Artculos Originales

DETERMINACIN IN VITRO DE LA
ACTIVIDAD FOSFATASA ALCALINA DE
LAS CLULAS PULPARES EXPUESTAS
A TRES CEMENTOS ENDODNTICOS

Revista Colombiana de Investigacin en

Odontologa 2011; 2 (6): 141- 154
1. Juan Carlos Munvar
2. Javier Nio
3. Martha Cecilia Tamayo
4. Daniela Escobar
5. Alberto Jose Vega
6. Mara Fernanda Ulloa
7. ngela Mara Puertas
8. Gloria Bautista
9. Jorge Forero

1. OD. MS Ciencias Biolgicas. MS Biologa

dental. Especializacin Biotica. Profesor
asociado. Facultad de odontologa. Investigador
instituto UIBO - Universidad el Bosque.
2. OD. Especialista en endodoncia. Docente
posgrado en endodoncia .Facultad de Odontologa
- Universidad el Bosque.
3. OD. Especialista en periodoncia PUJ. Profesor
asistente. Unidad de investigacin Facultad de
Odontologa Universidad el Bosque.
4-5-6-7. Residentes posgrado en endodoncia
.Facultad de Odontologa - Universidad el Bosque.
8. Bc UIS .Ms. en estadstica U. Nacional
de Colombia Profesor asistente. Unidad de
investigacin Facultad de Odontologa Universidad el Bosque.
9. OD. Especialista en endodoncia PUJ. Director
posgrado de endodoncia, Facultad de Odontologa
- Universidad el Bosque.
Recibido 02 Octubre 2011/ Modificacin 02
Noviembre 2011/ Aceptado 06 Diciembre 2011

EVALUATION IN VITRO THE ACTIVITY OF

THE ENZYME ALKALINE PHOSPHATASE
IN HUMAN DENTAL PULP EXPOSED
TO
THREE
ENDODONTIC
CEMENTS
Objetivo. Evaluar la actividad de la enzima fosfatasa
alcalina en pulpa dental humana expuesta a tres
cementos endodnticos para recubrimiento pulpar
directo; MTA ProRoot, cemento Portland tipo I con
oxido de bismuto al 25% y cemento Portland tipo I.
Mtodos. Se utiliz como grupo control positivo;
cultivo de osteoblastos, y como controles negativos
cultivos de fibroblastos pulpares sin exposicin
y cultivos de fibroblastos pulpares expuestos a
Levamisol. Se utiliz una muestra por conveniencia
de 9 pozos con 5000 fibroblastos de pulpa dental
humana, 3 replicas por cada condicin estudiada,
para un total de 27 pozos por grupo y cada grupo
fue expuesto cada cemento por 72 horas y evaluados
por fluorometra Los datos fueron analizados con
ANOVA y comparaciones mltiples de Bonferroni (p
< 0,005).
Resultados. Al evaluarse la actividad fosfatasa alcalina
de los tres cementos, se encontr mayor porcentaje
de esta actividad en el cemento Portland (15.56 DS
+/- 9.92) seguido de MTA (13.37 DS +/- 7.61) y en
cemento Portland + xido de Bismuto al 25% (11.88
DS +/- 6.36); sin presentar diferencias estadsticamente
significativas entre los tres. Al comparar la actividad
de la fosfatasa alcalina se encontraron diferencias
estadsticamente significativas siendo mayor la
actividad reportada por los fibroblastos pulpares no
expuestos (33.04 DS +/- 21.93).
Conclusiones. La actividad de la fosfatasa alcalina de
los fibroblastos pulpares estuvo disminuida frente a los
tres cementos evaluados a las 72 hrs. comparados con
la actividad de esta enzima observada en fibroblastos
sin estmulo alguno.
Palabras Clave: Fosfatasa Alcalina; Pulpa Dental;
MTA; Portland; xido de Bismuto, Fluorometra.

142 | Revista Colombiana de Investigacin en Odontologa 2011; 2 (6)

ABSTRACT
Objective. To assess the activity of the enzyme alkaline phosphatase in human dental pulp
exposed to three endodontic cements for direct pulp capping; ProRoot MTA, Portland
cement type I with bismuth oxide 25% Type I Portland cement
Methods. Group was used as positive control culture of osteoblasts, and as negative controls
fibroblast cultures without pulp exposure and pulp fibroblast cultures exposed to levamisole.
We used a convenience sample of 9 wells with 5000 human dental pulp fibroblasts, 3 replicas
for each condition studied, for a total of 27 wells per group and each group was exposed for
72 hours each cement and evaluated by fluorometry data were analyzed with ANOVA and
Bonferroni multiple comparisons (p <0.005).
Results. In assessing the alkaline phosphatase activity of the three cements, found a higher
percentage of the activity in the Portland cement (15.56 SD + / - 9.92) followed by MTA (13.37
SD + / - 7.61) and Portland cement + bismuth oxide to 25% (11.88 SD + / - 6.36), without
statistically significant differences between the three. By comparing the alkaline phosphatase
activity were found statistically significant differences being greater the activity reported by
pulp fibroblasts not exposed (SD 33.04 + / - 21.93).
Conclusions. The alkaline phosphatase activity of pulp fibroblasts was diminished compared
with three cements tested at 72 hrs. compared with the activity of this enzyme observed in
fibroblasts without any stimulus.
Keywords: alkaline phosphatase; Dental Pulp; MTA; Portland; Bismuth Oxide; fluorometry.

INTRODUCCIN
El xito biolgico y clnico del recubrimiento
pulpar radica en la induccin del potencial
dentinognico de las clulas pulpares para
formar una capa mineralizada denominada
puente dentinal (1), para la preservacin
de la vitalidad pulpar, disminuyendo la
sensibilidad y el dolor, generando mnima
respuesta inflamatoria, y ausencia de signos
radiogrficos de distrofia pulpar (2). Los
materiales para recubrimiento pulpar directo
deben controlar la infeccin, tener una
adherencia estrecha a la dentina para prevenir
microfiltracin, ser de fcil manipulacin
y finalmente permitir la formacin de una
barrera de tejido mineralizado (3).

fosfatos triclcicos y ms recientemente

mineral trixido agregado (MTA) (4). ste
ltimo fue desarrollado en la Universidad de
Loma Linda y presenta propiedades fsicas
y biolgicas favorables para ser usado como
material de recubrimiento pulpar; tales como
biocompatibilidad, radiopacidad, buen selle,
propiedades antimicrobianas e induccin de
tejidos mineralizados (5-6).

Uno de los parmetros para medir el xito de

los materiales de recubrimiento pulpar es la
actividad de la fosfatasa alcalina; que juega un
papel importante en los cambios metablicos
en pulpa dental y en otros tejidos del cuerpo
durante los procesos de diferenciacin celular
y es capaz de estimular la formacin de
dentina reparativa, considerada tambin un
A travs de los aos, se han utilizado diversos importante indicador de formacin sea y
materiales de recubrimiento pulpar tales como marcador fenotpico de clulas osteoblsticas
hidrxido de calcio, resinas hidroflicas, (7-9). Seltzer en 1975 report que mediante
cementos a base de ionmero de vidrio, el uso de un agente de recubrimiento pulpar,

Munvar - Determinacin In Vitro de la actividad fosfatasa | 143

la fosfatasa alcalina puede estimular el tejido
para formar matriz dentinal (10).
vvcvaAlgunos estudios han evaluado el uso de
MTA como material de recubrimiento pulpar
(11-13), mostrando resultados aceptables en
cuanto biocompatibilidad, menor induccin de
inflamacin pulpar y formacin de un mayor
puente dentinario. En efecto se ha observado
que el MTA induce procesos biolgicos
favorables en la formacin completa de
puente dentinal libre de tneles provocando
un mnimo efecto txico pulpar, sin signos
de inflamacin, provocando liberacin de
interleucinas necesarias para diferenciacin
celular, siendo un cemento no mutagnico que
favorece la adherencia y el crecimiento celular
(14-17). Adems, estimula la diferenciacin
de clulas pulpares en odontoblastos para
inducir la sntesis de una matriz mineralizada,
especialmente durante la dentinognesis
reparativa asociada con injurias y/o
enfermedades del complejo dentinopulpar,
(18) y promueve la mineralizacin de la
dentina cuando es usado en recubrimiento
pulpar directo involucrando en este proceso la
deposicin inicial de osteopontina (19-20).

tenga una adecuada radiopacidad es del 25

%. A esta mezcla tambin se le ha evaluado
su biocompatibilidad como material de
recubrimiento pulpar (28) y su microfiltracin
como cemento de obturacin retrgada
(29). En dichos estudios se observ que el
cemento Portland ms xido de bismuto al
25% present mayor efecto txico el ProRoot
MTA; probablemente porque que uno de
sus componentes es el oxido de azufre (SO3)
que afecta la viabilidad celular; y que presenta
mayor microfiltracin que el ProRoot MTA
en un 25.46%.
Hay pocos estudios sobre la actividad de
fosfatasa alcalina en MTA cuando es utilizado
como material de recubrimiento pulpar; slo se
reporta una estimulacin leve de esta actividad
cuando MTA es utilizado como material de
obturacin retrgada (30) y en la literatura no
existe estudios que hayan evaluado la actividad
fosfatasa alcalina de los cementos Portland y
Portland ms xido Bismuto al 25% como
materiales de recubrimiento pulpar.

Por tal razn el propsito de este estudio es

evaluar in vitro la actividad de fosfatasa
El MTA es una mezcla de cemento Portland alcalina en clulas de la pulpa expuestas a
refinado y xido bismuto ms ciertas cantidades tres cementos endodnticos: MTA, cemento
de SiO2, CaO, MgO, K2SO4, y Na2SO4. Portland y cemento Portland ms xido
Debido a que su mayor componente es cemento Bismuto al 25%.
Portland - mezcla de silicato triclcico, silicato
diclcico, aluminato triclcico, gypsum y
aluminatofrrico tetraclcico (21), ste podra MATERIALES Y MTODOS
ser utilizado como una alternativa teraputica.
En efecto las caractersticas qumicas y fsicas En este estudio experimental in Vitro
de estos dos cementos han sido comparadas; exploratorio se us un tamao de muestra
y se ha reportado que el MTA y el cemento por conveniencia de 9 pozos por 3 replicas
Portland son similares tanto microscpica por cada condicin estudiada para un total 27
como macroscpicamente cuando se han pozos por grupo (ver tabla 1). Cada pozo cont
analizado por difraccin de rayos X (22- con 5000 fibroblastos de pulpa dental humana.
26). Pero se diferencian en que el Portland
no contiene xido de Bismuto, el cual es Las clulas fueron obtenidas de dientes sanos
el componente que le da la caracterstica de (premolares con indicacin de exodoncia por
radiopacidad a algunos materiales dentales, y ortodoncia y terceros molares) sin patologa
si contiene azufre de 1.6 a 3%, que no contiene infecciosa coronal ni radicular comprobada
el MTA (25-26). Cuesta et al en 2007 (27) clnica y radiogrficamente, de pacientes que
determin que la mnima proporcin de xido concedieron su consentimiento informado
de bismuto necesaria que el cemento portland firmado. (Investigacin de riesgo mnimo

144 | Revista Colombiana de Investigacin en Odontologa 2011; 2 (6)

- Resolucin 8430). Las exodoncias de los El Bosque, siguiendo con todas las normas de
dientes fueron realizadas, en su mayora, por asepsia y antisepsia.
residentes de ciruga oral y mxilofacial en
las Clnicas Odontolgicas de la Universidad

GRUPO
1
2
3
4
5
6

CONDICIN
FIBROBLASTOS CON MTA
FIBROBLASTOS CON PORTLAND + OXIDO DE BISMUTO 25%
FIBROBLASTOS + PORTLAND
FIBROBLASTOS CONTROL
OSTEOBLASTOS (CONTROL POSITIVO)
FIBROBLASTOS CON LEVAMISOL (CONTROL NEGATIVO)

Una vez realizada la exodoncia, se sumergi

cada muestra tres veces en hipoclorito de sodio
al 5.25 % durante 1 minuto, luego se lav con
solucin salina y se efectu la odontoseccin
transversal de los dientes a nivel de la unin
amelocementaria mediante una fresa de
carburo N 556 o 557 en una pieza de mano de
alta velocidad sin refrigeracin bajo irrigacin
manual constante con solucin salina; se
extrajeron las pulpas dentales con pinzas
estriles de microciruga para depositarlas en
una solucin de trasporte (RPMI), en la cual
fueron llevadas inmediatamente al laboratorio
de la Unidad de Investigacin Bsica Oral
(UIBO) de la Universidad El Bosque para su
procesamiento.
En la cabina de flujo laminar bajo condiciones
de esterilidad, se coloco la muestra de pulpa
dental en cajas Petri, donde se lavaron
agregando 3000 L de PBS estril (Penicilina
100U/ml
Estreptomicina
100U/ml
y
Anfotericina 2.5 g/ml), con el fin de limpiar
e hidratar la muestra quitando los residuos
necrticos o con sangre. Se fragment el
tejido con hoja de bistur N 15, obteniendo
explantes tisulares de un dimetro aproximado
de 1 mm, que se organizaron radialmente
en una caja de cultivo T25. Se dejaron los
explantes en adhesin durante 1 hora y media
con 100 L de DMEM suplementado al 10%

con SFB, antibiticos (Penicilina 100 U/ml /

esteptomicina100g/ml) y anfotericina 2,5
g/ml. Luego se depositaron 4ml de medio
de cultivo DMEM, suplementado al 10%
con SFB, antibiticos (penicilina 100 U/ml
estreptomicina 100g/ml) y antimictico
(anfotericina 2,5 g/ml). Se incub a 37C,
atmsfera hmeda y 5% de CO, hasta obtener
un 70% de confluencia celular de este cultivo
primario. Se revis y se cambi el medio cada
dos das para observar la proliferacin, la
confluencia celular y descartar contaminacin,
utilizando el microscopio de contraste de fase
(ZEISS- Id03) a 10X y 20X.
Se utiliz como control experimental positivo
en la fluorometra, cultivos de osteoblastos
obtenidos por explantes de calvara craneana
de 2 ratones de 8 y 14 das de nacidos los cuales
fueron suministrados por el bioterio de la
Universidad El Bosque que fueron sacrificados
con un descenso en temperatura. Luego de
separar los huesos parietales se lavaron con
PBS estril, con antibiticos y antimictico
(concentracin 1X) y se seccionaron en
explantes que fueron depositados sobre
cajas de Petri estriles en forma radial, y se
dejaron en adhesin durante 1 hora con 100
L de DMEM suplementado al 10% con SFB,
antibiticos y antimictico. Despus de este
tiempo se dej el cultivo en incubacin con 4

Munvar - Determinacin In Vitro de la actividad fosfatasa | 145

ml de DMEM. Se revis y se cambi el medio
cada tres das para observar la proliferacin, la
confluencia celular y descartar contaminacin,
utilizando el microscopio de contraste de fase
(ZEISS- Id03) a 10X y 20X.
Para evaluar la posible contaminacin
bacteriana de los cultivos primarios de pulpa
y osteoblastos, se colocaron los cultivos en
caldo BHI y posteriormente se incubaron a
una temperatura de 37 C, 5% de CO2 durante
24 horas para observar crecimiento bacteriano
como fuente de contaminacin de cada
cultivo. As mismo se evaluaron el medio de
cultivo y reactivos que fueron utilizados para
el mantenimiento celular, sembrando por
agotamiento 100 L de cada solucin en agar
sangre y se incubaron de 24 a 48 h a 37 C, 5%
de CO2 y 80% de humedad.
Se expuso el tercer pasaje o sub-cultivo de
clulas pulpares (31) a los tres cementos:
1.
El MTA (ProRoot MTA Gris), se
prepar inmediatamente antes de ser utilizado;
mezclando el polvo con el agua estril en una
proporcin de 6:1 con la ayuda de una esptula
de plstico sobre una loseta de vidrio estril.
2.
Del cemento Portland tipo I
(Diamante) se mezclaron 10 gr. de polvo
con 0.016 ml de agua destilada sobre en una
loseta de vidrio hasta obtener una consistencia
pastosa como la del MTA.
3.
El cemento Portland con oxido de
bismuto al 25% (27); para cuya mezcla inicial
se combin 7.5 gr. de cemento Portland tipo
1(Diamante) y 2.5 gr. de xido de bismuto,
se le agreg 0.016 ml de agua destilada sobre
en una loseta de vidrio mezclndola hasta
obtener una consistencia pastosa como la del
MTA.

48 horas ms con el mismo sobrenadante.

Despus de 72 horas de exposicin a 37 C,
atmosfera hmeda y 5% de CO , se retir
2
el material y se lavaron los pozos con Tris
Buffer Salino (TBS). Se fij la monocapa con
paraformaldehido al 4% durante 30 minutos, y
luego se permeabiliz con Triton X-100 al 0.1%
por 1 hora. Se bloque la actividad fosfatasa
alcalina endgena en los cultivos de clulas
pulpares sin exposicin a ningn cemento con
Levamisol (Kasugai (33-34) (20 mM), en 5%
de cido actico durante 30 minutos, siendo
ste el control negativo. A continuacin, se
bloqueron los sitios de unin no especficos
lavando dos veces (2 minutos cada lavado)
con buffer de bloqueo: suero de caballo al
10% en TBS (Tris 10 mM, NaCl 0.14M, pH
7.2). En seguida y dentro de un campo oscuro
se agreg la solucin fluorognica Methil
Umberil Phosphate (MUP) (Molecular Probes,
H-6491) 3.6 mM (NaCl 100mM, Tris 100 mM
y MgCl 50 mM) y se llev a la incubadora a
2
37 C, antes de la lectura de fluorescencia. Para
determinar la actividad de fosfatasa alcalina se
utiliz el protocolo de fluorometra expuesto
por Rincn et al en 2004 (32).
La reaccin entre el MUP (Metil-UmberilFerona) y la enzima fosfatasa alcalina fue
leda por el fluormetro PR-521 (TecnoSuma
Habana Cuba) , y los resultados se dieron
en unidades de fluorescencia (UF). Estas
lecturas fueron realizadas cada 15 minutos
en 3 tiempos: 30, 45 y 60 minutos, solo para
evaluar el funcionamiento del aparato de
fluorometra, pero solo se tuvieron en cuenta
las lecturas correspondientes al ltimo tiempo.

El experimento fue realizado por triplicado

para validar la confiabilidad de los datos
obtenidos y los datos de las tres repeticiones
fueron promediados para cada condicin.
Luego de 24 horas de adhesin y proliferacin El promedio de las lecturas del grupo de
celular in Vitro se depositaron 2.5 gr. de fibroblastos + levamisol (control negativo), fue
cada material recin preparado en cada una tomado como lmite inferior con respecto a la
de las regiones de la caja de tal manera que actividad de la fosfatasa alcalina y el valor que
se simularan las condiciones clnicas reales. se obtuvo del grupo de osteoblastos (control
Al cabo de 24 horas del endurecimiento positivo), fue tomado como el valor del lmite
del material, se incubaron las clulas por superior de la actividad de la fosfatasa alcalina.

146 | Revista Colombiana de Investigacin en Odontologa 2011; 2 (6)

El valor que arrojaron los fibroblastos
pulpares no expuestos fue tomado como
valor 0 relativo, es decir, que los valores que
fueron superiores a ste los se consideraron
como valores de mayor actividad de fosfatasa
alcalina. De la misma manera los valores que
fueron inferiores este valor se consideraron
como valores de menor actividad de esta
enzima. Estos valores fueron corregidos para
eliminar los falsos positivos arrojados por
el fluormetro debido que los pozos con el
medio emitieron valores positivos que fueron
restados del valor total.

RESULTADOS
Considerando la heterogeneidad de la
varianza, se hizo necesaria la aplicacin
de una transformacin logartmica (ln) a
los datos. Segn la prueba de Levene esta
transformacin permiti su homogenizacin
(P = 0.348).

Al evaluarse la actividad fosfatasa alcalina

de los tres cementos a los tres tiempos de
medicin, se encontr mayor porcentaje de
esta actividad en cemento Portland seguido
de MTA y por ltimo en cemento Portland
El anlisis estadstico de los datos se llev a + xido de Bismuto al 25% (ver tabla 2);
cabo a travs de promedios y desviaciones sin presentar diferencias significativas entre
estndar, y los grupos fueron comparados los tres cementos a travs de la prueba de
mediante la prueba de ANOVA y la prueba de Bonferroni (ver tabla 3).
comparaciones mltiples de Bonferroni (p <
0,05)
Tabla 1. Descripcin de los de grupos de estudio

GRUPOS
Condicin
Tiempo
(minutos)
MTA
(N 27)

Portland +
xido de
Bismuto 25%
(N 27)
Portland
(N 27)

Fibroblastos +
Levamisol
(N 27)
Fibroblastos
(N 27)

PROMEDIO
(%)

DS

MNIMOS
MXIMOS

30

9.31

5.27

0.0551 - 25.88

45
60
30
45
60

11.57

6.56

0.145 - 32.57

13.37

7.61

0.255 - 37.47

7.614

4.096

-0.225 - 22.755

10.01

5.41

-0.0949 - 30.55

11.88

6.36

0.0651 - 36.98

30
45
60
30
45
60
30
45
60

9.56

6.26

0.00510 - 30.15

12.94

8.60

0.195 - 41.61

15.56

9.92

0.405 - 48.92

5.934

1.728

1.115 - 10.755

7.695

2.503

1.635 - 14.095

9.067

3.059

2.085 - 14.395

20.11

13.59

1.83 - 48.83

27.46

18.62

2.61 - 69.45

33.04

21.93

3.41 - 82.60

Munvar - Determinacin In Vitro de la actividad fosfatasa | 147

Al comparar la actividad de la fosfatasa alcalina
producida por cada uno de los cementos con el
grupo de fibroblastos sin cemento se encontraron
diferencias estadsticamente significativas
(ver tabla 3) siendo mayor la actividad
reportada por los fibroblastos (ver tabla 2).

de activacin dados por los tres cementos

(ver tabla 2); sin embargo al aplicar la
prueba de comparaciones mltiples de
Bonferroni solo se presentaron diferencias
estadsticamente significativas con el grupo
Portland y el grupo MTA ( ver tabla 3).

El promedio de inhibicin de actividad de

fosfatasa alcalina con levamisol - control
negativo - fue muy similar a los promedios
Tabla 2. Resultados descriptivos de medicin de fosfatasa alcalina para cada uno de los
grupos

GRUPOS
Fibroblastos con Levamisol Vs Fibroblastos sin cemento
Fibroblastos con Levamisol Vs MTA
Fibroblastos con Levamisol Vs Portland + xido Bismuto 25%
Fibroblastos con Levamisol Vs Portland
Fibroblastos sin cemento Vs MTA
Fibroblastos sin cemento Vs Portland + xido Bismuto 25%
Fibroblastos sin cemento Vs Portland
MTA Vs Portland + xido Bismuto 25%
MTA Vs Portland
Portland Vs Portland + xido Bismuto 25%

DISCUSIN

P
0.0000
0.0398
0.9465
0.0028
0.0000
0.0000
0.0000
1.0000
1.0000
0.4694

clulas pulpares que no fueron expuestas a

ningn cemento presentaron actividad de la
Pocos estudios se han llevado a cabo para enzima fosfatasa alcalina y la menor actividad
evaluar el comportamiento de la enzima se observo en las clulas pulpares expuestas
fosfatasa alcalina en clulas pulpares expuestas a levamisol. Sin embargo, se observ que al
a materiales de recubrimiento pulpar, siendo contrario de lo que se esperaba, las que fueron
el nuestro el primero en comparar dicha expuestas durante 72 horas a los cementos
actividad frente tres cementos; MTA (ProRoot- evaluados presentaron menor actividad que
Dentsply) , Portland tipo I (Diamante), y las no expuestas, lo que fue estadsticamente
Portland tipo I (Diamante)+ xido Bismuto significativo.
al 25%, mediante la tcnica de fluorometra,
que fue elegida por ser una tcnica Los resultados que se obtuvieron en este estudio
reproducible, simple, confiable y de bajo costo con respecto a la exposicin de fibroblastos
que permite la deteccin precisa de la enzima pulpares a MTA- (ProRoot-Dentsply) - (
en una longitud de onda especfica, siendo 13.37 UF, DS 7.61) podran coincidir con los
una prueba ms sensible que otros mtodos resultados mostrados por Bonson et al 2004
como colorimtricos, espectofotomtricos y donde encontraron una reducida actividad
fosfatasa alcalina durante los 4 primeros das
electroforticos (32).
de exposicin. Sin embargo Bonson et al 2004
En este estudio se observ que tal y como encontraron la mxima actividad despus del
reportan los estudios (30,31,33,35). Las noveno da.

148 | Revista Colombiana de Investigacin en Odontologa 2011; 2 (6)

La actividad de la fosfatasa alcalina es un
importante indicador de formacin sea y un
marcador fenotpico de clulas osteoblsticas
(8-9). En endodoncia se ha demostrado que
la fosfatasa alcalina es una enzima expresada
en las fases tempranas de la mineralizacin y
estimula al tejido pulpar para formar matriz
dentinal en terapias de recubrimiento pulpar
(36) y presenta varias isoformas que se han
expresado en gran variedad de tejidos como
hueso, hgado, rin, intestino y placenta;
adems observaron una gran expresin
de fosfatasa alcalina sea en sitios de
mineralizacin (37), lo que apoya el probable
papel de esta enzima en la mineralizacin
normal de hueso. En efecto esta actividad ha
sido observada en varios tejidos dentales en los
que hay procesos de mineralizacin tales como;
ligamento periodontal, enca, hueso alveolar,
cemento, esmalte, pulpa dental y saco dental,
(38-39-10-33-40-41). Estudios comparativos
in Vitro muestran que los fibroblastos del
ligamento periodontal presentan niveles ms
altos de actividad de fosfatasa alcalina que
los fibroblastos gingivales (42-43-40-44) y
en fibroblastos pulpares se detecta 7.5 veces
ms actividad enzimtica que en fibroblastos
gingivales (31).
As mismo Goseki et al en1990 mostraron que
en las clulas pulpares la actividad es mayor
que en las clulas osteoblsticas (33), aun
cuando se ha demostrado que las propiedades
de ambas enzimas corresponden a la misma
clase de isoforma: fosfatasa alcalina no
especfica de tejido (45-46). Los resultados del
estudio de Goseki et al en 1990 no coinciden
con los resultados este estudio, debido a que se
presento menor actividad la fosfatasa alcalina
en fibroblastos pulpares que en osteoblastos.
Sin embargo cabe aclarar que los mtodos
utilizados en los dos estudios son diferentes,
debido a en este estudio se uso el mtodo
fluoromtrico ye en el de Goseki et al en 1990
usaron el mtodo colorimtrico.

tipo inflamatorio particularmente en los

primeros das de exposicin a algn material
de recubrimiento lo que podra explicar
la baja actividad de la fosfatasa alcalina
que se observo en los fibroblastos pulpares
expuestos a los cementos que se utilizaron
en nuestro estudio. Justamente varios
estudios in vitro sugieren que en las etapas
iniciales de la exposicin, algunos materiales
dentales producen reacciones inflamatorias
y desnaturalizacin proteica ocasionando
un retraso en la cicatrizacin de las clulas
pulpares, y por ende en mineralizacin (18,5055) y citoquinas como la interleuquina 1 (IL1) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a)
que estn relacionadas a las etapas iniciales de
la inflamacin, han mostrado efecto inhibitorio
sobre la actividad de fosfatasa alcalina (5659).
No obstante, en dichos estudios in vitro el
efecto inhibitorio fue evaluado durante un
lapso de tiempo mucho mayor a las 72 horas
que empleamos en este estudio, pero Tatsu y
Kiyoshi en el 2006 observ que al exponer las
clulas pulpares a TNF-alfa ,produce efecto
inhibitorio sobre la actividad de fosfatasa
alcalina a ese tiempo (60) a diferencia de
lo reportado por Min et al en 2006 quienes
observaron un efecto inhibitorio por parte
de IL-1 y TNF-alfa hasta al sptimo da y
demostr que estas citoquinas en conjunto
ejercen un mayor efecto inhibitorio que
cuando estn solas (48).
En este estudio se evalu in vitro dicha
actividad a 72 horas de exposicin porque
se quera apreciar el efecto inicial de estos
biomateriales sobre clulas pulpares durante
las primeras horas despus de colocarlos.

Cuando se comparo la actividad de la

fosfatasa alcalina de fibroblastos expuestos
al MTA con fibroblastos no expuestos; se
encontraron diferencias estadsticamente
significativas siendo mayor la actividad de
los fibroblastos no expuestos, lo que est en
Para que ocurra la formacin de un tejido desacuerdo con los resultados reportados por
duro tienen que suceder una serie de eventos Min et al en 2009; que al evaluar in Vitro la
celulares (47, 48,49), incluyendo los de actividad fosfatasa alcalina de fibroblastos

Munvar - Determinacin In Vitro de la actividad fosfatasa | 149

pulpares frente a MTA mediante colorimetra,
encontraron que la actividad producida por
el MTA fue estadsticamente similar a la
del grupo control fibroblastos pulpares sin
cemento- al primer da. Pero al tercer da
se pudo observar que la actividad fosfatasa
alcalina con MTA se mantuvo igual, mientras
que en fibroblastos pulpares sin exposicin de
cemento la actividad enzimtica disminuyo
(61), Sin embargo, cabe aclarar que en este
estudio no hubo un contacto directo entre
las clulas y los materiales evaluados para
la deteccin enzimtica y al igual que en el
estudio de Bonson et al en 2004 utilizaron un
mtodo de medicin diferente al nuestro.
Cuando se compararon los tres cementos
entre s, se encontr que la mayor actividad
de fosfatasa alcalina se dio en las clulas
expuestas a Portland ( 15.56 UF, DS- 9.92),
seguido por las clulas expuestas a MTA (
13.37 UF, DS - 7.61) y por ltimo las clulas
expuestas a Portland + xido de Bismuto al
25% ( 11.88 UF, DS - 6.36), sin embargo
las diferencias no fueron estadsticamente
significativas.
Aunque
se
encontraron
diferencias
estadsticamente significativas entre las clulas
expuestas al MTA y al Portland frente al grupo
de clulas expuestas al levamisol ( 9.067 UF,
DS 3.059), el efecto de la exposicin de las
clulas pulpares al cemento Portland + xido
de Bismuto al 25 % fue estadsticamente
igual al obtenido en las clulas expuestas
a levamisol, que tiene un potente efecto
inhibitorio sobre la fosfatasa alcalina (33-34).
Esto podra sugerir que el xido de Bismuto
podra estar afectando la actividad de la enzima
en estas 72 horas de exposicin, acorde por
lo reportado por los estudios de Min et al en
2007 y Camargo et al en el 2009; en los que
se han observado los efectos citotxicos de
este elemento sobre clulas pulpares humanas,
indicando que dicha toxicidad se manifiesta a
corto plazo - 1da - pero con el paso de los das
el xido de Bismuto tiende a ejercer un efecto
protector (51-52).

Hoy por hoy, el MTA es considerado el

material por excelencia para recubrimiento
pulpar directo. Sobre el MTA se han
realizados mltiples estudios in vivo e in Vitro
para evaluar sus propiedades, pero an no es
completamente claro el mecanismo por el cual
induce la formacin y mineralizacin de un
puente dentinal. Por una parte Schroder et al
1985 sugirieron que el MTA por s mismo no
es el que promueve la mineralizacin como
tal, sino que el efecto de controlar la infeccin
y de estimular el proceso de cicatrizacin en
las clulas pulpares seran los responsables de
la formacin del puente dentinal (62). Por otro
lado, Mitchell et al 1999 y Koh et al en 1998
sugieren que el recubrimiento pulpar con MTA
induce cambios funcionales y citolgicos
en las clulas pulpares que fueron expuestas
resultando en la formacin de fibrodentina
y dentina reparativa (63-64) y Kuratate et al
en 2008 reportan que esta formacin ocurre
entre los 7 y 14 primeros das de aplicado el
MTA (20), lo que podra explicar la mnima
actividad de la fosfatasa alcalina producida
por los fibroblastos expuestos a este cemento
cuando lo comparamos con los fibroblastos no
expuestos a ningn cemento a las 72 horas.
Basados en los resultados del presente estudio,
se recomiendan nuevas investigaciones sobre
medicin de actividad de fosfatasa alcalina en
tiempos mayores de exposicin de 72 horas.
Tambin se sugiere evaluar el papel de las
citoquinas inflamatorias y la concentracin de
xido Bismuto en cemento Portland debido a
que pueden alterar la actividad de la fosfatasa
alcalina.
A partir de los resultados de este estudio se
concluye que: los tres cementos presentaron
una disminuida actividad de fosfatasa alcalina
a las 72 horas de exposicin sin presentar
diferencias entre ellos, el cemento Portland
tipo I con xido de bismuto al 25% acta como
el Levamisol, inhibiendo la actividad de esta
enzima en las primeras 72 horas de exposicin
a los cementos y los fibroblastos pulpares
sin exposicin a ningn material presentaron
mayor actividad de fosfatasa alcalina en las

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