Observacin microscpica

Examen Directo:

Es la base del diagnstico microbiolgico

Pone en evidencia la presencia de grmenes, permite evaluar sus caractersticas morfolgicas y su reaccin a
las diferentes coloraciones.

1. En fresco
2. Coloraciones

Examen Directo en fresco

Permite ver las estructuras microscpicas sin alteraciones producto de los colorantes,

Observar la movilidad de los grmenes y estudiar la presencia de organismos viables que suelen destruirse con
las coloraciones (Ej: trofozoitos).

Montaje en solucin salina

Montaje en iodo

Montaje en KOH

Tcnica de la tinta china

Examen en campo oscuro

Coloraciones

Distinguen los diferentes tipos de grmenes gracias a la composicin de su pared celular, sirviendo de
orientacin para el diagnstico y tratamiento.

Morfologa bacteriana

La forma ms sencilla de iniciar una identificacin del microorganismo que se desea estudiar es realizar una
coloracin o tincin de Gram.

La tincin de Gram es una tincin diferencial porque no todas las clulas se tien de la misma manera y
permite discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias, las eubacterias Gram (+) y Gram (-).

El tercer grupo de eubacterias es el de los Bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) que pueden ser
diferenciados utilizando la coloracin de Ziehl-Neelsen

Estructura de los Gram (+)

Las

bacterias

Gram

(+)

son

clulas

con

una

gruesa

pared

celular

de

El

peptidoglicano

Este peptidoglicano es una macromolcula gigante formada por cadenas de un dmero compuesto por Nacetilglucosamina y N-acetilmurmico

Estas cadenas se encuentran unidas entre s mediante pptidos, que son pequeas cadenas de aminocidos que
se entrecruzan

Rigidez: evita que la clula estalle en medios hipotnicos

Porosidad: permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalticas y productos
de secrecin hacia el exterior de la clula

Estructura de los Gram (-)

Las bacterias Gram (-) son clulas con una delgada capa de peptidoglicano y una segunda
envoltura denominada membrana externa

Preparacin de los portaobjetos

Hervir en detergente 10 minutos

Enjuagar con agua destilada

Enjuagar con alcohol

Secar con un pao limpio que no deje pelusa.

Almacenar en cajas cerradas

Para reciclar los portaobjetos se los debe hervir en detergente 20 minutos y continuar con el proceso similar al
de los portaobjetos nuevos.

COLORACIN DE GRAM

Fijar la muestra

Cubrir con cristal violeta durante 3 minutos

Enjuagar con agua

Cubrir con lugol durante 2 minutos

Enjuagar con agua

Decolorar con alcohol acetona

Enjuagar con agua

Cubrir con fucsina diluida 1 minuto

Enjuagar con agua

Para tener en cuenta:

Los extendidos de materiales compactos deben ser delgados

Se debe distribuir el material de manera uniforme por toda la superficie del vidrio.

No poner dos muestras en un mismo preparado.

En materiales lquidos dejar secar al aire antes de fijar, no acelerar el proceso de secado.

Identificar los vidrios del lado opuesto al de la coloracin.

Todas las bacterias, luego de la aplicacin del colorante primario cristal de violeta aparecen violetas.

Todas las clulas se tien con el colorante bsico debido a que este interacciona con las cargas negativas del
ADN.

El mordiente lugol prepara a la clula para una coloracin diferencial.

El yodo entra por los poros de la pared celular y forma un complejo con el cristal de violeta.

Este complejo es muy grande para atravesar los poros de la pared celular luego del lavado.

El decolorante alcohol acetona, disuelve los lpidos de la pared celular

La gran cantidad de lpidos que contiene la pared celular conforma grandes poros luego de la aplicacin del
colorante, por lo que el complejo cristal violeta-yodo es lavado.

Hasta este punto las clulas pueden aparecer sin color Gram negativas o violetas Gram positivas.

El colorante de contraste fucsina es usado para colorear clulas Gram negativas

Precauciones en Coloracin de Gram

Al fijar los extendidos a la llama se los debe flamear suavemente

Antes de colorear con cristal violeta el preparado debe de estar fro.

El cristal violeta y la fucsina deben de ser filtrados antes de usar.

Respetar los tiempos de coloracin en cada una de las etapas.

Dejar secar los preparados al aire

Como mirar una coloracin de Gram?

Se debe realizar una observacin macroscpica para determinar el lugar preciso del portaobjetos en el que se
encuentra la muestras

Se debe establecer si se ha decolorado excesivamente o si el extendido es demasiado grueso o delgado.

Observar a menor aumento

Un extendido excesivamente grueso es fcilmente reconocido porque resiste la decoloracin, mostrando

masas oscuras en las que no se pueden reconocer estructuras celulares.

Ante la presencia de un problema, una forma de controlar la tcnica de coloracin y la efectividad de los
reactivos usados, es hacer coloraciones de la flora bucal (saliva) en donde se encuentra habitualmente gran
cantidad de grmenes Gram (+) y Gram (-) as como tambin clulas epiteliales

Cuidado con los artefactos!

Formas cocoides o bacilares de estructuras Gram (+) pueden confundir con grmenes.

Los grmenes pueden tener sus caractersticas alteradas.

Los grmenes Gram (+) suelen aparecer como Gram variable o Gram (-) si sus paredes estn alteradas.

Examine la matriz de fondo.

Cuando la muestra tiene muchos restos celulares, no se suelen ver bacilos gram (-) delgados.

Sucede lo mismo, cuando hay predominancia de grmenes Gram (+)