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BIOPROSPECCIN DE

MICROORGANISMOS NATIVOS AMILOLTICOS


ORGANISMS WILDS AMILOLITICS BIOPROSPECTING
CLAUDIA P. SNCHEZ1, CARLOS E. MEJA2, CARLOS FIGUEROA M.3,
MABEL ESQUIVIA4, LINA MARIA AGUDELO5, NORELA ZAPATAQ.6

PALABRAS CLAVE:

RESUMEN

Amiloglucosidasa, amilasa, almidn de yuca, enzimas amilolticas,


bacillus sp.

En Colombia se han realizado pocos estudios de prospeccin, a pesar de


poseer una elevada diversidad biolgica. En el presente trabajo se realiz el
estudio de cepas microbianas aisladas de diferentes nichos ecolgicos,
productoras de las enzimas amilolticas, as: procesado de maz, de papa y
de yuca. Los criterios utilizados para el aislamiento de las cepas amilolticas,
fueron los inherentes al crecimiento sobre los medios modificados con
almidn y la positividad frente al Test de Lugol. Los medios empleados
fueron CZAPEK, PCA y MRS modificados. Las cepas obtenidas fueron debidamente purificadas, cro conservadas e identificadas bioqumicamente,
obteniendo un total de 103 cepas nativas. De ste total de cepas, se
seleccionaron debido a la similitud entre microorganismos aislados, 13
cepas. Estas ltimas fueron identificadas bioqumicamente. Los gneros
hallados fueron Bacillus sp, Clostridium sp y Kurthia sp. Las enzimas
amilolticas obtenidas a partir de las cepas nativas presentaron pesos
moleculares que oscilan entre 30 y 150 kDa aproximadamente.

KEYWORDS:
Amiloglucosidase, amilase,
cassava starch, enzymes amylolitics, bacillus sp.

ABSTRACT
In Colombia few studies of prospection have been made, in spite of
having a high biological diversity. In the present work the study of isolated
____________
Recibido para evaluacin: Diciembre 1 de 2003. Aprobado para publicacin: 27 de febrero de 2004.
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Todos los autores son miembros del Grupo de Biotecnologa, Universidad de Antioquia.
M. Sc. Ingeniera Qumica.
M.Sc. Biotecnologa. Ingeniero Qumico, Microbiologo.
Ph.D. Microbiologo.
Microbiologa.
Ingeniera Qumica.
Qumica, Politcnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid (PCJIC).

Correspondencia: Claudia P. Snchez, e_mail: csanchez@udea.edu.co

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Vol 2 No.1 Marzo 2004

microbial stocks of different ecological niches, producing of amilolticas enzymes were made, thus: cassava,
potatoes and corn starch processing. The criteria used for the isolation of the amylolitics stocks, were
inherent to the growth on means modified with starch and the true of the Test of Lugol. The culture employees
were modified CZAPEK, PCA and MRS. The obtained stocks properly were purified, child conserved and identified
biochemically, obtaining a total of 103 native stocks. Of this one total of stocks, they were selected due to the
similarity between isolated microorganisms, 13 stocks. These last ones were identified biochemically. The
found sorts were Bacillus sp, Clostridium sp and Kurthia sp. The obtained amylolitics enzymes from the native
stocks displayed molecular weights that oscillate approximately between 30 and 150 KDa.

INTRODUCCIN
La produccin de jarabes se basa en la degradacin del
almidn, y ha sido empleada industrialmente desde la
dcada del 70. Desde entonces, se han venido desarrollando procesos enzimticos que permiten transformar el almidn en los llamados jarabes con alto contenido de fructosa, dando origen a nuevos productos con
mayor poder edulcorante y menor costo en relacin con
el azcar de caa. La produccin de jarabes se da en
dos etapas, en la primera se utiliza una enzima -amilasa
y en la segunda una amiloglucosidasa. En el mundo
actualmente se buscan enzimas amilasas y amiloglucosidasas con caractersticas diferentes a las ya comercializadas.
Los jarabes glucosados son soluciones de glucosa en
alta concentracin que se utilizan en diversas aplicaciones de la industria alimenticia y biotecnolgica (1). Los
jarabes de glucosa se obtienen por hidrlisis enzimtica
del almidn (2). Este proceso requiere dos etapas, la
primera etapa, denominada de licuefaccin, es una
hidrlisis de las largas cadenas de almidn para obtener maltodextrinas (cadenas mas cortas de almidn),
esta es llevada a cabo por la enzima -amilasa que corta
los enlaces glicosdicos -1,4 internos en forma aleatoria
del almidn. En la segunda etapa, denominada
sacarificacin se hidrolizan los enlaces -1,4 y/o -1-6
del terminal no reductor de la cadena de dextrina, por la
enzima amiloglucosidasa, liberando glucosa (3).
Hasta el momento el proceso de hidrlisis enzimtica del
almidn hasta glucosa, se ha llevado a cabo en dos etapas, licuefaccin y sacarificacin, por lo que ha sido necesario cultivar y manipular dos microorganismos productores de enzimas amilolticas separadamente, conllevando a un alto consumo de energa y de equipos para el
proceso adems de las diferencias existentes entre el pH
y la temperatura que necesitan las dos enzimas, es difcil
que ambos acten simultneamente con el almidn.

Las perspectivas futuras con respecto a la hidrlisis


del almidn es acor tar las etapas del proceso, a una
sola etapa ya sea con dos cepas microbianas juntas
con sus respectivas enzimas, con una sola cepa con
las dos enzimas amilolticas, o con una enzima que
tenga capacidad de romper todo tipo de enlace de
las molculas de almidn como lo hace la
Glucoamilasa.
La amiloglucosidasa (Glucoamilasa o alfa-1,4 glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima "GRAS", extracelular producida por los hongos de los gneros
Aspergillus, Rhizopus, principalmente, y de Mucor,
Candida, Saccharomyces, Schwanniomyces, y de los
gneros bacterianos Clostridium, Arthrobacter y una
enzima tipo "Glucoamilasa" de Flavobacterium (4). En
otro trabajo se presenta un alineamiento de 14
amiloglucosidasas por anlisis de clusters
hidrofbicos (5).
La enzima es una glucoprotena que contiene manosa,
glucosa, galactosa y cido urnico, con un peso
molecular de 60-100.000 Da., con un pH ptimo de
4.3-4.5, e hidroliza fcilmente enlaces glicosdicos alfa1,4 y alfa-1,6 con menor afinidad (5). La rata de
hidrlisis enzimtica es afectada por el tamao del
substrato, por la estructura y los enlaces en la secuencia de la cadena. Algunos investigadores usando una
preparacin altamente purificada de A. niger, demostraron que la amiloglucosidasa es capaz de hidrolizar
maltosa 100 veces ms rpido que isomaltosa, mientras que la panosa se hidroliza en un 45 % de la rata de
maltosa, entonces, esto indica que los enlaces alfa-1,6
cerca a los enlaces alfa-1,4 fueron atacados ms rpidamente que los mismos enlaces solos. Con enlaces
alfa-1,6, un incremento en la longitud de la cadena causa un incremento en la rata de hidrlisis. La glucoamilasa
tiene gran afinidad por cadenas largas, as la rata mxima incrementa con la longitud mientras que la constante de Michaelis disminuye (4).

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La amiloglucosidasa se utiliza a gran escala en la industria del procesado del almidn en tanques discontinuos
a 55-60C y pH de 4.5 y con perodos de incubacin de
48-92 h. para transformar las dextrinas formadas por la
hidrlisis de alfa-amilasa en glucosa. El calcio la
estabiliza frente a la desnaturalizacin por el calor o el
lcalis (6).
En las industrias de alimentos y bebidas, las enzimas han
sido aplicadas satisfactoriamente desde hace muchos
aos y la necesidad de controlar los costos es dominante. Por ejemplo, en la produccin de edul-corantes se
han venido reemplazando la sacarosa de caa por otros
provenientes de una materia prima ms barata y accesible; como es el almidn de maz que se puede transformar en glucosa y de ella producir jarabes ricos en fructosa
con mayor poder endulzante y a menor costo, adems,
de las ventajas que tiene por ser producidos por va
enzimtica y no por va qumica. (6).
En el mundo actualmente se buscan enzimas amilasas
y amiloglucosidasas con caractersticas diferentes a las
ya comercializadas. Esto se hace mediante estudios de
bioprospeccin microbiana, que tratan de identificar las
potencialidades de la flora microbiana presente en los
diversos nichos ecolgicos del mundo, que posibiliten
la formacin de industrias productoras de enzimas y las
industrias derivadas de su aplicacin (4). En Colombia
se han realizado pocos estudios de este tipo, pese a que
posee una elevada diversidad biolgica (7).
Por tal razn, el objetivo del presente trabajo fue realizar
el estudio de cepas microbianas aisladas de diferentes
nichos ecolgicos, productoras de enzimas amilolticas.
Los resultados obtenidos incluyen el aislamiento de 103
cepas amilolticas. De estas, debido a la similitud entre
microorganismos aislados, se seleccionaron 13 cepas, las cuales fueron identificadas bioqumicamente.
De las 13 cepas estudiadas se seleccion una de las
que result positiva en la prueba de lugol y que present mayor halo, al igual que su expresin en la protena
fue siempre mejor, para establecer si presentaba actividad amiloltica; se estudi cualittivamente el efecto que
presentan diferentes fuentes de carbono en la expresin de la protena. La cepa utilizada en la fermentacin
correspondi a un Bacillus sp, para el cual no se obtuvieron resultados satisfactorios de actividad amiloltica
tanto para alfa amilasa como para amiloglucosidasa,
bajo las condiciones de fermentacin establecida.

MATERIALES Y METODOS
MICROORGANISMOS:
Se aislaron cepas microbianas de las fuentes de almidn (maz, papa y yuca) procedentes de sus respectivas procesadoras. Se identificaron por medio de
coloraciones y crecimiento en cultivos selectivos (MRS,
CZAPEK y PCA), para que crecieran, segn sean mohos, levaduras o bacterias.

RECOLECCIN DE LAS MUESTRAS DE


ALMIDN
Recoleccin de las muestras de almidn de maz.
Las muestras fueron colectadas de los tanques de procesamiento final y de lavado, de la empresa "Industrias
del Maz "en 2 frascos estriles de 1L, los cuales se
llenaron completamente con la muestra liquida proveniente de los compartimientos descritos, obtenindose
1L de muestra por cada tanque mencionado; luego de 2
h de ser recolectadas las muestras se prosigui a procesarlas.

Recoleccin de las muestras de almidn de papa.


La muestra fue colectada del tanque de agua de lavado
de la empresa Mekato, cuya materia prima es la papa, en
un frasco estril de 1L., el cual se llen completamente,
obtenindose 1L de muestra; luego de 2 h de ser colectada, la muestra fue procesada.
Recoleccin de la muestra de almidn de yuca.
La muestra fue colectada de la empresa "Almidones La
Mara", en tres frascos estriles de 1L, los cuales fueron
llenados completamente con almidn slido perteneciente a tres puntos diferentes del tanque de fermentacin, esta muestra fue enviada por la empresa a la universidad y procesada de inmediato.

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS.


Procesamiento de las muestras de almidn de maz
Por cada muestra de almidn de maz (una perteneciente al tanque de procesado final y otra proveniente del
tanque del agua de lavado), se tomaron 50 de los 1000

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mL recogidos inicialmente, luego se resuspendieron en


450 mL de agua peptonada estril y se homogenizaron
durante 10 min.; seguidamente se realizaron diluciones
seriadas hasta 10-9 en tubos que contenan 9mL de
agua peptonada.
Se continu con la siembra, por triplicado, de 100 L de
cada dilucin en cajas de petri con los medios: MRS,
CZAPECK y PCA, modificados con almidn. Posteriormente se dejaron incubando a 30 C durante 72horas,
tiempo al que se hizo el conteo de colonias, se descartaron las cajas de petri que presentaban un contenido
mucho mayor de 300 colonias.
Procesamiento de la muestra de almidn de papa
La muestra obtenida, fue procesada siguiendo los mismos parmetros utilizados para la muestra de almidn
de maz.
Procesamiento de la muestra de almidn de yuca
Se tomaron 100 g. de almidn de yuca, a partir de la
mezcla de las tres muestras colectadas y se
resuspendieron en 900 mL de solucin salina, luego se
homogenizaron durante 20 min.; seguidamente se realizaron diluciones seriadas hasta 10-9 en tubos que
contenan 9 mL de agua peptonada.
Se continu con la siembra por triplicado; de 100 L de
cada dilucin en cajas de petri con los medios: MRS,
CZAPECK y PCA, modificados. Posteriormente se dejaron Encubando a 30 C durante 72horas, tiempo al que
se hizo el conteo de colonias, se descartaron las cajas
de petri que presentaron un contenido mucho mayor de
300 colonias.

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medio slido en el que anteriormente haban crecido y se dejaron incubando a 30 C por 24 h.


Luego se describi su mor fologa gruesa, teniendo en cuenta tamao, tipo de borde, coloracin y
textura; seguidamente se les practic la prueba de
lugol, notificando como positivas aquellas que
presentaron la formacin de un halo transparente
alrededor de la colonia luego de aadirle lugol en
la superficie del agar. Las cepas positivas fueron
sembradas en 5ml de respectivo medio lquido e
incubadas a 30 C por 24 horas. Finalmente estas
ltimas cepas se crioconservaron en glicerol al 30%
a -20 C.

PURIFICACIN DE LAS CEPAS


AMILOLTICAS AISLADAS.
Las cepas aisladas fueron purificadas, sembrndolas
en 5mL del respectivo medio de cultivo e incubndolas
a 30 C durante 72 h.; seguidamente se les aplic coloracin de Gram, notificndose los resultados obtenidos. Luego se sembraron en medio slido por agotamiento y se incubaron a 30 C durante 48 h., despus se
les aplic la prueba de filancia (KOH), agregndoles
directamente a las colonias este reactivo; se notificaron
como positivas aquellas que formaban un filamento,
luego de agitarlas con un asa de ojo.
Posteriormente se sembraron estas cepas, (tomndose
una sola colonia con asa de ojo) en 5mL del medio en el
que haban reportado crecimiento y se incubaron a 30
C durante 48 h. Por ltimo, se crioconservaron en glicerol al 30% y se dejaron en nevera a -20C.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE CEPAS


MICROBIANAS CON ACTIVIDAD AMILOLTICA

IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE LAS


CEPAS AMILOLTICAS AISLADAS

AISLAMIENTO DE LAS CEPAS AMILOLTICAS.

Para la identificacin de las cepas obtenidas, se


tuvieron en cuenta los aspectos mor folgicos
macro y microscpicos y se realizaron las pruebas bioqumicas de oxidasa, catalasa, citrato, SIM
(sulfuro- indol - movilidad) y TSI (triple- azcar hierro). Los parmetros utilizados para el anlisis
de resultados y la clasificacin de los microorganismos manejados son los descritos por el Manual de Bergey (10).

Con base en el crecimiento sobre los medios modificados con almidn, la positividad frente al Test
de Lugol, y los aspectos mor folgicos de los
microorganismos, se hizo el aislamiento de las cepas amilolticas.
Estas cepas se sembraron por agotamiento en el

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CONDICIONES DE CULTIVO
Se utilizaron frascos tapa rosca de 500 mL conteniendo
medio de cultivo PCA en volumen de 150 mL por duplicado, incluyendo el almidn como substrato de degradacin para las enzimas amilolticas y como fuente de
carbono para los microorganismos. Estos cultivos se
colocaron en agitadores orbitales (BOEKEL cerant ORS
200) a una agitacin de 130rpm, T de 30C, durante
72h.

DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DE


LAS ENZIMAS PRODUCIDAS POR LAS
CEPAS AMILOLTICAS AISLADAS.
Las cepas positivas al lugol, fueron crecidas en medio
lquido, PCA modificado con almidn, se centrifugaron
a 8000g y 4C. El sobrenadante se recupera y somete
a electroforesis de protenas en SDS-PAGE, segn el
mtodo descrito por Sambrook et al (8), en geles al 8%
de poliacrylamida usando un marcador de peso
molecular conocido (Sigma B2787), para determinar
as la presencia de enzimas extracelulares y sus respectivos pesos moleculares.
NOTA:
Se estimaron como cepas amilolticas aquellas que presentaron la prueba de lugol positiva. El principio de esta
prueba se basa en la incapacidad que presenta el lugol
para pigmentar las zonas en las que el almidn ha sido
hidrolizado por accin enzimtica. Por esta razn se
utiliz la prueba de lugol para la determinacin de
microorganismos que producen enzimas amilolticas
exocelulares, ya que este test permite el reconocimiento
de las mismas por la formacin de un halo no pigmentado y de dimetro variable alrededor de aquellas colonias que sintetizan este tipo de enzimas.
Este fenmeno se observa cuando se expone el cultivo
a la accin del lugol durante un periodo aproximado de
1 a 3 min.

DETERMINACIN DEL EFECTO DE


DIFERENTES FUENTES DE CARBONO PARA
LA CEPA 24.
La fermentacin se realiz en erlenmeyers de 250 mL,

se someti a un bao agitado (BOEKEL cerant ORS


200) a 130 rpm y a 30 C. 50 mL del medio PCA modificado con 5g/L de cada una de las tres diferentes fuentes de carbono utilizadas (Almidn, Dextrinas y Glucosa) fueron inoculados con la cepa seleccionada (Bacillus
sp). Se realizaron toma de muestras en cmara de flujo
laminar para evitar la contaminacin del cultivo. Posteriormente se realiz electroforesis a las muestras (6).

FERMENTACIN
El inculo para la fermentacin, se prepar con la cepa
incubada en cajas petri. Tomando la muestra con asa
de ojo y adicionndola a 20 mL de medio lquido PCA,
hasta obtener una concentracin adecuada, verificada
con la lectura de la densidad ptica de la muestra en un
espectrofotmetro, a una longitud de onda de 600 nm.
Posteriormente fue adicionada al medio lquido para ser
fermentada en un bao agitado a 130 rpm y 30 C durante un perodo de 24 a 96 horas.
Determinacin de la Actividad enzimtica
Se tomaron 10 mL de muestra de la fermentacin a las
24, 48, 72 y 96 horas, en cmara de flujo laminar para
evitar contaminacin. Posteriormente la muestra fue
centrifugada a 4000 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente. Se tom el lquido decantado y se
practic la determinacin de actividad enzimtica de la
AMG, utilizando la tcnica desarrollada por Industrias
NOVO, en la que 1 AGU es la cantidad de enzima que a
condiciones estndar hidroliza una micromol de maltosa
por minuto a 25 C y pH 4.3 (Mtodo analtico Referencia: AF 22/ 4-GR. 1976, http:// www. Enzymes. Novo.dk,
2003)(9).
Se realiz tambin la determinacin de la actividad
enzimtica de la Alfa Amilasa siguiendo el protocolo descrito en el mtodo analtico Novozyme. EB-SM- 0009 02/
01. Mtodo basado en la degradacin de almidn por la
enzima alfa amilasa, en el que 1 KNU (kilo Novo Unit) es
la cantidad de enzima la cual degrada 5 mg de almidn
soluble por hora bajo condiciones estndar (9).
Adicionalmente, se realiz la concentracin de las muestras y se les practic las pruebas de medicin de la
actividad tanto amiloglucosidasa como alfa amilasa, siguiendo los protocolos establecidos. Para la concentracin se tomaron 5 mL de muestra se le adicionaron

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15 mL de sulfato de amonio concentrado (solucin saturada), se guard en nevera a 4 C por 60 min., luego
se centrifug a 10000 rpm por 10 min. a 4 C, se elimin el decantado y se resuspendi el precipitado en 200
?L de solucin buffer fosfato (6).

RESULTADOS Y DISCUSION
Proceso de aislamiento y seleccin
Se aislaron 103 cepas, teniendo en cuenta los
parmetros morfolgicos, el crecimiento en los medios
modificados con almidn y la positividad frente al Test
de Lugol. Dentro de las cepas obtenidas figuran
microorganismos de tipo bacilos y cocos Gram Positivos y Gram. negativos. Debido a la marcada similitud
existente entre algunos de las cepas aisladas y con base
en las diferencias de tipo morfolgico, se seleccionaron 13 de ellas para su respectiva identificacin las cuales se presentan en la Tabla 1.

Identificacin bioqumica
Las cepas amilolticas seleccionadas fueron identificadas bioqumicamente, mostraron per tenecer a
los gneros Bacillus sp, Clostridium sp y Kurtia sp.,
siendo el primero el ms predominante dentro de
las cepas seleccionadas. En la Tabla 2. aparecen
consignados los resultados obtenidos a par tir del
anlisis bioqumico de las cepas seleccionadas y la
clasificacin segn gnero de las mismas. Los
parmetros utilizados para la clasificacin y anlisis
de resultados de los microorganismos manejados
son los descritos por Bergeys. (10).

DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DE


LAS DE ENZIMAS PRODUCIDAS POR LAS
CEPAS AMILOLTICAS AISLADAS.
A las cepas seleccionadas se les realiz la prueba de

TABLA 1. Seleccin de algunas cepas amilolticas aisladas de diferentes fuentes de almidn.


1'(
&2/21,$














'(6&5,3&,1

&RORQLDLUUHJXODUHV$PDULOODVHQIRUPDGH
DEDQLFR
&RORQLDVUHJXODUHV0HGLDQDVEODQFDV\
EULOODQWHV
&RORQLDVPHGLDQDV3ODQDVUHJXODUHV\
EODQFDV
&RORQLDVSHTXHxDVEODQFDV\FUHPRVDV
&RORQLDVLUUHJXODUHV0HGLDQDV\FUHPRVDV
&RORQLDVPHGLDQDVLUUHJXODUHVSODQDV\
EODQFDV
&RORQLDVLUUHJXODUHVSHTXHxDV\EODQFDV
&RORQLDVUHJXODUHVEULOODQWHV\FUHPRVDV
&RORQLDVLUUHJXODUHVJUDQGHV\EODQFDV
&RORQLDVLUUHJXODUHVPHGLDQDV\EODQFDV
&RORQLDVUHJXODUHVSHTXHxDV\EODQFDV
&RORQLDVUHJXODUHVPHGLDQDV\FUHPRVDV

/8*2/

7,32'(02*

),/$1&,$



%DFLORV*UDP






&RFRV*UDP





%DFLORV*UDP






%DFLORV*UDP
%DFLORV*UDP






%DFLORV*UDP










%DFLORV*UDP
%DFLORV*UDP
%DFLORV*UDP
%DFLORV*UDP
%DFLORV*UDP
%DFLORV*UDP








* M.O: microorganismo, las muestras seleccionadas fueron del muestreo de almidn de maz, estas presentaron una
mayor formacin de halo.

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electroforesis para determinar el peso molecular promedio de las protenas presentes en las fermentaciones. Los resultados se presentan en la Tabla 3, donde
se observa como vara el peso molecular de las protenas de acuerdo con la especie; el peso molecular
oscila entre 38-175 KDa (11), 1997; (3), 1998). Como
se puede observar de los resultados, es posible que
las cepas estn expresando protenas de AMG, ya que
estn en rango de pesos moleculares esperados, seguira la prueba de actividad enzimtica para corroborar si son AMG (amilogucosidasas) o alfa amilasas.
Las enzimas amilolticas varan su peso molecular dependiendo del microorganismo que las produce presentando pesos entre 38 y 175 KDa. Cabe anotar que,
las -amilasas microbianas oscilan entre 23-96KDa,
mientras que las amiloglucosidasas estn entre 82114KDa En nuestro caso, las enzimas amilolticas producidas por los microorganismos nativos seleccionados, presentaron pesos moleculares que oscilaron entre 30 y 150 KDa aproximadamente. Por esta razn, no
es clara la determinacin si las enzimas producidas son
-amilasas o amiloglucosidasas, dada la diversidad de
tamaos moleculares presentes en ellas. Se recomien-

da una purificacin de las protenas con membranas de


dilisis para medir la actividad especfica de cada una
de estas enzimas.

DETERMINACIN DEL EFECTO DE


DIFERENTES FUENTES DE CARBONO PARA
LA COLONIA 24
Las modificaciones de la fuente de Carbono del medio
estndar seleccionado utilizando Almidn, Glucosa y
Dextrina en una cantidad de 1g/L permitieron establecer
que el comportamiento de las cepas seleccionadas
cuando se utiliza un medio de cultivo con almidn o
dextrina como fuente de carbono es similar; es decir, al
realizar la electroforesis de las respectivas muestras de
las fermentaciones realizadas, se observ que las protenas presentes en el medio de cultivo modificado con
almidn son exactamente las mismas expresadas en el
medio de cultivo modificado con dextrina. Las protenas expresadas por la cepa en el medio de cultivo modificado con glucosa, y observadas en la electroforesis
no presentaron un comportamiento diferente. Estos
resultados se pueden apreciar en las Figuras 1 y 2.

TABLA 2. Clasificacin de las cepas amiliolticas seleccionadas segn gnero.

N DE
COLONIA




*
*








Pruebas bioqumicas Practicadas


Oxidasa

catalasa

GENERO

citrato

SIM

TSI











%DFLOOXVVS





























































%DFLOOXVVS
%DFLOOXVVS


%DFLOOXVVS
.XUWKLDVS
%DFLOOXVVS
&ORVWULGLXPVS
%DFLOOXVVS
%DFLOOXVVS
%DFLOOXVVS

* Las colonias 72 y 89 no pudieron ser identificadas por la ambigedad que presentan sus
comportamientos bioqumicos, razn por la cual su clasificacin segn gnero requiere la
realizacin de otras pruebas confirmatorias.

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TABLA 3. Peso molecular de las protenas obtenidas a partir de las cepas amilolticas nativas seleccionadas.
1qGHFRORQLD 3HVRPROHFXODU N'D 



















Tiempo de fermentacin 48h


En la Figura 1 se pueden apreciar las enzimas patrones
utilizadas y el marcador molecular con los diferentes
pesos moleculares. La primera banda observada corresponde a la enzima patrn Termamy 120L (T), la
segunda banda corresponde a la enzima patrn
Amiloglucosidasa: AMG 300L (A). El marcador (M) presenta 7 bandas que corresponden de manera descendente a los siguientes pesos moleculares: 116, 97, 58.1,
39.8, 29, 20.1 y 14.3 K Da.
Los perfiles electroforticos de los diferentes aislados
presentaron bandas claramente definidas a 30 y 58 kDa
acordes con los tamaos definidos para -amilasas,
como lo muestra la cepa 24 (Figura 2).
A partir de lo observado en la electroforesis realizada
a las muestras tomadas de las fermentaciones, se
aprecia que la cepa 24 presenta trazas de diferentes
protenas. Se seleccion por lo tanto sta cepa para
realizar la determinacin de actividad amiloltica y para
realizar el seguimiento de la cintica de fermentacin.
Se eligi, adems, el almidn como fuente de carbono, ya que como se observa ste no inhibe la expresin de diferentes protenas del microorganismo, y
el inters es obtener una enzima que degrade este
sustrato.
Existen muchos factores como la temperatura, la deshidratacin, la purificacin, la congelacin etc., que
pueden desnaturalizar las protenas y enzimas. La actividad de las enzimas depende de la concentracin de
stas en el medio fermentado. La electroforesis es un
medio bastante sensible, que no requiere de grandes
cantidades de protena para arrojar resultados positi-

vos. Sin embargo, los protocolos utilizados para la


determinacin de las actividades, tanto, de
amiloglucosidasa como alfa-amilasa requieren de una
concentracin mnima de enzimas para llevar a cabo
con xito la cuantificacin. Las fermentaciones realizadas con el medio, y el volumen establecidos en la metodologa, no presentaron una concentracin de enzima que fuera detectable por los mtodos establecidos.
Se plantea la necesidad de desarrollar un nuevo diseo
experimental que permita trabajar con un volumen mayor de muestra que garantice la concentracin mnima
de enzima requerida para la determinacin de la actividad enzimtica.

CONCLUSIONES
Bajo las condiciones de referencia se logr obtener un
cepario de 103 cepas amilolticas, de las cuales 13
presentaron cualitativamente mayor actividad amiloltica
e identificadas bioqumicamente pertenecen a los gneros Bacillus sp ,Clostridium sp y Kurthia sp,estas fueron presentadas en el Almidn de maz.
Se plantea la necesidad de realizar futuras investigaciones, orientadas a la experimentacin con otros medios
de cultivo diferentes al PCA, que proporcionen los
nutrientes necesarios para el mantenimiento del microorganismo, y que estimulen la expresin de la enzima
amiloltica AMG. A su vez, se puede recomendar una
metodologa diferente, donde se realice un seguimiento
durante un mayor tiempo, con el objetivo de verificar el
comportamiento del microorganismo y la produccin
de protenas a perodos ms largos de fermentacin.

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Figura 1. Perfiles electroforticos (SDS-PAGE) obtenidos usando el marcador de peso molecular de Sigma B2787,
y las enzimas comerciales, a-amilasa bacteriana (Tarmamyl 120L) y la amiloglucosidasa fngica (AMG 300L).

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7

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Figura 2. Influencia de la fuente de carbono en la expresin de enzimas amilolticas en la cepa 24 a las 72h de
fermentacin. T: enzima Tarmamyl 120L, A: AMG 300L, 24-A: medio con almidn, 24-D: medio con dextrina, 24G: medio con glucosa, M: marcador de peso molecular (Sigma B2787).

24-G

24-A

24-D

116 KDa
97 kDa

58 kDa
39.8
KD
29

REFERENCIAS
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