo en la escala logartmica). Se traza una recta aproximada y se lee en la
grfica la CE50 (concentracin de ensayo correspondiente a una inhibicin del 50 %).
Alternativamente, se calcula el valor de CE50 por un anlisis de regresin, por ejemplo el mtodo de
probit.
9.4 Determinacin de NOEC
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La NOEC es la mxima concentracin ensayado en la cual no se observa ninguna inhibicin


significativa de crecimiento en relacin con los cultivos control. Se determina este valor por un
mtodo estadstico apropiado (por ejemplo, anlisis de la variancia y ensayo de Dunnett) utilizando
cada rplica individual de A o de .
10 PRESENTACIN DE LOS RESULTADOS
Se anotan los valores de CE50 basados en el rea de la curva de crecimiento (biomasa) CEb50 y los
relativos a la tasa de crecimiento CEIt50, Se anotan los valores de NOEC, respectivamente, NOEC b
para los valores relativos al rea de la curva de crecimiento, o NOEC t para los valores relativos a la
tasa de crecimiento. Se indica tambin claramente la duracin del ensayo, por ejemplo CEbso (de 0 h
a 72 h). Se indica los valores de CE50 y NOEC para dos cifras significativas, normalmente en
miligramos por litro.
11 INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
Los valores de NOEC y CE50 son datos toxicolgicos obtenidos a partir de un ensayo de laboratorio
realizado en condiciones definidas. Dan una indicacin de los riesgos potenciales, pero no pueden
utilizarse directamente para prevenir los efectos en un medio natural.
Al interpretar los valores de CE50 y NOEC se tendr en cuenta la magnitud de las curvas de
crecimiento. Ciertas caractersticas de estas curvas (por ejemplo, inicio tardo del crecimiento; buen
crecimiento inicial, pero no sostenido a continuacin) pueden ayudar a la interpretacin del
comportamiento de la sustancia txica.
12 REPRODUCIBILlDAD
Un ensayo interlaboratorio efectuado por 16 laboratorios, basado en el ensayo descrito en esta
norma ha dado los resultados indicados en la tabla 2, para el dicromato de potasio (K 2Cr2O7).

Media

Intervalo

Desviacin
Estndar

CIr50 (O a 72h)

0,84

0,60 a 1,03

0,13

CIb50 (O a 72h)

0,53

0,20 a 0,75

0,20

Punto final

Tabla 2
13 INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe hacer referencia a esta norma IRAM y debe incluir en particular la
informacin siguiente:
a) Sustancia de ensayo: datos de identificacin qumica.
b)

Organismos de ensayo: especie, origen, numero de referencia de la cepa, mtodo de cultivo.

c) Datos relativos al ensayo:


-

fecha de comienzo y duracin;

concentraciones ensayadas;

10

composicin del medio;

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equipo de cultivo y mtodo de incubacin;

intensidad y calidad de la luz;

temperatura;

pH de las soluciones de ensayo al comienzo y al final del ensayo;

mtodo utilizado para medir la densidad celular.

d) Resultados:

e)

densidad celular para cada recipiente en cada tiempo de medicin;

densidad celular media para cada concentracin de ensayo (y cada solucin control) a cada
tiempo de medicin;

curvas de crecimiento (Iogaritmo de la densidad celular en funcin del tiempo);

relacin concentracin/efecto (porcentaje de inhibicin del crecimiento en funcin de la


concentracin) tabulada o en representacin grfica, por ejemplo: porcentaje de inhibicin
en probit en ordenadas frente a la concentracin en escala logartmica en abscisas;

valores de CEI50 y mtodo de determinacin;

valores de NOEC y mtodo de determinacin;

otros efectos observados.

otros efectos relevantes en relacin con el modo operatorio.

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Anexo A

(Informativo)

Evaluacin rpida de la inhibicin del crecimiento de algas en aguas residuales


A.1 General
Se puede aplicar esta norma para ensayar efluentes, aguas residuales y otras muestras acuosas
ambientales. Las siguientes modificaciones se aplican principalmente a requisitos para llevar a cabo
evaluaciones rpidas en diferentes tipos de recipientes de ensayo (por ejemplo: microplacas).
A.2 Muestreo y Conservacin
Se necesita, que las muestras se evalen tan pronto sea posible luego de la recoleccin o
ocasionalmente luego de ser congeladas y descongeladas, filtradas o centrifugadas. Es
conveniente considerar, antes de la planificacin del ensayo de aguas residuales, las
recomendaciones de ISO 14442 e IRAM 29012-16.
A.3 Recipientes de cultivo
Se usan frascos, viales o microplacas con apropiados volmenes de cultivo. Se debe elegir el
material y la geometra de los recipientes de ensayo con el fin de evitar:
a) liberacin de sustancias potencialmente toxicas;
b) absorcin de componentes del medio de ensayo;
c) prdidas por evaporacin de constituyentes importantes de las aguas residuales;
d) inhomogeneidades de la luz entre replicados y tratamientos.
A.4 Elecciones de las concentraciones de ensayo
Se prepara una serie de diluciones del agua de la muestra descripta en A.5. Es conveniente que la
serie de diluciones sigua una progresin geomtrica que abarque el intervalo deseado de
respuesta. Si se usan microplacas o sistemas automatizados, se recomienda un incremento en el
nmero de diluciones ensayadas con el fin de asegurar la conformidad con este requerimiento. Se
puede realizar un ensayo de bsqueda de intervalo para definir las series de diluciones.
Se usa al menos tres rplicas por tratamiento (incluyendo el control) y cinco concentraciones, a
menos que haya suficiente justificacin tcnica para un diseo de ensayo diferente. Se puede
reducir el nmero de replicados por concentracin basada en consideraciones estadsticas,
incrementando el nmero de concentraciones o reduciendo el espaciado de la concentracin.
A.5 Preparacin de los lotes de ensayo
Se preparan las series de lotes de ensayo de una manera que asegure que todos los lotes reciben
las mismas concentraciones de nutrientes adicionadas y de inculo de algas. Se puede lograr esto,
por ejemplo, por medio de adicin a la muestra de agua de soluciones de nutrientes de reserva
(4.3) como es descripto en 6.1 y mezclando la muestra de agua adicionada con volmenes
apropiados de crecimiento de medio y cultivo de inculo. El protocolo permite concentraciones de
ensayo hasta 98% aproximadamente.
A.6 Background control

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Se requieren diluciones de aguas residuales sin algas para determinar las interferencias posibles
para mediciones de densidad algal (A.9), con el fin de permitir correcciones de fondo (de ltimo
momento) o seleccionar un mtodo de medicin conveniente.
No debe haber interferencia en el crecimiento algal en el control de fondo al final del ensayo.
A.7 Sustancia de referencia
Se recomienda el ensayo con una sustancia de referencia (ver Captulo 12)a intervalos regulares
para el aseguramiento de la calidad y verificar la sensibilidad de las algas. Si se realiza el ensayo
de inhibicin del crecimiento con dos mediciones solamente (al comienzo y al final del ensayo), o, si
se usa la densidad celular nominal, solamente una medicin al final del ensayo, se puede conducir
el ensayo de referencia con este procedimiento simplificado.
A.8 Organismos de ensayo
Se usan Desmodesmus subspicatus o Pseudokirchneriella subcapitata (ver 5.1).
A.9 Medicin de la densidad celular algal
Los mtodos de referencia son el recuento electrnico o el recuento microscpico. Sin embargo, se
pueden usar mtodos indirectos tales como turbidimetra, fotometra o fluorimetra cuando son
suficientemente sensitivos y si demuestran ser lo suficientemente bien correlacionados con la
densidad celular. Se recomienda la fluorometra, si la muestra de ensayo es turbia, para mantener la
interferencia provocada por la turbiedad tan bajo como sea posible.
A.10 Duracin de ensayo
La duracin del ensayo debe ser al menos de 48 h, pero puede ser extendida a 72h.
A.11 Frecuencia de mediciones
Generalmente, se recomienda una medicin diaria de la densidad celular algal. Con muestras de
agua, la densidad celular se puede medir solamente al comienzo y al final del ensayo.
Alternativamente, se pude utilizar la densidad celular nominal como densidad celular inicial. En ese
caso, solamennte se requiere una medicin al final del ensayo.
A.12 Medicin del pH
Se puede medir el pH en un recipiente control al final del ensayo. En un ensayo de microplaca, se
puede necesitar un pooling de replicados control para la medicin del pH.
A.13 Clculo del porcentaje de inhibicin
Se recomienda como punto final para este evaluacin rpida la inhibicin de la tasa de crecimiento
(ver 9.2) debido a que esto es bastante independiente de los niveles de biomasa, las condiciones
de crecimiento y la duracin del ensayo.
A.14 Determinacin de CEX y de valores de MID
Se puede determinar los valores de CE X como se describe en el apartado 9.3. Tambin, se puede
determinar el CEX a travs de una interpolacin grfica straight-line. Los valores de CE X se pueden
expresar, como por ejemplo mL/L o porcentaje de aguas residuales en el medio de ensayo
(Fraccin volumen).
Tambin, se pueden expresar los resultados en MID (Mnima Dilucin Inefectiva, ver IRAM 2901216, Anexo A), la cual es la ms baja dilucin con un efecto menor a 5%.
13

Esqu e m a A5 I RA M 2 9111: 2004

A.15 Criterios de validacin


Se aplican, tambin en este anexo, los criterios de validacin enunciados en el Captulo 8. Se debe
cumplir el siguiente criterio adicional (que refiere a A.6).
No debe haber interferencia en el crecimiento algal en el control de fondo al final del ensayo.
A.16 Informe de ensayo
Adems de la informacin requerida en el captulo 13, es conveniente que el informe de ensayo
incluya la naturaleza de la muestra ensayada (aguas residuales, efluente, lixiviado, etc), origen,
etiquetado, mtodo de muestreo, datos de la coleccin, conservacin, duracin de la exposicin,
apariencia pretratamiento (sedimentacin, filtracin, centrifugacin y ajuste de pH).
Se debe informar el punto final y el mtodo de clculo.

Anexo B

(Informativo)
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E sque m a A4 I RA M 29111:2 004

Bibliografa
En el estudio de este esquema se han tenido en cuenta los antecedentes siguientes:
ISO INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ISO 8692:2004 Water quality. Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green
algae
ISO 8692: 1989 Water quality. Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus
subspicatus y Selenastrum capricornutum
Bibliografa de la ISO 8692:2004
[1]

BOZEMAN, J., KOOPMAN, K. and BITTON, G. Toxicity using immobilized algae, Aquatic
Toxicity, 14, 1989, pp. 345-352.

[2]

MAYER, P., CUHEL, R.L. and NYHOLM, N. A simple in vitro fluorescence method for biomass
measurements in algal growth inhibition tests, Water Research, 31, 1997, pp. 2525-2531.

[3] SLOVACECK, R.E. and HANNAN, P.J. In vivo fluorescence determinations of phytoplankton
chlorophyll, Limnology & Oceanography, 22 (5), 1997, pp. 919-925.
[4] IEC 60081, Double-capped fluorescent lamps. Performance specifications.
[5] OECD: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures.
OECD Environmental Health and Safety Publications. Series of Testing and Assessment N 23,
2000, 53 pp.
[6] KOOIJMAN, S.A.L.M., HANSTVEIT, A.O. and OLDERSMA, H. Parametric analysis of population
growth in bioassays, Water Research, 17, 1983, pp. 527-538
[7] NYHOLM, N, SRENSEN, P.S., KUSK, K.O. and Christensen, E.R. Statistical treatment of data
from microbiological toxicity test, Environmental. Tox. Chem., 11, 1992, pp. 157-167
[8] BRAIN, P. and COUSENS, R. An equation to describe dose-response where there is stimulation
of growth at low doses, Weed Research, 29, 1989, pp. 93-96
[9] HANSTVEIT, A. and OLDERSMA, H. Evaluation of the results of the second ISO interlaboratory
study with an algal toxicity test. ISO/TC 147/SC 5/WG 5, N. 43. Prepared for the International
Standards Organization by Nederlands Normalisatie Instituut, Delft, Netherlands, 1981.
[10] HANSTVEIT, A. O. Evaluation of the results of the third ISO-interlaboratory study with an algal
toxicity test. ISO/TC 147/SC 5/WG 5 64. Prepared for the International Standards Organization
by Nederlands Normalisatie Instituut, Delft, Netherlands, 1982.
[11] ISO/TS 20281, Water quality. Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data

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