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INSTRUMENTAL
Un equipo para cromatografa liquida de alta resolucin puede representarse
por el siguiente esquema:
La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando
se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes
de diferentes botellas en una Proporcin determinada y realice la mezcla en
una cmara de mezclado. Cuando durante toda la separacin se utiliza siempre
el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar un
gradiente de composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para
mejorar la eficiencia y acortar la duracin del proceso. Estos gradientes de
solvente tambin son realizados en forma automtica por las bombas.
La bomba enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo,
generalmente de acero inoxidable, hacia la vlvula inyectora. Esta consiste en
una vlvula de seis vas que permite introducir en el flujo de solvente, la
muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan
por el detector. Este produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de
materia y esa seal es enviada al registrador que realiza un grfico de
intensidad en funcin del tiempo (cronograma) del tipo:
PARMETROS RELEVANTES
Los parmetros tericos que caracterizan las separaciones cromatografas por
HPLC son idnticos a los descriptos en cromatografa gaseosa.
En HPLC, en lugar de variar la temperatura de la columna para mejorar la
resolucin del cronograma, se cambia la composicin de la fase mvil a lo largo
de la separacin utilizando mezclas de entre dos y cuatro solventes.
ETAPAS DEL ANALISIS DE UNA MUESTRA
Son idnticas a las puntualizadas para cromatografa gaseosa.
En lo que respecta a la optimizacin de las condiciones experimentales, en
este caso es posible realizar ensayos preliminares orientativos utilizando
cromatografa en capa delgada con la misma fase fija que contiene la columna.
Por otra parte es necesario tener en cuenta que dado que se utilizan altas
presiones, es imprescindible evitar la presencia de partculas que puedan
obstruir los caos y la formacin de burbujas que puedan deteriorar el relleno
de las columnas y que produzcan inestabilidad en la seal del detector.
Para evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran
con membranas de 0,45 a 0,22 m. Para evitar la formacin de burbujas, los
equipos de HPLC cuentan con desgas adores de solvente por vaco o por
burbujeo con He y, en el caso de no contar con los mismos, se deben desgasar
los solventes por medio de ultrasonido o agitacin bajo vaco antes de
utilizarlos como fase mvil.
PARTE EXPERIMENTAL
Objetivos
Realizar curvas de calibracin para distintos analitos.
Cuantificar el contenido de los mismos en muestras sintticas y comerciales.
Materiales a emplear
Equipo para HPLC marca Thermo Separations compuesto por una
bomba binaria modelo Spectra System P2000, una vlvula inyectora
Reodyne provista de un loop de inyeccin de 10 l, un detector de
absorcin UV-visible de longitud de onda variable modelo Spectra 100 y
un integrador registrador modelo Datajet.
Columna analtica marca Alltech econosphere C18 (fase reversa unida
qumicamente formada por cadenas de hidrocarburo lineal de 18 tomos
de carbono) de 150 mm de longitud por 4,6 mm de dimetro interno.
Buffer fosfato 0,025 M; pH=3; calidad HPLC.
Metanol calidad HPLC.
Patrones de aspartamo, cafena y acido benzoico en agua, de diferentes
concentraciones.