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DEPARTAMENTO DE QUMICA
LABORATORIO DE BIOQUMICA
NORMA:
VERSIN:
FECHA DE REVISIN:
REVISADO POR:
CAGV
APROBADO POR:
Departamento de Qumica
1. OBJETIVOS
2. INTRODUCCIN
El ADN es un polmero lineal compuesto
de nucletidos unidos a travs de
enlaces fosfodiester. Estos nucletidos
estn formados a su vez de fosfato azcar- base nitrogenada. Segn el tipo
de cido nucleico, el azcar puede ser
desoxirribosa o ribosa (ARN o ADN,
respectivamente) que en posiciones 5 y
3 forman uniones fosfodiester y en
posicin 1 se unen a una base
nitrogenada que otorga identidad al
nucletido.
Las bases nitrogenadas son compuestos
orgnicos heterocclicos, que incluyen
dos o ms tomos de nitrgeno. Son
parte fundamental de los nuclesidos,
nucletidos
y
cidos
nucleicos.
Biolgicamente existen cinco bases nitrogenadas principales, que se clasifican en dos
grupos, bases pricas (derivadas de la estructura de la purina) y bases pirimidnicas
(derivadas de la estructura de la pirimidina). La adenina (A) y la guanina (G) son
pricas, mientras que la timina (T), la citosina (C) y el uracilo (U) son pirimidnicas.
Las cuatro primeras bases se encuentran en el ADN, mientras que en el ARN en lugar
de timina existe el uracilo.
Por comodidad el nombre de los nucletidos hace referencia a cada una de las bases
nitrogenadas que se representan por la letra indicada. Un punto fundamental es que
las bases nitrogenadas son complementarias entre s, es decir, forman parejas de igual
manera que lo haran una llave y su cerradura (donadoras y aceptoras de puentes de
H). La adenina y la timina son complementarias (A=T), al igual que la guanina y la
citosina (GC). Dado que en el ARN no existe timina, la complementariedad se
establece entre adenina y uracilo (A=U). La complementariedad de las bases es la
clave de la estructura del ADN y tiene importantes implicaciones, pues permite
procesos como la replicacin del ADN y la traduccin del ARN en protenas.
El ADN consiste en dos hebras complementarias que se retuercen sobre un eje comn
a manera de -hlices de igual quiralidad. El orden de las bases en la cadena de ADN
tiene un importante significado biolgico: es el elemento fundamental diferenciador de
un ser vivo de otro.
Casi todas las clulas contienen ADN, pero la cantidad presente en algunos tejidos es
muy pequea. Algunos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa
(ADNasa) y el ADN es roto en pequeos pedazos. Una fuente conveniente para aislar el
ADN debe contener una alta cantidad del material y una baja actividad de ADNasa. El
ADN se desnaturaliza fcilmente y en consecuencia debe tenerse mucho cuidado
durante su extraccin.
4. PROCEDIMIENTO
POR GRUPO NECESITARN TRAER 4 FRESAS FRESCAS Y MADURAS (sin partes
blancas o verdes).
ANTES DE EMPEZAR ATIENDA LAS INSTRUCCIONES DEL PROFESOR. EL ASIGNAR
MISIONES PRIORITARIAS A CADA GRUPO.
Conserve las disoluciones con ADN en baos con hielo.
Guarde el ADN en la solucin salina y refrigrelo antes de usarlo.
El cido sulfrico debe ser manipulado con extremo cuidado: use guantes, gafas y
dems elementos de seguridad.
4.1.
EXTRACCIN DE ADN
g) Rote (no mezcle) lentamente (1 vuelta cada 4s) la varilla delgada de vidrio o
madera para tratar de atrapar el ADN precipitado. Una vez lo extraiga, retire el
exceso del lquido acercando su varilla con el ADN suavemente a las paredes del
vidrio del recipiente.
h) Lvelo en la varilla varias veces con un poco de etanol del 80%, evitando que el
ADN se vaya de la varilla y/o se seque (gurdelo y renalo con el resto que
extraer despus).
i)
j)
Rena todo el ADN extrado por todos los grupos de todo el laboratorio (cada
grupo le dar el ADN que no haya presentado problemas en el momento de la
extraccin) y resuspndalo en buffer de resuspensin caliente por 30
minutos (~60C) y despus llvelo a un volumen final de 150 200 mL
en un baln aforado.
4.2.
Prepare 9 tubos de ensayo medianos (~20 mL) como se indica en la tabla 1 (valores
en mL). Ejemplo; Al tubo 1, se le adiciona 0,2 mL de patrn de ADN, 1 ml de cistena
al 0,05 % y 0,8 mL de agua.
Tabla 1. Datos para realizar la cuantificacin de calibracin de ADN
Tubo No.
M1
M2
RNA
ALB
0,2
0,4
0,6
1,0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
1
0,8
0
0
0
0
1
0,6
0
0
0
0
1
0,4
0
0
0
0
1
0
1,0
0
0
0
1
0
0
1,0
0
0
1
0
0
0
1,0
0
1
0
0
0
0
1,0
1
0
Una vez
preparado
cada tubo,
agtelo y
djelo en
bao de
hielo por 5
minutos.
500
750
2,5 2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2.5
2,5 2,2
0 0,3
2,1
0,4
1,9
0,6
1,6
0.9
0,9
1,6
0
2,5
Para c/u de los anteriores tubos realice blancos (tienen todo excepto el ADN patrn,
dicho volumen e se remplaza por tampn de resuspensin). Incbelos a 70C por 20
minutos mnimo y posteriormente enfrelos segn el protocolo de rpido enfriamiento.
5.
TRATAMIENTO DE DESECHOS
Al final del curso el profesor indicar el protocolo respectivo para llevar a cabo el
tratamiento de cada uno de los desechos generados en la presente prctica. Sin
embargo, esto no exonera al estudiante de hacer la respectiva bsqueda bibliogrfica
que deber ser consignada en sus preinformes.
6. CLCULOS Y RESULTADOS
Hay partes que otros grupos realizaron y su grupo no. Deber averiguar los
resultados obtenidos por ellos en tales casos e incluirlos en su informe.
Analice los efectos de cada una de las variables termodinmicas en la estructura de
ADN de acuerdo a las medidas realizadas en el espectrofotmetro UV.
7. PREGUNTAS
Preguntas a resolver en el preinforme
Como siempre, incluya diagrama de flujo sobre los procedimientos a seguir; desde
antes planee cmo se va a organizar con su/s compaero/s. Trate de resolver ANTES
de la prctica las dudas que se le presenten con el profesor. Incluya fichas de
seguridad y de tratamiento de los reactivos empleados.
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
II.
III.
IV.
V.
VI.
8. BIBLIOGRAFA
1. Lehninger. Principios de Bioqumica. 5ta. Edicin. 2006.
2. Lpez E. Guas de laboratorio (Bioqumica para la carrera de qumica). Notas de
clase. Universidad Nacional. 2005.
3. Brody S. A spectrophotometric study of the desoxipentonse nucleic acid. Act. Scan.
Chem. 1953 (502-506).
ANEXOS
ANEXO 1: TABLAS DE RESULTADOS
Vol. ADN o
RNA (mL)
0,0
0,2
0,4
0,6
1,0
M1
1,0
M2
1,0
RNA
1,0
ALB
1,0
Abs
Temperatura
(C)
Tubo
(Con
Etanol)
Temperatura
(C)
25
25
60
60
70
70
85
85
90
90
100
100
Abs
Blanco
Abs
Tubo
Abs
Blanco
Abs
Tubo
Efecto del pH
Tubo
(Sin
Etanol)
pH
Tubo
(Sin
Etanol)
pH
12
12
13
13
Abs
Blanco
Abs
Tubo
Abs
Blanco
Efecto de la Urea
Tubo
(Sin
Etanol)
Urea
(mM)
500
750
1000
1500
2500
4000
Abs
Blanco
Abs
Tubo
CONCENTRACIN
EDTA 0,1 M, NaCl 2M (pH 8).
EDTA 0,1 M, SDS 1% (pH 8).
NaCl 0,20 M, EDTA 10mM (pH 8,5).
~100 mM
50 mM
50 mM
50 mM
~50 mM
~100 mM
0,05 %
98 %
25 mL
80 %
20 mg/50 mL
Abs
Tubo