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Ministerio de Educacin,Cultura, Ciencia y Tecnologa

Instituto de Educacin Superior


Domingo Faustino Sarmiento
PROFESORADO PARA

-2014ELECTROFORESIS

LA EDUCACIN
SECUNDARIA EN
QUIMICA

La electroforesis. es la migracin de iones en un campo elctrico, se utiliza


ampliamente para la separacin analtica de molculas, biolgicas.
El uso de la electroforesis para separar protenas lo inform por primera vez en 1937
el bioqumico sueco Arne Tiselius. La tcnica que l introdujo, electroforesis de entorno
mvil, fue una de las pocas tcnicas analticas poderosas disponibles en los primeros
aos de la qumica de protenas. Sin embargo, dado que el mtodo tiene lugar por
completo en solucin, la prevencin de la mezcla convectiva de las protenas
migrantes requera un aparato complicado y un gran volumen de muestra. Por ello la
electroforesis de entorno mvil se reemplaz por electroforesis zonal, una tcnica en la
que el desplazamiento de una protena est limitado a un soporte slido como el papel
de

filtro,

el

acetato

de

celulosa

o,

ms

menudo,

un

gel.

Esto elimina en gran medida la mezcla por convexin de la muestra que limita la
resolucin en la electroforesis de entorno mvil. Adems, en la modalidad zonal los
componentes de la muestra migran como bandas discretas (zonas), por lo que solo se
requieren pequeas cantidades de material.
A. Electroforesis en papel
En la electroforesis en papel la muestra se coloca en un punto sobre una tira de papel
de filtro o de acetato de celulosa embebida en buffer. Los extremos de la tira se
sumergen en reservorios separados de buffer en los que se colocan los electrodos (fig.
1). Al aplicar una corriente directa los iones de la muestra migran hacia los electrodos
de

polaridad

opuesta

velocidades

caractersticas.

Al

completarse

el

electroforetograma, se seca la tira y se localizan los componentes de la muestra


usando los mtodos de deteccin empleados en la cromatografa de papel.
La electroforesis y la cromatografa en papel son similares, la primera separa los iones
en mayor medida sobre la base de sus cargas inicas, mientras que la segunda
separa las molculas en funcin de sus polaridades. Los dos mtodos pueden
combinarse en una tcnica bidimensional denominada huella digital. Por lo tanto, las
molculas se separan tanto en funcin de su carga como de su polaridad.

B. Electroforesis en gel

Fig. 1: electroforesis en papel.

Mtodo ms conveniente para la separacin de macromolculas, suplant a la


electroforesis en papel. Los geles ms usados, poliacrilamida y agarosa, tienen poros
de dimensiones moleculares

cuyos tamaos pueden especificarse. Por ello, las

separaciones moleculares se basan en la filtracin en geles y en las movilidades


electroforticas de las molculas que se intentan separar. Los geles utilizados retardan
las molculas grandes en comparacin con las de menor tamao. Dado que las
molculas de una muestra no pueden abandonar el gel, el movimiento electrofortico
de las ms grandes se ve impedido en comparacin con el de las ms pequeas.
En la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) los geles se forman por
polimerizacin de la acrilamida y la N,N-metileno bisacrilamida inducida por radicales
libres en un buffer (fig. 2). Por lo general en gel se arma como una plancha rectangular
delgada en la que pueden analizarse varias muestras en calles paralelas en forma
simultnea (fig. 3), lo que permite comparar muestras similares. El buffer, que es el
mismo en ambos reservorios y en el gel, tiene un pH tal (en general alrededor de 9
para las protenas) que las macromolculas tienen carga negativa, por lo que migran
hacia el nodo ubicado en el reservorio inferior. Cada muestra, que puede contener no
ms de 10 g de material macromolecular, se disuelve en una cantidad mnima de una
solucin relativamente densa de glicerol o sacarosa que previene la mezcla con el
buffer del reservorio superior. La muestra se coloca en fosas preformadas en la parte
superior del gel como se muestra en la figura 3. Como alternativa, puede estar corto
de gel para muestra, cuyos poros son demasiados grandes como para impedir la
migracin de las macromolculas. A continuacin se aplica al gel una corriente directa
alrededor de 300 V por un tiempo suficiente para separar a los componentes
macromoleculares en una serie de bandas discretas. El gel se retira de su
compartimiento y se le aplica un mtodo adecuado para visualizar las bandas de
macromolculas. Mediante esta tcnica, una mezcla proteica de 0,1 a 0,2 mg puede
resolverse en hasta 20 bandas discretas.

Fig. 2

Fig. 3: aparato para electroforesis en gel en forma de lmina.

a. La electroforesis en disco mejoro la resolucin


La estrechez de las bandas en el mtodo anterior y, por lo tanto, la resolucin de las
separaciones, est limitada por la longitud de la columna de muestra al ingresar en el
gel. Las bandas pueden definirse mejor mediante una tcnica ingeniosa conocida
como electroforesis de pH discontinuo o electroforesis en disco, que requiere un
sistema de 2 geles y varios buffers diferentes (fig. 4). El gel de resolucin, en el que
tiene lugar la separacin de los componentes de la muestra, se prepara como se
describiera antes y sobre l se coloca luego un gel corto (1 cm) de poros grandes
denominado "espaciador" o "de apilamiento".
Los buffers del reservorio inferior y del gel de resolucin son como se describi antes,
mientras que el que contiene a la muestra y el del gel espaciador tiene un pH 2
unidades menor que el del reservorio Inferior. El pH del buffer del reservorio superior,
que debe contener un cido dbil (por Io general glicina) Se ajusta a un valor cercano
al del reservorio inferior.
Cuando se conecta la corriente los iones del buffer del reservorio superior migran
dentro del gel espaciador a medida que los iones del buffer de este gel migran por
delante. Cuando esto ocurre, los iones del buffer del reservorio superior encuentran un
pH mucho menor que su pK. por Io tanto, asumen su forma no cargada (o, en el caso
de la glicina, zwitterinica) y carecen de movilidad electrofortica.
Los

aniones

macromoleculares

migran

con

rapidez

hasta

alcanzar

la regin que contiene los iones del buffer del gel espaciador, donde se frenan por no
haber all deficiencia de iones. Este efecto hacen que los iones macromoleculares se

aproximen al gel de resolucin como apilamientos de bandas o discos muy estrechos


(alrededor de 0.01 mm) ordenados de acuerdo movilidades y que se ubiquen entre los
iones migrantes del reservorio superior y los del gel espaciador. A medida que los
iones macromoleculares ingresan en el gel de resolucin reducen su velocidad de
migracin como resultado del efecto de filtracin por gel. Esto permite que los iones
del buffer del reservorio superior alcancen las bandas macromoleculares y, debido al
mayor pH del gel de resolucin, asuman su forma cargada por completo
a medida que entran en el gel. En ese momento desaparece la deficiencia de
portadores de carga y a partir de all procede normalmente la separacin
electrofortica.

Fig. 4: diagrama de una electroforesis en disco

b. Los geles de agarosa se usan para separar por electroforesis grandes


molculas
Los poros muy grandes necesarios para las separacin por PAGE de compuestos de
masas moleculares grandes (> a 200 KDa) requieren que geles tengan una
concentracin de poliacrilamida tan baja (< a 2,5 %) que son demasiado blandos para
manipularse. Esta dificultad se soluciona por el uso de agarosa. Por ejemplo, para la
separacin electrofortica de cidos nucleicos con masas moleculares de hasta 50000
kDa se usa un gel de agarosa al 0,8 %.
c. Las bandas en el gel pueden detectarse por tincin, conteo radiactivo o
inmunoblot
Las bandas resultantes de la separacin electrofortica pueden localizarse por
distintas tcnicas. Con frecuencia las protenas se visualizan por tincin. El azul
brillante de Coomasie.

Que es el colorante ms usado para este propsito, se aplica al sumergir al gel con
solucin alcohlica acdica del colorante. Esto fija a la protena en el gel al
desnaturalizarla y forma un complejo con el colorante. El exceso de colorante se retira
mediante el lavado repetido del gel con una solucin acdica o por decoloracin
electrofortica. Con este procedimiento pueden detectarse bandas que contienen 0,1
g de protena.
Si Se dispone de un anticuerpo contra la protena de inters es posible detectar de
manera especfica esa protena en el gel entre medio de otras protenas mediante una
tcnica de inmunotransferencia (tambin conocida como Western blot). Este
procedimiento es una variante del Southern blot y utiliza una tcnica similar al ELISA
para detectar la protena de inters (fig.):
1. Se transfiere un electroforetograma en gel a una hoja de nitrocelulosa, que une
protenas con firmeza y en forma no especfica (tambin pueden utilizarse membranas
de nailon o difluoruro de polivinilidina (PVDF).
2. Los sitios de adsorcin de la nitrocelulosa no ocupados por protenas del gel se
bloquean con una protena no especfica como casena (protena de la leche; en
general se emplea leche descremada) para prevenir la adsorcin no especfica de los
anticuerpos

usados

en

los

pasos

(que

tambin

son

protenas.

3. La membrana se incuba con el anticuerpo contra la protena de inters (anticuerpo


primario),

que

por

lo

general

se

obtiene

en

el

conejo.

4. Luego de eliminar por lavado el exceso anticuerpo primario, la membrana se incuba


con un anticuerpo de cabra dirigido contra el anticuerpo de conejo, al que se le acopl
de manera covalente una enzima detectable con facilidad (anticuerpo secundario).
5. Luego de eliminar el exceso de anticuerpo secundarlo, la enzima acoplada al
anticuerpo unido se detecta mediante una reaccin cromognica, lo que hace que
aparezcan bandas coloradas sobre la nitrocelulosa en el lugar donde estaba la
protena de inters.

Fig. 5: deteccin de protenas por Western blot

D. Isoelectroenfoque
Una protena tiene grupos cargados de ambas polaridades, por lo que presenta un
punto isoelctrico, pI, el pH al que es inmvil en un campo elctrico. Si se somete a
electroforesis una mezcla de protenas a travs de una solucin que tenga un
gradiente estable de pH en el que ste se incrementa en forma paulatina desde el
nodo hacia el ctodo, cada protena migrara a la posicin en el gradiente de pH que
corresponda a su punto isoelctrico. Si una protena se difunde fuera de esa posicin,
su carga neta cambiar medida que Se mueve a una regin de distinto pH, y las
fuerzas electroforticas resultantes la forzaran a moverse de nuevo a la posicin
isoelctrica.

De esta manera, cada protena se "enfoca" en una banda estrecha

alrededor de su punto isoelctrico, que puede ser tan delgada como 0,01 unidades de
pH. Este proceso se denomina isoelectroenfoque (IEF).
La capacidad del IEF de separar las protenas en bandas definidas lo hace til como
herramienta analtica y preparativa. De hecho, varias preparaciones proteicas que se
crean homogneas se separaron en varios componentes mediante IEF. ste puede

combinarse con la electroforesis en una tcnica de separacin bidimensional en


extremo poderosa denominada electroforesis bidimensional.

Formula general de los anfolitos usados en isoelectroenfoque

E. Electroforesis capilar
Aunque la electroforesis en gel en sus distintos formatos es un mtodo comn y muy
eficaz para la separacin de molculas cargadas, suele requerir corridas de 1 hora o
ms y es difcil de cuantificar o automatizar. Estas desventajas Se superan en gran
medida por el uso de la electroforesis capilar (EC), una tcnica en la que la
electroforesis se realiza en tubos capilares muy delgados (20 a 100 m de dimetro
interno) hechos de cuarzo, vidrio o plstico. Estos tubos capilares disipan el calor con
rapidez y por lo tanto permiten el uso de grandes campos elctricos (por lo general
100 a 300 V/ cm unas 10 veces superior al de la mayora de las otras tcnicas
electroforticas), lo que reduce los tiempos de separacin a unos pocos minutos.
Estas separaciones rpidas, a su vez, minimizan el ensanchamiento de las bandas
debido a la difusin, con lo que se logran separaciones en extremo definidas.
Estas tcnicas de EC tienen una resolucin en extremo elevada y pueden
automatizarse de manera similar a la CLAR, esto es con carga automtica de la
muestra y deteccin de la muestra en lnea. Dado que la EC solo puede separar
pequeas cantidades de material, se la utiliza nicamente con tcnica analtica.

Bibliografa
Voet, D. y Voet, J.bioquimica. Tercera edicin. Editorial medica panamericana. Bs. As.
2006.

http://books.google.com.ar/books?
id=r5bedH_aST0C&pg=PA152&dq=electroforesis&hl=es&sa=X&ei=6qVjVIDMLub
vigLE84GIAQ&ved=0CCYQ6AEwAg#v=onepage&q=electroforesis&f=false [visto
el 9/11/2014]