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UNIVERSIDAD DEL VALLE

DEPARTAMENTO DE QUMICA
LABORATORIO DE BIOQUMICA

NORMA:

VERSIN:

FECHA DE REVISIN:

CIDOS NUCLEICOS: ADN, AISLAMIENTO Y PROPIEDADES


ELABORADO POR:

REVISADO POR:

CAGV

APROBADO POR:
Departamento de Qumica

1. OBJETIVOS

Familiarizar al estudiante con la metodologa bsica para la separacin de cidos


nucleicos del resto de componentes celulares de un tejido.
Determinar experimentalmente algunas de las propiedades caractersticas del ADN.

2. INTRODUCCIN
El ADN es un polmero lineal compuesto
de nucletidos unidos a travs de
enlaces fosfodiester. Estos nucletidos
estn formados a su vez de fosfato azcar- base nitrogenada. Segn el tipo
de cido nucleico, el azcar puede ser
desoxirribosa o ribosa (ARN o ADN,
respectivamente) que en posiciones 5 y
3 forman uniones fosfodiester y en
posicin 1 se unen a una base
nitrogenada que otorga identidad al
nucletido.
Las bases nitrogenadas son compuestos
orgnicos heterocclicos, que incluyen
dos o ms tomos de nitrgeno. Son
parte fundamental de los nuclesidos,
nucletidos
y
cidos
nucleicos.
Biolgicamente existen cinco bases nitrogenadas principales, que se clasifican en dos
grupos, bases pricas (derivadas de la estructura de la purina) y bases pirimidnicas
(derivadas de la estructura de la pirimidina). La adenina (A) y la guanina (G) son
pricas, mientras que la timina (T), la citosina (C) y el uracilo (U) son pirimidnicas.
Las cuatro primeras bases se encuentran en el ADN, mientras que en el ARN en lugar
de timina existe el uracilo.

Por comodidad el nombre de los nucletidos hace referencia a cada una de las bases
nitrogenadas que se representan por la letra indicada. Un punto fundamental es que
las bases nitrogenadas son complementarias entre s, es decir, forman parejas de igual
manera que lo haran una llave y su cerradura (donadoras y aceptoras de puentes de
H). La adenina y la timina son complementarias (A=T), al igual que la guanina y la
citosina (GC). Dado que en el ARN no existe timina, la complementariedad se
establece entre adenina y uracilo (A=U). La complementariedad de las bases es la
clave de la estructura del ADN y tiene importantes implicaciones, pues permite
procesos como la replicacin del ADN y la traduccin del ARN en protenas.
El ADN consiste en dos hebras complementarias que se retuercen sobre un eje comn
a manera de -hlices de igual quiralidad. El orden de las bases en la cadena de ADN
tiene un importante significado biolgico: es el elemento fundamental diferenciador de
un ser vivo de otro.
Casi todas las clulas contienen ADN, pero la cantidad presente en algunos tejidos es
muy pequea. Algunos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa
(ADNasa) y el ADN es roto en pequeos pedazos. Una fuente conveniente para aislar el
ADN debe contener una alta cantidad del material y una baja actividad de ADNasa. El
ADN se desnaturaliza fcilmente y en consecuencia debe tenerse mucho cuidado
durante su extraccin.

3. MATERIAL (a reservar por cada grupo) Y REACTIVOS


Material
Vaso de precipitados de 250 mL (2)
Termmetro (1)
Microesptula (1)
Vidrio reloj (1)
Pipeta volumtrica 5 mL (2)
Pipeta graduada 1 mL (2)
Pipeta graduada 2 mL (2)
Pipeta graduada 5 mL (1)
Varilla de vidrio delgada (2)
Bao mara (2)
Baln aforado 25 mL con tapa (3)
Baln aforado 50 mL con tapa (2)
Tubo de ensayo mediano Pyrex (15)
Gradilla (2)
Cronmetro (1)
Vaso de precipitados de 50 mL (2)
Vaso de precipitados de 100mL (1)
Plancha calentadora con control de temperatura (1)
Termostato (1)
Bureta de 10 mL (2)
Pipeta Pasteur (2)
Jeringa (2)

Frasco lavador (1)


Pinzas para bureta (2)
Gotero (1)
Probeta 100 mL (1)
Pinza para tubo de ensayo (1)
Falcn (1)
Escobilln (1)
Reactivos
NaCl
Etanol
SDS
NaOH
Cistena
cido sulfrico frio
Albmina patrn
HCl concentrado
EDTA (tetrasdico)
Acetato de sodio anhidro
Fosfato de sodio anhidro
Tris-HCl
ARN patrn
ADN patrn

La concentracin y composicin de cada una de las soluciones empleadas en esta


prctica se encuentra descrita en el Anexo 2.

4. PROCEDIMIENTO
POR GRUPO NECESITARN TRAER 4 FRESAS FRESCAS Y MADURAS (sin partes
blancas o verdes).
ANTES DE EMPEZAR ATIENDA LAS INSTRUCCIONES DEL PROFESOR. EL ASIGNAR
MISIONES PRIORITARIAS A CADA GRUPO.
Conserve las disoluciones con ADN en baos con hielo.
Guarde el ADN en la solucin salina y refrigrelo antes de usarlo.
El cido sulfrico debe ser manipulado con extremo cuidado: use guantes, gafas y
dems elementos de seguridad.
4.1.

EXTRACCIN DE ADN

a) Pese 4 gramos de fresas maduras limpias y sin hojas y pngalas en la bolsa


ziplock, cirrela y haga un pur empleando suavemente sus dedos.
b) Posteriormente adicione 5mL de buffer de extraccin 1 y mzclelo en la bolsa
con el macerado de fresas, agite durante cerca de 5 minutos.
c)

Adicione 5mL de buffer de extraccin 2 y agite durante cerca de 10 minutos en


la misma bolsa.

d) En un vaso de 50 mL, filtre con dos capas de tela. Descarte el slido.


e) (Opcional) Distribuya el sobrenadante anterior entre los integrantes del
grupo. c/u har esto en bao de hielo:
f)

Adicione por las paredes del recipiente de su eleccin MUY LENTAMENTE 3


volmenes de Etanol del 80% FRIO. Deje establecer las dos fases sin agitar
durante 3 minutos. En la interface deber aparecer una especie de red filamentosa
(el ADN).

g) Rote (no mezcle) lentamente (1 vuelta cada 4s) la varilla delgada de vidrio o
madera para tratar de atrapar el ADN precipitado. Una vez lo extraiga, retire el
exceso del lquido acercando su varilla con el ADN suavemente a las paredes del
vidrio del recipiente.
h) Lvelo en la varilla varias veces con un poco de etanol del 80%, evitando que el
ADN se vaya de la varilla y/o se seque (gurdelo y renalo con el resto que
extraer despus).
i)

Extraiga ms ADN agitando vigorosamente el resto del sistema bifsico (sin


introducir la varilla). De nuevo espere 5 minutos o hasta que se establezcan dos
fases para extraer ms ADN. Repita lo indicado en f, g y h.

j)

Rena todo el ADN extrado por todos los grupos de todo el laboratorio (cada
grupo le dar el ADN que no haya presentado problemas en el momento de la
extraccin) y resuspndalo en buffer de resuspensin caliente por 30
minutos (~60C) y despus llvelo a un volumen final de 150 200 mL
en un baln aforado.

k) Centrifugue a 4750 rpm por 10 minutos a 4C. Y trabaje con el sobrenadante.


l)

La anterior ser la disolucin madre de ADN de fresa (de esta se realizarn


diluciones, de ser necesario, en las partes que siguen) las cuales se emplearn
en la cuantificacin y la determinacin de las propiedades de esta biomolcula.
Prepare una dilucin 1/5 (50 mL en total).

4.2.

CUANTIFICACIN DE ADN POR COLORIMETRA (474nm- slo un grupo).

Prepare 9 tubos de ensayo medianos (~20 mL) como se indica en la tabla 1 (valores
en mL). Ejemplo; Al tubo 1, se le adiciona 0,2 mL de patrn de ADN, 1 ml de cistena
al 0,05 % y 0,8 mL de agua.
Tabla 1. Datos para realizar la cuantificacin de calibracin de ADN
Tubo No.

M1

M2

RNA

ALB

Patrn de ADN (sin diluir)

0,2

0,4

0,6

1,0

ADN fresa (disolucin madre)

0
0
0
0
1
1

0
0
0
0
1
0,8

0
0
0
0
1
0,6

0
0
0
0
1
0,4

0
0
0
0
1
0

1,0
0
0
0
1
0

0
1,0
0
0
1
0

0
0
1,0
0
1
0

0
0
0
1,0
1
0

ADN fresa diluido 1/5 (opcional)

ARN patrn (sin diluir)


Albumina patrn (sin diluir)
Cistena al 0,05%
Agua

Una vez
preparado
cada tubo,
agtelo y
djelo en
bao de
hielo por 5
minutos.

Vaya por el H2SO4 fro en la nevera y en campana de extraccin, adicione 5,0 mL a


cada tubo de los anteriores dejando verter el lquido por la paredes. Mezcle despus
con una varilla de vidrio del ms concetrado al menos concetrado en ADN. Este es el
tiempo cero. Coloque enseguida el tubo en un bao a 35C y lea la Abs474nm
exactamente 20 minutos despus. Repita el procedimiento para el resto de tubos a
igual intervalo de tiempo.
4.3.

PROPIEDADES DEL ADN

Estas medidas las deber realizar en un espectrofotmetro UV una vez realizado la


parte 4.1. Idealmente, tres grupos empezarn con el efecto de la temperatura y tres
grupos les seguirn con el efecto del pH. LAS CUBETAS EMPLEADAS SON MUY
COSTOSAS TRTELAS CON EXTREMO CUIDADO. (Emplee como blanco el buffer de
resuspensin sin ADN para las medidas de efecto de la temperatura).

A) DETERMINACIN DE DILUCIN APROPIADA (lo hace un slo grupo).


En un tubo de ensayo (PYREX) adicione 2,5 mL de muestra de ADN de fresa sin diluir y
adicione 2,5 mL de buffer de resuspensin. En tres tubos de ensayo adicione segn sea
el caso 2,5 mL de patrones de (ADN ARN Albumina) diluidos 1/5 y adicione 2,5 mL
de buffer de resuspensin. Mezcle y saque espectros entre 340 nm y 190 nm frente al
blanco (buffer de resuspensin). Determine los valores de absorbancia mxima
alrededor de 260nm (la longitud de onda correspondiente ser mx). Si la lectura es
muy baja (Abs.<0,5) realice la medida con la disoluciones de ADN ms concentradas.
Si es muy alta (Abs>2) emplee diluciones adecuadas (haga los clculos) de modo que
logre una lectura de alrededor de 0,7- 1,0. Debern preparar al menos 50 mL de la
dilucin adecuada. Registre el valor de la absorbancia a 280 nm.
B)

EFECTO DEL CALENTAMIENTO Y RPIDO ENFRIAMIENTO.

Separe 6 tubos de ensayo PYREX iguales de los ms grandes y a c/u ponga 4 mL de la


disolucin apropiada hallada en el procedimiento anterior. (Un grupo pondr adems 1
mL de etanol absoluto). Lleve cada tubo por 15 minutos a una de las siguientes
temperaturas: 25C (o T ambiente), 60C, 70C, 85C, 90C y agua hirviendo. Use los
baos mara o los termostatos que cada grupo se encarga de mantener a la
temperatura indicada. Agite para que alcancen el equilibrio trmico rpidamente.
Mantngalos en tal temperatura (registre la temperatura real alcanzada dentro del
tubo). Inmediatamente pase los tubos a bao de agua/mucho hielo/mucha sal,
agitando los tubos para que se enfren rpidamente. Djelos 5 minutos, para que los
tubos alcancen la temperatura ambiente y mida la absorbancia a la longitud de
onda mxima (mx) de absorcin determinada en el punto anterior. Haga un blanco
para esta medida con tampn de resuspensin (y el mismo pero con 1mL de etanol
absoluto para quienes lo hayan usado).
C) EFECTO DEL pH.
En 8 tubos de ensayo tome 2,5 mL de la dilucin adecuada de ADN de fresa (o del
patrn de ADN segn se asigne) establecida en el punto A, adicione 2,5 mL de los
tampones respectivos a pH 1 / 3 / 7/ 9/ 12 y 13. Lea en el espectrofotmetro el valor
de absorbancia a mx (Algunos grupos agregarn a los anteriores 0,5 mL de etanol
absoluto). Dos grupos realizarn los blancos para cada punto de pH (un grupo blancos
sin etanol y el otro con etanol).

D) EFECTO DE LA UREA (a 70C).


Prepare 14 tubos de ensayo de acuerdo a las instrucciones de la siguiente tabla:
Tabla 2. Datos para realizar efecto de la urea
Tubo (Urea en mM)
Patrn de ADN (dilucin
adecuada)
Agua
Urea 8M

500

750

1000 1500 2500 4000

2,5 2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2.5

2,5 2,2
0 0,3

2,1
0,4

1,9
0,6

1,6
0.9

0,9
1,6

0
2,5

Para c/u de los anteriores tubos realice blancos (tienen todo excepto el ADN patrn,
dicho volumen e se remplaza por tampn de resuspensin). Incbelos a 70C por 20
minutos mnimo y posteriormente enfrelos segn el protocolo de rpido enfriamiento.

5.

TRATAMIENTO DE DESECHOS

Al final del curso el profesor indicar el protocolo respectivo para llevar a cabo el
tratamiento de cada uno de los desechos generados en la presente prctica. Sin
embargo, esto no exonera al estudiante de hacer la respectiva bsqueda bibliogrfica
que deber ser consignada en sus preinformes.

6. CLCULOS Y RESULTADOS
Hay partes que otros grupos realizaron y su grupo no. Deber averiguar los
resultados obtenidos por ellos en tales casos e incluirlos en su informe.
Analice los efectos de cada una de las variables termodinmicas en la estructura de
ADN de acuerdo a las medidas realizadas en el espectrofotmetro UV.

Comente adems sobre la selectividad y sensibilidad del mtodo colorimtrico de


cuantificacin de ADN.

Exprese la concentracin de ADN extrado por masa de fresa segn lo encontrado


en el punto 4.2.

7. PREGUNTAS
Preguntas a resolver en el preinforme
Como siempre, incluya diagrama de flujo sobre los procedimientos a seguir; desde
antes planee cmo se va a organizar con su/s compaero/s. Trate de resolver ANTES
de la prctica las dudas que se le presenten con el profesor. Incluya fichas de
seguridad y de tratamiento de los reactivos empleados.

I.

Averige sobre los fundamentos que estn detrs de la separacin selectiva de


ADN del resto de componentes celulares (protenas, lpidos, carbohidratos, etc.)
que vamos a utilizar en sta prctica. Indique la funcin de cada reactivo durante
cada parte el proceso.
Por qu se eligi fresa y no otra fruta para la prctica?
Por qu es importante incluir EDTA en la extraccin de ADN?
Qu es un mutgeno? D un ejemplo explicando cmo interacta con la doble
hlice de ADN.
Cmo se cuantifica ADN mediante la absorcin en el UV. Como interferira la
presencia de protenas en dicho caso.
Qu metodologa moderna se emplea para cuantificar y secuenciar ADN?

II.
III.
IV.
V.
VI.

Preguntas a resolver en el informe


I.

II.
III.

IV.
V.

VI.

Suponga que su ADN presenta un elevado nmero de errores en el


apareamiento de las bases: qu influencia tendra esto sobre, por ejemplo, el
Tm?
Qu informacin se obtiene a partir de la medida Abs a mx / Abs a 280 nm
para la dilucin de trabajo de ADN en el punto 4.3 A ?
De acuerdo al rango de Tm que Ud. determin para el ADN de la fresa y el de
esperma de arenque, Es un ADN rico en C y G? Comprelo con el Tm de otros
ADN (otros vegetales, organismos termfilos o psicrfilos) en la literatura.
Cul es la temperatura inicial de ADN que ms cambio tuvo en la lectura de
absorbancia a mx? Por qu esto fue as?
Si hubiese realizado el experimento del efecto de la temperatura en presencia
de formaldehdo. Cmo sera el resultado de Tm obtenido en tales condiciones
frente al que obtuvo usted en ausencia de formaldehido? Explique.
Cul el pH que signific un mayor valor de Abs a mx? Por qu esto fue as?
Explique.

8. BIBLIOGRAFA
1. Lehninger. Principios de Bioqumica. 5ta. Edicin. 2006.
2. Lpez E. Guas de laboratorio (Bioqumica para la carrera de qumica). Notas de
clase. Universidad Nacional. 2005.
3. Brody S. A spectrophotometric study of the desoxipentonse nucleic acid. Act. Scan.
Chem. 1953 (502-506).

4. Singer, A.; Kuhn, H. Frank-Kamenetskii, M. Meller, A. Detection of urea-induced


internal denaturation of dsADN using solid-state nanopores. J Phys Condens
Matter, 2010, 22(45).

ANEXOS
ANEXO 1: TABLAS DE RESULTADOS

Cuantificacin de ADN por colorimetra


Tubo

Vol. ADN o
RNA (mL)

0,0

0,2

0,4

0,6

1,0

M1

1,0

M2

1,0

RNA

1,0

ALB

1,0

Abs

Efecto del Calentamiento y el Rpido Enfriamiento


Tubo
(Sin
Etanol)

Temperatura
(C)

Tubo
(Con
Etanol)

Temperatura
(C)

25

25

60

60

70

70

85

85

90

90

100

100

Abs
Blanco

Abs
Tubo

Abs
Blanco

Abs
Tubo

Efecto del pH
Tubo
(Sin
Etanol)

pH

Tubo
(Sin
Etanol)

pH

12

12

13

13

Abs
Blanco

Abs
Tubo

Abs
Blanco

Efecto de la Urea
Tubo
(Sin
Etanol)

Urea
(mM)

500

750

1000

1500

2500

4000

Abs
Blanco

Abs
Tubo

ANEXO 2: SOLUCIONES DE TRABAJO


SOLUCIN O REACTIVO
Buffer de extraccin1
Buffer de extraccin 2
Buffer de resuspensin
Buffer pH 1 (HCl en agua)
Buffer pH 3 (acetato)
Buffer pH 7 (fosfato)
Buffer pH 9 (tris HCl)
Buffer pH 12 (NaOH en agua)
Buffer pH >13 (NaOH en agua)
Cistena recin preparada.
cido sulfrico (frio)
Etanol absoluto
Etanol (frio)
Albumina patrn

CONCENTRACIN
EDTA 0,1 M, NaCl 2M (pH 8).
EDTA 0,1 M, SDS 1% (pH 8).
NaCl 0,20 M, EDTA 10mM (pH 8,5).
~100 mM
50 mM
50 mM
50 mM
~50 mM
~100 mM
0,05 %
98 %
25 mL
80 %
20 mg/50 mL

Abs
Tubo

Patrn de DNA de Arenque: 80 mg en 200 mL de buffer de resuspensin. El patrn


anterior sin diluir se usar para la parte 4.2. El patrn anterior diluido 1/5 en buffer de
resuspensin (volumen total de la dilucin 250mL) se usar para la parte 4.3. Esta
dilucin la preparar un grupo y ser usada por los dems.
Patrn de RNA: 20 mg en 50 mL de buffer de resuspensin. A partir de esta prepare
una dilucin 1/5 en buffer de resuspensin (25mL).
Albmina de huevo: 10 mg en 25 mL de buffer de resuspensin. A partir de esta
prepare un dilucin 1/5 en buffer de resuspensin (25mL).

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