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REVIVIENDO UNA ENZIMA

En 1950 los cientficos descubrieron que el AND mantena un cdigo que permita
que las protenas se sintetizaran. Sin embargo, como una cadena de aminocidos se
dobla en una protena completamente funcional, con su estructura tridimensional,
sigue siendo un misterio. Debe existir un mecanismo que asegure el correcto
plegamiento de la protena. Pero de dnde vino esa informacin? En 1957,
Christian Anfinsen public la primera evidencia de que la informacin necesaria
para el correcto plegamiento de la protena se encuentra dentro de la misma
protena.
TRASFONDO
Las protenas estn hechas de una combinacin de 20 aminocidos que se doblan
en estructuras complejas. La cadena de aminocido desdoblado (revelado,
desplegado) se llama estructura primaria. Para tener una estructura biolgica, la
protena debe doblar en una segunda y tercera estructura. Estas estructuras se
mantienen juntas a travs de interacciones qumicas entre las cadenas laterales de
los aminocidos, incluyendo enlaces de hidrogeno, interacciones hidrofbicas y, a
veces, los enlaces covalentes. El cmo se forman estas grandes estructuras ha sido
un misterio. Se dobla correctamente la protena a medida que se sintetiza o
necesita de la accin de otras protenas para plegarse correctamente? Puede la
protena doblarse correctamente por s sola de manera espontnea?
En la dcada de 1950, el bioqumico Anfinsen estaba interesado en el tema del
correcto doblamiento de las protenas. Especficamente, investigaba sobre la
formacin de los puentes de disulfuro, los cuales son los enlaces covalentes entre
las cadenas lateras cistena, que se desempean como uno de las mayores
adherentes para mantener juntas las estructuras que secretan protenas. l crea
que le protena, por s sola, tena toda la informacin necesaria para el correcto
doblamiento de la misma. As, propuso la Hiptesis de la termodinmica, la cual
seala que la estructura biolgicamente activa de la protena es tambin la ms
estable termodinmicamente dentro de una condicin in vivo. En otras palabras, si
la condicin intracelular pudiera ser imitada dentro de un tubo de ensayo, entonces
la protena podra naturalmente doblarse dentro de su conformacin activa.
Anfinsen comenz su investigacin en una enzima secretada, ribonucleasa
pancretica bovina, y estudi la habilidad de sta para plegarse correctamente
fuera de la clula.

EL EXPERIMENTO
Las protenas realizan una gran variedad de funciones en la clula.
Independientemente de su funcin, una protena necesita plegarse correctamente
para llevar a cabo su funcin biolgica. Para estudiar el doblamiento de protenas lo
mejor es estudiar una encima cuya actividad biolgica pueda ser fcilmente
monitoreada in vitro. Anfinsen eligi una pequea protena secretada: enzima
ribonucleasa, en la cual l pudo monitorear su correcto plegamiento ensayando su

capacidad para catalizar la escisin de ARN. La Ribonucleasa, es una protena


secretada que se activa a travs de la oxidacin y en condiciones in vitro. La
estructura terciaria de la ribonuclease activa se mantiene unida bajo cuatro puentes
de disulfuro. Aadiendo un agente reductor que reduce el enlace de disulfuro de
dos cadenas laterales de cistena en dos grupos libres de sulfhidrilo que puede
interrumpir esta interaccin covalente. Para tener una desnaturalizacin completa
de ribonucleasa es necesario un tratamiento con agente reductor. Anfinsen
monitore la reduccin de la ribonucleasa a travs de la medicin de los nmeros
de grupos libres de sulfhidrilo que estn presentes en la protena. En el estado de
oxidacin, no hay grupos libres de sulfhidrilos dentro de la ribonucleasa porque
cada residuo de cistena est involucrado en un enlace de disulfuro. Por otra parte,
en el estado de completa reduccin, la ribonucleasa contiene ocho grupos libres de
sulfhidrilo. Anfinsen aprovech esa diferencia para evaluar el grado de reduccin
usando el ensayo del espectrofotomtrico para valorar el nmero de grupos de
sulfhidrilo.
Para estudiar el plegamiento de las protenas fuera de la clula, lo primero que se
debe hacer es desnaturalizar la protena. Lo cual se logra fcilmente a travs del
calor o una alteracin mecnica como un temblor y/o a travs de tratamientos
qumicos. Las protenas con puentes de disulfuro requieren una medicin adicional
del tratamiento con el agente reductor para poder romper y separar los enlaces
covalentes. As, para desnaturalizar la ribonucleasa, Anfinsen primero redujo los
puentes de disulfuro con cido tiogliclico. Luego, la desnaturaliz mediante el uso
de una gran concentracin de urea y encubando la solucin a temperatura
ambiente. Con esto, l demostr que ese tratamiento quit la enzima inactiva
mostrando que la ribonucleasa ahora era incapaz de catalizar la escisin de ARN.
Mediante el uso del ensayo espectrofotomtrico, Anfinsen
demostr que la
ribonucleasa inactiva contena ocho grupos de sulfhidrilos que correspondan a los
cuatros puentes de disulfuros rotos. Y, con una protena completamente reducida y
desnaturalizada, Anfinsen se pregunt: Puede una encima desnaturalizada
plegarse correctamente in vitro y ser activa nuevamente?
Para encontrar la respuesta, Anfinsen permiti que una solucin reducida de
ribonuclease desnaturalizada se oxidara. Y le quit la urea de la enzima
desnaturalizada mediante precipitaciones. Luego, re-suspendi la ribonucleasa
desnaturalizada sin urea en una solucin tamponada y la incub por dos a tres das.
Y la exposicin al oxigeno molecular de la atmsfera oxid los residuos de cistena.
Con eso, l compar la actividad de la ribonuclease re-naturalizada con la de la
enzima original. En los experimentos iniciales, el 12%-19% de las previamente
protenas inactivas fueron capaces de catalizar la escisin de ARN nuevamente. Las
protenas se agregaban en concentraciones altas, lo que dificulta que se plieguen
(doblen) correctamente. As, al disminuir las concentraciones generales de la
ribonucleasa en una solucin, Anfinsen demostr que hasta un 94%de las protenas
podan plegarse nuevamente (ver foto de la tabla 3.1). La enzima haba podido
plegarse nuevamente en su conformacin activa fuera de la clula, demostrando
que la informacin del plegamiento/doblamiento de la protena se encuentra dentro
de la misma protena.

DISCUSIN
A travs de experimientos muy cuidadosos, Anfinsen demostr que la informacin
requerida para el correcto plegamiento de la protena estaba en su secuencia
primaria. Su anlisis qumico de este proceso respondi una pregunta fundamental
de la biologa. Luego l demostr el re-plegado (re-doblamiento) de otras enzimas
libres de clulas, incluyendo las protenas que carecen de puentes de disulfuro. Si
bien es posible plegar correctamente una serie de protenas fuera de la maquinaria
de procesamiento normal de las protenas en la clula, este proceso se acelera
enormemente in vivo por una serie de enzimas. Anfinsen continu con estudiando
sobre los problemas presentes en el plegamiento de las protena. Y, aunque la
Hiptesis termodinmica no resulta para todas las protenas, la demostracin de
Anfinsen sobre el re-doblamiento de la ribonucleasa libre de clulas, marc (fue un
hito) el campo de la bioqumica. Y, en 1972, l recibi el Premio Nobel de Qumica
por su trabajo.