KROMATOGRAFI

Sri Teguh Rahayu, M. Farm., Apt

 Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan

perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada
larutan.[1] Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati
kolom yang merupakan fase diam.[1] Molekul yang memiliki ikatan
yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat
dibanding molekul yang berikatan lemah.[2] Dengan ini, berbagai
macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan
pada kolom.[2]
Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat

dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan

untuk analisis lebih lanjut.[2] Beberapa alat-alat analitik dapat
digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara online (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas
chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography)
dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform
infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLCUV-VIS).

 Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran

didasarkan atas perbedaan campuran didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen-komponen
distribusi dari komponen-komponen campuran
tersebut diantara dua fase, campuran tersebut
diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair)
dan fase yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase
gerak (cair atau gas).

 Kromatografi merupakan teknik pemisahan senyawa

campuran berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi,

karena adanya perbedaan koefisien distribusi masingmasing senyawa di antara dua fase yang saling
bersinggungan dan tidak saling campur, yang disebut
sebagai fase gerak (mobile phase) yang berupa zat cair
atau zat gas, dan fase diam (stationary phase) yang
berupa zat cair atau zat padat

 Teknik kromatografi digunakan pada hampir setiap

metode analisis sampel kompleks karena kemampuan

pemisahannya, kecepatannya, dan penggunaan jumlah
sampel yang sedikit.

 Metode kromatografi secara umum dapat dibedakan

berdasarkan fase gerak dan fase diam yang digunakan.

Berdasarkan fase gerak kromatografi :
a. kromatografi gas (GC = gas chromatography) dan
b. kromatografi cair (LC = liquid chromatography).
Berdasarkan fase diam dapat digunakan sebagai dasar
klasifikasi selanjutnya :
a. Fase diam berupa padatan yang bersifat sebagai
adsorben, maka mekanisme pemisahan berdasarkan
kekuatan interaksi fisik permukaan (adsorpsi) di antara
kedua fase. Bila fase geraknya gas disebut kromatografi
gas padat (GSC = gas solid chromatography), dan bila
fase geraknya cair disebut kromatografi cair padat (LSC =
liquid solid chromatography).

b. Fase diam berupa cairan yang disalutkan pada

penyangga padatan, maka mekanisme pemisahan
berdasarkan partisi komponen sampel di antara dua cairan
yang tidak saling campur. Bila fase geraknya gas disebut
kromatografi gas cair (GLC = gas liquid chromatography),
dan bila fase geraknya cair disebut kromatografi cair cair
(LLC = liquid liquid chromatography).

 Dengan demikian, kromatografi cair-cair

disebut juga sebagai kromatografi partisi

dan kromatografi cair padat disebut juga
sebagai kromatografi penjerapan /
adsorpsi.
Berdasarkan kepolaran relatif fase diam
terhadap fase gerak, maka kromatografi
dibedakan menjadi kromatografi fase
normal (normal phase) dan fase terbalik
(reversed phase).

 Pada kromatografi fase normal digunakan fase

diam polar dan fase gerak nonpolar, sedangkan

pada kromatografi fase terbalik, fase diam relatif
nonpolar dibanding fase gerak
Berdasarkan instrumen yang digunakan,
kromatografi dibedakan menjadi kromatografi
kolom dan kromatografi planar
Apabila fase diam dipadatkan di dalam pipa gelas
atau pipa logam, kemudian fase gerak gas atau
cair dialirkan melalui fase diam tersebut
berdasarkan gravitasi ataupun dengan tekanan,
maka cara ini disebut sebagai kromatografi kolom

 Apabila fase diam berupa kertas berpori

(kromatografi kertas) ataupun padatan halus

yang diratakan pada plat gelas atau plat
aluminium (kromatografi lapis tipis), kemudian
fase gerak cair akan bergerak karena
pengaruh daya kapilaritas (metode
ascendens) atau gravitasi (metode
descendes), maka cara ini disebut sebagai
kromatografi planar.

Pengisian Kolom
Fase diam
Pasir

fase diam homogen

fase diam ukuran sama
fase diam bentuk seragam
bebas gelembung udara

Kapas / glass
wool

Tehnis : fase diam + pelarut bubur (fase gerak)

Kolom kromatografi sederhana

Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif

CHCl3 : MeOH : H2O = 6,5 :2,5:0,4

Isolat yang diambil

Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan

fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

 Apabila solut masuk ke dalam suatu sistem

kromatografi, maka akan segera terdistribusi di antara

fase diam dan fase gerak. Bila aliran fase gerak
dihentikan, maka akan terjadi kesetimbangan di antara
kedua fase. Distribusi molekul-molekul solut di antara
kedua fase ditentukan oleh tetapan kesetimbangan
yang disebut koefisien partisi atau konstanta distribusi
(K), yang merupakan harga perbandingan konsentrasi
solut pada tiap fase:

Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam (stationary

phase), dan Cm adalah konsentrasi solut dalam fase

gerak (mobile phase).

HPLC?
Awalnya dikenal sebagai High-Pressure

Liquid Chromatography

sekarang lebih dikenal dengan nama High

Performance Liquid Chromatography

HPLC merupakan salah satu metode

kromatografi cair yang fase geraknya

dialirkan secara cepat dengan bantuan
tekanan, dan hasilnya dideteksi secara
instrumen

HPLC PRINCIPLE

Stationary Phases
Polar (Normal Phase):
Silica, alumina

Non-Polar (Reversed Phase)

ODS Silica gel
C18, C8

The Mobile Phase

Normal chromatography

Hexane ; dichloromethane; isopropanol; methanol

Increasing strength
Reverse phase chromatography

water ; methanol; acetonitrile; tetrahydrofuran (THF)

Increasing strength

Components of HPLC
1.
2.
3.

4.
5.
6.

7.

Solvent Reservoir
Pumps
Sample Injection System
Columns
Detectors
Data Processing
Waste

Solvent Reservoir
Mobile phase
isocratic elution - single solvent separation teachnique
gradient elution - 2 or more solvents, varied during separation
To carry sample into the column

Pumps
Untuk menghasilkan tekanan yang

akan mendorong pelarut ke dalam

sample.

kemampuan pompa mendorong

pelarut untuk menghasilkan tenakan

sampai 4000 psi dan pada aliran
sampai 10 ml/min

Tekanan 1000 psi (4000 6000psi)

Kec. Alir 1-3ml/menit
Bahan harus resisten secara kimiawi
Ex : dari teflon & stainless steel

Tidak ada pulsa getaran

Kontinyu

Sistem penginjek Sample

sample valve
Syringe/injector

Syringe :
manual
Autoinjector
A fixed-volume loop of between 1

200 l (20 l is often used as standard)

Columns
straight, 15 to 150 cm in length; 2 to 3

mm i.d.
packing - silica gel, alumina, Celite

HPLC Detectors
UV/Vis
Refractive index
Fluorescence
Evaporative light scattering (ELSD)
MS
Diode Array Detector (DAD)

Data Processing
menggunakan software khusus yang

dihubungkan dengan HPLC

Informasi yang diperoleh dari mesin HPLC
ditampilkan dalam bentuk kromatogram
Kromatogram menjelaskan tentang data
kualitatif (waktu retensi) dan data kuantitatif
(AUC)

29

Separations
Injector

Separation in based upon differential

migration between the stationary and
mobile phases.
Stationary Phase - the phase which
remains fixed in the column, e.g. C18,
Silica

Mixer

Pumps

Mobile Phase - carries the sample

through the stationary phase as it
moves through the column.
Column

Detector

Solvents

Waste

High Performance Liquid Chromatograph

30

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

High Performance Liquid Chromatograph

time

31

arations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

32

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

33

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

34

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

35

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

36

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

37

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

38

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

39

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

40

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

41

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

42

Separations

Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

43

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

44

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection
Column

Detector

Solvents

time

45

The Chromatogram
to - elution time of unretained peak
tR- retention time - determines sample identity
tR

tR
mAU

Area or height is proportional

to the quantity of analyte.

to
Injection

time

HPLC Chromatograms
Approximation
of peak area by

Absorbance

triangulation

Peak A

Peak B
height

Time (minutes)
Rt = 3.0 min. Rt = 5.2 min.
faster moving slower moving
less retained more retained

7
base
Area =

base x height
2

Performace coloumn
Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan
atau kegagalan analisis tergantung pada pemilihan kolom
dan kondisi kerja yang tepat.
Tujuan utama kromatografi adalah memisahkan senyawa
campuran dalam waktu yang relatif cepat dan wajar,
menjadi puncak atau pita, ketika senyawa bergerak
melalui kolom.
Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari kemampuan kolom
dalam memisahkan senyawa.
Kolom yang efisien mencegah pelebaran puncak atau
menghasilkan puncak yang sangat sempit.

 Parameter yang paling banyak digunakan

untuk mengukur keefisienan kolom adalah
faktor resolusi (R), bilangan lempeng teoritik
(N) dan HETP (High Equivalent to Theoretical
Plate).
Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari
2 puncak. Daya pisah , Rs, antara 2 puncak
dapat diukur secara kuantitatif dengan
persamaan di samping. Harga tR1 dan tR2
adalah waktu retensi senyawa, sedangkan
harga w1 dan w2 adalah lebar alas puncak


t R 2 t R1
2t
Rs

1 / 2w1 w2 w1 w2

Daya pisah 2 puncak dikatakan baik

apabila memiliki harga Rs minimal 1,5.

Pada teori lempeng, kolom kromatografi

digambarkan sebagai suatu seri lapisan tipis
horisontal yang disebut lempeng teoritik (theoritical
plates), dimana pada setiap lempeng akan terjadi
keseimbangan solut antara fase diam dan fase
gerak. Gerakan solut dan fase gerak digambarkan
sebagai transfer berurutan dari lempeng satu ke
lempeng berikutnya. Pemisahan akan terjadi lebih
baik jika terjadi keseimbangan berkali-kali dalam
jumlah yang tinggi. Hal tersebut dapat tercapai jika
bilangan lempeng teoritik juga tinggi

 bilangan lempeng teoritik (N) dapat

digunakan sebagai ukuran efisiensi kolom.
Persamaan tersebut menyatakan
hubungan waktu retensi senyawa (tR) dan
lebar alas puncak (w) atau lebar puncak
pada setengah tinggi puncak (wh) dengan
bilangan lempeng teoritik (N).
Bilangan lempeng teoritik berbanding lurus
dengan panjang kolom (L). Karena
panjang kolom bermacam-macam, maka
diperlukan ukuran keefisienan kolom yang
tidak tergantung pada panjang kolom

Teori Lempeng (Plate Theory)

Martin & Synge (1941)

Efisiensi kolom

Apabila jumlah kesetimbangan makin besar

efisiensi >> menambah jumlah lempeng (N)
tebal lempeng teoritik H
N & H menyatakan efisiensi

Secara matematis : N = L / H
Kelemahan teori :
tidak mampu mengidentifikasi variabel-variabel yang
mempengaruhi pelebaran pita kromatogram

HETP atau H merupakan ukuran keefisienan

kolom yang lebih disukai karena memungkinkan
perbandingan antara kolom yang panjangnya
berlainan, yang dapat diukur dengan persamaan
berikut

Terlihat bahwa apabila H kecil maka N besar,

sehingga jumlah terjadinya kesetimbangan di
dalam kolom akan semakin banyak. Dengan
demikian pemisahan di dalam kolom akan lebih
efisien

57

HPLC Analysis Parameters

Mobile Phases

Flow Rate
Composition
Injection Volume
Column
Oven Temperature
Wavelength
Time Constant

Fig. 4. Sample injector.

Fig.7. Membrane
filtration device.

Fig. 8. filter
assembly.

Fig. 9. Sample filtering.

Fig. 10. Sample injection and recorded peaks.

Injektor Automatik

Application of HPLC
1. Pharmaceuticals industry

To control the drug stability

Quantity of drug determination from

pharmaceutical dosage forms, ex. Paracetamol
determination in panadol tablet

Quantity of drug determination from biological

fluids, ex: blood glucose level
2. Analysis of natural contamination
- Phenol & Mercury from sea water
3. Forensic test
- Determination of steroid in blood, urine & sweat.
- Detection of psychotropic drug in plasma

Application of HPLC
4. Clinical test
- Monitoring of hepatic chirosis patient
through aquaporin 2 in the urine.
5. Food and essence manufacture
- sweetener analysis in the fruit juice
- preservative analysis in sausage.

The factors which influence the HPLC

performance
Internal diameter of column
- the smaller in diameter, the higher in
sensitivity
2. Pump pressure
- the higher in pressure, the higher in
separation
3. Sample size
4. The polarity sample, solvent and column
5. Temperature
- the higher in temperature, the higher in
separation
1.

advantages
1. Needs a small sample with a high

accuracy and precis

2. Non-destructed sample during
operation compared to GC.

Disadvantages
Need a skill to run the instruments
Solvents consuming

HPLC CHROMATOGRAM

Predict the order of elution from first to last of the

following morphinane compounds from an ODS
column in an acetonitrile/buffer mixture pH 8 (10 : 90).

Retention Time
The retention time of a solute is taken as the elapsed

time between the time of injection of a solute and

the time of elution of the peak maximum of that
solute.

DETEKTOR KCKT/HPLC : UV-VIS,

FLUORESCENCE

HPLC Detectors
suatu campuran dari sejumlah komponen dapat
dipisahkan dengan KCKT , bagaimana mengetahuinya?
Diperlukan detektor KCKT yang bersifat :
Sensitif (signalnya tinggi, noise rendah)
Tidak dipengaruhi oleh fase geraknya
Harus mampu bekerja dilingkungan fase cair

Detector HPLC

detektor HPLC yang umum digunakan :

Refractive Index
UV-Visible
Fluorescence
Conductivity (for ion chromatography)
Mass Spectrometry

Refractive Index Detector

Legacy bulk property detector
Almost universal, rugged
Low sensitivity (high ppm), no gradient programs

possible

UV-Visible Detector
Most common detection method along with mass

spectrometry
Detects solute analytes by their absorbance of
light at various wavelengths
More sensitive than refractive index, depends on
specific analyte and wavelength
Less sensitive than mass spec, compound must
absorb in the UV-Vis, mobile phase cutoff

Molecules and Light

Why is our universe coloured?
Absorbance - compounds absorb light of specific
wavelengths and reflect or transmit all others
Emission - compounds emit light after converted to a

higher energy state (ex: fluorescence, phosphorescence)

Molecular Orbital Theory

Molecular orbitals exist at different energy levels; bonding
orbitals (sigma/pi), non-bonding orbitals and anti-bonding
orbitals
Molecular absorption occurs when photonic energy causes
promotion of an electron to a higher energy orbital,
different types of transitions possible

Molecular Orbital Theory

(sigma) orbital has symmetry about the

bonding axes, lowest energy

(pi) only one orbital plane passes through
both nuclei involved
n (non-bonding) orbital involved is not involved
in bonding, usually a lone pair, higher in energy
*, * (anti-bonding) nodal planes exist between
nuclei, high in energy, usually unpopulated in
stable molecules

Molecular Orbital Theory

Absorption occurs when light of a specific wavelength

causes the electronic transition

Molecular Orbital Theory

HOMO = highest occupied molecular orbital (, , n)
LUMO = lowest unoccupied molecular orbital (* , *)
Most transitions we will be concerned with are from HOMO
to LUMO
The orbital types of HOMO/LUMO partially determine the
energy required to make the transition

Formaldehyde UV-Vis
Possible Transitions for Formaldehyde
* at 182 nm
n * at 290 nm
But do we see sharp peaks at those wavelengths?
Why are electronic transitions broad?
Answer: Vibrational transitions combined with
condensed phase and solvent effects broaden
UV-Vis peaks

Absorption Intensities
* at 182 nm ( = 10,000 L M-1 cm-1)
n * at 290 nm ( = 12 L M-1 cm-1)

In formaldehyde, * has strong absorption

n * has very weak absorptions
= Molar absorptivity
Beers Law: A = c l
Hence, UV-Vis can be used to quantify
chromatography peaks linearly

After Absorption

Stokes Shift

Remember: Emission spectra are redshifted relative to absorption (excitation)

spectra

Aromatic Rings
Benzene rings absorb nominally at about 254 nm but

this can change depending on auxochromes

Absorption bands are redshifted by:
Electron donating groups (OH, NH2) redshift

* transitions
Extended conjugation (NO2, C=O) which create n * transitions
at longer wavelengths

Auxochromes
H

OH

254 nm; = 200

270 nm; = 1450
280 nm; = 1450

NH2

269 nm; = 7800 ( *)

330 nm; = 125 (n *)
NO2

Halogens
Halogens redshift UV-Vis spectra in the order

F << Cl < Br < I because of polarizability

1: 10 Br
2: 9 Br
3: 8 Br
4: 7 Br
5: 6 Br
6: 5 Br
7: 4 Br
8: Sunlight

Wavelength Selection
For HPLC-UV, want to observe a chromatogram at the

longest reasonable wavelength, why?

Signal:noise is usually better at longer wavelengths due to
reduction in noise from mobile phase and impurities
Ex: DNPH derivitization of carbonyls

Wavelength Selection
O

Acetone
MAX = 190 nm

DNPH-Acetone
MAX = 360 nm

NO2
H
N
N
O2N

Solvent Cutoffs
Acetonitrile
Methanol
Water
Chloroform
THF
Ethyl acetate
Toluene
Acetone
Pyridine

190 nm
205 nm
200 nm
245 nm
215 nm
254 nm
284 nm
330 nm
330 nm

Chromatograms
Top = 220 nm
Bottom = 280 nm
OH

CBN
O

OH

CBD
HO

Chromatograms

= 245 nm

HPLC-UV-Vis
Generally, UV-Vis HPLC detector not too different

from a standalone UV-Vis (flow cell instead of a

cuvette)
Variable wavelength detector vs. Diode array
detector

HPLC-UV-Vis
Variable wavelength detector - monochromator

PMT

HPLC-UV-Vis
Diode array detector - polychromator

HPLC-UV-Vis
Variable Wavelength detector
More sensitive due to photomultiplier tube or
amplification circuitry
Requires more method development
Diode array detector
Less sensitive due to photodiodes only
Very easy to develop a method

Fluorescence
Example: Highlighter Pens absorb

UV and blue light and emit yellow-green

Fluorescence Detectors

Fluorescence Detectors
Greater sensitivity and selectivity over

UV-Vis but the analyte must fluoresce!

flu > abs
What makes a good fluorophore?
High absorbance, aromatic
Fused rings, electron donating groups
Quantum yield ()

Fluorescence Detectors
Need to select an excitation and an emission

wavelength

Chromatogram
Top: UV-Vis
Bottom: Fluorescence

Hence, fluorescence is more selective and

sensitive due to noise reductions

Kesimpulan
Refractive Index Detector
Legacy detector, insensitive, no gradients in mobile phase
possible
UV-Vis Detector
Detects absorption of chromophoric analytes based on molecular
structure
Variable wavelength vs. Diode array detector
Fluorescence Detector
Most sensitive and selective detector

Kurva kalibrasi
Nilai sebenarnya
Area
(ng/mL)
0,00
20,50
51,19
102,39
204,98
511,94
1023,89
2559,72

0,0000
0,0249
0,0704
0,1498
0,3021
0,7713
1,5683
3,9766

Nilai
terukur
(ng/mL)
0,00
23,03
51,52
101,11
196,34
489,54
987,68
2492,86

0,00
20,50
51,19
102,39
204,98
511,94
1023,89
2559,72

0,0000
0,0249
0,0704
0,1498
0,3021
0,7713
1,5683
3,9766

Nilai terukur

Nilai
sebenarnya
(ng/mL)

20,50

10,25

AREA

0,0241
0,0232
0,0253
0,0254
0,0258
0,0157
0,0159
0,0104
0,0300
0,0000

Nilai terukur
(ng/mL)
22,57
21,97
23,28
23,39
23,61
17,31
17,46
13,98
26,26
7,50

% diff = akurasi
% CV = presisi

Rata-rata
terukur
(ng/mL)

SD

CV
(%)

22,96

0,68

2,95

16,50

6,78

41,12

% Diff
10,13
7,19
13,59
14,11
15,17
-15,55
-14,84
-31,81
28,09
-63,41