DEPARTAMENTO DE

BIOQU
IMICA Y BIOLOG
IA MOLECULAR

GRADO EN BIOTECNOLOG
IA

N EN BIOTECNOLOG
EXPERIMENTACIO
IA-2

Curso 2013/2014

NOMBRE Y APELLIDOS:
CURSO Y GRUPO:
Taquilla no :

4/4/2014


INDICE GENERAL
CTICA No 1: Efecto del pH sobre la actividad de la
1. PRA
fosfatasa.

on.
1.1. Introducci

1.1.1. Determinaci
on del pH
optimo de la fosfatasa.

1.1.2. Determinaci
on de la actividad de la fosfatasa.

1.2. Procedimiento.

1.3. Resultados.

CTICA No 2: Determinaci
2. PRA
on de la Km de la fosfatasa para el
p-nitrofenil-fosfato y de la Ki para la inhibici
on por fosfato.

2.1. Introducci
on.

2.1.1. Determinaci
on de la Km .

on de la Ki .
2.1.2. Determinaci

2.2. Procedimiento.

2.3. Resultados.

CTICA No 3: Estudio de la respuesta a la temperatura de la

3. PRA
fosfatasa
acida.

3.1. Introducci
on.

3.2. Materiales.

3.3. Procedimiento.

3.3.1. Estudio de la cin

etica de inactivaci
on t
ermica.

3.3.2. Estudio de la energ

a de activaci
on.

CTICA No 4: Obtenci
on de extractos libres de c
elulas y
4. PRA
determinaci
on cuantitativa de prote
nas.

11

4.1. Obtenci
on de extractos libres de c
elulas .

11

4.2. Determinaci
on cuantitativa de prote
nas.

11

4.3. Procedimiento del ensayo de prote

na.

12

4.4. Resultados.

13
i

 CTICA No 5: Determinaci
5. PRA
on de la invertasa (sacarasa).

15

5.1. Fundamento.

15

5.2. Procedimiento del ensayo.

15

5.3. Resultados.

16

CTICA No 6: Determinaci
6. PRA
on de la hexoquinasa.

18

6.1. Fundamento.

18

6.2. Procedimiento.

19

6.3. C
alculo de la relaci
on de fosforilaci
on fructosa/glucosa en cada
muestra.

19

CTICA No 7: Preparaci
7. PRA
on y utilizaci
on de un enzima
inmovilizado.

20

on.
7.1. Introducci

20

7.1.1. Fundamento de la inmovilizaci

on con alginato s
odico.

20

7.1.2. Fundamento del m

etodo de valoraci
on de la glucosa.

21

7.2. Materiales.

21

7.3. Procedimiento.

21

7.3.1. Preparaci
on de la disoluci
on de cloruro c
alcico.

22

7.3.2. Preparaci
on de la disoluci
on de -galactosidasa.

22

7.3.3. Inmovilizaci
on del enzima.

22

7.3.4. Carga y utilizaci

on de la minicolumna.

22

7.4. Conclusiones.

22

CTICA No 8: Determinaci
on de colesterol en suero.
8. PRA

23

8.1. Introducci
on general.

23

8.2. Esquema general de la pr

actica.

23

8.2.1. Fundamento.

23

8.2.2. Procedimiento.

24

8.3. Resultados.

25

ii

 CTICA No 1
PRA
Efecto del pH sobre la actividad de la fosfatasa
1.1. Introducci
on.
La mayor parte de los enzimas poseen un pH caracterstico al que su actividad es
m
axima: por encima y por debajo de ese pH la actividad disminuye. En esta pr
actica
se va a averiguar el pH
optimo al que act
ua la fosfatasa. Este enzima cataliza la
reacci
on siguiente:
p-nitrofenil-fosfato + H2 O p-nitrofenol + fosfato.
1.1.1. Determinaci
on del pH
optimo de la fosfatasa.
Con objeto de averiguar el pH
optimo al que tiene lugar la hidr
olisis del

p-nitrofenil-fosfato catalizada por la fosfatasa, se incuban a 30 C concentraciones

fijas de enzima y de sustrato en diferentes tubos a diferentes pHs.
En el tubo cuyo pH sea
optimo para la acci
on de la fosfatasa, la cantidad de
p-nitrofenil-fosfato hidrolizado ser
a mayor, y por tanto, el p-nitrofenol liberado ser
a
m
as elevado.
1.1.2. Determinaci
on de la actividad de la fosfatasa.
La determinaci
on de la actividad de la fosfatasa se realiza midiendo la
concentraci
on o absorbancia de p-nitrofenol liberado por acci
on del enzima durante
un perodo de tiempo determinado, en las condiciones de ensayo. El p-nitrofenol
posee un color amarillo caracterstico en disoluci
on alcalina, con un m
aximo de
absorbancia a 400 nm.
1.2. Procedimiento.
Numerar los tubos de ensayo, colocarlos en la gradilla y poner en cada tubo los
siguientes reactivos:
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
Blanco

Tamp
on a ensayar
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6

ml
ml
ml
ml
ml
ml
ml
ml

de
de
de
de
de
de
de
de

pH
pH
pH
pH
pH
pH
pH
pH

=
=
=
=
=
=
=
=

2
3
4
5
6
7
8
9

Fosfatasa
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2

ml de 0,05 mg/ml
ml

ml

ml

ml

ml

ml

ml

Agua

0,8 ml

P
agina 2

CTICA No 1. Efecto del pH sobre la actividad de la fosfatasa.

PRA

A continuaci
on, introducir la gradilla con los tubos conteniendo el tamp
on

correspondiente y la fosfatasa en un ba
no graduado a 30 C.
A
nadir a todos los tubos, inclu
do el blanco, 0,2 ml de p-nitrofenil-fosfato
50 mM con un intervalo de 30 s entre tubo y tubo. Mezclar bien los componentes
con un agitador tras iniciar la reacci
on en cada tubo. Dejar transcurrir la reacci
on
durante 15 min en estas condiciones.
Detener la reacci
on con 3 ml de Na2 CO3 0,1 M, tambi
en con intervalos de
30 segundos, y empezando en el mismo orden que en la etapa anterior.
Sacar la gradilla con los tubos del ba
no y medir la absorbancia a 400 nm en un
colormetro frente al blanco, anotando los datos correspondientes a los distintos
pHs ensayados.
Representar gr
aficamente los resultados, poniendo en abscisas el pH y en
ordenadas la absorbancia a 400 nm. Qu
e otra representaci
on interesa hacer, y qu
e
informaci
on proporciona?
Teniendo en cuenta que el valor del coeficiente de extinci
on molar () del
p-nitrofenol a 400 nm es 400nm =16600 M1 cm1 , calcular los moles de p-nitrofenol
liberados por minuto (unidades de actividad enzim
atica), cuando el enzima funciona
en condiciones
optimas de pH y a temperatura prefijada.
1.3. Resultados.
Tubo

pH

A400nm

1. C
alculo de los moles de p-nitrofenol liberado por minuto para el valor
optimo de
pH (unidades de actividad enzim
atica):

Secci
on 1.3. Resultados.

T
tulo:

P
agina 3

 CTICA No 2
PRA
Determinaci
on de la Km de la fosfatasa para el
p-nitrofenil-fosfato y de la Ki para la inhibici
on por fosfato

2.1. Introducci
on.
La actividad enzim
atica se ve afectada por varios factores, uno de los cuales es
la concentraci
on de sustrato.
La constante de Michaelis (Km ) se define como la concentraci
on de sustrato para
la cual la velocidad de reacci
on es la mitad de la velocidad m
axima. Sirve pues, para
saber la concentraci
on mnima de sustrato a la que hay que realizar los ensayos de
actividad enzim
atica.
La inhibici
on se define como la disminuci
on de la velocidad de la reacci
on
catalizada por un enzima, provocada por la presencia de determinadas sustancias
denominadas inhibidores.
Los enzimas pueden inhibirse reversiblemente seg
un varios mecanismos. En el
m
as com
un, la inhibici
on competitiva, la uni
on del sustrato y del inhibidor al enzima
son mutuamente excluyentes. La inhibici
on competitiva se caracteriza porque en
presencia del inhibidor cambia la Km pero no la Vm . Por el contrario, los inhibidores
no competitivos cambian la Vm pero no la Km .
La constante de inhibici
on (Ki ) se define como:
E + I EI

Ki =

[E] [I]
[EI]

y mide la afinidad del enzima por el inhibidor.

2.1.1. Determinaci
on de la Km .
La determinaci
on de la Km de la fosfatasa
acida para el p-nitrofenil-fosfato
se realiza incubando el enzima con diferentes concentraciones del sustrato
on o absorbancia del p-nitrofenol
p-nitrofenil-fosfato y midiendo la concentraci
liberado en cada caso.
2.1.2. Determinaci
on de la Ki .
La determinaci
on de la Ki para el fosfato se realiza incubando el enzima en las
condiciones anteriores y en presencia de una concentraci
on constante del inhibidor
fosfato.
4

P
agina 5

Secci
on 2.2. Procedimiento.

2.2. Procedimiento.
Numerar los tubos de ensayo y colocarlos en la gradilla.
Poner en cada tubo los siguientes reactivos:

Tubo

Tamp
on

550 l

50 l de 8 mM

200 l

500 l

100 l de 8 mM

200 l

400 l

200 l de 8 mM

200 l

300 l

300 l de 8 mM

200 l

550 l

50 l de 80 mM

200 l

500 l

100 l de 80 mM

200 l

400 l

200 l de 80 mM

200 l

300 l

300 l de 80 mM

200 l

Tamp
on

p-nitrofenil-fosfato

KH2 PO4 50 mM

p-nitrofenil-fosfato

Agua

550 l

50 l de 8 mM

200 l

10

500 l

100 l de 8 mM

200 l

11

400 l

200 l de 8 mM

200 l

12

300 l

300 l de 8 mM

200 l

13

550 l

50 l de 80 mM

200 l

14

500 l

100 l de 80 mM

200 l

15

400 l

200 l de 80 mM

200 l

16

300 l

300 l de 80 mM

200 l

Blanco

950 l

50 l de 80 mM

Seguidamente, introducir la gradilla en un ba

no graduado a 30 C y a
nadir a cada
uno de los tubos excepto el blanco, 0,2 ml de la disoluci
on de fosfatasa
acida
0,05 mg/ml, con un intervalo de 30 segundos entre tubo y tubo.
Incubar durante 15 minutos a 30 C. Detener la reacci
on con 3 ml de Na2 CO3
0,1 M tambi
en con intervalos de 30 segundos entre tubo y tubo, y empezando en el
mismo orden que en la etapa anterior.
Sacar la gradilla con los tubos del ba
no y medir la absorbancia a 400 nm en un
colormetro frente al blanco, anotando los datos correspondientes a las distintas
concentraciones de p-nitrofenil-fosfato ensayadas.
Representar gr
aficamente los resultados de forma que permita calcular la Km
para el p-nitrofenil-fosfato y la Ki para el inhibidor. Calc
ulelos tambi
en con ayuda
de Matlab o de R.

CTICA No 2. Determinaci
PRA
on de la Km y de la Ki de la fosfatasa.

P
agina 6

2.3. Resultados.

Tubo

[S0 ]

v0 SIN inhibidor

(reacci
on)

A400nm

//////

//////

//////

//////

//////

//////

//////

//////
[S0 ]

v0 CON inhibidor

(reacci
on)

A400nm

//////

10

//////

11

//////

12

//////

13

//////

14

//////

15

//////

16

//////

1. Km (en mM) de la fosfatasa para el p-nitrofenil-fosfato:

2. Ki (en mM) de la fosfatasa para el fosfato:

Secci
on 2.3. Resultados.

T
tulo:

T
tulo:

P
agina 7

 CTICA No 3
PRA
Estudio de la respuesta a la temperatura de la fosfatasa
acida

3.1. Introducci
on.
En esta pr
actica, se estudiar
a el efecto del calor sobre la actividad de la fosfatasa
acida procedente de dos orgenes diferentes. Ello nos permitir
a conocer la energa

de activaci
on y la cin
etica de inactivaci
on t
ermica del enzima, y determinar los
par
ametros cin
eticos correspondientes en cada caso. Con estos datos, podremos
adem
as conocer si la fosfatasa
acida obtenida en ambos casos es id
entica, o son
formas diferentes.
Recu
erdese que la velocidad de una reacci
on elemental depende de la
temperatura de acuerdo con la ecuaci
on de Arrhenius:
k = AeEa/RT ,
donde k es la constante de velocidad de la reacci
on, A la constante preexponencial
de Arrhenius, R=8,31441J K1 mol1 la constante universal de los gases, T la
temperatura absoluta, y Ea la energa de activaci
on.
Por otro lado, la inactivaci
on t
ermica se comporta, frecuentemente, como una
reacci
on de primer orden,
Et = E0 ekT t ,
donde E0 es la actividad original (a tiempo cero), Et es la obtenida despu
es de un
tiempo t, y kT es la constante de velocidad de inactivaci
on a la temperatura T.
La fosfatasa
acida (EC3.1.3.2, tambi
en denominada fosfomonoesterasa) cataliza
la siguiente reacci
on de hidr
olisis (la especificidad de substrato es muy amplia en
este enzima):
mono
ester ortofosf
orico + H2 O *
) alcohol + o-fosfato.
Para la valoraci
on de la actividad, el substrato que utilizaremos ser
a el
p-nitrofenilfosfato.
Este es un substrato artificial, sin funci
on biol
ogica, y que
incluso puede ser t
oxico si se utiliza in vivo en substituci
on de los substratos
naturales. Se utiliza frecuentemente en el laboratorio para estudiar la actividad
de fosfatasas in vitro debido a la facilidad de manipulaci
on, a su elevada solubilidad
y a que puede medirse con sensibilidad y precisi
on su hidr
olisis. La hidr
olisis del
p-nitrofenilfosfato por acci
on de la fosfatasa da lugar a la liberaci
on de o-fosfato y
de p-nitrofenol. Este u
aximo de absorci
on de la luz a
ltimo compuesto tiene un m
410 nm (410 = 16600), gracias al cual podemos medir facilmente su concentraci
on.

Secci
on 3.3. Procedimiento.

P
agina 9

3.2. Materiales.
1. Disoluci
on de fosfatasa de germen de trigo con aproximadamente 40 U/l.
2. Tamp
on acetato 0,05 M pH 4,8.
3. p-Nitrofenilfosfato 50 mM.
4. Carbonato de sodio 0,1 M.
5. Ba
nos termostatizados a varias temperaturas.
6. Recipientes con hielo picado.
7. Tubos, pipetas, gradillas, reloj y un colormetro.
3.3. Procedimiento.
3.3.1. Estudio de la cin
etica de inactivaci
on t
ermica.
Dise
ne y realice un experimento que sirva para comprobar si la inactivaci
on
t
ermica de la fosfatasa discurre siguiendo una cin
etica de primer orden. La
a un ba
no a esa
temperatura de inactivaci
on ser
a de 55o C, para lo que habr
temperatura en el laboratorio. Para dise
nar el experimento, asumiremos que el
enzima es estable a 0o C, motivo por el que el enzima se les proporcionar
a en una
bandeja con hielo picado.
Para el dise
no de este experimento:
as all
a de 20 o
1. No prolongue la acci
on desnaturalizadora del calor a 55o C m
30 minutos.
2. Asumiremos que las mol
eculas de este enzima no son capaces de
renaturalizarse una vez desnaturalizadas por acci
on del calor, incluso
a
aunque volvamos a poner la disoluci
on a 0 C.
3. El ensayo de la actividad enzim
atica se realizar
a exactamente igual que en las
dos pr
acticas precedentes, aunque con un u
on (el de pH
optimo), y
nico tamp
una u
on de substrato considerada como cercana a saturante
nica concentraci
y adecuada para el ensayo.
4. Los reactivos se proporcionan todos ya preparados.
Una vez realizado el experimento, represente gr
aficamente los resultados de
alguna manera que permita verificar si el orden de reacci
on es el esperado, y en su
caso, calcular de manera aproximada la constante de velocidad de inactivaci
on.
3.3.2. Estudio de la energ
a de activaci
on.
Dise
ne y realice un experimento que sirva para comprobar si la dependencia de
la velocidad de la reacci
on catalizada por la fosfatasa respecto de la temperatura
cumple lo previsto por ecuaci
on de Arrhenius, y en su caso, determinar el valor de
la energa de activaci
on.
Para el dise
no de este experimento, se sugiere:

P
agina 10

CTICA No 3. Estudio de la respuesta a la temperatura de la fosfatasa a

PRA
cida.

1. Como rango de temperaturas a las que estudiar la velocidad de la reacci

on,
o
o
a en el laboratorio de una
se sugiere el de 0 a 60 C. Para eso se dispondr
serie de ba
nos regulados a 0 C (hielo fundente), 10, 20, 30, 40, 50 y 60 C.
2. Se dispondr
a de los mismos reactivos que para el experimento anterior.
Una vez realizado el experimento, represente gr
aficamente los resultados de
alguna manera que permita verificar si se cumple en todo o en parte lo previsto
seg
un Arrhenius, y en su caso, calcular de manera aproximada la energa de
activaci
on.

 CTICA No 4
PRA
Obtenci
on de extractos libres de c
elulas y determinaci
on
cuantitativa de prote
nas

4.1. Obtenci
on de extractos libres de c
elulas .
Para determinar las concentraciones proteicas intracelulares, es necesario
obtener extractos libres de c
elulas.
Cada grupo parte de c
elulas recogidas por centrifugaci
on de 10 ml de cultivo
de cada una de las cepas: silvestre (DBY 1315) y mutante (DBY 2052), que le ser
an
suministrados por los profesores al comienzo de la pr
actica.
1. LAVAR las c
elulas para eliminar los restos del medio de cultivo. Para ello, se
a
naden a cada sedimento de c
elulas 3 ml de agua destilada y se resuspenden
agitando en el vortex a velocidad m
axima.
2. RECOGER las c
elulas lavadas centrifugando como en el paso 1. Decantar
r
apidamente el sobrenadante y guardar el sedimento.
3. ROMPER las c
elulas. Para ello se a
naden a los sedimentos obtenidos en
el paso anterior aproximadamente 0,5 g de perlas de vidrio, y se agitan
vigorosamente en el vortex a m
axima velocidad durante 1 minuto, al cabo del
cual se introducen los tubos inmediatamente en hielo donde se mantienen
N 3 VECES.
durante 1 minuto. REPETIR ESTA OPERACIO
ADIR 1 ml de tamp
4. AN
on fosfato pot
asico 20 mM pH 7,0 a cada muestra y
mezclar agitando en el vortex.
5. DECANTAR las c
elulas rotas en un tubo de microcentrfuga, de forma que las
bolas de vidrio queden en el tubo inicial.
6. CENTRIFUGAR el lisado celular en una microcentrfuga durante 10 minutos
a velocidad m
axima.
7. RECOGER EL SOBRENADANTE con una micropipeta en un tubo de
microcentrfuga. La muestra as obtenida es el extracto libre de c
elulas,
donde se encuentran los enzimas que se ensayar
an.
8. GUARDAR LOS EXTRACTOS para la siguiente pr
actica.
4.2. Determinaci
on cuantitativa de prote
nas.
Uno de los m
etodos m
as utilizados para la determinaci
on cuantitativa de
protena total es el propuesto por Lowry y colaboradores en 1951. El proceso en
11

P
agina 12

CTICA No 4. Obtenci
PRA
on de ELC y determinaci
on de protenas.

s tiene notable inter

es por su aplicaci
on directa y como referencia en m
etodos de
laboratorio o de diagn
ostico clnico.
El color azul desarrollado es el resultado de la reacci
on de la protena con
2+
los iones Cu
en medio alcalino (reacci
on de Biuret) y de la reacci
on del
acido
fosfomolbdico-fosfowolfr
amico (reactivo de Folin) con los amino
acidos tirosina y
tript
ofano existentes en la protena.
El biuret (H2 N-CO-NH-CO-NH2 ) es un compuesto que se obtiene al calentar la urea
y contiene en su mol
ecula dos enlaces amida sucesivos, an
alogos a los existentes en
las protenas. El biuret, en medio alcalino, forma unos complejos de coordinaci
on
con el cobre de color azul-morado caracterstico.

O=C
@
RCH
O=C
@

C=O
NH
..

..

.
..

Cu2+

..
NH

..

..

RCH

HN
@
HCR
C=O

..

HN
@
HCR

Los enlaces peptdicos de las protenas forman con el Cu2+ complejos similares
a
este, permitiendo la determinaci
on cuantitativa de la protena. Ahora bien,
esta reacci
on es poco sensible, necesit
andose cantidades de protena del orden de
miligramos para que el color desarrollado sea aparente.
En el m
etodo de Lowry este inconveniente se supera mediante la utilizaci
on del
reactivo de Folin-Ciocalteau, el cual intensifica el color de los complejos c
upricos
formados en la reacci
on de Biuret y adem
as reacciona con los residuos de tirosina y
tript
ofano de la protena, produciendo coloraci
on azulada.
Mediante el uso de una disoluci
on de protena de concentraci
on conocida de la
que se a
naden vol
umenes crecientes a los tubos de ensayo, se puede elaborar una
recta patr
on, relacionando la cantidad de protena a
nadida con su correspondiente
absorbancia. La recta patr
on sirve despu
es para deducir la cantidad de protena
presente en el tubo problema, la cual nos permitir
a calcular la concentraci
on
original.
4.3. Procedimiento del ensayo de prote
na.
1. Pipetear en un tubo de ensayo muestra + H2 O hasta un volumen de 1 ml;
2. A
nadir 2,5 ml de reactivo del cobre alcalino1 (Na2 CO3 2% en NaOH 0,1 N;
CuSO4 1%; tartrato s
odico pot
asico 2%; 100:1:1);
1 Preparaci
on del reactivo del cobre alcalino: mezclar

50 ml de Na2 CO3 2% en NaOH 0,1 N,

0,5 ml de CuSO4 1%, y
0,5 ml de tartrato s
odico pot
asico 2%.

P
agina 13

Secci
on 4.4. Resultados.

3. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente;

4. A
nadir 0,5 ml de reactivo Folin utilizando una pipeta de vidrio;
5. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente;
6. Leer a 500 nm, ajustando el aparato previamente con el blanco.
N con 50, 100, 200, 300, 400 y 500 l de una
Hacer una CURVA DE CALIBRACIO
disoluci
on de seroalb
umina bovina de 0,2 mg/ml.
Hacer un BLANCO con 1 ml de H2 O destilada sin muestra.
4.4. Resultados.

Muestra (l)
Silvestre 10
Silvestre 20
Mutante 10
Mutante 20

A 500 nm

g Protena

mg/ml

P
agina 14

T
tulo:

CTICA No 4. Obtenci
PRA
on de ELC y determinaci
on de protenas.

 CTICA No 5
PRA
Determinaci
on de la invertasa (sacarasa)

5.1. Fundamento.
La -fructofuranosidasa (EC3.2.1.26, nombre com
un invertasa) cataliza in vivo
la hidr
olisis de la sacarosa. La reacci
on in vitro utiliza igualmente la sacarosa
como sustrato que es hidrolizado por el enzima existente en las muestras
endose glucosa y fructosa como producto de la reacci
on. Ninguno de
obteni
estos az
ucares es detectable directamente por lo que se a
naden a la mezcla de
reacci
on glucosa oxidasa, peroxidasa y ABTS [sal de diamonio del
acido 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulf
onico)], que mediante reacciones acopladas utilizando
como sustrato la glucosa, oxida una mol
ecula de ABTS por cada mol
ecula de glucosa
formada en la reacci
on de la invertasa.
invertasa

sacarosa + H2 O glucosa + fructosa

O2 + H2 O \
glucosa
oxidasa
y
acido gluc
onico

+ H2 O2

ABTS (incoloro) +

peroxidasa

ABTS oxidado
y
(verde)
H2 O
El ABTS oxidado, producto de la reacci
on de la peroxidasa, en medio
acido es de
una coloraci
on verdosa que tiene un m
aximo de absorci
on a 420 nm. La intensidad
del color es proporcional a la cantidad de glucosa presente, y
esta depender
a de la
cantidad de INVERTASA existente en las muestras.
5.2. Procedimiento del ensayo.
1. Se utilizan los extractos libres de c
elulas obtenidos en la pr
actica 4.1
(p
ag. 11).
2. Pipetear en tubos de ensayo (tabla 5.1) 10 y 50 l del extracto de la cepa
silvestre diluida 1:10, y 10 y 50 l de la cepa mutante diluida 1:40;
3. A
nadir tamp
on acetato 0,1 M pH 5 hasta completar los vol
umenes a 200 l;
4. Iniciar la reacci
on a
nadiendo (A TIEMPOS): 50 l de sacarosa 0,5 M (sustrato);
15

CTICA No 5. Determinaci
PRA
on de la invertasa (sacarasa).

P
agina 16

5. Incubaci
on: de 10 minutos en un ba
no a 30 C;
6. Detenci
on de la reacci
on y valoraci
on de la glucosa formada: A
nadir (A
2
TIEMPOS) 1 ml de una mezcla de glucosa oxidasa/peroxidasa/ABTS );
7. Incubar de 10 a 20 minutos (seg
un el desarrollo del color) a 30 C;
8. Detener la reacci
on a
nadiendo (A TIEMPOS) 2,5 ml de HCl 0,2 N;
9. Leer la absorbancia a 420 nm;

Tabla 5.1. Resumen de los reactivos a pipetear para la determinaci

on de la invertasa.
Tubo
No
1

Muestra

volumen

Tamp
on

Sacarosa

Gluc.oxid.

HCl 0,2 N

(l)

(l)

(l)

(ml)

(ml)

Cepa silvestre 10

190

50

1,0

2,5

Cepa

silvestre

50

150

50

1,0

2,5

Cepa

mutante

10

190

50

1,0

2,5

Cepa

mutante

50

150

50

1,0

2,5

Glucosa 1 mM

20

180

50

1,0

2,5

Glucosa 1 mM

40

160

50

1,0

2,5

Glucosa 1 mM

60

140

50

1,0

2,5

Glucosa 1 mM

80

120

50

1,0

2,5

Glucosa 1 mM 100

100

50

1,0

2,5

200

50

1,0

2,5

2
3

Blanco

= cepa silvestre diluida 10 veces, = mutante diluida 40 veces

5.3. Resultados.
Muestra

A 420 nm

nmoles gluc.

nmoles/min

mU/ml

mU/mg

Silvestre
Silvestre
Mutante
Mutante
2 Composici
on del reactivo: glucosa oxidasa 1000 U/l, peroxidasa 5 mg/l, ABTS 0,6 g/l en tamp
on

fosfato pot
asico 0,1 M pH 7. Para preparar la mezcla, a
nadir a 1 l de tamp
on: 1 ml de glucosa
oxidasa comercial y 5 mg de peroxidasa. En el momento de usar se a
naden 0,6 g de ABTS.

Secci
on 5.3. Resultados.

T
tulo:

P
agina 17

 CTICA No 6
PRA
Determinaci
on de la hexoquinasa
6.1. Fundamento.
La hexoquinasa cataliza in vivo la fosforilaci
on de hexosas (glucosa y fructosa),
siendo el ATP el donador de los grupos fosforilos. Para determinar la actividad in
vitro distinguiremos dos casos, seg
un cu
al sea el sustrato utilizado:
1. Con fructosa como sustrato. El producto de la reacci
on es fructosa-6-P cuya
concentraci
on en la mezcla de reacci
on se determina indirectamente por
medio de reacciones acopladas catalizadas por la fosfoglucosa isomerasa
que cataliza la formaci
on de una mol
ecula de glucosa-6-P a partir de una de
fructosa-6-P. La glucosa-6-P por acci
on de la glucosa-6-P deshidrogenasa en
presencia de NADP+ se oxida de forma que por cada mol
ecula de glucosa6-P oxidada se formar
a una de NADPH. La velocidad de formaci
on de
este compuesto nos permite determinar la concentraci
on de hexoquinasa
existente en la muestra.
hexoquinasa

fructosa + ATP fructosa-6-fosfato + ADP

fosfoglucosa

isomerasa
y
glucosa-6-fosfato

NADP+ +

glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa
NADPH

y
+ H+
6-fosfogluconolactona
2. Con glucosa como sustrato
hexoquinasa

glucosa + ATP glucosa-6-fosfato + ADP

NADP+ +

glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa
NADPH

y
+ H+
6-fosfogluconolactona
A 340 nm se mide el incremento de absorbancia debido a la aparici
on de NADPH,
de forma que por cada mol de glucosa, o de fructosa, que se consume por acci
on
de la hexoquinasa, aparece un mol de NADPH. El coeficiente de extinci
on molar del
NADPH a 340 nm es 6300 M1 cm1 .
18

Secci
on 6.3. C
alculo de la relaci
on de fosforilaci
on fructosa/glucosa en cada muestra.

P
agina 19

6.2. Procedimiento.
1. Preparar 10 ml de cada mezcla de reacci
on3 mezclando en dos tubos:
en uno de los tubos (para medir la fosforilaci
on de la glucosa),
9 ml de glucosa 10 mM MgCl2 7,5 mM en Tris/HCl 20 mM pH 7,5,
en el otro tubo (para medir la fosforilaci
on de la fructosa), 9 ml
de fructosa 10 mM MgCl2 7,5 mM en Tris/HCl 20 mM pH 7,5,
200 l de NADP+ 30 mM,
500 l de ATP 15 mM, y
200 l de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (100 U/ml).
en el tubo para medir la fosforilaci
on de la fructosa, se a
naden
adem
as 100 l de fosfoglucosa isomerasa (400 U/ml).
2. Pipetear en la cubeta del espectrofot
ometro, termostatizada a 25o C, 1 ml de
mezcla de reacci
on;
3. Comenzar la reacci
on a
nadiendo 10 l de extracto en el caso de la cepa
silvestre y 50 l en el de la cepa mutante;
4. Seguir la reacci
on en el registrador, midiendo incrementos de absorbancia a
340 nm.
6.3. C
alculo de la relaci
on de fosforilaci
on fructosa/glucosa en cada
muestra.

Cepa

Medio

Silvestre

Glucosa

Silvestre

Fructosa

Mutante

Glucosa

Mutante

Fructosa

3 Composici
on de la mezcla de reacci
on:

A340 /min

U/ml

U/mg

NADP+ 0,48 mM, ATP 0,65 mM, glucosa-6-fosfato

deshidrogenasa 0,7 U/ml, glucosa o fructosa 10 mM y fosfoglucosa isomerasa 4 U/ml si el
sustrato es fructosa.

 CTICA No 7
PRA
Preparaci
on y utilizaci
on de un enzima inmovilizado

7.1. Introducci
on.
La inmovilizaci
on de los enzimas consiste en fijarlos de alguna manera a
alg
un soporte s
olido sin que se vean afectadas sus propiedades catalticas de
forma relevante. Existen numerosas maneras de inmovilizar enzimas, y la elecci
on
depende, principalmente, del uso al que est
an destinados.
Para muchas aplicaciones pr
acticas, los enzimas inmovilizados presentan
ventajas frente a las preparaciones en disoluci
on. Generalmente, son m
as estables
que en disoluci
on, lo que permite mantenerlos activos durante m
as tiempo y en
condiciones m
as adversas. Al estar fijados a soportes s
olidos son facilmente
separables de los componentes solubles, lo que facilita su recuperaci
on y evita
impurificar otros materiales.
En esta pr
actica, se inmovilizar
a un enzima mezcl
andolo con alginato s
odico,
un polmero capaz de formar entramados en los que quedan atrapadas las
macromol
eculas, pero dejando poros suficientemente grandes para permitir el paso
de los substratos y de los productos. El enzima utilizado ser
a la -D-galact
osido
galactohidrolasa (EC3.2.1.23, nombre com
un -galactosidasa), una hidrolasa que
cataliza la escisi
on de la galactosa terminal de diversos galact
osidos, siendo el m
as
relevante la lactosa, el az
ucar de la leche, por lo que tambi
en se le conoce como
lactasa:
lactosa + H2 O galactosa + glucosa.
Se verificar
a su utilidad haciendo pasar muestras de leche, preferiblemente
pasteurizada, por minicolumnas cargadas con el enzima inmovilizando, y
comprobando la presencia o ausencia de glucosa antes y despu
es del tratamiento
con el enzima inmovilizado.
7.1.1. Fundamento de la inmovilizaci
on con alginato s
odico.
Los alginatos son polisac
aridos procedentes de algas pardas marinas, son muy
utilizados en la industria alimentaria como substancias gelificantes aptas para el
acido D-manur
onico
consumo humano. Son mezclas de polmeros lineales del
(poli-M), del
acido -L-gulur
onico (poli-G), o de ambos alternados (poli-GM), unidos
mediante enlaces 14.
Los dos mon
omeros son derivados
acidos de hexosas que adoptan la
conformaci
on de anillos piranosa con un grupo carboxilo en posici
on ecuatorial.
Mientras que el
acido algnico es insoluble, sus sales de metales alcalinos (por
20

P
agina 21

Secci
on 7.3. Procedimiento.

ejemplo, el alginato s
odico) s son solubles en el agua. En presencia de Ca2+ gelifican
r
apidamente gracias a la formaci
on de complejos entre pares de cadena adyacentes
de poli-G entre las que se intercalan los iones calcio a raz
on de uno entre cuatro
restos de L-guluronato.
7.1.2. Fundamento del m
etodo de valoraci
on de la glucosa.
Para analizar la glucosa, se utilizar
a un ensayo enzim
atico cl
asico basado
en la utilizaci
on de dos reacciones acopladas, catalizadas sucesivamente por la
glucosaoxidasa (EC1.1.3.4) y por la peroxidasa (EC1.11.1.7). Este ensayo es sensible,
preciso y f
acil de llevar a cabo. Las reacciones que tienen lugar son las siguientes:
glucosa

-D-glucosa + O2 *
)

D -glucono-1,5-lactona

oxidasa

+ H2 O2

peroxidasa

H2 O2 + ABTS (incoloro) *
) H2 O + ABTS oxidado (verde).
La glucosa-oxidasa, que tiene FAD como cofactor, es un enzima con una gran
especificidad, lo que permite valorar la concentraci
on de glucosa de forma muy
precisa, incluso en presencia de otros az
ucares. La peroxidasa, que contiene un
grupo hemo, es, sin embargo, muy especfico para el agua oxigenada, pero muy
poco respecto al reductor. En este ensayo, se utiliza como reductor un compuesto
etico, el ABTS o sal de diamonio del
acido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6sint
sulf
onico), que tiene la propiedad de mostrar un m
aximo de absorci
on importante a
420 nm que solo aparece cuando est
a oxidado.
7.2. Materiales.
1. Alginato de sodio.
2. CaCl2 .
3. Tamp
on acetato s
odico 10 mM pH 5.
4. -galactosidasa.
5. Disoluci
on de glucosa 5 mM (patr
on).
6. Tiras reactivas para el an
alisis r
apido de glucosa.
on de HCl 0,2 N (en caso de an
alisis cuantitativo de glucosa).
7. Disoluci
on (jeringa de 5 o 10 ml), lana de vidrio, trpode
8. Una minicolumna para filtraci
con pinzas de sujecci
on.
9. Vasos de precipitados de 50100 ml, tubos, pipetas, gradillas, etc.
7.3. Procedimiento.
Cada equipo experimentador preparar
a una de las disoluciones de partida que
compartir
a con los compa
neros. Despu
es, cada uno preparar
a y utilizar
a el enzima
inmovilizado a partir de esas disoluciones.

P
agina 22

CTICA No 7. Preparaci
PRA
on y utilizaci
on de un enzima inmovilizado.

7.3.1. Preparaci
on de la disoluci
on de cloruro c
alcico.
Cada experimentador necesitar
a 100 ml de una disoluci
on de CaCl2 al 1,5% (p/v).
Calcular la cantidad necesaria y prepararla disolviendo el CaCl2 en agua destilada.
7.3.2. Preparaci
on de la disoluci
on de

-galactosidasa.

Cada experimentador necesitar

a 1 ml de una disoluci
on con, aproximadamente,
2000 U de -galactosidasa disuelta en tamp
on fosfato s
odico 10 mM pH 6 o de
tamp
on acetato s
odico 10 mM pH 5.
7.3.3. Inmovilizaci
on del enzima.
A
nadir 1 ml de la disoluci
on de -galatosidasa a 8 ml de disoluci
on de alginato
s
odico y mezclar por inversi
on.
Disponer 100 ml de CaCl2 en un vaso de precipitados. Con una pipeta
autom
atica de 1 ml, a
nadir gota a gota la mezcla de alginato-enzima sin que la punta
on de CaCl2 .
de la pipeta entre en contacto con la disoluci
Dejar reposar unos minutos las perlas gelificadas con el enzima inmovilizado
que se habr
an formado, y recuperarlas utilizando un filtro y un embudo.
7.3.4. Carga y utilizaci
on de la minicolumna.
Lavar la columna con varios mililitros del tamp
on utilizado para disolver el
enzima.
Una vez cargada, la minicolumna puede utilizarse para hidrolizar lactosa. Para
ello, se a
nadir
a leche (preferiblemente pasteurizada) con una pipeta sobre la parte
superior, se dejar
a que atraviese la columna por gravedad y se recoger
a por el otro
extremo. Se comprobar
a la hidr
olisis de la lactosa analizando la presencia de glucosa
en la leche antes y despu
es de atravesar la columna.
La presencia de glucosa se detectar
a r
apidamente utilizando tiras reactivas
especficas, cuyo resultado es solo aproximado.
7.4. Conclusiones.
Comparar la concentraci
on de glucosa (aunque sea aproximada con las tiras)
de muestras de leche antes y despu
es de tratarlas con el enzima inmovilizado.
Qu
e significa el resultado obtenido? Por qu
e piensa que se recomendaba utilizar
preferentemente leche pasteurizada para realizar el experimento?

 CTICA No 8
PRA
Determinaci
on de colesterol en suero

8.1. Introducci
on general.
El colesterol es un esteroide con un grupo hidroxilo secundario en la posici
on C3 .
Se sintetiza en muchos tejidos, pero especialmente en el hgado. Aproximadamente
tres cuartos del colesterol se forman por sntesis end
ogena y una cuarta parte se
ingiere con la dieta.
Dada la naturaleza insoluble del colesterol, en el suero se encuentra formando
on y transporte.
Estas
parte de lipoprotenas que permiten su solubilizaci
lipoprotenas se diferencian entre si tanto en la composici
on lipdica como en la
proteica y se clasifican en varios grupos de acuerdo a su densidad (quilomicrones,
VLDL, LDL y HDL). Dos terceras partes del colesterol circulante est
a en forma
esterificada y el resto en forma libre.
8.2. Esquema general de la pr
actica.
En esta pr
actica se van a determinar experimentalmente el colesterol unido a
HDLs y el colesterol total en una muestra de suero de cerdo.
1. Purificaci
on de HDL;
2. Cuantificaci
on del colesterol total y del colesterol-HDL;
3. C
alculos te
oricos de la concentraci
on de VLDL y de LDL.
8.2.1. Fundamento.
La adici
on de
acido fosfot
ungstico e iones magnesio a una muestra de suero
provoca la precipitaci
on de los quilomicrones, VLDL y LDL. El sobrenadante despu
es
de centrifugar contiene las HDL. La determinaci
on del colesterol en la muestra de
suero directamente (antes de la precipitaci
on) permite conocer la concentraci
on del
colesterol total y su determinaci
on en el sobrenadante que contiene las HDL permite
conocer la concentraci
on del colesterol presente en estas lipoprotenas.
El m
etodo que se va a emplear es un m
etodo enzim
atico. La serie de reacciones
implicadas en el m
etodo de ensayo se describe a continuaci
on4 .
4 Composici
on del reactivo:

oxidasa de colesterol 100 U/l,

esterasa de colesterol 1250 U/l,
peroxidasa 800 U/l,
4-aminoantipirina (AAP) 0,25 mM y
acido hidroxibenzoico (AHB) 10 mM pH 6,6.

23

CTICA No 8. Determinaci
PRA
on de colesterol en suero.

P
agina 24

1. Los
esteres de colesterol son hidrolizados enzim
aticamente por la esterasa
de colesterol hasta colesterol y
acido graso libre:
esterasa de

esteres de colesterol colesterol +

acido graso.

colesterol

2. El colesterol libre, incluyendo el presente originalmente en el suero, es

oxidado por la oxidasa de colesterol:
oxidasa de

colesterol + O2 4-colesten-3-ona +H2 O2 .

colesterol

3. El per
oxido de hidr
ogeno se combina con el
acido hidroxibenzoico (AHB) y
con la 4-aminoantipirina (AAP) en presencia de peroxidasa para formar un
oforo que puede ser cuantificado a 500 nm:
crom
peroxidasa

2 H2 O2 + AHB + AAP colorante de quinonimina + 4 H2 O.

8.2.2. Procedimiento.
1. Precipitaci
on del colesterol unido a lipoprotenas diferentes de HDL:
Pipetear en un tubo eppendorf 100 l de suero y 250 l
del reactivo de
acido fosfot
ungstico5 .
Agitar mezclando
suavemente.
Dejar precipitando en la meseta 10 min.
Centrifugar 10 min a 4000 rpm en una microcentrfuga de mesa.
Pasar con cuidado (con una P1000) 250 l del sobrenadante a otro
tubo eppendorf limpio. Este sobrenadante contiene las HDL.
2. Determinaci
on del colesterol:
Pipetear en seis tubos de ensayo los vol
umenes de muestras y de
H2 O que se indican en la tabla 8.1. Como muestras se utilizan el
suero problema, el sobrenadante con HDL, o vol
umenes variables
de un suero patr
on que contiene una concentraci
on de colesterol
de 200 mg/dl. Estos vol
umenes variables servir
an para construir
una curva de calibraci
on.
Iniciar la reacci
on a
nadiendo 1000 l del reactivo de ensayo de
colesterol a cada uno de los tubos. Agitar.
on en un ba
no a 30 C durante
Incubar las muestras de reacci
15 min.
Leer la absorbancia a 500 nm frente a un blanco que contiene
100 l de H2 O y 1000 l de reactivo.

5 Composici
on del reactivo:

fosfotungstato de sodio 0,44 mM y

MgCl2 20mM.

P
agina 25

Secci
on 8.3. Resultados.

Tabla 8.1. Resumen de los reactivos a pipetear para la determinaci

on del colesterol.
Tubo

Muestra

volumen

H2 O

Reactivo

(l)

(l)

(ml)

Suero problema

50

50

1,0

Sobrenadante con HDL 100

1,0

Suero patr
on

20

80

1,0

Suero patr
on

40

60

1,0

Suero patr
on

60

40

1,0

Suero patr
on

80

20

1,0

Blanco

100

1,0

8.3. Resultados.

Muestra
Suero problema

(l)

A 500 nm

g colesterol

mg/dl

50

Sobrenadante con HDL 100

A partir de los datos obtenidos, calcular la concentraci

on de LDL sabiendo que
la concentraci
on de triacilgliceroles es 300 mg/dl.
Colesterol total = HDL + VLDL + LDL
VLDL = Triacilgliceroles/5

P
agina 26

T
tulo:

CTICA No 8. Determinaci
PRA
on de colesterol en suero.