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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

UNAD

MODULO DE BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA

AUTORA: Msc FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES

TABLA DE CONTENIDO
UNIDAD 1 : : ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOGA

CAPITULO 1. CONTEXTUALIZACIN DE LA BIOTECNOLOGA.

Leccin 1. Definiciones de Biotecnologa

Leccin 2: Historia de la biotecnologa

CAPITULO 2: CLASIFICACIN DE LA BIOTECNOLOGA

Leccin 3: Divisiones de la Biotecnologa

Leccin 4: Tipos de Biotecnologa

CAPITULO. 3. IMPACTO DE LA BIOTECNOLOGA Y TENDENCIAS

13

Leccin 5. Impacto de la Biotecnologa en el contexto colombiano.

13

Leccin 6 : Tendencias de la Biotecnologa

15

ACTIVIDADES

19

UNIDAD 2. BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES

23

CAPITULO 1. METABOLISMO MICROBIANO


Leccin 1: Nutricin microbiana.

23
23

Leccin 2: Metabolismo energtico

26

Leccin 3 : Aspectos generales de los procesos biosintticos

28

CAPITULO 2: CRECIMIENTO MICROBIANO

29

Leccin 4: Crecimiento bacteriano

29

Leccin 5: Modelos matemticos del crecimiento balaceado

31

CAPITULO 3: SISTEMAS DE FERMENTACION

33

leccin 6 : Tipos de fermentacin

33

Leccin 7: Productividad y velocidad especifica de produccin.


Leccin 8. Coeficientes de rendimiento

37
40

CAPITULO 4: PRINCIPIOS DE BIOINGENIERA

41

Leccin 9 : Biorreactores

41

Leccin 10. Transferencia de O2

43

Leccin 11: Caractersticas de la fermentacin en gran escala

44

Actividades:

46

UNIDAD 3: BIOTECNOLOGA ENZIMTICA

47

CAPITULO 1: BIOQUIMICA Y BIOCATLISIS

47

Leccin 1: Las enzimas, biocatalizadores de naturaleza protenica

47

Leccin 2 : Naturaleza de las enzimas

47

Leccin 3 : Cofactores

49

CAPITULO 2. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIN DE ENZIMAS

50

Leccin 1: Clasificacin de las enzimas segn la naturaleza de la reaccin

51

CAPITULO 3 : CINETICA ENZIMATICA

54

Leccin 1 Enzimas Michaelianas

54

CAPITULO 4: PRODUCCIN DE ENZIMAS

59

Leccin 1. Enzimas de Origen Vegetal

59

Leccin 2 : Enzimas de origen animal

60

Leccin 3 : Enzimas de Origen Microbiano

60

Leccin 4 : Produccin Industrial de enzimas

61

Leccin 5: Inmovilizacin de enzimas

66

UNIDAD 4: PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA BIOTECNOLOGA

70

CAPITULO 1: TECNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACIN GENTICA IN VITRO.

71

Leccin 1: Tecnologa del ADN recombinante

72

Leccin 2: La reaccin en cadena de polimerasa ( PCR)

78

CAPITULO 2: OTRAS TCNICAS UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGIA :

81

Leccin 1: Mutagnesis

81

Leccin 2: Mutaciones Dirigidas por Oligonucleotidos

81

Leccin 3 : Mutagnesis en Casette o interrupcin gnica

83

CAPITULO 3 : APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE

83

Leccin 4: Animales transgnicos

83

Leccin 5: Plantas Transgnicas

84

Leccin 6: Alimentos genticamente modificados

86

UNIDAD 5 : PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS DE INTERES ALIMENTARIO


CAPITULO 1: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA OBTENCIN DE PRODUCTOS

88
88

DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGTICO POR VA FERMENTATIVA.


Leccin 1: Bebidas alcohlicas

88

Leccin 2: Biologa de las fermentaciones con levaduras

88

Leccin 3: Condiciones de la fermentacin


Leccin 4 : Compuestos organolpticos

89
91

Leccin 5 : Alimentos basados en soja fermentada

92

Leccin 6 : Productos crnicos fermentados

94

Leccin 7 : Vinagre

95

leccin 8 : acido Lctico

96

leccin 9: acido Actico

96

CAPITULO 2: COMPUESTOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA PRODUCCIN DEL METABOLISMO

97

SECUNDARIO.
Leccin 1 : Produccin de acido ctrico

97

CAPITULO 3 : PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO SINTTICOS

101

Leccin 1 : Polisacridos microbianos y PHAs

101

Actividades:

103

BIBLIOGRAFIA

104

UNIDAD 1: ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOGA.

CAPITULO 1. CONTEXTUALIZACIN DE LA BIOTECNOLOGA.


Leccin 1. Definiciones de Biotecnologa

Existen diversas definiciones de Biotecnologa provenientes de diversos enfoques y puntos de


vista, que van desde conceptos ms generales hasta particulares. Por ejemplo: La biotecnologa,
se ha definido como la aplicacin de organismos, componentes o sistemas biolgicos para la
obtencin de bienes y servicios. Sin embargo, se considera que este enunciado es muy amplio y
engloba todas las operaciones de la biologa aplicada desde la agricultura hasta la ciencia
culinaria.

En un sentido mucho ms estrecho, la palabra biotecnologa se refiere a veces, para definir la


utilizacin de la manipulacin gentica con el fin de obtener la expresin correcta a altos niveles de
un gen clonado en clulas husped. As como tambin la aplicacin de la biologa molecular en
direcciones que se esperan sean de utilidad como el uso de marcadores moleculares para
identificar microorganismos de importancia agrcola. Este enfoque, supone confundir los aspectos
de moda con los principios de la biotecnologa y se debe ms a la filosofa de las agencias de
publicidad y medios de comunicacin que a la industria.
Segn la OTA-USA (1981), la OECD (1982) y la CEPA-Canad (1985), la biotecnologa es la
aplicacin de la ciencia y la ingeniera en el uso directo o indirecto de organismos vivos o parte de
ellos, en sus formas naturales o modificadas, en una forma innovadora para la produccin de
bienes y servicios o para la mejora de procesos industriales existentes. Desde este punto de vista
se evidencia una integracin entre las ciencias bsicas con las ciencias aplicadas puesto que se
pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes biolgicos sencillos como clulas vivas
o muertas, o componentes celulares en operaciones tcnicamente beneficiosas, bien sea de
fabricacin de productos o como operaciones de servicios.
Para responder a los planteamientos de la anterior definicin la biotecnologa debe considerarse
como un rea del conocimiento intensamente interdisciplinar, caracterizada por la reunin de
conceptos y metodologas procedentes de numerosas ciencias para aplicarlas tanto a la
investigacin bsica como a la resolucin de problemas prcticos y la obtencin de bienes y
servicios.
Algunas de las ramas de conocimiento implicadas en la biotecnologa son: La Microbiologa,
Embriologa, Bioqumica, Gentica, Biologa celular, Qumica, Mecnica, Electrnica, Informtica.
Entre otras.

En conclusin, la biotecnologa surge como un espacio de recombinacin de conocimiento de


diversas reas del conocimiento que pretende dar soluciones a los problemas relacionados con la
medicina, la agronoma, zootecnia, la agroindustria, la ingeniera de alimentos, problemas
ambientales, entre otros campos. Es as entonces, que el aporte de la biotecnologa se produce en
dos etapas, en la primera, la investigacin cientfica bsica que se coloca por delante de la
innovacin tecnolgica, exponiendo todo su valor predictivo y transformador, adems de su
capacidad explicativa. No hay desarrollo en esta rama sin investigacin cientfica. La segunda fase,
se caracteriza por el desarrollo de un sistema estandarizado de mtodos secuenciales entre los
cuales se identifican claramente las relaciones y procedimientos operacionales que condicionan el
xito del proceso.
Leccin 2: Historia de la biotecnologa
Si bien es cierto, en las primeras etapas de la historia de la humanidad se

utilizaron los seres

vivos o productos derivados de ellos para atender las necesidades del hombre tales como el vino y
el pan, entre otros; estos productos no pueden considerarse como un resultado de procesos
biotecnolgicos, puesto que en este estadio de desarrollo las fermentaciones son procesos
naturales que no involucran la manipulacin de los sistemas biolgicos para modificar o controlar
las propiedades del producto obtenido. Sin embargo, esta es una larga etapa de prembulo
caracterizada por las ideas vitalistas o animistas que desde un enfoque dialctico motivan el
desarrollo de mtodos experimentales que buscan predecir, explicar y transformar los fenmenos
biolgicos para obtencin de bienes y servicios, que finaliza con la consolidacin de la moderna
Biotecnologa en el siglo XX I.
Para comprender la historia de la Biotecnologa es preciso dividirla en cuatro fases.
Primera poca o era precientfica: corresponde a la poca anterior a Pasteur y sus comienzos
se confunden con los de la humanidad. En esta poca, se realizan prcticas empricas de
seleccin de plantas y animales y sus cruzas, y fermentaciones como un proceso para preservar y
enriquecer el contenido protenico de los alimentos. Este perodo se extiende hasta la segunda
mitad del siglo XIX y se caracteriza como la aplicacin artesanal de una experiencia resultante de
la prctica diaria. Era tecnologa sin ciencia subyacente en su acepcin moderna. Como ejemplos
concretos cabe mencionar las aplicaciones en :


La domesticacin de plantas y animales ya comenz en el perodo Neoltico.

Las civilizaciones Sumeria y Babilnica (6000 aos a.C.) ya conocan cmo elaborar
cerveza.

Los egipcios ya saban fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C.

Antes de la escritura del libro del Gnesis, se disfrutaba del vino en el Cercano Oriente: recurdese
que, segn la Biblia, No "sufri" (o disfrut) accidentalmente los efectos de la fermentacin
espontnea del mosto de la uva (primera borrachera con vino)
Se podra afirmar que esta era pre-cientfica termina en el siglo XVIII cuando cobra cuerpo la idea
de que la materia viva puede ser estudiada como la materia inanimada, es decir, usando el mtodo
experimental, con lo que se inicia el lento declive de las ideas vitalistas (creencias errneas de que
"la vida depende de un principio vital irreducible a otras ramas de la ciencia"), que an daran sus
ltimos estertores casi al final del siglo XIX.
Segunda poca
El trabajo preliminar de los primeros microscopistas, como van Leeuwenhoek y Hooke (siglo XVII),
facilit un par de siglos ms tarde, la comprensin, de la verdadera importancia de las clulas
procariticas y eucariticas, en procesos relacionados con la fermentacin y en el origen de las
enfermedades infecciosas.
Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiolgica fue el establecimiento
de la relacin que une ciertas transformaciones qumicas que se dan en las infusiones con el
crecimiento de los grmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour en 1836, y Schwann y Ktzing
en 1837 haban sugerido que las levaduras eran las causantes de la fermentacin alcohlica por la
que el azcar pasa a alcohol etlico y dixido de carbono, pero se encontraron con la crtica
adversa de los grandes qumicos de la poca (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig, hacia 1840,
haba realizado importantes confirmaciones a la "teora mineral" sobre la nutricin de las plantas,
enfrentndose a la "teora del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas
vitalistas heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas
microscpicas, se supona que los procesos de fermentacin y putrefaccin se deban a
fenmenos qumicos de descomposicin y muerte encuadrables en el marco de la teora mineral
de la fisiologa vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se poda explicar en trminos
de qumica y fsica retras por algn tiempo la adscripcin de estos fenmenos a clulas vivas.
Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades pticas de los cristales de
tartrato, vena suponiendo que estos compuestos tenan un orgen orgnico) quien de nuevo
intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostr que los agentes de la fermentacin
lctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema que haba surgido entre los
destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentacin alcohlica se vio sustituida por una
indeseable fermentacin lctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habra de
durar hasta 1876, en los que Pasteur identific distintos microorganismos responsables de
diferentes clases de procesos fermentativos. As, en 1860 adscribe inequvocamente la
fermentacin alcohlica a ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus tudes sur le vin resume
sus hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiologa Aplicada, una de las primeras derivaciones

prcticas no empricas emanadas de la Biologa. A finales del siglo XIX eminentes bilogos como
Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad en industrias y
destileras.

Trabajando sobre los agentes de la fermentacin butrica, Pasteur descubri la presencia de


microorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxgeno, lo cual desmenta la creencia de
que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. Acu los trminos aerobiosis y
anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de oxgeno.

Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendi las distintas implicaciones


energticas subyacentes a la utilizacin de sustratos orgnicos en presencia y en ausencia de
oxgeno, demostrando que, en el segundo caso el

rendimiento (medido como crecimiento

microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la degradacin total de las correspondientes
sustancias.

Una profundizacin en los fenmenos de fermentacin lleg cuando en 1897 Buchner obtuvo, a
partir de levaduras, una preparacin enzimtica (zimasa) que era capaz de realizar la misma
transformacin de "fermentacin" que las clulas vivas. Este descubrimiento, que evocaba las
propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques qumico y
biolgico: las fermentaciones eran procesos qumicos catalizados por enzimas presentes dentro de
clulas vivas, que podan ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioqumica, nacida
como una rama de la qumica fisiolgica, que se vena especializando en la enzimologa, encontr
una alianza fructfera y duradera con la joven Microbiologa, estableciendo las bases enzimticas y
metablicas de muchos procesos de fermentacin. De esta forma se desarrollaron procedimientos
industriales para producir enzimas (invertasa, proteasas, amilasas, etc.). y el siguiente
descubrimiento por parte de Buchner de la capacidad de las enzimas, extradas de las levaduras,
de convertir azcares en alcohol.

Tercera poca
En la historia de la biotecnologa se caracteriza por desarrollos en cierto sentido opuestos, ya que
por un lado la expansin vertiginosa de la industria petroqumica tiende a desplazar los procesos
biotecnolgicos de la fermentacin, pero por otro, el descubrimiento de la penicilina por Fleming
en 1928, sentara las bases para la produccin en gran escala de este antibitico con el fin de
satisfacer las demandas generadas en la II Guerra Mundial, en esa poca, la produccin de
penicilina es el resultado de avances importantes en tcnicas de esterilizacin a gran escala,
mejora de las instalaciones de fermentacin, comprensin y control de procesos de fermentacin

(incluyendo temperatura, pH, aireacin), entre otros. A partir de entonces se disearon estrategias
para mejorar genticamente las cepas microbianas industriales.
Desde esa poca, las tcnicas de ingeniera qumica, aliadas a la microbiologa y a la bioqumica,
permiten la produccin masiva de antibiticos, cidos orgnicos, esteroides, polisacridos y
vacunas.
Estos desarrollos dieron un gran impulso a la aplicacin de las tcnicas de fermentacin en la
industria alimenticia y al desarrollo industrial de productos como las levaduras, los cidos ctricos y
lcticos y, finalmente, al desarrollo de una industria qumica para la produccin de acetona,
"butanol" y glicerol, mediante el uso de bacterias. Las dcadas de los 60 y 70 vieron la mejora de
procesos de obtencin de pequeos metabolitos como nuclesidos, aminocidos y vitaminas.
Los procesos de fermentacin experimentaron mejoras con las tcnicas de inmovilizacin de
clulas y enzimas en soportes, y con la fermentacin continua para obtener protena de clulas
sencillas (biomasa microbiana). As mismo los polmeros microbianos como xantanos y dextranos
se obtuvieron industrialmente, con aplicaciones en el campo de la alimentacin (como aditivos). Y
se abri la posibilidad de cultivar cada cepa microbiana sin mezclas con otras: cultivos puros en
medios de cultivo de laboratorio
Cuarta poca.
Es la actual. Se inicia con el descubrimiento de la doble estructura axial del cido "deoxiribonucleico" (ADN) por Crick y Watson en 1953, seguido por los procesos que permiten la
inmovilizacin de las enzimas, los primeros experimentos de ingeniera gentica realizados por
Cohen y Boyer en 1973 y aplicacin en 1975 de la tcnica del "hibridoma" para la produccin de
anticuerpos "monoclonales", gracias a los trabajos de Milstein y Kohler.(1983). Estos importantes
descubrimientos han dado lugar a numerosos trabajos de mejoramiento gentico tanto en plantas
como animales; el cultivo de tejidos vegetales y animales a partir de clulas madre, y el importante
acontecimiento de la aparicin de la oveja Dolli en el contexto cientfico, que dio un vuelco total al
concepto de Biotecnologa.

Revisin de conceptos

: La Biotecnologa evidencia como una


integracin entre las ciencias bsicas con las ciencias aplicadas puesto
que se pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes
biolgicos sencillos como clulas vivas o muertas, o componentes
celulares en operaciones tcnicamente beneficiosas, bien sea de
fabricacin de productos o como operaciones de servicios.
Segn lo anterior:
 Se puede afirmar, qu la fabricacin de vino en la poca
antigua es Biotecnologa?
 Cules son los ejes tericos que sustentan la Biotecnologa.

 La obtencin de azcar a partir de la caa, se


podra considerar un proceso de Biotecnologa?
Cules seran los puntos a tener en cuenta para
considerar esta prctica como tal.

CAPITULO 2: CLASIFICACIN DE LA BIOTECNOLOGA


Leccin 3: Divisiones de la Biotecnologa

En la historia de la Biotecnologa se puede apreciar que las tcnicas y procedimientos utilizados


han tenido una aplicacin rpida en reas tan diversas como la agricultura, la industria alimenticia,
la farmacutica, los procesos de diagnstico y tratamiento mdico, la industria qumica, la minera y
la informtica, Como se puede apreciar existe una amplia gama de campos de aplicacin y en
todos ellos se han generado un amplio numero de productos y servicios. Sin embargo, es de
sealar que todos los procesos de innovacin tecnolgica se caracterizan generalmente por
presentar tres ncleos cientficos John Smith (1996) :

1. obtencin del mejor catalizador biolgico para una funcin o proceso


especfico: En la mayora de los casos, el catalizador biolgico son clulas vivas,
sobre todo microorganismos. Por ello, uno de los pilares de la biotecnologa es
precisamente la microbiologa (entendiendo esta en sentido amplio de biologa
microbiana).

Parte

de

lo

que

hemos

aprendido

sobre

el

manejo

de

microorganismos se puede aplicar, con modificaciones, al manejo de clulas de


animales y plantas, que cada vez son ms importantes en la biotecnologa. Varias
son las caractersticas que hacen atractivos a los microorganismos:

2. obtener el mejor ambiente para la funcin de ese catalizador biolgico,


mediante una serie de diseos tcnicos en los que es fundamental la ingeniera
qumica El segundo componente o ncleo de las biotecnologas estriba en el
entorno industrial en que ponemos a funcionar las clulas o las enzimas. Esto nos
lleva al concepto de biorreactor, un entorno cerrado y controlado para que nuestros
catalizadores biolgicos hagan lo que queremos con la mxima eficiencia. En esta
parte de la biotecnologa se requiere la colaboracin estrecha entre los bilogos y
los ingenieros de bioprocesos, incluyendo los ingenieros qumicos. Se trata de
disear biorreactores o fermentadores, especies de cubas cerradas diseadas
para controlar diversos parmetros que condicionan la buena produccin:
temperatura, aireacin, pH, etc

3. procesamiento del material, consistente en separar y eventualmente purificar el


material biolgico producido: quizs esta es el rea ms desconocida y compleja,
el procesamiento de la biomasa o de la sustancia producida: separacin de las
clulas respecto del medio acuoso en que han funcionado, recuperacin eficiente
del producto buscado, purificacin, entre otros procedimientos.
Atendiendo a los planteamientos anteriores la biotecnologa la podemos clasificar bajo dos
enfoques, el primero, de acuerdo con el nivel de tecnologa utilizado en la obtencin de productos,
y el segundo, segn el campo de aplicacin del producto o servici

De acuerdo al primer enfoque, las nuevas biotecnologas generalmente se

agrupan en tres

categoras bsicas:


Tcnicas para el cultivo de clulas y tejidos.

Procesos biotecnolgicos, fundamentalmente de fermentacin, y que incluyen la tcnica de


inmovilizacin de enzimas. (Osorio M. 2005)

Tcnicas para la manipulacin, modificacin y transferencia de materiales genticos


(ingeniera gentica).

Aunque estos tres grupos se complementan entre s, existe una diferencia fundamental entre los
dos primeros y el tercero. Los primeros se basan en el conocimiento de las caractersticas y
comportamiento de los microorganismos y en el uso deliberado de estas caractersticas (de cada
organismo en particular), para el logro de objetivos especficos como la obtencin de nuevos
productos o procesos. La enorme potencialidad del ltimo grupo se deriva de la capacidad de
manipular, las caractersticas estructurales y funcionales de los organismos y de aplicacin prctica
de esta capacidad para superar ciertos lmites naturales en el desarrollo de nuevos productos o
procesos.
A diferencia de la primera clasificacin, que seala las tcnicas propiamente tales, la segunda se
refiere tambin a las actividades econmicas en las que se hace uso de dichas tecnologas. La
nueva biotecnologa crea nuevos procesos y nuevos productos en diversas reas de la economa.
Como estos procesos se basan en los mismos principios, ya sea que se apliquen en un sector
econmico o en otro, ello introduce cierto grado de flexibilidad, ya que permite la movilidad entre
diferentes sectores. Por ejemplo, los procesos de fermentacin pueden aplicarse para la
produccin, en gran escala, de alcohol o de antibiticos como la penicilina, o en escalas menores
para la produccin de aminocidos en la industria farmacutica. Esto facilita la, movilidad de

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factores productivos y tiene impacto sobre la calificacin de la mano de obra, la cual, aun cuando
deber adaptarse a este nuevo perfil tecnolgico (tanto en trminos, cuantitativos como
cualitativos) posiblemente logre al mismo tiempo una mayor facilidad de empleo.
Leccin 4: Tipos de Biotecnologa: Dependiendo del campo de aplicacin del servicio o producto
obtenido la biotecnologa se ha clasificado en:
Biotecnologa Microbiana: La biotecnologa microbiana o como se llamaba anteriormente
microbiologa industrial se refiere a los procesos donde participan los microorganismos para la
obtencin de productos o metabolitos de inters humano.

La microbiologa industrial comenz con los procesos de fermentacin alcohlica por ej. La
fermentacin del vino y de la cerveza. Ms tarde se desarrollaron los procesos microbianos para la
produccin de agentes farmacuticos como los antibiticos, la produccin de aditivos alimentarios
como los amino cidos, para la produccin de enzimas y sustancias qumicas industriales como el
butanol, el acido ctrico, entre otros.
En la actualidad estamos en una nueva era de la tecnologa microbiana con el advenimiento de la
tecnologa de genes. La tecnologa gentica permite que un microorganismo procesado
genticamente fabrique sustancias que normalmente no sera capaz de producir, es as como
utilizando ingeniera gentica se ha podido producir insulina por una bacteria introduciendo el gen
de la insulina humana en la bacteria Escherichia coli.
Podemos dividir a la biotecnologa microbiana en dos fases distintas:
1) La tecnologa microbiana tradicional, que implica la fabricacin a gran escala de productos que
los microorganismo son capaces de fabricar normalmente. En este caso la tarea del microbilogo
consiste en modificando el organismo o el proceso para aumentar el rendimiento del producto
deseado.
2) La tecnologa microbiana con organismos alterados mediante procesos de ingeniera, es decir
microorganismos en los cuales se ha insertado genes extraos. En esta nueva tecnologa el
microbilogo industrial trabaja estrechamente asociado con el ingeniero gentico en el desarrollo
de un organismo adecuado que no solo produzca el producto de inters, sino que tambin pueda
ser cultivado en la escala necesaria para su explotacin comercial. (Brook y Scaligan 2002)

Biotecnologa Agrcola vegetal: Con las tcnicas de la biotecnologa moderna, es posible


producir ms rpidamente que antes, nuevas variedades de plantas con caractersticas mejoradas,
produciendo en mayores cantidades, con tolerancia a condiciones adversas, resistencia a
herbicidas especficos, control de plagas, cultivo durante todo el ao. Problemas de enfermedades

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y control de malezas ahora pueden ser tratados genticamente en lugar del uso de qumicos. Una
planta modificada por ingeniera gentica, que contiene ADN de una fuente externa, es un
organismo transgnico. Un ejemplo de planta transgnica es el tomate que permite mantenerse
durante mas tiempo en los almacenes evitando que se reblandezcan antes de ser transportados
Algunos pases desarrollados como Estados Unidos y a sus multinacionales, defienden el uso de
la biotecnologa y pone de relieve la importancia de su industria, que crea nuevos puestos de
trabajo y fomenta la innovacin tecnolgica y podra acabar con el hambre del mundo. En Europa,
los casos de Soja y Maz transgnicos resultan de especial relevancia. La soja se utiliza en un 40 a
60% de los alimentos procesados: aceite, margarina, alimentos dietticos e infantiles, cerveza, etc.
Espaa importa de EEUU 15 millones de toneladas, el cuarto pas importador detrs de Japn,
Taiwan y Holanda.
La comercializacin del maz transgnico est autorizada en EEUU, Canad, Japn y tambin en
la Unin Europea desde Enero de 1997.
China planea plantar tomates, arroz, pimientos y patatas por lo menos en la mitad de todas sus
tierras de labor (500.000 kilmetros cuadrados) en el plazo de cinco aos. Sus investigadores
analizaron el efecto de los pimientos y los tomates transgnicos en ratas de laboratorio,
comparando el peso y el estado de los mismos con los de otros no alimentados, y no observaron
diferencias significativas.
Para profundizar en este tema haga clic aqu: La biotecnologa en la alimentacin y la agricultura
Biotecnologa animal: Esta ha experimentado un gran desarrollo en las ltimas dcadas. Las
aplicaciones iniciales se dirigieron principalmente a sistemas diagnsticos, nuevas vacunas y
drogas, fertilizacin de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento, entre otros
procedimientos. Los animales transgnicos como el "ratn oncognico" han sido muy tiles en
trabajos de laboratorio para estudios de enfermedades humanas.
Existen tres reas diferentes en las cuales la biotecnologa puede influir sobre la produccin
animal:
-El uso de tecnologas reproductivas
-Nuevas vacunas y
-cultivos celulares que producen hormonas.
En animales tenemos ejemplos de modelos desarrollados para evaluar enfermedades genticas
humanas, el uso de animales para la produccin de drogas y como fuente donante de clulas y

12

rganos, por ejemplo el uso de animales para la produccin de protenas sanguneas humanas o
anticuerpos.
Para las enfermedades animales, la biotecnologa provee de numerosas oportunidades para
combatirlas, y estn siendo desarrolladas vacunas contra muchas enfermedades bovinas y
porcinas, que en los ltimos tiempos han hecho mella en estos animales.
Biotecnologa Humana Las tcnicas del ADN estn siendo utilizadas para determinar relaciones
familiares en litigios de paternidad, para confrontar donantes de rganos con receptores en
programas de trasplante, unir sospechosos con la evidencia de ADN en la escena del crimen
(biotecnologa forense).
El desarrollo de tcnicas para el diagnstico de enfermedades infecciosas o de desordenes
genticos es una de las aplicaciones de mayor impacto de la tecnologa de ADN. Al utilizar las
tcnicas de secuenciacin de ADN los cientficos pueden diagnosticar infecciones vricas,
bacterianas o mapear la localizacin especfica de los genes a lo largo de la molcula de ADN en
las clulas.
El primer tratamiento exitoso en terapia gnica fue en 1990, cuando se trat una enfermedad del
sistema inmune de nios llamada "Deficiencia de ADA". Clulas sanguneas con los genes
correctos de ADA fueron inyectadas al cuerpo del paciente donde produjeron suficientes clulas
normales que permitieron mejorar el sistema inmune.
Hoy, la terapia gnica esta tratando enfermedades tales como tumores cerebrales malignos,
fibrosis qustica y HIV. Con esta tcnica se pretende tambin reparar rganos, como por ejemplo
un hgado cirrtico a partir de las pocas clulas sanas que le quedan, un par de ventrculos nuevos
para reemplazar los efectos devastadores de un infarto, la regeneracin de una mano amputada o
disponer de una fuente inagotable de neuronas para corregir los efectos de enfermedades tan
graves como el Alzheimer o el mal de Parkinson.

Capitulo 3. IMPACTO DE LA BIOTECNOLOGA Y TENDENCIAS


Leccin 5. Impacto de la Biotecnologa en el contexto colombiano.

Su impacto ha alcanzado varios sectores productivos: agricultura, industria de alimentos, industria


farmacutica, bioindustria, entre otros. Aumentando la productividad y la competitividad con la
generacin de nuevos productos, por lo cual se han convertido en parte clave del crecimiento de la
economa en la mayora de los pases industrializados y algunos pases en desarrollo. En general,
el alto valor agregado que se genera con la moderna Biotecnologa, particularmente

a nivel

13

farmacutico, est determinado por su novedad y especificidad de uso en consumo humano.


(Osorio,1995)

En Colombia el avance de la moderna biotecnologa en los ltimos diez aos ha comenzado a


generar algunos productos, particularmente en el sector agrcola. Existen cerca de 70 instituciones
entre estatales y privadas, que involucran biotecnologa en sus procesos de investigacin y/o
produccin.

En el sector agrcola se ha avanzado en tcnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en el


estudio y uso sostenible de microorganismos con el fin de buscar alternativas de control biolgico
de enfermedades y plagas y se estn realizando algunos trabajos en mejoramiento gentico de
plantas de papas, pasifloras, entre otros basados en el ADN recombinante. Se observan trabajos
escasos a nivel de estudios de diversidad gentica en especies silvestres del pas, los cuales se
desarrollan para identificar nuevos genes tiles en el mejoramiento de variedades comerciales y
para aumentar la eficiencia y calidad de los bancos de germoplasma existentes en el pas.

En el sector pecuario, la aplicacin de la biologa se limita a la produccin de vacunas y a la


bsqueda de razas mejoradas mediante la implantacin de embriones. Actualmente se estn
realizando trabajos de investigacin en la estandarizacin de kits de diagnstico de enfermedades
serolgicas y moleculares, vacunas sintticas y aplicacin selectiva de microorganismos
relacionados con la nutricin animal mejorada. A nivel de diversidad gentica de especies nativas
los trabajos son discontinuos y aislados.

En el sector de la salud humana se desarrollan proyectos de investigacin con produccin de kits


serolgicos y moleculares para el diagnstico rpido de enfermedades tropicales y se estudian los
espectros de variabilidad existentes por ejemplo, enfermedad de Chagas.

En el sector agroindustrial y de la alimentacin animal, la Biologa es aplicada para generar


productos lcteos, bebidas fermentadas, destilacin de fermentaciones etanlicas para la
elaboracin de licores, produccin de levaduras por fermentacin y produccin de materias primas
como cido ctrico y solventes orgnicos. Este sector utiliza fundamentalmente mtodos
biotecnolgicos tradicionales.

En el sector del medio ambiente se han iniciado algunos trabajos a nivel del tratamiento de aguas
residuales industriales como lodos activados y biofiltros, mtodos de descontaminacin de los
derramamientos de petrleo mediante el uso de microorganismos nativos o transformados
genticamente. Algunos trabajos de investigacin cientfica se estn realizando sobre

14

biodigestores de alta calidad. Sin embargo, el desarrollo nacional en este sector es todava
discreto.

La diversidad biolgica de Colombia es una ventaja comparativa que al ser usada sosteniblemente
puede apoyar el desarrollo del sector productivo. As mismo constituye una respuesta a problemas
de seguridad alimentaria, sostenibilidad de aguas, suelos y aire, as como un elemento de
negociacin poltica internacional y fortalecimiento de la soberana. Por estas razones, su
conocimiento, conservacin y uso sostenible es prioritario. Sin embargo, como se observa con el
estado de la biotecnologa en Colombia, los avances en estos campos son muy pequeos
comparativamente con otros pases de Amrica Latina como Costa Rica, Brasil y otros del mundo .

Con relacin a los bio-recursos, Colombia es un pas privilegiado ya que se encuentra entre uno de
los pases de mayor diversidad biolgica del planeta por rea . Sin embargo, para aprovechar ese
potencial, el pas debe desarrollar la capacidad cientfica y tcnica que le permita explorar,
conocer, estudiar, investigar, valorar, conservar y desarrollar esos biorrecursos como un patrimonio
altamente productivo y no simplemente como una diversidad ecolgica, social y econmicamente
improductiva.

Leccin 6 : Tendencias de la Biotecnologa

A nivel mundial el inters por la biotecnologa es indudable, como se ve a travs del, frecuente
abordaje de tales temas en los peridicos, libros y medios de comunicacin.

Algunos descubrimientos tiles sern una consecuencia directa del uso de las tcnicas de
ingeniera gentica que logren transferir determinados genes (a veces incluso genes humanos) a
un determinado microorganismo apropiado, para hacer el producto que es precisamente requerido
en el mercado. Determinadas protenas humanas y algunos enzimas requeridos en Medicina se
conseguirn de esta forma, en el futuro. Otros muchos beneficios, sern el resultado de la
fabricacin mediante tcnicas de fermentacin, de anticuerpos especficos para, fines analticos y
teraputicos. Estos anticuerpos monoclonales se producirn mediante el uso de microorganismos
en grandes fermentadores, como por ejemplo la produccin de antibiticos como la penicilina.

Se estn desarrollando en la actualidad, importantes descubrimiento y aplicaciones comerciales en


cada uno de los campos de la Biotecnologa, incluyendo las que tienen lugar en las industrias de
fermentacin, la biotecnologa de los enzimas y clulas inmovilizadas, el tratamiento de residuos y
la utilizacin de subproductos. Aquellos procesos que resulten productivos sern tiles a la

15

sociedad, atractivos para la industria por motivos comerciales y en algunos casos recibirn el
apoyo de los respectivos gobiernos.

Una gran potencialidad de la biotecnologa se da en el campo de la investigacin y el desarrollo


cientfico, ya que proporciona herramientas que permiten una mejor comprensin de los procesos
fisiolgicos, por ejemplo, del sistema inmuno-defensivo, o que reducen, en forma considerable, los
plazos de la I y D, facilitando as los procesos de innovacin tecnolgica. A su vez, con el
advenimiento de nuevas tcnicas en el campo biolgico, la actividad de la I y D en este campo
tiende a hacerse cada vez ms cientfica y menos emprica, acentundose as las caractersticas
de intensidad cientfica propias de la biotecnologa.

Resulta claro que siendo la biotecnologa un sistema de diversas innovaciones cientficotecnolgicas interrelacionadas, no todas ellas evolucionan al mismo ritmo. Las condiciones de
mercado, las expectativas de beneficios, aspectos organizativos y de gestin, entre otros,
favorecen la rpida puesta en marcha y difusin de algunas de estas tecnologas, relegando a
otras. La literatura sobre la innovacin tecnolgica acostumbra distinguir entre aquellas
innovaciones que surgen como respuesta a una situacin de mercado, y a expectativas de
beneficios econmicos, de aqullas que se originan en el rea de I y D como resultado de un
proceso continuo y acumulativo de desarrollo cientfico-tecnolgico. En el primer caso se habla de
"demand or market-pull" y en el segundo, de "technological-push". Ha sido frecuente, en los ltimos
tiempos, sealar el lser y la biotecnologa como ejemplos del segundo tipo de innovacin. Es
decir, descubrimientos cientficos a los que se arriba sin una aplicacin especfica predeterminada
en mente, pero que luego encuentran una gama considerable de aplicaciones prcticas.

Sin embargo, pareciera ms correcto considerar ambos actores, el inherente proceso cientficotecnolgico y aqul que corresponde a incentivos eonmicos, como complementarios. As, en el
caso de la biotecnologa, aun cuando sta nace e el mbito de la I y D, de las muchas aplicaciones
posibles, las que se desarrollan primero son aquellas que ofrecen expectativas de importantes
beneficios econmicos en un plazo ms menos breve.
En la agricultura, la biotecnologa se orienta a la superacin de los factores limitantes de la
reduccin agrcola a travs de la obtencin de variedades de plantas tolerantes a condiciones
ambientales negativas (sequas, suelos cidos), resistentes a enfermedades y pestes, que
permitan aumentar el proceso fotosinttico, la fijacin de nitrgeno o la captacin de elementos
nutritivos. Tambin se apunta al logro de plantas ms productivas y/ o ms nutritivas, mediante la
mejora de su contenido protenico o aminocido.

16

Un desarrollo paralelo es la produccin de pesticidas (insecticidas, herbicidas y fungicidas)


microbianos. Las tcnicas que ya se emplean, o que estn desarrollndose, van desde los cultivos
de tejidos, la fusin protoplasmtica, el cultivo in vitro de "meristemas", la produccin de ndulos de
"rhizobium" y "micorizas", hasta la ingeniera gentica para la obtencin de plantas de mayor
capacidad fotosinttica, que puedan fijar directamente nitrgeno, resistentes a plagas y pestes,
etc. El cultivo de tejidos consiste en la regeneracin de plantas completas a partir de una masa
amorfa, de clulas, que se denomina "callo".
En su forma ms general, se aplica a todo tipo de cultivo "in vitro", desde simples unidades
indiferenciadas hasta complejos multicelulares y rganos. El proceso consiste en la incubacin, en
condiciones controladas y aspticas, de una clula o parte de un tejido vegetal (hoja, tallo, raz,
embrin, semilla, "meristema", polen, etc.) en un medio que contiene elementos nutritivos,
vitaminas y factores de crecimiento (Osorio, 2005)

La magnitud del mercado potencial agrcola para la biotecnologa es, en gran medida materia de
especulacin debido precisamente a la falta de un conocimiento detallado de muchas de estas
condiciones locales. En este campo, la biotecnologa est orientada a la utilizacin en gran escala
de "biomasa" para la produccin de materias primas orgnicas, que actualmente se obtienen
mediante procesos qumicos convencionales. Las ventajas son que la "biomasa" es un recurso
altamente subutilizado y relativamente barato., ya que en gran parte esta constitudo por residuos y
desechos de plantaciones forestales y de cultivos en gran escala. Es adems un recurso
renovable. Las principales fuentes potencialmente disponibles para la produccin tanto de etanol
como de otros productos qumicos a granel son (aparte de las melazas de la caa) cultivos como la
yuca, el sorgo, las papas y el maz; los sueros de la industria de la leche; los residuos de las
plantaciones de caf y, en general, todo tipo de residuo celuloso.

Actualmente la biotecnologa est siendo aplicada en gran escala en la produccin de alcohol


(etanol), como combustible sustituto del petrleo, fundamentalmente en el Brasil y en menor
medida en Estados Unidos y la India. En el Brasil, la produccin se logra a partir de melazas de la
caa de azcar, mientras que en Estados Unidos se usa el maz. Otro producto importante es el
cido ctrico. Los principales productores son los Estados Unidos, Italia, Blgica y Francia que
utilizan como materia prima melazas de remolacha. La importancia que tiene cada una de las
aplicaciones mencionadas es incuestionable desde el punto de vista econmico.
A pesar que en el siglo XX, cuando la Gentica haba resuelto el misterio de la naturaleza del
material de la herencia, las posibilidades que haba para actuar sobre dicho material eran limitadas:
cruces entre plantas y animales de la misma especie (o de especies similares), seleccin de los
individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y lento), mutaciones con

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agentes fsicos (rayos UV, rayos X) o qumicos, con ulterior bsqueda (seleccin o rastreo screening) de alguna variante de inters (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc.
Debimos esperar a la dcada de los 70 para que surja un conjunto de tcnicas de laboratorio
revolucionarias que por primera vez permiten "tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la
vida. Son tcnicas y herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a diseos
previos y objetivos concretos (de ah el nombre popular de Ingeniera Gentica).
La Ingeniera Gentica (I.G.), mejor llamada tecnologa del ADN recombinante in vitro, se
caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos
distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que
ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro
provecho.
Teniendo en cuenta lo anterior se puede inferir que las tendencias cientficas mundiales a todos los
niveles y clasificacin de la Biotecnologa, se han concentrado en seis aspectos:
-

Cultivos de tejidos y clulas para: la rpida micropropagacin "in vitro" de plantas, la


obtencin de cultivos sanos, el mejoramiento gentico por cruza amplia, la preservacin e
intercambio de "germoplasma", la "biosntesis" de "metabolitos" secundarios de inters
econmico y la investigacin bsica.

Metabolomica La manipulacin del metabolismo para inhibir unas rutas biosinteticas o


favorecer otras sin afectar la economa celular con el propsito de obtener una mayor
produccin del producto de inters.

El uso de enzimas o fermentacin microbiana, para la conservacin de materia primas


definidas como sustratos en determinados productos, la recuperacin de estos productos,
su separacin de los caldos de fermentacin y su purificacin final.

Tecnologa del "hibridoma", que se refiere a la produccin, a partir de "clones", de


anticuerpos de accin muy especfica que reciben el nombre de anticuerpos
"monoclonales".

Ingeniera de protenas Proteomica, que implica la modificacin de la estructura de las


protenas para mejorar su funcionamiento o para la produccin de protenas totalmente
nuevas.

Ingeniera gentica o tecnologa del "ADN", que consiste en la introduccin de un "ADN"


hbrido, que contiene los genes de inters para determinados propsitos, para capacitar a

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ciertos organismos en la elaboracin de productos especficos, ya sean estos enzimas,


hormonas o cualquier otro tipo de protena u organismo.

Bioinformtica, que se refiere a la tcnica basada en la utilizacin de protenas en aparatos


electrnicos, particularmente sensores biolgicos y "bioships"; es decir, "microchips"
biolgicos, capaces de lgica y memoria.

A todo esto tenemos que aadir que un factor importantsimo en el desarrollo de la biotecnologa
es la evaluacin de la seguridad del producto, sometida a controles rigurosos segn normativas
nacionales e internacionales. De hecho este factor es tan importante que se puede convertir en
limitante, de modo que las regulaciones estrictas desincentivan ciertos desarrollos biotecnolgicos.
Por todo ello, es importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan ms de lo que la
evidencia cientfica sugiere, manteniendo en todo momento la preservacin de la salud y el medio
ambiente. A su vez, las regulaciones reflejan la percepcin pblica de los riesgos y promesas de la
biotecnologa. Por ejemplo, hoy en Europa la percepcin pblica ha logrado prcticamente una
parada en las plantas transgnicas, a pesar de los informes cientficos que dicen que en la mayor
parte de los casos, sus riesgos son similares a las plantas convencionales. La creacin o
elaboracin de este tipo de alimentos depende del nivel de desarrollo del pas, de los intereses
polticos del mismo y del grado de presin que ejerzan las grandes industrias privadas del sector.
Hay un gran debate en torno a la conveniencia o no de este tipo de organismos.
Habr que llegar a un dilogo racional entre los diversos actores (cientficos, empresas,
consumidores, ecologistas, entre otros) para asegurar el correcto empleo de estas tecnologas, que
por un lado no impida aplicaciones benficas sin riesgos, y por otro regule adecuadamente
aquellos mbitos donde las dudas razonables hagan recomendables ms restricciones. El ideal
sera permitir todo aquello que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de
prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados, en buena parte
imaginaciones y tergiversasiones de grupos de presin que pueden esconder agendas polticas
ocultas.

ACTIVIDADES
Lectura 1. Aplicando el mtodo de Lectura Auto regulada IPLER ;

Realice un ensayo de la

siguiente lectura.
Los beneficios de la biotecnologa alimentaria
La biotecnologa ya nos est ayudando de muchas maneras:
Proteccin del medio ambiente. Los cientficos lograron que algunos alimentos, como la papaya y
la papa, sean ms resistentes a las plagas. Estos cultivos necesitan ahora menos productos

19

qumicos para estar protegidos de insectos o virus dainos, lo que es mucho mejor para el agua y
la vida silvestre. Otros cultivos estn protegidos de los herbicidas que se usan para controlar a las
malezas. El mejor control de las malezas permite que los agricultores conserven el suelo ya que no
tienen que arar la tierra con tanta frecuencia.
Mayores rendimientos. Los agricultores tambin usan la biotecnologa para ayudar a las plantas a
sobrevivir. Por ejemplo, las nuevas variedades de maz y algodn rechazan a los insectos dainos,
y la soya mejorada puede tolerar los herbicidas. Los agricultores pueden esperar mayores
rendimientos de la cosecha en estas plantas ms resistentes.
Alimentos con mejor sabor y ms frescos. Pimientos ms dulces y tomates que maduran ms
despacio son slo dos ejemplos de cmo la biotecnologa puede producir alimentos ms frescos y
de mejor sabor.
El futuro de la biotecnologa
En el futuro, la biotecnologa podr ayudarnos a:
Cultivar ms alimentos en menor superficie. En la actualidad hay 6,000 millones de personas
viviendo en la Tierra. Para el ao 2050, seremos 9,000 millones. Al usar la biotecnologa, los
agricultores podrn producir mayores cosechas en la misma superficie que utilizan en la actualidad.
Si podemos obtener los alimentos que necesitamos de estos cultivos, ya no tendremos que
destinar ms superficie al cultivo. Los pases en desarrollo sern los que ms se beneficien con
esta tecnologa moderna ya que en ellos se producir el mayor crecimiento de la poblacin.
Mantener alimentos que sean seguros para comer. Los cientficos podrn detectar con mayor
precisin cules son los virus y bacterias dainas que pueden hallarse en los alimentos. Por lo
tanto, correremos menos riesgos de contraer enfermedades transmitidas por los alimentos.
Obtener alimentos ms saludables. Mejorar algunos alimentos por medio de la biotecnologa nos
podr ayudar a disminuir nuestro riesgo de contraer enfermedades crnicas como el cncer y
afecciones cardacas. Por ejemplo:
o Algunas frutas y verduras contendrn ms antioxidantes, Vitamina C y Vitamina E.
o Los aceites para cocinar se obtendrn de plantas que contendrn menos grasas saturadas.
o Los cacahuates podrn contener menos cantidad de las protenas que causan alergias.
Mantener seguros los alimentos para los animales. Algunos tipos de hongos que se hallan en las
sustancias que libera el maz pueden daar a los animales que lo consumen. Estas sustancias ya
estn reguladas en los Estados Unidos y la biotecnologa representa otra herramienta que ayudar
a reducir la cantidad de estas sustancias presentes en el maz.

20

Elecciones: Arroz enriquecido


Muchas de las personas que viven en los pases en desarrollo raramente consumen las vitaminas
que necesitan. Por lo tanto, es posible que tengan problemas de salud. Por ejemplo, la falta de
Vitamina A causa ceguera, y la falta de hierro puede ser daina para la salud de las mujeres y los
nios. Sin embargo, gracias a la biotecnologa, los cientficos han descubierto una manera de
agregar mayores cantidades de Vitamina A y hierro al arroz. En los pases en que el arroz es uno
de los alimentos principales de la dieta, esta nueva variedad del cereal puede llegar a proteger a la
poblacin de la ceguera y de otros problemas de salud.
La seguridad de la biotecnologa alimentaria
La Administracin de Alimentos y Frmacos (FDA) revisa la seguridad de todos los alimentos que
estn en el mercado. La FDA, la Agencia de Proteccin Ambiental (EPA), el Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la comunidad cientfica en general estn de acuerdo
en afirmar que los alimentos producidos aplicando la biotecnologa son seguros. Los alimentos
producidos utilizando mtodos biotecnolgicos o convencionales deben satisfacer los mismos
estndares de seguridad.
La FDA regula los alimentos desarrollados utilizando la biotecnologa de la misma manera en que
regula los alimentos producidos por otros mtodos.
La FDA garantiza la seguridad de estos alimentos y requiere un etiquetado especial si es que el
contenido nutricional del alimento se modifica o si se adiciona una sustancia que puede causar
alergias.
El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y la EPA tambin ayudan a regular la
biotecnologa agrcola para garantizar la seguridad. Adems, despus de una completa revisin de
la ciencia en 2002, la Sociedad de Toxicologa lleg a la conclusin de que los alimentos
producidos aplicando mtodos biotecnolgicos son tan seguros como los alimentos tradicionales.
Elecciones: Maz seguro para el medio ambiente
El maz mejorado biotecnolgicamente para que contenga menos fitato, uno de sus componentes
del mas, ayudar a reducir el impacto que tienen los animales de granja en el medio ambiente. El
maz con bajo contenido de fitato puede reducir la cantidad de fsforo no deseado en las
deposiciones de los animales, lo que representa una potencial amenaza para la calidad del agua.
Para ms informacin:
Usted puede obtener ms informacin sobre los alimentos y cmo se producen de los
profesionales de la salud, dietistas, nutrilogos, agentes de informacin, agricultores locales y

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programas universitarios que se dedican a estos temas.En los sitios de Internet que se mencionan
a continuacin hallar la informacin que necesita:
Servicio de Inspeccin de Salud de Animales y Plantas, Servicios Regulatorios de Biotecnologa
del Departamento de Agricultura de los Estados Unidoshttp://www.aphis.usda.gov/brs/
Centro de Seguridad de los Alimentos y Nutricin Aplicada de la FDAhttp://www.cfsan.fda.gov/
Agencia de proteccin ambiental (EPA) http://www.epa.gov
La Asociacin Diettica de los Estados Unidos http://www.eatright.org
Consejo de Ciencia y Tecnologa Agrcola http://www.cast-science.org
Instituto de Tecnlogos de Alimentos http://www.ift.org
Sociedad de Toxicologa http://www.toxicology.org/
IFIC Foundation http://ific.org/food/biotechnology

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UNIDAD 2. BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES


CAPITULO 1. METABOLISMO MICROBIANO
Leccin 1: Nutricin microbiana.
Las clulas contienen grandes cantidades de pequeas molculas as como de macromolculas.
La clula puede obtener la mayora de las pequeas molculas que necesita del exterior o
sintetizarlas a partir de molculas ms simples. Las macromolculas, por el contrario, son siempre
sintetizadas en la clula.

Las sustancias que son tomadas de medio externo las cuales son utilizadas con fines energticos
o plsticos se denominan como nutrientes, en cualquier caso, los nutrientes deben suministrase en
los diferentes medios de cultivo.
Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: (1) macronutrientes, los que son requeridos en
grandes cantidades; (2) Micronutrientes, y (3) factores de crecimiento que lo son solamente en
pequeas cantidades. Empezaremos por los macronutrientes mayoritarios: carbono y nitrgeno.
1.1 Macronutrientes:
Prcticamente la totalidad de la masa celular est formada por sustancias con cuatro tipos de
tomos: Carbono, oxgeno, hidrgeno y nitrgeno. Estos cuatro elementos constituyen el esqueleto
de las macromolculas as como las molculas orgnicas pequeas.
La mayora de los procariotas requieren un compuesto orgnico de algn tipo como fuente de
carbono. Estudios nutricionales han demostrado que muchas bacterias pueden asimilar varios
compuestos de carbono orgnico y utilizarlos para fabricar material celular. Un incontable nmero
de compuestos tales como animocidos, cidos grasos, y compuestos aromticos pueden ser
usados por una bacteria u otra. En peso seco, una clula tpica consta de aproximadamente 50%
de carbono y a su vez este es el elemento mayoritario de las macromolculas.
Despus del carbono, el siguiente elemento ms abundante en la clula es el nitrgeno. Una
bacteria tpica contiene aproximadamente el 12% de nitrgeno (peso seco) y a su vez el nitrgeno
es un componente mayoritario de protenas, cidos nucleicos y otros constituyentes celulares. El
nitrgeno se encuentra en la naturaleza tanto en forma orgnica como inorgnica. Sin embargo, la
globalidad del nitrgeno utilizable est en forma inorgnica, bien como amonaco (NH3), nitrato
-

(NH3 )

23

N2. La mayora de las bacterias pueden utilizar amonaco y muchas adems nitrato. El nitrgeno
molecular (gas), sin embargo, puede ser fuente de nitrgeno para un reducido grupo de bacterias
(bacterias fijadoras de nitrgeno).
1.2 Otros macronutrientes: P,S,K,Mg,Ca,Na,Fe
El fsforo acontece en la naturaleza en forma de fosfatos orgnicos o inorgnicos y es requerido
por la clula para la sntesis de cidos nucleicos y fosfolpidos. El azufre es fundamental por ser un
elemento estructural en los aminocidos cisteina y metionina y porque est presente en vitaminas
tales como la tiamina, biotina, cido lipoico as como coenzima A. El potasio es necesario en todos
los organismos. Una gran diversidad de enzimas, incluyendo varias implicadas en la sntesis de
protenas, lo requiere especficamente. El magnesio estabiliza los ribosomas, las membranas
celulares, los cidos nucleicos y se requiere tambin para la actividad de muchas enzimas. El
calcio (que no es nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos ),ayuda a
estabilizar la pared celular bacteriana y juega un papel fundamental en la termorresistencia de la
endospora bacteriana. El sodio es requerido por algunos, pero no todos, microorganismos y
cuando lo es, es debido a la naturaleza qumica de su hbitat. El hierro es requerido por las
clulas en mayores cantidades que otros metales traza y por ellos debe ser considerado como un
macronutriente. El hierro juega un papel fundamental en la respiracin celular, siendo un
componente clave de los citocromos, y de las protenas que contiene hierro y azufre implicadas en
el transporte de electrones. Debido a que la mayor parte de las sales inorgnicas son altamente
insolubles, muchos microorganismos producen agentes que unen el hierro de una manera muy
especfica, denominados siderforos, que solubilizan las sales de hierro trasportndolo al interior
celular.
1.3 Micronutrientes (elementos traza)
Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeas cantidades son, sin embargo, tan
importantes como los macronutrientes para la funcin celular. Los micronutrientes son metales,
muchos de los cuales forman parte de enzimas que son los catalizadores celulares. Entre los
micronutrientes ms importantes de sistemas vivos, que son necesarios para el funcionamiento de
enzimas estn: Cromo, Cobalto, Cobre, Manganeso, Molibdeno, Nquel, Selenio, Tungsteno,
Vanadio, Zinc, Hierro.
1.4 Factores de crecimiento
Estos son compuestos orgnicos que, como los micronutrientes, son requeridos en muy pequeas
cantidades y slo por algunas clulas. Los factores de crecimiento incluyen vitaminas,
aminocidos, purinas y pirimidinas. Aunque la mayora de los microorganismos son capaces de
sintetizar estos compuestos, otros microorganismos

requieren tomar uno o ms compuestos

preformados del medio ambiente.

24

1.5. Medios de cultivo


En microbiologa industrial se usan dos grandes grupos de medios de cultivo: Los qumicamente
definidos y los indefinidos (complejos). Los medios qumicamente definidos se preparan
aadiendo al agua destilada cantidades precisas de compuestos orgnicos o inorgnicos
altamente purificados. Por ellos se conoce la composicin qumica exacta .En muchos casos, sin
embargo, el conocimiento exacto de la composicin qumica no es crtico. En estas ocasiones los
medios complejos pueden ser suficientes, e incluso presentar ventajas sobre los definidos. Los
medios complejos emplean lisados de casena (protena de la leche), de carne, de soja, de
levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva (qumicamente indefinida): Tales lisados
estn disponibles comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados rpidamente y
disueltos en agua destilada para dar lugar a un medio. Sin embargo, cuando se utilizan medio
complejos hay que tener en cuenta que no se conoce la composicin de nutrientes.

El metabolismo es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el interior de la clula


y que da lugar a la sntesis de material celular a partir de sustancias nutritivas.

El metabolismo puede dividirse, para su mejor estudio, en tres aspectos diferentes pero
ntimamente ligados (figura 1) : el catabolismo (Metabolismos energtico) que es la suma de
reacciones exergnicas que permiten liberar la energa contenida en los nutrientes o estratos y ser
acumulada en forma de ATP u otros compuestos, el anfibolismo o metabolismo intermediario, que
es el conjunto de reacciones en que los productos de hidrlisis del catabolismo y algunos
nutrientes son transformados en cidos orgnicos , steres fosfricos y otros compuestos como
aminocidos; el anabolismo o metabolismo biosinttico que es la parte del metabolismo implicado
en la sntesis de macromolculas-cidos nucleicos, protenas sustancias de reserva y otros, todas
Figura 1: Diferentes fases del metabolismo microbiano:

25

Leccin 2: Metabolismo energtico

Es tradicional agrupar a los microorganismos en clases metablicas dependiendo de la fuente de


energa que utilicen. Todos los trminos utilizados para describir estas clases emplean la
terminacin trofo que deriva del griego y significa alimentarse. As, lo organismos que utiliza luz
como fuente de energa se llaman fototrofos (foto es luz en griego) y los organismos que utilizan
productos qumicos como fuente de energa se denominan quimiotrfos. La mayor parte de los
organismos que estudia la microbiologa utilizan compuestos orgnicos como fuente de energa;
pertenecen por tanto a los quimiotrfos y se denominan quimiorganotrofos. Los organismos
capaces

de

utilizar

compuestos

inorgnicos

como fuente

de

energa

se

denominan

quimiolitotrofos

Los mecanismo por los que se sintetiza ATP como resultado de reacciones de oxidacin
reduccin que implican compuestos orgnicos, pueden contemplarse en dos grandes grupos: (1)
Fermentacin, en que los procesos de oxido reduccin ocurren en ausencia de aceptores
terminales de electrones aadidos; y (2) respiracin, en que el oxgeno molecular u otros
oxidantes sirven como aceptores terminales de electrones.

2.1 Naturaleza de la fermentacin:

La fermentacin es el mecanismo ms simple y quizs el ms antiguo desde el punto de vista


evolutivo, de los procesos de obtencin de energa. Se suponen que en las condiciones del mundo
primitivo, donde no exista oxgeno libre, ni los rayos del sol llegaban a su superficie, los primero
organismos solo podan obtener la energa a partir de la contenida en los compuestos orgnicos.

Se puede definir entonces, la fermentacin como el proceso metablico de generacin de ATP, en


el cual los donantes y los aceptores de electrones son molculas orgnicas. (Martinez, J; 1995)
Los compuestos que llevan acabo estas dos funciones son usualmente dos metabolitos diferentes
derivados de un sustrato fermentable simple (como azcar, por ejemplo). En la fermentacin el
sustrato da lugar a una serie de compuestos, unos ms oxidados y otros ms reducidos; en el
proceso fermentativo mantiene un estricto balance O-R. El nivel de oxidacin promedio de los
productos finales es muy cercano al del sustrato. De ah que la generacin de ATP asociada a la
fermentacin se denomina fosforilacin a nivel de sustrato. la fermentacin posee tres
caractersticas:
1. En la fermentacin, tanto donantes como aceptores de electrones son molculas
orgnicas; en ocasiones es la misma molcula la que se oxida y se reduce.
2. El proceso ocurre en ausencia de oxigeno
3. Existe un riguroso balance de C, O e H entre los sustratos y los productos

26

Un ejemplo de fermentacin es el catabolismo de la glucosa por una bacteria del cido lctico:

Glucosa
( CcH12O6

2 lactatos +2 H+

2C3H4O3 - + 2CO2)

Ntese que sta es una reaccin balanceada y que los productos, lactato ms protones, tienen la
misma proporcin de tomos de hidrgeno y oxgeno que la glucosa. Esta reaccin puede
analizarse desde tres puntos de vista: Termodinmicamente, por la energa de enlace y por el
metabolismo intermediario.

Desde el punto de vista termodinmico, las fermentaciones se caracterizan por ser una suma de
reacciones, al final de las cuales los productos poseen un contenido energtico menor que el
inicial.

Si analizamos la fermentacin a travs de la energa de enlace, tendremos que en ella se producen


reordenamientos moleculares en los que se pasa de funciones de mayor contenido a funciones de
menor contenido energtico. As, en la mayora de las fermentaciones se pasa de grupos carbonilo
e hidroxilo a grupos carboxilo de menor contenido energtico.
Existen tres rutas bsicas empleadas por los microorganismo para el aprovechamiento energtico
de los sustratos.

1. La va fructosa difosfato (FDP) tambin conocida como gliclisis o va de EmbdenMeyerhof


2. la va de las pentosas fosfato (PP) o de Warburg-Dickens Horecker
3. La va de Entner-Doudorff p KDPG
Cada una de estas vas tiene funciones y unidades especficas para los microorganismos. Las dos
primeras vas son comunes tanto a organismos respiratorios como fermentativos, procariontes o
eucariontes. La tercera se halla restringida a procariontes. Al existir diferentes vas de fermentacin
se obtienen tambin diferentes productos: Algunos productos derivados de la fermentacin se
observan en la siguiente tabla

Tabla 1. Productos derivados de la fermentacin

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Tipo de fermentacin

Producto(s)

Fermentacin lctica

Lactato

Fermentacin alcohlica

etanol, CO2

Fermentacin cida-mixta

etanol, succinato, acetato, formiato, lactato, CO2, H2

Fermentacin butilngliclica

butilnglicol, CO2

Fermentacin aceto-butrica

acetato, acetona, butirato, butanol, etanol, CO2, H2

Fuente : J. Martines. 1988

2.2 : Naturaleza de la respiracin:


La respiracin es un mecanismo metablico de generacin de ATP en el que, a diferencia de la
fermentacin, sirven como donantes de electrones tanto compuestos orgnicos como inorgnicos
(oxidndose). Generalmente el aceptor electrnico final es el oxigeno molecular. A diferencia de la
fermentacin, los electrones son transferidos a travs de una cadena transportadora de
electrones al final de la cual existe un aceptor exgeno oxidado (A), que se reduce. Si el aceptor
final es el O2, hablamos de respiracin aerobia; Si el aceptor final es distinto del O2 (nitrato,
sulfato, etc.), respiracin anaerobia.
En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la direccin de mayor potencial redox
positivo, con la consiguiente liberacin de energa libre. Como veremos enseguida, esta energa
libre se va a traducir en un potencial electroqumico de protones, cuya disipacin a travs de ATPasas de membrana origina ATP, conocindose este proceso como fosforilacin oxidativa

Leccin 3: Aspectos generales de los procesos biosnteticos


Diversas reacciones catablicas producen unidades para la biosntesis, pero otras pueden ser
tomadas desde exterior y un tercer grupo de unidades, al igual que las coenzimas, son el resultado
de las vas biosintticas que han sido denominadas reacciones metablicas. Finalmente, en la
sntesis de macromolculas los productos mayoritarios son protenas y cidos nucleicos. Tambin
son importantes, e incluso pueden ser mayoritarios otros tipos de molculas de gran tamao, entre
los que se encuentran los polisacridos y lpidos complejos. El tipo de estructura de estos dos
ltimos variar mucho de un organismo a otro, y tiene especial inters en las bacterias.

28

La mayor parte de peso seco de la bacteria est constituidos por macromolculas de cuatro tipos:
cidos nucleicos, protenas, polisacridos y lpidos complejos. Estas macromolculas son
polmeros formados por unidades estructurales debajo peso molecular que tiene que formarse
como precursores. Ya sabemos que las subunidades estructurales de los cidos nucleicos son 8
tipos distinto de nucletidos, las de las protenas 20 aminocidos diferentes, las de los
polisacridos, unos 15 azucares diferentes, y que para la formacin de los lpidos se requieren
cidos grasos, polialcoholes, azcares, aminas y aminocios que constituyen tambin unos 20
tipos diferentes de molculas orgnicas. Adems se requieren sintetizar unas 20 coenzimas y
transportadores de electrones.

Un tipo ms interesante y bastante ms complejo de proceso microbiano industrial es aquel en el


que el producto deseado no es producido durante la primera fase de crecimiento, sino poco
despus que se inicie la fase estacionaria. Metabolitos producidos durante la fase estacionaria son
llamados metabolitos secundarios y son algunos de los ms comunes e importantes metabolitos de
inters industrial. Los mejor conocidos y el ms extensamente estudiados metabolitos secundarios
son los antibiticos.

Se han reconocido las siguientes caractersticas de los metabolitos secundarios:


1) Cada metabolito secundario se forma nicamente a partir de relativamente pocos organismos.
2) La formacin de metabolitos secundarios es sumamente dependiente de las condiciones de
crecimiento, en particular de la composicin del medio. Es frecuente la represin de la formacin
de metabolitos secundarios.
3) Los metabolitos secundarios no son indispensables para el crecimiento y la
reproduccin.
4) Los metabolitos secundarios se suelen producir como un grupo de sustancias estrechamente
relacionadas. Por ej. una sola cepa de Streptomyces ha llegado ha producir 32 antibiticos de
antraciclina diferentes, pero relacionados.

Capitulo 2: CRECIMIENTO MICROBIANO


Leccin 4: Crecimiento Bacteriano
Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de
todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular
que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha
multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares
que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los
microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no se acompaa de divisin

29

celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento


bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y a escala
poblacional. Para efectos prcticos, esta seccin nos centraremos al estudio del crecimiento
poblacional. El cual en cultivo cerrado atraviesa por las siguientes fases:
4.1. Fases del crecimiento en un sistema cerrado en medio lquido
En sistema de produccin cerrado, en el cual la adicin de sustancias y microorganismos solo se
realizan al inicio d ela fermentacin se pueden identificar 6 fases de crecimiento. (Figura 2)

Figura 2 Curva de crecimiento microbiano


Como se puede constatar en el anterior grfico, el crecimiento en un sistema cerrado consta de
varias fases, que pasamos a comentar:
1) Fase de latencia: Es el perodo de tiempo durante el que el inculo se adapta a las condiciones
del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un perodo de ajuste metablico. Su
duracin depende de varios factores:
Tamao del inculo
Estado fisiolgico del inculo:
Si las clulas estn daadas por algn agente, la fase de latencia tambin es
larga, ya que necesitan un tiempo para la reparacin de los daos.
Si las clulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en fase exponencial,
la fase de latencia es ms corta.
Medio de cultivo del que procede el inculo:
Si el medio es similar al medio fresco, la fase de latencia es ms corta;

30

Si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es ms pobre, la


fase de latencia se hace ms larga, porque las bacterias necesitan un tiempo
adicional para activar la sntesis de las enzimas biosintticas que estaban
reprimidas en el medio rico.
2) Fase de transicin, de crecimiento acelerado, que conduce a la siguiente fase
3) Fase de crecimiento exponencial. Durante esta fase se produce un crecimiento balanceado
no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de
generacin (g) es caracterstico para cada especie o cepa, en cada medio concreto:
El valor del tiempo de generacin (g) depende de:

composicin del medio, temperatura, pH,

osmolaridad (tonicidad), etc.


Los microorganismos hetertrofos suelen crecer ms rpidamente en los medios complejos, ricos,
que en los medios sintticos, y dentro de estos ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes
de carbono. Algunos microorganismos tienen, a su temperatura ptima tiempos de generacin muy
cortos (15, 20 min), mientras que otros tienen crecen ms lentamente, con tiempos de generacin
que pueden ser de varias horas o incluso das.
4) Fase de aceleracin negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a
5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace
nulo ( = 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con
las muertes celulares.
En este perodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el
pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular.
Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transicin (de aceleracin negativa) puede
ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a
aminocidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono).
6) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se debe a
agotamiento de reservas de energa. Algunas veces las clulas aparecen grandes, hinchadas,
distorsionadas (formas fantasmas, ghost). La pendiente de esta parte de la curva depende de
las especies (por ejemplo, en bacterias entricas es suave, mientras que en Bacillus es ms
acentuada).
Leccin 5: Modelos Matemticos del crecimiento microbiano
Para muchos propsitos en biotecnologa microbiana es necesario conocer el nmero de
generaciones, la poblacin de bacterias con el fin de estimar el estado fisiolgico de la

31

poblacin microbiana y establecer relaciones con los sustratos del medio de cultivo o los
productos de biosntesis.

En los organismos unicelulares la clula se divide por fisin binaria dando lugar a dos clulas hijas,
cada una de las cuales se divide nuevamente produciendo dos clulas nuevas, por lo que en cada
periodo e divisin la poblacin se duplica. Esta multiplicacin representa una progresin
geomtrica en la cual hay una relacin directa entre el nmero de clulas iniciales y la cantidad de
clulas en otro tiempo determinado. La expresin matemptica que representa esta relacin es:
n

N = No2 Donde:
N= numero final de clulas,
No = nmero inicial de clulas
N = nmero de generaciones
Para explicar la anterior ecuacin en trminos de n se aplica una transformacin logartmica cuyo
resultado es:

El tiempo de generacin (G) de la poblacin es:


donde,
t = horas o minutos de crecimiento exponencial
Una expresin alternativa del crecimiento se deriva de asumir que la velocidad de incremento en la
masa celular o densidad celular (dx/dt) en un tiempo (t) es proporcional a la densidad celular en
dicho tiempo. Por consiguiente:

de donde:
x = nmero de clulas o algn componente (protena)
constante de velocidad de crecimiento instantneo
Integrando se obtiene:

ln X1 = ln Xo + t
tomando el antilogaritmo a cada lado se obtiene

X1 = Xoe

Considerando que despus de un tiempo la poblacin se duplica (td) entonces:

32

X1 = 2Xo por tanto, la duplicacin de la poblacin celular se puede expresar as:


X1/Xo = 2 reordenando los valores en la penltima ecuacin se obtiene:
2 = et aplicando antilogaritmo a cada lado se obtiene:

entonces:

= 0.693/td
Una aplicacin especialmente importante de la constante de velocidad instantnea, es el
quimiostato, el cual es un dispositivo de cultivo continuo donde el Volumen es constante y el
nutriente entra con la misma velocidad con la que sale. En este equipo el tamao de la poblacin y
la velocidad de crecimiento pueden mantenerse constantes, puesto que la velocidad de
crecimiento es una funcin de la concentracin de nutrientes. Monod propueso la siguiente
ecuacin para representar esta relacin :

Donde mx. es la velocidad de crecimiento a saturacin de nutriente, S es la concentracin de


nutriente, y K es una constante de saturacin que es numricamente iguala la concentracin de
nutriente a la que = de max La ecuacin anterior es formalmente equivalente a la ecuacin de
Michaelis- Mente usada en el anlisis de la cintica enzimtica. La determinacin de los
parmetros desconocidos max y Ks se puede hacer representando 1/sobre el eje y frente a 1/S
sobre el eje X. Se obtendr una lnea recta que corta al eje Y , y el valor en el punto de
intervenciones 1/max .La pendiente de la recta es Ks/mx y como se conoce

mx

se puede calcular

Ks. En general los valores de Ks son muy bajos.

Capitulo 3: SISTEMAS DE FERMENTACIN


Leccin 6: Tipos de fermentacin

1) Fermentacin discontinua Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada
como un sistema cerrado. A tiempo cero t = 0, la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con
microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de
fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no se aade nada, excepto oxgeno (en forma de
aire), un agente antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio de
cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente en

33

forma continua como resultado del metabolismo de las clulas. Despus de la inoculacin de una
solucin nutritiva estril con microorganismos y su cultivo en condiciones fisiolgicas se observan
cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia, fase logartmica, fase estacionaria y fase de
muerte
2) Proceso de fermentacin alimentada (fed-batch)
En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los substratos se
aaden al principio de la fermentacin. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la
fermentacin alimentada, que se utiliza en la produccin de substancias como la penicilina. En los
procesos alimentados los substratos se aaden escalonadamente a medida que progresa la
fermentacin. La formacin de muchos metabolitos secundarios est sometida a represin
catablica por altas concentraciones de glucosa, por otros carbohidratos, o por compuestos
nitrogenados. Por esta razn en el mtodo alimentado los elementos crticos de la solucin de
nutrientes se aaden en pequeas concentraciones al principio de la fermentacin y continan
aadindose a pequeas dosis durante la fase de produccin.

Puesto que generalmente no es posible medir la concentracin del substrato directa y continuamente durante la fermentacin a fin de controlar el proceso de alimentacin, tienen que ser
medidos parmetros indirectos que estn correlacionados con el metabolismo del substrato crtico.
Por ejemplo, en la produccin de cidos orgnicos, el valor del pH puede ser utilizado para
determinar la velocidad de alimentacin de la glucosa. En fermentaciones con valores osmticos
crticos la alimentacin puede ser regulada controlando el valor de pO2 o el contenido en CO2, en
los gases que se liberan.
3) Fermentacin continua.
En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin nutritiva estril se aade
continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con
los microorganismos, se saca simultneamente del sistema. Entre las distintas clases de fermentaciones continuas pueden ser distinguidos dos tipos bsicos:
a. Biorreactor mezclado homogneamente. Este es utilizado como un quimiostato o como
un turbidostato. En el quimiostato en estado de equilibrio, el crecimiento de las clulas se
controla ajustando la concentracin de un substrato (Fig. 3.A). cualquier substrato que se
requiera (carbohidrato, compuesto nitrogenado, sales, a,) puede ser utilizado como
substrato limitante. En el turbidostato el crecimiento de las clulas se mantiene constante
utilizando la turbidez para controlar la concentracin de biomasa y la velocidad de alimentacin de la solucin de nutrientes se ajusta de forma apropiada (Fig. 3).

34

Figura 3 Fermentacin continua en quimiostato A), Turbidostato B) y Fermentador de flujo de tapn

Fuente : Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiologa industrial


b. Reactor de flujo de tapn. En este tipo de fermentacin continua la solucin de cultivo fluye a
travs de un reactor tubular sin mezclado. La composicin de la solucin de nutrientes, el nmero
de clulas, la transferencia de masa (suministro de O2) y la productividad varan en distintas
posiciones dentro del sistema (Fig. 3C). A la entrada del reactor las clulas deben aadirse
continuamente junto con la solucin de nutrientes (generalmente como un flujo que revierte de una
desviacin desde la salida del fermentador o desde una segunda fermentacin continua).

En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la prdida de clulas debida al fluido que sale
debe ser balanceada por el crecimiento del microorganismo

La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volumtrico (que entra y sale) a travs
del volumen del fermentador.
Utilizando la ecuacin de Monod que describe la dependencia de la velocidad especfica de
crecimiento sobre la concentracin de substrato limitante pueden ser determinados en el
biorreactor la constante de rendimiento biomasa/substrato (Y X/S), la densidad de las clulas (X) y la
concentracin de substrato (S).

35

A velocidad ms baja de flujo el substrato es casi completamente agotado por las clulas (S O).
La concentracin de clulas es entonces X = So/Y. Si D aumenta, X desciende lentamente, al
principio en forma lineal y luego a D = m cae bruscamente hasta O. S aumenta lentamente al
principio y se aproxima a So a D = m. Cuando X es cero en la ecuacin que explica el sustrato (S),
se alcanza el punto de lavado Dm.

Por encima de Dm no es posible un estado de equilibrio. Si la velocidad de flujo es slo ligeramente


ms baja que D" el sistema es muy sensible a las influencias externas. Pequeas desviaciones en
la alimentacin pueden originar cambios extremos en la biomasa o en la separacin de las clulas.
La Figura 4 muestra la interdependencia de la velocidad de flujo, la concentracin de substrato, la
concentracin de clulas y la velocidad de formacin de clulas (m = 1 h-1 Ks = 0,2 g/l Y = 0,5).
Figura 4. Efecto de la velocidad de flujo sobre la concentracin de substrato (5), la concentracin
de clulas (X). Tiempo de duplicacin (1,) y velocidad de fermentacin de clulas (D * X)

Fuente : Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiologa industrial

36

La velocidad especfica mxima de crecimiento en los procesos industriales se escoge de forma


que se obtenga el rendimiento ms alto en el volumen ms pequeo de fermentador y en el tiempo
ms corto.

El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentacin continua a velocidades muy


bajas o muy altas de dilucin. A velocidades medias de dilucin la relacin molar entre la biomasa
producida y el CO2 que se desprende es constante. A bajas velocidades de dilucin la proporcin
de CO2 se hace ms grande. Esto se debe a que se utiliza ms fuente de energa para el
mantenimiento de la estructura celular, para la regulacin osmtica o para la motilidad. Por otra
parte, a velocidades altas de flujo una parte del carbono aadido es oxidado incompletamente (a
productos como piruvato, acetato o cidos tricarboxlicos) y de esta forma se reduce la
productividad. A bajas velocidades de flujo, con nitrgeno como substrato limitan te, se forman
materiales de reserva, como polisacridos, lo que resulta en un aumento en el tamao de la clula
y por tanto de la biomasa.
Leccin 7: Productividad y velocidad especfica de produccin
La productividad de una fermentacin se define como
Productividad P =
Concentracin de producto / I = unidades
Tiempo de fermentacin
hxL
Para evaluar la economa de un proceso deben ser considerados varios factores, el tiempo de
produccin de la fermentacin, el tiempo requerido para limpiar y poner a punto el fermentador, el
tiempo de esterilizacin y la duracin de la fase de latencia. En la Figura 5 la pendiente de la
tangente de la curva de formacin del producto es una medida de la productividad mxima y la
pendiente de la lnea recta, al final de la curva de formacin de producto, indica la productividad
total.

Que el proceso de fermentacin termine al tiempo de la productividad mxima o ms tarde


depende de los costes de operacin, que incluyen la energa, gastos generales, costes de mano
de obra, gastos en personal y la capacidad del sistema. Utilizando una grfica como la de la Figura
5 se puede hacer una estimacin de como optimizar el proceso. En fermentaciones a tiempo corto
(8-70 h) el tiempo para la puesta a punto es significativo, mientras que en fermentaciones largas
(>3 das) el tiempo de puesta a punto es menos crucial.

Las condiciones de fermentacin afectan directamente la productividad. La Figura 6 muestra la


productividad de un proceso para la obtencin de protena de origen unicelular en relacin al
contenido del substrato (hidrocarburo). Existe un aumento lineal de [a productividad a medida que
el contenido del substrato aumenta, hasta que se alcanza la concentracin a la que el hidrocarburo

37

se convierte en la fase continua (aceite y agua no son miscibles). Por encima de esta
concentracin la productividad decrece.
Figura 5. Productividad total y productividad mxima

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiologa industrial


En fermentaciones continuas la productividad puede ser expresada como:
P = D * X (g/l *h)

Cuando se utiliza la relacin de la ecuacin sobre sustrato (S) resulta la siguiente ecuacin

P=D*Yx/y (S0 D*Ks/m-D)

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Figura 6. Productividad en relacin a la concentracin de cidos grasos en un proceso de


produccin de protena de origen unicelular.

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiologa industrial

En fermentaciones continuas la productividad mxima es igual a la productividad total ya que el


tiempo de establecimiento y la fase de latencia pueden ser despreciados. Por ejemplo, si el tiempo
inicial de puesta a punto requiere 24 h Y la propia fermentacin continua funciona durante 24 horas
con una velocidad de flujo de O,1 h-l, 24 h con 0,15 h-l Y al menos 72 h con 0,2 h-l, la
productividad total para el producto X se calcula como se muestra en la Tabla 2.

39

La velocidad especfica de produccin qp deriva de la ecuacin 1 de la siguiente forma:

El valor P1 es la concentracin de producto y la velocidad especfica de produccin qp es equivalente a la velocidad especfica de crecimiento en la ecuacin 1. Sin embargo, en los procesos de
tipos II y IlI no hay correlacin directa entre y qp
Leccin 8: Coeficientes de rendimiento

Monod defini originalmente el coeficiente de rendimiento Y como la relacin de clulas producidas


a substrato consumido:

Hoy los coeficientes generales de rendimiento se utilizan para caracterizar los procesos de fermentacin, es decir las relaciones de las clulas producidas a los substratos individuales
convertidos o a la energa liberada o energa consumida. Sin embargo, los coeficientes de
rendimiento no son constantes, ya que dependen de parmetros biolgicos (X, ) y de parmetros
qumicos (pO2 relacin C/N, y contenido en fsforo del medio.
Los coeficientes de rendimiento han sido clasificados en tres grupos. El primer grupo de coeficientes (Ys Y02 Ykcal) da informacin acerca de los procesos tcnicos y por tanto acerca de la
economa. El segundo grupo (Yc Yp YN Yave) describe el catabolismo, anfibolismo y anabolismo.
El tercer grupo incluye YATP un coeficiente que describe las relaciones de energa de las clulas
(Tempest y Neijssel, 1984). Algunos autores utilizan otros coeficientes de rendimiento que deben
ser propiamente designados, como muestra;

40

Capitulo 4: PRINCIPIOS DE BIOINGENIERA


Como ya se dijo, el equipo donde se realiza el proceso se denomina biorreactor o fermentados. El
mismo provee todos los servicios que son necesarios para el cultivo, tales como mezclado,
termostatizacin, suministro de oxgeno, entradas para adicin de nutrientes, control del pH, etc.
Por otra parte, cuando se habla de sistemas de cultivo o, tambin, mtodos de cultivo, se hace
referencia al modo de operar el biorreactor, esto es en forma continua o discontinua. En esta fase
nops ocuparemos de los birreactores.
Leccin 9: Biorreactores
El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiologa industrial. Es el
recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseo debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y
adecuado para los microorganismos. Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del
siguiente modo:
a) Mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de prevenir
la sedimentacin o la flotacin.
b) Mantener constante y homognea la temperatura.
c) Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes.
d) Suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
e) El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo el sistema ha sido
esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo deseado.

Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor est provisto de un
sistema de agitacin, a dems para el punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el
cultivo.
Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: el tanque agitado y
al "air lift". En el primero de ellos (Figura 7) la agitacin se realiza mecnicamente mediante un eje
provisto de turbinas accionado por un motor.

41

Figura 7. Esquema de un reactor aerobio con agitacin mecnica.

El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee
pequeos orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale de cada orificio es
"golpeado" por las paletas de la turbina inferior generndose de este modo miles de pequeas
burbujas de aire, desde las cuales difunde el O2 hacia el seno del lquido. El sistema de agitacin
se completa con cuatro o seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento
circular que imprimen las turbinas al lquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor
mezclado. El tanque est rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que permite controlar
la temperatura. Para tanques mayores que 1000 2000 litros este sistema ya no es eficiente y es
reemplazado por un serpentn que circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse
en cuenta que a medida que es mayor el volumen de cultivo tambin lo es la cantidad de calor
generado, por lo que se hace necesario una mayor rea de refrigeracin. Los tanques son de
acero inoxidable y estn pulidos a fin de facilitar la limpieza y posterior esterilizacin.

42

Figura 8. Esquema de un reactor tipo Air lift.

El aire que ingresa al biorreactor debe estar estril, lo que se consigue hacindolo pasar por un
filtro cuyo dimetro de poro es de 0,45 micrones, que impide el paso de microorganismos y
esporas. En los reactores de tipo "air lift" (Figura 8) es el mismo aire inyectado al cultivo lo que
promueve la agitacin. Bsicamente consiste en dos cilindros concntricos y por la base de uno de
ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulacin de lquido
ascendente en el comportamiento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el
mezclado.
Leccin 10: Transferencia de O2
La velocidad de transferencia de 02, R02, desde el seno de la fase gaseosa (burbujas) hasta la
fase lquida est dada por la siguiente ecuacin:

donde KLa es el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno, C la concentracin de 02


disuelto en el seno del lquido y C* la concentracin de 02 disuelto que estara en equilibrio con la
presin parcial de oxgeno de la fase gaseosa. El KLa depende del diseo del biorreactor, de las
condiciones de operacin (caudal de aire, agitacin) y de la viscosidad del cultivo. A mayor
viscosidad menor K La. El KLa es una medida de la capacidad que posee un biorreactor para
sumnistrar O2 y el rango de valores usuales est comprendido entre 50 h-1 y 1000 h.

43

Es til en este punto retomar el ejemplo visto al final del y calcular el KLa necesario para que la
velocidad de transferencia de 02 sea igual a la de consumo; esto significa que R02 deber ser igual
a 1,526 mg 1-1 h-1. Asumiendo que C* = 7,8 mg 1 -1 y C = 0,5 mg 1 -1, resulta Por tanto valores
de KLa iguales o superiores al calculado asegurarn, que el cultivo no est limitado por 02. Cuando
la velocidad de consumo del oxgeno vara con el tiempo, como ocurre por ejemplo en un cultivo
"batch", el clculo de KLa necesario se realiza empleando el mximo valor de RO2 esperado, a fin
de asegurar un adecuado suministro de 02 durante todo el cultivo.

Leccin 11: Caractersticas de la Fermentacin en gran escala.


El fermentador donde se lleva a cabo los procesos industriales pueden variar en tamao de la
escala pequea de laboratorio 5-10 litros a la enorme escala industrial de 400.000 litros. Las
dimensiones dependen del proceso y de cmo opera. Los procesos manejados en lote o batch
requieren fermentadores ms grandes que los manejados en forma contnua o semicontnua.
Tabla 1. Tamao de fermentadores para varios procesos
Tamao del fermentador (litros)
1-20.000
40-80.000
100- 150.000
450.000

Producto
Enzimas para diagnstico, sustancias para
biologa molecular
Algunas enzimas, antibiticos
Penicilina,
antibiticos
amino-glicsidos,
proteasas, amilasas, transformaciones de
esteroides, amino cidos
Amino cidos ( cido glutmico)

11.1 Control y monitoreo del proceso.


Debido a los elevados costos de produccin, los fermentadores industriales estn cuidadosamente
controlados. No solo se necesita controlar el crecimiento y la formacin del producto, sino que se
deben controlar otros factores ambientales a medida que el proceso se efecta. Los factores
ambientales controlados ms frecuentemente son: la concentracin de oxgeno, pH, masa celular y
concentracin del producto. Tambin es necesario en muchos casos controlar la espuma dentro
del fermentador y ajustar la temperatura. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar
los procesos de fermentacin ya sea en la obtencin de datos que reflejen los cambios que tienen
lugar durante el proceso de fermentacin o en el control de varios factores ambientales que se
deben ajustar o alterar durante la fermentacin. La obtencin de datos a medida que el proceso de
fermentacin tiene lugar se llama adquisicin inmediata y tiene un valor especial cuando estos
datos se puedan procesar para convertirlos en cifras que puedan interpretarse en trminos

44

microbiolgicos o bioqumicos. Las computadoras tambin permiten graficar los datos obtenidos
permitiendo al operador del fermentador tener una representacin visual del progreso de la
fermentacin. Finalmente la computadora nos permite almacenar los datos en forma legible de
modo que estos datos se puedan traducir a otro sistema, o analizar en forma mas sofisticada.

Un uso mas sofisticado de las computadoras es el control inmediato del proceso de fermentacin
por ej. cambiando los parmetros ambientales a medida que la fermentacin progresa o agregando
un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del crecimiento, en esta forma el nutriente es
aadido cuando se necesita evitando en algunos casos que el mismo sea metabolizado a
productos indeseables.

Finalmente, las computadoras pueden ayudar a modular los procesos de fermentacin, para ello se
debe desarrollar un modelo matemtico del proceso de fermentacin, el cual incorpora ecuaciones
diferenciales para describir el crecimiento microbiano y la formacin del producto. El valor del uso
de una computadora para modelar el proceso de fermentacin es que se puede ensayar el efecto
de varios parmetros sobre el crecimiento y sobre la formacin del producto en forma rpida e
interactivamente, y entonces hacer modificaciones en los parmetros para ver como afectan al
proceso. De esta forma se pueden estudiar con gran economa muchas variaciones de la
fermentacin en la Terminal de la computadora y no en forma ms costosa en la planta piloto o en
la planta industrial.
11.2 Escalamiento del proceso de fermentacin.
Uno de los aspectos mas importantes y complicados de la microbiologa industrial es la
transferencia de un proceso del equipo de laboratorio a pequea escala, al equipo comercial a gran
escala, procedimiento que se llama escalamiento. Es sumamente importante comprender los
problemas del escalamiento ya que es raro que un proceso microbiano se comporte de la misma
forma en fermentadores a gran escala que en un equipo de laboratorio a pequea escala. La
mezcla y la aireacin son mucho mas eficientes en el matraz de laboratorio pequeo que en el
fermentador industrial grande. A medida que cambia el tamao del equipo, cambia la relacin
superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayor para un rea superficial
determinada. Como la transferencia del gas y la mezcla dependen de la superficie expuesta ms
que del volumen del fermentador, es obvio que sea ms difcil mezclar el contenido del tanque
grande que del matraz pequeo. Como la mayor parte de las fermentaciones industriales son
aerbicas, es indispensable una transferencia efectiva del oxigeno. Con el medio de cultivo rico
que se utiliza en los procesos industriales se obtiene una alta biomasa, que origina una gran
demanda de oxigeno. Si se reduce la aireacin, aun durante un periodo corto, el cultivo puede
experimentar una anaerobiosis parcial, con serias consecuencias en trminos de rendimiento del
producto.

45

El escalamiento en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero bioqumico, quien esta


familiarizado con la transferencia de gases, la dinmica de fluidos y la termodinmica. El papel del
microbilogo industrial en el proceso de escalamiento es trabajar estrechamente con el ingeniero
bioqumico para asegurar que se han abarcado los parmetros necesarios para una fermentacin
exitosa y que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una fermentacin en gran
escala.
Las distintas etapas que deben realizarse para llegar de un proceso de laboratorio a un proceso
industrial son las siguientes:
1) Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera indicacin que es
posible un proceso de inters industrial.

2) El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequea, generalmente de


vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el fermentador de laboratorio es posible ensayar
variaciones en el medio de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos tanto en
el equipo como en los medios de cultivo.

3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000 litros. Aqu las
condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no es aun un factor de
importancia. En el fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa instrumentacin y
un control con computadora, de modo que las condiciones que se obtengan sean lo ms similares
a las del fermentador industrial.

Actividades:

Investigue en su localidad los sustratos o subproductos que pueden utilizarse como fuente de
Carbono, nitrgeno y fsforo. Enuncie sus caractersticas relacionadas en cuanto a produccin
mensual del sustrato, estabilidad del sustrato y concentracin de los nutrientes.
Investiga sobre mtodos de cuantificacin del crecimiento microbiano, realiza un foro con tus
compaeros y compara las diferentes tcnicas.

Establece las ventajas e inconvenientes de la produccin de metabolitos intracelulares con los


metabolitos extracelulares.

46

UNIDAD 3: BIOTECNOLOGA ENZIMTICA


Capitulo 1: BIOQUIMICA Y BIOCATLISIS
Leccin 1: Las enzimas, biocatalizadores de naturaleza protenica

Definicin:
El choque entre dos molculas produce energa que puede ser absorbida por las molculas
mismas, o puede ser disipada bajo forma de calor en el medio.
Si la energa absorbida por el substrato (S) es suficiente para franquear la barrera de potencial,
llamada energa de activacin, el substrato se puede transformar y conducir a la formacin de un
producto (P), es decir llegar a un estado final, diferente del estado inicial.
Esta energa de activacin generalmente es elevada y no es compatible con las condiciones del
medio en el cual se deben desarrollar las reacciones del metabolismo de los organismos vivientes:
pH vecino de la neutralidad, temperatura comprendida entre O y 40C, presin vecina a la presin
atmosfrica. Por tanto, la realizacin de esas reacciones necesita de catalizadores bioqumicos, las
enzimas cuya accin consiste, como la de todo catalizador abatir la energa de activacin lo que
tiene por efecto acelerar la reaccin, cuya velocidad se encuentra multiplicada por un factor del
orden de 1012-1020.
Al final de cada ciclo de reaccin, la enzima permanece inalterada.

E+S

ES

E+P

Las enzimas son pues, catalizadores biolgicos de naturaleza protdica que intervienen en todas
las reacciones metablicas energticamente posibles, que ellas aceleran por activacin especfica.
Permiten alcanzar rpidamente el estado de equilibrio de la reaccin sin modificarlo. Son las llaves
tiles de la biotecnologa y de la bioindustria. Son ellas las que en la ingeniera microbiolgica,
catalizan las reacciones metablicas puestas en juego y aseguran su regulacin. Son ellas
igualmente las que conducen la ingeniera gentica para realizar las modificaciones del
equipamiento enzimtico de ciertos microorganismos con vista a hacerlos aptos para la biosntesis
de metabolitos interesantes
El conocimiento de las enzimas, de su naturaleza y de sus propiedades, as como de la cintica de
las reacciones que catalizan es fundamental en biotecnologa

Leccin 2: Naturaleza de las enzimas


Todas ellas son macromolculas que corresponden a la clase de las protenas globulares. Algunas
son holoprotenas constituidas nicamente por un encadenamiento de cidos aminados; otras son
heteroprotenas, que poseen una parte no protenica, el cofactor, necesario para la actividad
cataltica y asociado ms o menos fuertemente a la protena.

47

Especificidad de la catlisis enzimtica sitio activo:

Una de las caractersticas ms importantes de la catlisis enzimtica reside en su especificidad,


mucho ms marcada que la especificidad de la catlisis qumica.
Esta especificidad presenta un doble aspecto:

Especificidad de reaccin. Una enzima no puede catalizar sino un solo tipo de reaccin,
por ejemplo: hidrlisis de enlaces glucosdicos o hidrlisis de enlaces steres (liplisis), etc.
Esta especificidad sirve de base a la clasificacin de estos catalizadores bioqumicos.

Especificidad en cuanto al substrato. Esta propiedad resulta delhecho, plenamente


establecido, de que toda reaccin enzimtica implica la fijacin del substrato en puntos
bien precisos de la protena enzimtica. Esta fijacin se hace por el establecimiento de
enlaces de tipo del de hidrgeno, hidrfobos o de Van der Waals.

La conformacin de la protena enzimtica es tal, que no reconoce sino un tipo de substrato.


Ciertas enzimas presentan una especificidad estricta y son capaces de asociarse a un nico
substrato; ste es el caso de la fumarasa (EC. 4.2.1.2) que transforma el L-malato en fumarato y
que no tiene accin sobre el D-malato o sobre ningn otro compuesto relacionado. Otras enzimas,
por el contrario, se pueden fijar a substratos diferentes, pero de la misma naturaleza y provocar un
mismo tipo de reaccin qumica.
La enzima, despus de haber fijado el substrato, lo transforma en seguida. Para esto, su estructura
espacial es tal, que en la vecindad y a las distancias adecuadas se encuentran grupos funcionales
en donde las acciones diferentes y complementarias realizan la reaccin. La pequea porcin de la
enzima, implicada en la fijacin y posicionamiento del substrato, as como en la reaccin de
catlisis, delimita un volumen denominado "sitio activo".
En las enzimas holoprotenicas, stos son principalmente los agrupamientos funcionales libres
situados en los radicales de algunos cidos aminados que intervienen al nivel del sitio activo
(funcin OH de la serina, ncleo imidazol de la histidina, funcin fenol de la tirosina, funcin COOH
de los cidos asprtico o glutmico, funcin tiol de la cistena).
En lo que concierne a las enzimas del tipo heteroprotenico, la fijacin al substrato se hace sobre
la parte protenica, la apoenzima, mientras que la catlisis de la reaccin es hecha por la parte no
protenica, el grupo prosttico o el cosubstrato.
La parte "apoenzima" de la molcula enzimtica que lleva el sitio de fijacin al substrato es por
consiguiente responsable de la especificidad en cuanto al substrato de esa enzima. Pero tambin
puede intervenir en la especificidad de la reaccin e inducir un tipo particular de reaccin. As es,

48

por ejemplo, que en el metabolismo de los cidos aminados, el fosfato depiridoxal puede, de
acuerdo a la apoenzima con la cual est combinado, catalizar reacciones, sean de transaminacin,
sean de descarboxilacin, de desaminacin, o de racemizacin.
La actividad de las enzimas es funcin directa de su estructura terciaria o de la cuaternaria. En
estas condiciones, todo tratamiento que modifique la conformacin de la enzima (calentamiento,
modificacin del pH), es decir estorbando o impidiendo, la fijacin del substrato a la enzima o
cambiando la estructura del sitio activo, alterar las propiedades catalticas de la enzima y por
tanto su funcin.

Leccin 3: Cofactores
Las enzimas heteroprotenicas utilizan diversos tipos de cofactores: algunos son iones metlicos
(Mg++, Fe++, eu++, Mo+++, Zn++), Fig. otros cofactores son orgnicos (heme, nicotinamida,
flavina, coenzima A, fosfato de piridoxal, tiamina, etc.). Este tipo de enzima adopta diversas formas
de funcionamiento, lo que con frecuencia entraa una confusin en la terminologa de estos
cofactores. En efecto, algunos estn combinados fuertemente a la apoenzima por intermedio de
enlace covalente; son parte integrante de la enzima y no se le separan: se les designa con el
nombre de grupos prostticos. Otros, por el contrario, son co-substratos; se fijan en un primer
tiempo sobre la apoenzima, provocando la transformacin del substrato sufriendo una modificacin
en su estructura qumica; despus se separan de la apoenzima: se les denomina coenzimas.
Regresan a su estado inicial en el transcurso de una segunda etapa enzimtica fijndose sobre
otra apoenzima.
Para ilustrar esta distincin, tomemos el caso de dos enzimas responsables de la oxidacin de
cidos aminados: la L-aminocido-oxidasa y la glutamato deshidrogenada.

La primera (EC. 1.4.3.2) es una flavoprotena en la cual el cofactor, la flavina adenosina


dinucletido (FAD) se comporta como un grupo prosttico. Permaneciendo fija a la apoenzima
provoca la oxidacin por deshidrogenacin y desaminacin del cido aminado y se reduce a F

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ADH:z. La enzima regresa a su estado inicial cediendo los dos hidrgenos, fijados transitoriamente,
a un segundo substrato, oxidante ms potente, que provoca la reoxidacin del F ADH:z a F AD.

A la inversa, la glutamato deshidrogenasa (EC. 1.4.1.2) cataliza una reaccin del mismo tipo, la
oxidacin del cido glutmico a cido 2-oxoglutrico con ayuda de la coenzima nicotinamida
adenina dinucletido (NAD). Esta se encuentra reducida. Abandona la superficie de la apoenzima.
En seguida ser reoxidada a expensas de otro substrato que es reducido por otro sistema enzimtico del medio. El NAD se comporta en estas dos reacciones sucesivas como un substrato.

Captulo 2: NOMENCLATURA Y CLASIFICACIN DE ENZIMAS:

La nomenclatura y la clasificacin de las enzimas han sido normalizadas por la Comisin sobre
Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica, creada en 1955 antes de solucionar la confusin
que haba y el-riesgo de que la situacin se agravara con el rpido progreso del conocimiento
acerca de las enzimas.
Los objetivos que fueron asignados a esa Comisin sobre Enzimas desde su creacin fueron:

Hacer un inventario de las enzimas identificadas y caracterizadas, precisando para cada


enzima la naturaleza exacta de la reaccin catalizada.

Establecer, a partir de este inventario, una clasificacin de las enzimas.

Definir, con base en esta Clasificacin, reglas de nomenclatura que permitan designar,
sin ambigedad, a una enzima dada, proporcionando la mayor informacin posible
sobre la naturaleza de la reaccin catalizada.

Para cada enzima es preciso:

La reaccin catalizada.

Su nombre sistemtico en nomenclatura normalizada.

50

Y sobre todo su nmero de identificacin que define sin ninguna ambigedad, el lugar de la
enzima en la clasificacin normalizada. Este I nmero contiene 4 cifras o nmeros,
separados por puntos, cada uno de ellos corresponde a los elementos siguientes:
a) La primera cifra indica la clase a la cual pertenece la enzima. Estas clases, en nmero
de 6 se definen de acuerdo a la naturaleza general de la reaccin catalizada. Hay: loxidorreductasas, 2-Transferasas, 3-Hidrolasas, 4-Liasas, 5-Isomerasas, 6-Ligasas (o
sintetasas). I
b) La segunda y la tercera cifras designan la subccase y la sub-sub- I clase, definiendo en
cada clase, segn ciertos criterios que se precisarn ms adelante.

c) La cuarta cifra da el nmero de orden de la enzima en la sub-clase considerada

La regla general adoptada para designar a una enzima de acuerdo a la nomenclatura


sistemtica es que el nombre de una enzima se forme de dos partes:
La primera lleva el nombre del substrato; o en el caso de reacciones bimoleculares, los nombres de
los dos substratos separados por "dos puntos".
La segunda parte indica la clase a la cual pertenece la enzima; el nombre de la clase puede.
Precisarse por un prefijo que precede al tipo exacto de reaccin catalizada.
Leccin 1: Clasificacin de las enzimas segn la naturaleza de la reaccin

OXIDORREDUCTASAS
Catalizan las reacciones de oxidorreduccin: transferencia de hidrgeno o de electrn(es) de un
donador, que est oxidado, a un receptor, que est reducido.(Fig. 5) En esta clase, que lleva la
cifra, se reagrupan todas las enzimas llamadas: oxidasas, reductasas, deshidrogenasas y
peroxidasas.

Los nombres comunes que se han retenido son del tipo "donador: deshidrogenasa" o "receptor:
reductasa". El trmino oxidasa no se ha conservado salvo cuando el receptor es el oxgeno.

Fig. 3 . Enzimas de oxido


reduccin, participan en la
respiracin y fermentacin

TRANSFERASAS

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Catalizan las reacciones de transferencia de radicales o de agrupamientos (metilo, hidroximetilo,


carboxilo, acilo, glucosilo, amino, etc.).
En esta clase, que lleva la cifra 2, se reagrupan las transferasas, fosforilasas, cinasas, entre otras
Las sub-clases se definen por la naturaleza del agrupamiento que es transferido (agrupamientos
de un carbono, de dos carbonos, nitrogenados, etc.).
El nombre sistemtico est formado segn el modelo: donador: receptor o grupo transferido:
transferasa.

Fig. 4: TRANSFERASAS se
encargan de transferir grupos
funcionales

HIDROLASAS
Provocan la hidrlisis de diversos tipos de enlaces: ster, acetal (osdico), amida (peptdico), (Fig.
7)
Las subclases son definidas por la naturaleza general del enlace que es hidrolizado.
El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo "substrato hidrolasa", un prefijo que precisa
la naturaleza del grupo eliminado cuando la enzima es especfica para este enlace.

El nombre comn que se recomienda es, en la mayor parte de los casos, formado por el nombre
del substrato al cual se adiciona el sufijo "asa". En general las hidrolasas son holoprotenas.
Algunas pueden tener un grupo prosttico, por ejemplo el fosfato de piridoxal.

Fig.5:
HIDROLASAS..Reacciones de
hidrlisis, transforman
polmetro en monmeros

LIASAS
Son enzimas que rompen los enlaces C - C, C - O, C - N u algn otro, por medios diferentes a la
hidrlisis o a, la oxidacin, con formacin de un doble enlace en alguno de los dos fragmentos.

52

Cuando ellas actan en sentido inverso -condensacin de dos molculas con desaparicin de un
doble enlace se les designa con el nombre de sintetasas.
Las subclases son definidas por la naturaleza del enlace roto y las sub. clases precisan la identidad
de la fraccin eliminada: CO2, aldehdo, amoniaco, etc.
El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo, substrato: fraccin eliminada-liasa.

Fig. 6: Liasas.
Condensacin de
molculas con desaparicin
de doble enlace

ISOMERASAS
Catalizan las reacciones de isomerizacin: racemizacin, epimerizacin, isomerizacin cis-trans, o
tambin originan modificaciones intramoleculares tales que transfieren un agrupamiento o
producen oxidorreduccin.
Para su nomenclatura se retiene el principio "substrato. . .asa", pero el trmino isonerasa se
reserva a ciertas subclases; un prefijo hace precisa la naturaleza de la isomerizacin, por ejemplo
cis-trans isomerasa.

Fig. 7: Ejemplo de
Isomerizacin

LIGASAS O SINTETASAS
Son enzimas que catalizan la reaccin de unin de dos molculas, acopladas a la ruptura, sin
intervencin del agua, de un enlace pirofosfrico en el ATP o eventualmente en un nucletido
trifosfrico del mismo tipo.
Las subclases corresponden al tipo de enlace que se establece (C - , C - S, C - N, C - C) y la subsubclases se refieren a la naturaleza del producto formado (amida, pptido, etc.) o a la reaccin
que es catalizada.
El nombre sistemtico es formado de acuerdo al modelo, " X: Y ligasa (formando ADP), X Y , son
los dos substratos que se condensan; el producto formado a partir del nucletido trifosfrico
implicado .en la reaccin (ADP o AMP) se indica entre parntesis.
Para darle nombre comn se utiliza, en general, el nombre del producto formado seguido del
trmino "sintetasa".

53

Fig. 8: Ligazas

Capitulo 3: CINETICA ENZIMATICA

El objeto de la cintica enzimtica es el estudio de las enzimas en su funcionamiento. Se propone,


en particular, establecer las relaciones que existen entre la velocidad de la reaccin enzimtica y
las concentraciones del substrato (S) y de la enzima (E), as como la influencia de algunos
factores: pH, temperatura, presencia de efectores y eventualmente, actividad del agua.
La Comisin sobre Enzimas ha definido una unidad internacional de actividad enzimtica, el katal,
cantidad de enzima que transforma un mol de substrato por segundo bajo las condiciones
experimentales estndar. Esta es una unidad de valor elevado: por ello se utilizan ms
corrientemente sub. mltiplos de ella: microkatal (JLkat), nanokatal (nkat) y picokatal (pkat), que
valen, respectivamente 10-6, 10-9 y 10-12 katal (kat).
Las enzimas se pueden presentar bajo la forma pura, o bajo la forma de preparaciones
enzimticas, ms o menos purificadas. Con frecuencia es interesante determinar la actividad
enzimtica de una cantidad unitaria de preparacin enzimtica no purificada o de una enzima
purificada. Se refiere entonces la actividad, sea a 1 kilogramo de protena, sea a una molcula
gramo, as se define una actividad especfica, katal por kg de protenas y una actividad molar, katal
por mol de enzima.
Leccin 1: Enzimas Michaelianas
Principales hechos experimentales: Debemos subrayar, como un prembulo, la necesidad
absoluta de que las enzimas sean puras y desprovistas de actividad parsita.
Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes generales de la cintica
enzimtica son:
a) El substrato, S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario

transitorio ES. Este

complejo resulta de una complementaria de la estructura entre el sitio activo de la enzima y la


molcula del substrato.
b) La velocidad de la reaccin en el tiempo t, es decir la velocidad de dS/dP desaparicin del
substrato, o de aparicin del producto, dt/dt que se representa por la pendiente de la tangente a la

54

curva, P o S = f(t) no es constante para las concentraciones dadas en enzima o en substrato (fig.9),
y disminuye en funcin del tiempo debido a la desaparicin del substrato en el curso de desarrollo
de la reaccin.
Siempre, al principio de la reaccin, se puede considerar que la tangente a la curva se confunde
con aqulla en que la velocidad permanece constante.
Los estudios de cintica enzimtica corresponden siempre a esta parte lineal de la curva; lo que
implica el trabajar a velocidades iniciales. En estas condiciones, al principio de la reaccin, la
concentracin en producto es muy dbil; puede despreciarse, as como la reaccin inversa de
transformacin del producto en substrato. Entonces se puede escribir
E + S

ES

k1

k3

E + P
k2
Fig. 9. Curva de aparicin del producto en funcin del tiempo

Fuente: Scriban, Biotecnologa,


1985

c) Por otra parte, para una concentracin dada de substrato, el estudio de las variaciones de la
velocidad inicial de reaccin en funcin de la concentracin de enzima (fig. 10) muestra que
esta variacin no es lineal. La curva presenta un trazo hiperblico correspondiente al hecho de
que para una cierta concentracin de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la
forma de complejo enzima-substrato;

Fig. 10. Curva que


representa la velocidad
enzimtica en funcin de la
concentracin de la enzima
Fuente: Scriban,
Biotecnologa, 1985

55

de lo que resulta que la velocidad inicial, funcin de la concentracin de este complejo, permanece
constante. Para los estudios cinticos, es necesario situarse en las condiciones que corresponden
al principio de la curva, donde es lineal, es decir a concentraciones bajas de enzimas.
En otros trminos, la cantidad de enzima debe ser pequea en comparacin a la concentracin del
substrato, de tal manera, que la formacin del complejo enzima-substrato, ES, no modifica, o
modifica poco la concentracin del substrato,
Hiptesis de Michaelis-Menten: Al establecer la ecuacin de la velocidad, Michaelis y Menten
toman como principio de que la velocidad de transformacin del complejo ES en E + P es muy
lenta, con relacin a la velocidad de la ruptura del complejo que vuelve a dar E + S.
Esta hiptesis significa que k3 ~ k2 Y que E y ES estn en equilibrio, sea:

Hiptesis del estado estacionario de Briggs y Haldane: Estos autores consideraron que la hiptesis
de Michaelis-Menten es demasiado restrictiva y que es preferible postular un estado estacionario,
estado para el cual la velocidad de formacin del complejo ES es igual a su velocidad de
descomposicin en todas las direcciones (formacin de productos y aumento del substrato).
Velocidad de formacin de ES = k1 [E] [S]
Velocidad de desaparicin de ES = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3)
[ES]
El estado estacionario se describe entonces:

Al escribir que la cantidad de enzima que se ha puesto en el medio de reaccin [ET] se reparte en
una fraccin libre [E], y una fraccin que forma un complejo [ES], se tiene:
[ET] = [E] + [ES]
Al sustituir E por su valor, se obtiene:

56

La velocidad de formacin del producto est dada por: v = k3 [ES], la ecuacin general es de la
forma:

Ecuacin de Michaelis-Menten: Cuando la concentracin en substrato cambia al infimito; la


velocidad inicial tiende hacia k3 [Er], o sea hacia la velocidad mxima V m; toda la enzima se
encuentra entonces bajo la forma ES.
La ecuacin es en su forma ms simple:

Esta es la ecuacin de Michaelis-Menten, segn la cual la velocidad de la reaccin enzimtica es


una funcin hiperblica de la concentracin del substrato.
Los resultados experimentales en el caso de las enzimas michaelianas con un solo substrato
corroboran la validez de esta ecuacin.
Significacin de Km Y de Vm: Vm representa la velocidad mxima que puede alcanzar la reaccin:
toda la enzima se encuentra bajo la forma compleja ES.
Cuando la velocidad de la reaccin alcanza la mitad de la velocidad mxima, v = 1/2 Vm, Km es
entonces igual a (S].
Si kz > k3, Km = kz/k1 que es la hiptesis de Michaelis-Menten : [E] + [S] y [ES] estn en equilibrio
y la formacin del producto representa una ligera fuga. En este caso, Km puede ser asimilada a la
inversa de la afinidad de las enzimas por el substrato. Mientras ms pequea sea Km, mayor ser
la afinidad y viceversa.

57

Si kz < k3, la hiptesis de Michaelis-Menten no tiene validez y Km ya no tiene relacin con la


afinidad de la enzima por el substrato. Tambin es preferible considerar Km como una constante
emprica igual a la concentracin del substrato para la cual la velocidad inicial es igual a V m/2en
las condiciones experimentales definidas.
Reversibilidad y relacin de Haldane: En distintos puntos de la curva las reacciones enzimticas
son reversibles, es decir las enzimas pueden catalizar la reaccin inversa:

Keq = constante de equilibrio de la reaccin global.

Figura 11 :
Representacin grfica
de Michaelis-Menten

58

Representacin grfica de la cintica michaeliana de un substrato: La representacin de MichaelisMenten, v en funcin de S.


Esta relacin resalta la interdependencia de la constante de equilibrio y

de los parmetros

cinticos de una reaccin enzimtica reversible y muestra que no es posible olvidar la reaccin
inversa en la que los productos se acumulan.

Capitulo 4: PRODUCCIN DE ENZIMAS

La produccin mundial de enzimas representa una cifra anual de 1.5 millares de millones de
dlares, 60% de ellos con utilizacin en las industrias agroalimentarias.
Las enzimas que se utilizan en procesos agroalimentarios son objeto de una reglamentacin
estricta, en lo que concierne a su produccin, su pureza qumica y microbiolgica. En su
presentacin comercial, sea bajo la forma ms o menos diluida, fijada sobre soportes inertes, o
diluyentes estn tambin igualmente reglamentadas. Las enzimas, biocatalizadores utilizados en la
bioindustria o en otras diversas industrias (farmacia, textiles, pieles...) pueden provenir de varias
fuentes, especialmente:

De origen vegetal, de origen animal y de origen microbiano.


Cada una de estas fuentes se estudiar tomando en cuenta slo algunos ejemplos.
Leccin 1. Enzimas de Origen Vegetal

Las enzimas de origen vegetal y especialmente las proteasas son por orden decreciente de inters
tecnolgico, una de las ms importantes enzimas vegetales de uso industrial se encuentran: la
papana que proviene de una planta ecuatorial y tropical (Carica papaya L.), la bromelina, extrada
de la pifia (Ananas comosus Merr) y la ficina proveniente del higo (Ficus carica).

La preparacin de papana industrial ms pura (papana refinada) ha sido desarrollada en 1969


por Baudard en Zaire (Jones y Mercier, 1974). El ltex fresco es guardado en fro, agitado, diluido,
centrifugado, filtrado sobre kieselgur y a travs de placas esterilizantes, a fin de eliminar toda
impureza y finalmente atomizada al vaco a 50C. Se debe obtener un polvo blanco y evitar por un
lado cualquier obscurecimiento debido a la oxidacin y el empleo de temperaturas anormales,
adems evitar toda infeccin microbiolgica (Escherichia co/i, Salmonella, . . .). El ltex fresco
contiene alrededor de 12% en peso de papana.

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Son numerosas las aplicaciones de la papana industrial (alrededor de 300 ton.), de las cuales se
usa 75% en la industria cervecera para la estabilizacin coloidal de la cerveza; 10% en la industria
de la carne (ablandamiento), 5% en la fabricacin de hidrolizados de pescado destinados a la
alimentacin animal, 2% en la industria farmacutica, entre otros. La tasa de utilizacin puede
variar seriamente en funcin de la legislacin alimentara de cada pas. El desarrollo de la papana
industrial es ciertamente interesante de seguir, pues puede sufrir fluctuaciones por razones
diversas (produccin, acontecimientos polticos, cambios de tecnologas). En los ltimos aos se
han introducido exigencias muy estrictas sobre la calidad del producto.
Leccin 2: Enzimas de origen animal
Un ejemplo importante de este tipo de enzimas en la pepsina, esta enzima es producida
industrialmente a partir de la mucosa gstrica del cerdo donde se encuentra en forma de un
precursor, el pepsingeno, de una masa molecular de 42,000. La preparacin industrial de la
pepsina se puede hacer de acuerdo a varios mtodos: en general se practica la auto digestin de
mucosas gstricas de cerdo, raspadas y trituradas, en medio acuoso. acidificado con cido clorhdrico, en presencia de cloroformo. Despus de flltracin se efecta una concentracin por
liofilizacin. La pepsina purificada es blanquecina y soluble en agua.

Su actividad enzimtica es ms elevada entre pH 1 Y 4 con un mximo a valores de 1.8 y vara


segn la naturaleza del substrato; es termosensible en solucin arriba de los 55C, lo que limita su
utilizacin en tecnologa.
Sin embargo, puede ser utilizada en bebidas refrescantes, en cervecera en el transcurso de la
estabilizacin coloidal durante la pasteurizacin en botellas (Trolle, 1949) en razn de su actividad
en medio cido (pH de la cerveza = 4 a 4.5). Tiene, como la papana, la propiedad de precipitar las
protenas o los polipptidos en medio lquido (leche, cerveza.) (efecto "coagulante ").
Finalmente es necesario advertir que la pepsina puede provocar la hidrlisis de enzimas como las
amilasas, la tripsina, la papana industrial, lo que debe tenerse en cuenta para su uso tecnolgico
ocasional.
Leccin 3: Enzimas de Origen Microbiano

Desde que el desarrollo de la microbiologa ha permitido comprender mejor los sistemas que
condicionan la sntesis de enzima s en los microorganismos, la produccin industrial de enzimas se
ha orientado hacia los procesos de fermentacin. Las principales ventajas de las enzimas en la
fermentacin con relacin a las enzimas en la extraccin son las siguientes:
- Una produccin independiente de restricciones estacinales o geogrficas.

60

- La posibilidad de utilizacin de materias primas de fcil adquisicin.


- Los rendimientos en la produccin se pueden aumentar en proporcin importante al mejorar las
capas microbianas y aplicar las pti

mas condiciones de fermentacin.

Por otro lado, las enzimas de origen microbiano presentan propiedades y


especificidades diversas.
Estas ventajas predominan sobre los inconvenientes propios de las industrias de fermentacin
(fuertes inversiones, consumo de energa, riesgos de contaminacin...) y en el transcurso de los
ltimos treinta aos se han desarrollado un nmero importante de fermentaciones productoras de
enzimas.
Las principales producciones se presentan en el cuadro 1

La fundamentacin de la produccin de enzimas microbianas exocelulares es muy simple: un


microorganismo es cultivado en un medio apropiado, a partir del cual es extrada la enzima (para
las enzimas endocelulares es necesario Un tratamiento previo de la biomasa). Los problemas
radican en los detalles de proceso.

En la Industria alimentara, existe una gran variedad de enzimas de mucha importancia. En el


cuadro (2) se muestran algunos ejemplos:
Leccin 4: Produccin Industrial de enzimas

En la produccin industrial de las enzimas se consideran las siguientes etapas . (Scriban, 1985)
A. Definicin de la enzima que se busca
La produccin de una enzima industrial que responda, en principio, a una exigencia potencial de
quienes la pueden utilizar, hace necesario determinar las propiedades que esta enzima pueda
tener. Prioritariamente, de acuerdo a Sicart (1980):

61

- La especificidad: Aunque en la industria las enzimas sean utilizadas para la hidrlisis de


macromolculas complejas en las cuales los sitios de acoplamiento con, frecuencia se
desconocen, el efecto global que se busca involucra, generalmente, la utilizacin de un tipo preciso
de enzima. En ciertos casos, como sucede con la pectinasa, una enzima asocia tres actividades
diferentes, y se debe precisar estrechamente la relacin entre estas tres actividades de acuerdo al
producto que se vaya a tratar.
Cuadro : 2 Enzimas utilizadas, en la industria alimenticia.
INDUSTRIA

ENZIMAS

Lctea

Tripsina.
Lactasa

Quesera

Helados

Crnicas

Panificacin

Cervecera

Vinificacin

Bebidas
alcohlicas

Quimosina
(renina)
Lactasa
Lipasa
Lactasa
Glucosaisomerasa
Papana,
Fiscina
Bromelina
Amilasa
Proteasa
Lipoxidasa
Lactasa
Amilasas
Papana,
Pepesina
Pectinasas
Glucosaoxidasa
Pectinasas
Glucosano isomerasa
Tannasa
Glucosaoxidasa

USOS
Enmascara
el
gusto
a
xido.
Fabricacin de leche delactosada, evita la cristalizacin de leche
concentrada.
Coagulacin de las protenas de la leche
Influencia en el sabor y aceleracin de la maduracin.
Evita la textura arenosa provocada por
Permite la utilizacin de jarabes de alta fructosa.
Ablandamiento
Produccin de hidrolizados.

la cristalizacin.

de

Mejora
la
calidad
Disminuye
la
viscosidad
Produce
una
miga
Mejora la coloracin de la superficie.

(casena).

carnes.
del
de

la
muy

pan.
pasta.
blanca

Usadas
para
licuar
la
pasta
de
malta.
Evitan la turbidez durante la conservacin de ciertos productos.
Mejoran
la
clarificacin
y
extraccin
de
Evitan el oscurecimiento y los sabores desagradables.

jugos.

Mejoran
la
clarificacin
de
jugos.
Conversin de la glucosa en fructosa (jarabes de alta fructuosa).
Aumenta la solubilidad y disminuye la turbidez del t.
Evita el oscurecimiento y los sabores desagradables.

- El valor ptimo de pH: Este factor tiene una influencia variable segn las enzimas; algunas de
ellas, como la proteasa alcalina an son activas a pH = 10, en tanto que las enzimas fngicas
funcionan an a pH = 3.
- El valor ptimo de temperatura: Generalmente, quienes utilizan enzimas se interesan en poder
disponer de enzimas que soporten temperaturas elevadas, ya que estas temperaturas conservan
en parte la esterilidad del medio de fermentacin.

62

Despus, es necesario definir el sistema que se adoptar para medir su actividad, pero conviene
disociar la nocin de actividad que se aplica a la cantidad de enzima presente en una preparacin,
la que se puede determinar mediante un mtodo de laboratorio, de la nocin de eficacia que
caracteriza el comportamiento de la misma preparacin colocada en las condiciones industriales en
las que vaa utilizarse. (Sicart, 1980).
B. Seleccin de una cepa microbiana
Los microorganismos que son capaces de producir enzimas de degradacin de ciertos compuestos
se localizan generalmente en donde abundan esas substancias. Por ejemplo, los microorganismos
que secretan celulosas son numerosos en el suelo de los bosques. Inicialmente, las cepas se han
aislado del suelo o de elementos naturales.
Los mtodos de aislamiento que se utilizan son los mtodos clsicos, el ms importante es el
cultivo de enriquecimiento, seguido de un sub cultivo en un medio selectivo. En el medio selectivo
ideal, el substrato de la enzima es la nica fuente de uno de los elementos vitales. Por ejemplo, el
almidn como nica fuente de carbono. para aislar a los microorganismo s que tienen una amilasa.
Las tcnicas de difusin en agar se han desarrollado para la deteccin de la actividad enzimtica.
Esta prueba, en las condiciones estndar, puede dar informacin de orden cualitativo. Para que la
cepa aislada sea retenida definitivamente debe presentar algunas caractersticas, de acuerdo a
Aunstrup y col. (1979) y Sicart (1980):
- Desarrollarse sobre un medio sencillo fcilmente asequible.
- Producir el menor nmero posible de metabolitos secundarios, como antibiticos, por ejemplo.
- Excretar la enzima en forma que se facilite su separacin y su purificacin. .
- No originar contaminantes diversos
- No ser patgena ni producir compuestos txicos.
Con los progresos de la gentica, las posibilidades de mejoramiento de las cepas son,
tericamente, ilimitadas; por una 'parte por una mutacin, por otra parte, mediante la nueva va de
la ingeniera gentica.
En cualquier forma, la gentica de los microorganismos que se utilizan en la produccin industrial
de enzimas (Bacillus, Aspergillus) an est mal conocida para que puedan realizarse las
aplicaciones de la ingeniera gentica y son las mutaciones las ms utilizadas.
Las cepas industriales deben ser protegidas contra la degeneracin, la prdida de viabilidad y las
contaminaciones. Los medios ms seguros son la liofilizacin o la conservacin a temperatura del
nitrgeno lquido. Estas tcnicas permiten conservar las cepas casi indefinidamente.
C. Produccin industrial de la enzima

63

Tradicionalmente, las enzimas microbianas eran producidas por cultivo en superficie, en una
delgada capa de medio lquido o de medio semislido. Esta tcnica es an utilizada para algunas
producciones, en particular de enzimas de origen fngico, tales como las amilasas de Aspergillus,
las proteasas de Aspergillus y de Mucor o las pectinasas de Penicillium. Pero existen varios
problemas en el control de la temperatura, de la aireacin y de la humedad, por ello se prefieren
los cultivos sumergidos a los cultivos en superficie. Los cultivos en medio lquido, profundos,
agitados, son mejor adaptados a los diferentes controles mediante mtodos modernos y reducen
los riesgos de contaminacin. Adems se prestan mejor a las operaciones de extrapolacin y de
optimizacin necesarias para el paso del fermentador piloto de laboratorio al fermentador industrial.
Preparacin del inculo
En esta etapa de preparacin del inculo, la capacidad de produccin de la cepa debe
conservarse y eliminarse todo riesgo de contaminacin. Para ello es necesario evitar que haya
un nmero excesivamente grande de cultivos sucesivos. Es preferible el sembrar directamente
un matraz de medio gelosado, a partir de la cepa liofilizada, despus, a partir de este cultivo se
sembrar un nico fermentador que servir el mismo de inculo para el fermentador industrial. El
volumen del inoculo representa generalmente de 3 a 10% del volumen del fermentador de
produccin y la composicin del medio para la preparacin del inculo se aproxima bastante a la
del medio de produccin. El tiempo de permanencia en el fermentador vara de 10 a 80 horas
segn el procedimiento, la cepa, las condiciones de cultivo, . . . (Aunstrup y col., 1979)
D. Composicin del medio de cultivo
El medio de cultivo debe contener la fuente de carbono, la fuente de nitrgeno y los principales
factores de crecimiento necesarios para la cepa microbiana. Se pueden adicionar ciertos factores
para abreviar la fase de latencia. De todas formas, la produccin de enzima puede no tener lugar a
pesar de que el medio sea el conveniente para un buen desarrollo. Hay que tomar en cuenta la
necesidad de un inductor, de las represiones posibles debida a algn componente del medio, de la
represin catablica producida por la glucosa. Esta represin puede ser evitada reemplazando la
glucosa por glcidos fermentables lentamente o por almidn parcialmente hidrolizado.
Para aumentar la productividad, se utilizan medios concentrados, pero esta concentracin puede
igualmente -ser causa de aumento en la presin osmtica y dificultar la aireacin.
A menudo se adicionan sales para complementar la cantidad de nitrgeno en el medio
E. Fermentacin y equipo necesario
Vincent y Priestley (1975) han detallado las condiciones de fermentacin que deben mantenerse
para producir una enzima.
Los fermentadores utilizados habitualmente contienen volmenes de 100 a 200 m3. Deben estar
equipados de un sistema de agitacin de gran potencia, capaz de agitar medios relativamente
viscosos, ya que pueden contener hasta 350 g/lt. de materia seca (Sicart, 1980).

64

Los fermentadores estn equipados de una corona clsica de aereacin, ya que la mayor parte de
las fermentaciones productoras de enzimas tienen una fuerte demanda de oxgeno. Generalmente,
estas fermentaciones son conducidas en condiciones limitadas de oxigenacin. Para la
glucoamilasa, la productividad est limitada a la transferencia de oxgeno (Aunstrup y col., 1979).

Los equipos de medicin y de control del fermentador permiten seguir y regular los parmetros del
cultivo. Los controles se ejercen generalmente sobre el pR, la temperatura, el oxgeno disuelto, la
espuma y la evolucin de la concentracin de ciertos nutrientes. Adems la medicin de la aparicin de la actividad enzimtica se efecta a intervalos regulares por el laboratorio de control. An
no existen reguladores que permitan hacer esas mediciones en forma continua. (Sicart, 1980). Esta
medicin es importante porque de ella depende la decisin de detener la fermentacin.

Para la produccin de enzimas, son necesarias condiciones rigurosas de asepsia, por una parte
para obtener un buen rendimiento, por otra parte para no tener el riesgo de secrecin de
substancias txicas como contaminantes. Esta asepsia es difcil de mantener, siendo el medio muy
rico y el pH cercano a la neutralidad.
Se necesita tomar precauciones a nivel de la construccin del fermentador y para la eleccin de las
instalaciones y los equipos colaterales. Durante toda la fermentacin, una ligera supresin de aire
en el fermentador impide la penetracin de contaminantes, esta precaucin la refuerzan las
protecciones de vapor en todos los puntos de comunicacin con el exterior (fig. 12).
An no se ha establecido el modelo cintico general para la sntesis de enzimas, pero, ya se ha
estudiado la regulacin de la formacin de algunas enzimas. Algunas enzimas se forman durante
la fase exponencial de crecimiento, pero la mayor parte aparecen en la fase postexponencial.
Segn sean las enzimas y los procedimientos, la fermentacin dura de 30 a 150 horas.
La cantidad de protena -enzima en el medio, al final de la fermentacin, representa de 1 a 5% de
la materia seca inicial, en tanto que la biomasa celular puede alcanzar de 2 a 10%.
La calidad de las enzimas producidas est en estrecha relacin a la forma en que se condujo la
fermentacin. La seleccin de las materias primas, el mtodo de esterilizacin, el procedimiento
para regular la formacin de espuma, la aireacin y la agitacin, as como la duracin de la
fermentacin afectan, no solamente al rendimiento y al costo de produccin, sino tambin al color,
olor y a la estabilidad de la enzimas.

65

Fig. 12: Esquema para una produccin de fermentacin para la


produccin de enzimas (Aunstrup, 1979)

Utilizado este biocatalizador. En la prctica, la mayor parte de las operaciones industriales se


realizan de forma discontinua, en lotes, con la renovacin de la enzima al principio de cada ciclo.
Para los enzimlogos, la fijacin sobre un soporte realiza un modelo cercano a las condiciones
de la clula viviente, en donde las enzimas se encuentran con frecuencia asociadas a la
membrana a organelos intracelulares.

Desde 1916, Nelson y Griffin haban demostrado que la invertasa adsorbida sobre carbn
activo, conservaba su actividad. Pero de cualquier modo hubo que esperar hasta la dcada de
los 50's para que aparecieran las primeras aplicaciones de esta tcnica, en particular con los
trabajos de Grubhofer y Schleith.
Despus de 1960, las investigaciones se han intensificado y bajo el impulso de los equipos de
Katchalski en Israel y de Manecke en Alemania, se han multiplicado las utilizaciones potenciales
de las enzimas inmovilizadas. En1969 Chibata y sus colaboradores desarrollaron en Japn el
primer reactor industrial con enzima fijada, una L-aminocidos a partir de la correspondiente
mezcla racmica. Esta tcnica permitira, segn los autores, disminuir el precio de costo a menos
del 40% con relacin al procedimiento convencional.
En la actualidad, se han desarrollado numerosos mtodos de fijacin de inters para ms de 100
enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como en escala piloto y se ha abierto un campo de
experimentacin, despus de algunos aos, para la inmovilizacin de clulas intactas, vivas o
muertas. Esta multiplicacin de trabajos ha dado lugar a una abundante literatura cientfica.
Leccin 5: Inmovilizacin de enzimas

66

La actividad de las enzimas est ligada al mantenimiento de la integridad de su conformacin


temaria, en particular al nivel de su sitio activo. Los procedimientos de inmovilizacin deben, por
consiguiente, ser mtodos suaves, bien regulados, que respeten la estructura nativa de la protena,
que los enlaces que se crean entre el soporte y la enzima, excluyan los cidos aminados
involucrados directamente en la reaccin cataltica..
Se han propuesto diversos tipos de mtodos y en 1971, en la primera conferencia de Ingeniera
Enzimtica de Henniker (E.U.A.) se defini una clasificacin de enzimas inmovilizadas, segn el
mtodo de fijacin utilizado.
Fig : 13 : Clasificacin de formas de obtencin de enzimas

En esta clasificacin, las enzimas inmovilizadas se consideran como un caso particular de las
enzimas modificadas. Despus apareci la tcnica de reticulacin (enlazamiento cruzado) en el
cual las molculas enzimticas son polimerizadas por intermedio de un ligando polifuncional.

- Propiedades de las enzimas inmovillzadas


Los efectos de la inmovilizacin sobre la actividad de las enzimas resultan de la interaccin de
diferentes factores:
a) Modificaciones de la estructura tridimensional de la enzima, a causa
de tensiones durante la fijacin.
b) Modificaciones del microambiente: pH local, interacciones electrostticas.
c) Fenmenos difusionales en el interior del complejo.
d) Impedimentos estricos.
Este conjunto de factores juega un papel determinante en la actividad y
la estabilidad de la enzima.

67

- Medicin de la actividad

Las condiciones ptimas de accin de las enzimas inmovilizadas difieren a menudo de las de las
enzimas en solucin y deben ser perfectamente conocidas para evitar todo riesgo de error de
interpretacin. As para la ureasa, fijada sobre bentonita, la actividad de pH 7.7 no alcanza sino a
75% de la actividad de la enzima libre mientras que es de 100% a pH 7.1.17
La Comisin Internacional de Hennicker en 1971, ha propuesto caracterizar la actividad de los
complejos por la velocidad inicial de reaccin expresada en microkatales (JIkat): cantidad de
producto formado en micromoles por segundo y por mg (materia seca) o por unidad de superficie
del soporte; precisando las condiciones de determinacin de la materia seca, el tenor en protenas
fijadas y la actividad especfica de la enzima antes de la inmovilizacin.
Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilizacin entraa con frecuencia una prdida de
actividad, muy variable segn sea la naturaleza de la enzima y el modo de fijacin; pero tambin se
han sealado algunos casos en los que hay aumento de actividad. Estas variaciones en un sentido
o en otro podran explicarse por una modificacin estrica del sitio activo de la enzima bajo el
efecto de un cambio de conformacin de la cadena polipeptdica.
Gracias a la gran especificidad en su accin, las enzimas constituyen una herramienta de
fabricacin y de anlisis indispensable en numerosos sectores de la investigacin, del control y de
la produccin industrial.
La introduccin de las tcnicas de insolubilizacin de los biocatalizadores suscita un inters
considerable en razn de las ventajas que presenta: tratamientos en continu, control
automatizado, mejoramiento de los rendimientos por unidad de enzima, obtencin de derivados
ms puros, disminucin de requerimientos energticos. . . y los recientes desarrollos de los
mtodos de inmovilizacin de clulas enteras han abierto nuevas perspectivas.
A pesar de los numerosos trabajos de investigacin, las instalaciones de produccin industrial son
an muy limitadas. Es necesario buscar la causa en la complejidad del funcionamiento de los
reactores, en donde la matriz es a menudo muy delicada y en la gran inestabilidad de los
catalizadores biolgicos; sin olvidar las limitaciones debidas a regulaciones legales.
La obtencin de nuevas fuentes de enzimas ms estables, el desarrollo de sistemas
multienzimticos, la recuperacin y la re utilizacin de cofactores de. Las enzimas son las vas de
investigacin susceptibles de ampliar el campo de las aplicaciones actuales:

68

TAREA:
1. Realice un Glosario, de la unidad estudiada:
2. Realice una investigacin bibliogrfica sobre las enzimas ms importantes en la industria
alimenticia, escoja una de ellas y realice un diagrama de flujo para la produccin de la misma.
3. Para mayor comprensin lea el articulo de Miguel Arroyo en el siguiente link: Inmovilizacin de
enzimas: Fundamentos, mtodos y aplicaciones. Y realice una comparacin de los diferentes
mtodos teniendo en cuenta sus ventajas y desventajas.

CIBERGRAFIA:
http://www.arrakis.es/~lluengo/enzimas.html. Sitio que incluye informacin acerca de las enzimas,
su funcin y caractersticas.
http://minnie.uab.es/~veteri/21264/t4_els_enzims.pdf. Las enzimas en los alimentos
Biotecnologa de los alimentos. Introduccin. ILSI International Life Sciences Institute. Serie de
monografas concisas de ILSI Europa. http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/
Alimentos y tecnologa de modificacin gentica. Salud y seguridad en el consumidor. ILSI
International Life Sciences Institute. Serie de monografas concisas de ILSI Europa.
http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/

69

UNIDAD 4: PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA BIOTECNOLOGA

El principal objetivo de la ingeniera gentica en el campo de la Biotecnologa es alterar la


composicin gentica de los seres vivos de importancia industrial, con el fin de incrementar la
eficiencia global del proceso para el que se emplea dicho ser vivo. Aunque el objetivo principal es
incrementar el rendimiento de un producto

especfico, es interesante tener en cuenta otros

parmetros, particularmente los que se refieren a las mejoras en las caractersticas de crecimiento
y la eliminacin de subproductos perjudiciales. (Wiseman, A,1986)

El desarrollo de organismo sper productores, se considera el principal objetivo de este campo de


la biotecnologa, aunque se podran aadir otros dos: en primer lugar, la obtencin de nuevas
especies que produzcan productos nuevos o modificados y en segundo lugar, el conocimiento de
las rutas biosintticas que conducen a la produccin de metabolitos de inters comercial, as como
mecanismos de control que regulan estas rutas.(Wiseman, A. 1986)
La estructura y funcin bsica de los genes se conoca desde finales de los aos sesenta. Ms
an, la labor de los bioqumicos haba producido un gran cmulo de conocimientos respecto de los
conjuntos de reacciones qumicas que ocurren dentro de los seres vivos. Las vas metablicas
fundamentales para la generacin de energa y la biosntesis de la mayora de los compuestos
esenciales para la vida ya estaban establecidos. (Saberon , 1997)
Este conocimiento se basaba en la aplicacin inteligente de mtodos de ensayo y purificacin de
enzimas clave, y de la identificacin y anlisis de sus sustratos y productos. Al mismo tiempo,
otras disciplinas como la inmunologa y la gentica, realizaban avances y eran actividades de gran
complejidad y finura.

La biologa molecular, sin embargo, se encontraba en un punto en el que su desarrollo se haba


hecho muy lento. Una vez sentadas las bases fundamentales de la replicacin y expresin de la
informacin gentica, el siguiente paso era desentraar; en forma detallada, los mecanismos de
regulacin de la expresin gentica.

Todas las vas metablicas, la expresin de anticuerpos, la actividad de los virus, en fin, todas las
manifestaciones del fenmeno viviente, estn, en ltima instancia, orquestados por la expresin
ordenada y regulada de los genes, por medio de la produccin de protenas especficas.

El extraordinario proceso por el cual una sola clula, el huevo fecundado, da origen a un organismo
complejo, es decir; las etapas de diferenciacin celular; constitua un reto extremadamente
atractivo, pero a la vez formidable. Un descubrimiento clave inici el cambio dramtico que

70

conocemos hoy como ingeniera gentica o ADN recombinante: en 1970 Hamilton Smith y Daniel
Nathans descubren una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias especficas,
que les vali el Premio Nobel de fisiologa o medicina, compartido con Werner Arber, en 1978.

Este descubrimiento (consecuencia de un hallazgo accidental, en el que los investigadores


profundizaron con gran sentido) dio origen a una sucesin de nuevos descubrimientos y potenci el
desarrollo de toda una serie de otras disciplinas y metodologas. En este captulo revisaremos los
fundamentos de algunas de las ms importantes.
Capitulo 1: TCNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACIN GENTICA IN VITRO.

Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen el ADN. Estos
sistemas, llamados de modificacin-restriccin, son anlogos a un sistema inmune, los cuales
probablemente evolucionaron como un mecanismo de proteccin de los microorganismos contra
infecciones virales. En efecto, las bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamados
bacterifagos, que inyectan su propio ADN en la clula bacteriana para despus controlar su
maquinaria celular y redirigirla hacia la sntesis de sus propios componentes, dando como
resultado final la ruptura de la clula y la liberacin de cientos o miles de nuevos virus. En algunas
bacterias el ADN propio est modificado en ciertas secuencias. Una enzima de modificacin se
desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo
GAATTC, introduce un pequeo grupo qumico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima
de restriccin, tambin se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la secuencia GAATTC, corta
el ADN en esa posicin. La enzima, sin embargo, no corta el ADN modificado, por lo que
efectivamente es capaz de degradar el ADN extrao que puede entrar a la clula, sin alterar el
ADN propio.

Hoy en da se conoce miles de diferentes enzimas de restriccin, provenientes de otros tantos


distintos microorganismos. Ms de cien distintas secuencias pequeas de ADN pueden ser rotas,
especficamente, por medio del uso de la adecuada enzima de restriccin. Otra interesante
propiedad de las enzimas de restriccin es que, en general, reconocen secuencias palindrmicas,
es decir; secuencias que son iguales si se leen en una direccin, o en la direccin contraria. Por
ejemplo:
5GAATTC3
3CTTAAG5

Es una secuencia palindrmica. Cuando acta la enzima que reconoce y corta esta secuencia,
llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con extremos que se proyectan fuera de la doble
cadena:

71

5G AATTC3
3CTTAA G5
Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse
nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por un corte con EcoRI puede
hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima. Los descubridores de las
primeras enzimas de restriccin pronto se dieron cuenta de que su accin sobre el ADN
(comnmente llamada "digestin") produca un conjunto definido de diferentes segmentos.
Sbitamente, el ADN dej de ser una sustancia montona y frgil, donde purificar un segmento
especfico resultaba una tarea ardua o imposible. Al poder generar segmentos especficos, con las
enzimas de restriccin, la molcula de la vida qued a merced del bilogo molecular y por lo tanto
nos facilit el camino para manipular la secuencia del ADN, de cualquier especie. Este, entonces
se convirti en la nueva herramienta de la Biologa moderna y por lo tanto de la BIOTECNOLOGA.

Figura 1. La separacin de los cidos nucleicos


Cuando se utiliza la electroforesis, es posible
visualizar la accin de las enzimas de restriccin. Si
se colocan muestras que contienen ADN de diversos
tamaos en los pozos de un gel en forma de placa, y
se aplica corriente elctrica, la diferencia de
velocidad de migracin de estas molculas las
distribuir, por separado, al cabo de un tiempo,
dentro del gel. Si despus se agrega una sustancia
que se hace luminosa al interaccionar con el ADN y
baarse con luz ultravioleta, directamente se puede
observar el patrn de distribucin de las bandas
constituidas por las molculas de diversos tamaos,
por medio del cual es factible deducir sus respectivas
dimensiones
Al usar diferentes enzimas de restriccin, se generan
diferentes segmentos. Por ejemplo, si la secuencia
reconocida por la enzima Sall aparece en la molcula
del ejemplo una vez, cortara el segmento en dos
partes. Si la secuencia reconocida por EcoRI,
aparece dos veces, generara tres pedazos. Al usar las
dos enzimas simultneamente, se produciran cuatro
segmentos.
Fuente: Saberon Maneiro, Biologa molecular y la nueva

Biotecnologa, Mexico, Fondo de cultura, 1997

Leccin 1: Tecnologa del ADN recombinante.


Como se menciono anteriormente, los fragmentos generados por las enzimas de restriccin tienen
adems la propiedad de reasociarse unos con otros, por medio de sus extremos cohesivos. La
importancia de manipular este procedimiento(tambin conocido como tecnologa del ADN
recombinante) es la que nos permite en primer lugar evitar los mltiples mecanismo que restringen
la transferencia de genes entre organismos no relacionado y, en segundo lugar, que se lleven a
cabo manipulaciones precisas y sutiles aprovechando estas caractersticas del proceso de

72

recombinacin Este procedimiento consite, entonces, en cortar el ADN en fragmentos especficos


utilizando enzimas llamadas endonucleasas de restriccin y ligar los fragmentos a un vector, es
decir, una molcula de ADN que es capa de ser incorporada y replicada por la clula
hospedadora..
En resumen, los elementos esenciales de la tcnica de ADN recombinante (vase la figura 2): son
los siguientes
1. Obtencin de fragmentos especficos de ADN (enzimas de restriccin).
2.

Ligacin (o reasociacin covalente) de las molculas para obtener hebras continas de


ADN (enzima ligasa).

3. Mecanismo para introducir

al interior

de clulas vivas el

ADN recombinante

(transformacin).
4. Mecanismo para asegurar la replicacin e identificacin de la molcula recombinante
dentro de la clula (vehculo molecular).
El primer experimento en el que se puso en prctica este concepto, realmente simple, que se
conoce como clonacin molecular se logr al utilizar plsmidos bacterianos como vehculos y ADN,
tambin bacteriano, como pasajero. (Fig.2)

73

Fig. 2. Los procedimientos bsicos del ADN recombinante


El producto de la digestin del ADN con endonucleasas de restriccin est constituido por
muchos fragmentos especficos, cuyos extremos son compatibles o cohesivos unos con otros.
Estos fragmentos se ligan despus a un segmento especial de ADN, el vehculo de donacin
(usualmente un plsmido), que fue cortado con la misma enzima. Las molculas
recombinantes resultantes contienen un ADN vehculo o vector y un ADN pasajero,
constituyendo una nueva molcula circular continua.

Fuente: Raven, J. Biology, 2002

74

A. Corte y ligadura del ADN

Hasta el momento hemos mencionado a la ADN ligasa, una importante enzima que permite ligar o
unir molculas de ADN. La investigacin sobre la fisiologa de los cidos nucleicos ha
proporcionado, adems, una serie de enzimas que se utilizan ampliamente para manipular los
cidos nucleicos en el tubo de ensayo, y que forman parte importante de las herramientas del ADN
recombinante. Cada una de estas enzimas, al igual que las endonucleasas de restriccin, cumple
un papel dentro de la clula viva, para alterar el material gentico (por ejemplo, para repararlo,
replicarlo, degradarlo, recombinarlo, etc.). en el laboratorio se pueden usar estas enzimas, despus
de purificarlas de sus fuentes naturales, para efectuar transformaciones tiles a los propsitos del
experimentador. Por ejemplo, la enzima transcriptasa reversa, que naturalmente producen ciertos
virus para invadir el genoma de sus clulas blanco, se utiliza ampliamente para clonar genes a
partir de sus ARN mensajeros
Dado que el propio desarrollo del ADN recombinante , ha potenciado, a su vez el desarrollo de
herramientas moleculares, hoy en da contamos con un enorme nmero de enzimas y reactivos
que permiten gran versatilidad en la manipulacion del ADN.

B- SECUENCIACIN DEL ADN

Una consecuencia inmediata de la clonacion molecular es que permite disponer de cantidades


ilimitadas de cantidades especificos de ADN pasajero se encuentra formando parte de un
plsmido, es factible separarlo fcilmente del resto del ADN celular, que se encuentra en el
cromosoma bacteriano, una molcula mucho ms grande. A partir de un cultivo de E. coli, se
puede separar suficiente ADN plasmdico para caracterizarlo. Una vez que se dispuso de genes
individuales purificados, el escenario estaba listo para la siguiente etapa.
Walter Gilbert, en la Universidad de Harvard, y Frederic Sanger, en Cambridge, Inglaterra, se
dieron a la tarea de desarrollar tcnicas para determinar la ms importante caracterstica del ADN,
su secuencia de bases. Pocos aos despus lograron su objetivo, y compartieron el Premio Nobel
de qumica en 1980. Las tcnicas de secuenciacin actuales (vase el recuadro II.5) son usadas
abundantemente e, inclusive, han sido automatizadas. A la fecha, genes de las ms diversas
fuentes han sido secuenciados, acumulando una base de datos que representa cientos de millones
de nucletidos: Esta cantidad crece a paso inexorable y se espera que lo haga cada vez ms
aceleradamente .
C. Vectores para el clonaje

75

Adems de las enzimas que hacen posible la transformacin y manipulacin del DNA, hay otro
elemento indispensable para el trabajo del ingeniero gentico: los vectores. Los vectores no son
ms que los portadores del fragmento de DNA que se quiere aislar o clonar.

Se usan tres tipos de vectores diferentes:


4

Plsmidos

Fagos

Csmidos

Plsmidos:

Son molculas de DNA circular de doble cadena extracromosomales presentes en


bacterias que son capaces de autoreplicarse.
Fueron descubiertos en bacterias, quienes adems de sus cromosomas principales de 4x
106 bp, poseen estos elementos de pequeo tamao (~103 bp). Ellos fueron descubiertos
como elementos portadores de la resistencia a antibiticos. El hecho de que estos genes
de resistencia a antibiticos fueran hallados en plsmidos no fue una casualidad ya que la
resistencia a antibiticos requiere de grandes cantidades de enzima que neutralice
quimicamente los antibiticos. Al estar presentes en un No. De copias mayor que lo que
estuvieran representados en el cromosoma principal.

En la naturaleza existen una amplia diversidad de estas molculas. Ellos especifican:


Resistencia a antibiticos
Resistencia a metales pesados
Sensibilidad a mutgenos
Sensibilidad o resistencia a fagos
Produccin de enzimas de restriccin
Produccin de aminocidos raros
Catabolismo de sustancias complejas

La replicacin de los plsmidos puede o no requerir de protenas codificadas por ellos y puede
o no estar sincronizada con la del cromosoma bacteriano.
Ya en la dcada de los 70, en los primeros trabajos de Biologa Molecular y de I.G. se
construyeron muchos plsmidos naturales para ser usados como vectores

Todos los plsmidos que se usan como vectores poseen tres caractersticas comunes:

76

1. Un sitio replicador
2. Un marcador de seleccin
3. Un sitio de clonaje (Polylinker o Multiple cloning site)
1. Sitio replicador:

El replicador es el segmento de DNA que contiene el sitio a partir del cual se comienza a
replicar el DNA usualmente llamado origen de replicacin: ORI. Este sitio incluye los genes
que codifican para las protenas y RNAs que se requieren para la replicacin.
El nmero de copias de un plsmido puede ser alto o bajo en dependencia del control al
que estn sometido los replicadores. Este control puede ser de dos tipos: relajado o
restringido
Control relajado: La replicacin del plsmido no depende de las protenas sisntetizadas al
comienzo del ciclo celular bacteriano: protenas de la iniciacin de la replicacin. Por tanto
estos plsmidos se pueden amplificar aun cuando se trate la cepa bacteriana con
inhibidores de la sntesis de protenas (cloranfenicol). Produce un nmero de copias alto
del plsmido (>20 copias por clula en condiciones determinadas)
Control restringido: La replicacin precisa de la sntesis de protenas inestables que
participan en la iniciacin de la replicacin y por tanto est sincronizada con el ciclo celular
o sea con la replicacin del cromosoma bacteriano. Produce un bajo nmero de copias
(<20 copias por clula)
2. Marcadores de Seleccin:

Los marcadores de seleccin ms usados sobre todo en bacteria son genes que codifican
para la resistencia a determinados antibiticos. Los antibiticos son sustancias qumicas
que producen la muerte de los microrganismos pero son relativamente poco txicos a las
clulas eucariticas.

Los vectores plasmdicos o de fagos portan genes para la resistencia a estos antibiticos.
Estos genes son normalmente dominantes y por lo tanto las clulas que los contengan
pueden ser identificadas por su capacidad de crecer y formar colonias en presencia del
antibitico. Los plsmidos que contienen tales genes le confieren a las clulas donde son
isertados la capacidad de vivir en presencia de tales sustancias.

77

Los antibiticos se aaden usualmente a medio slido recien autoclaveado antes que la
temperatura haya disminuido por debajo de 50 oC. En casos de emergencia se pueden
aadir directamente a plcas ya preparadas, dando tiempo para que el antibitico pueda
o

difundir (~60 min). Se deben guerdar a 4 C pues los antibiticos pierden potencia a RT.
Algunos como la Tet y la Rifampicina deben guardarse en la oscuridad pues son sensibles
a la luz
En levaduras se emplea la auxotrofia a determinados amonicidos como marcadores de
seleccin.
3. Sitio de Clonaje

Es una regin donde un nmero diverso de enzimas de restriccin tienen sitios de


reconocimiento y por tanto pueden insertarse el DNA forneo sin causar interferencias ni
con la habilidad del plsmido de replicarse ni con su capacidad de conferirle a la cepa
hospedera la resistencia a antibiticos. Usualmente se le conoce con el nombre de Multiple
Cloning Site o Polylinker
Leccin 2: La Reaccin en cadena de Polimerasa (PCR)

Otro de los avances metodolgicos ms importantes es la reaccin en cadena de polimerasa


(PCR, siglas en ingles polymerase chain reaction). Este procedimiento constituye un ejemplo
sumamente interesante de la importancia de la metodologa en el desarrollo cientfico. Tambin
ilustra la manera como ocurren muchos de los descubrimientos: a partir de intuiciones que integran
conocimientos que han estado disponibles durante cierto tiempo.

En efecto hacia 1985 con el ADN recombinante ya plenamente establecido como una tcnica
aplicada rutinariamente por cientos de laboratorios en el mundo, Kary Mullis, quien a la sazn
trabajaba para la compaa Cetus, en San Francisco, California, tuvo una sbita inspiracin
mientras manejaba su auto y se diriga hacia una cabaa en la que se dispona descansar el fin de
semana. Como muchos otros investigadores, Mullis se encontraba desarrollando aplicaciones para
los oligos sintticos. Concibi entonces la idea de que combinando el uso de los oligos con varios
ciclos de replicacin in vitro se poda amplificar, es decir; obtener en gran cantidad, un segmento
de ADN especfico (por ejemplo, un gene en particular).

En esencia la idea consiste en que la enzima ADN polimerasa participa en la replicacin del ADN
(Ver fig. 3) . Para convertir una molcula de ADN de doble cadena en dos molculas idnticas, la

78

enzima requiere que las cadenas de la molcula inicial se separen, para as tener un molde
disponible.

Adems, la enzima requiere un segmento de ADN con un extremo libre, que sirve para cebar o
iniciar la reaccin de replicacin y los nucletidos precursores. Si se colocan estos sustratos en un
tubo de ensayo, la ADN polimerasa puede incorporar uno por uno los nucletidos
correspondientes, es decir, frente a una A en el molde, adicionar T en la cadena creciente; frente
a G, C, etc.

En realidad, ste concepto era perfectamente conocido y aplicado desde mucho antes de que se
concibiera la tcnica de la PCR. Lo original de la idea de la concepcin de Mullis fue pensar qu
sucedera si se aplica este procedimiento en ciclos sucesivos, en una reaccin en cadena. Los
oligos sintticos, en virtud de su propiedad de hibridacin de los cidos nucleicos, definen los
puntos de partida para el copiado de las cadenas de ADN. Si se colocan dos oligos cuya secuencia
define los extremos de un segmento determinado de ADN, se hacen hibridar con las hebras del
molde, previamente separadas, y se someten a una reaccin con ADN polimerasa, de lo que
resultarn dos molculas cuyos extremos estn definidos por los oligos y que corren en sentido
opuesto. Las cadenas resultantes son complementarias entre si: existen ahora el doble de
molculas con la secuencia que demarcan los oligos. , por lo tanto s el proceso se replica
cclicamente entonces, la replicacin del ADN, ser exponencial. En el siguiente ciclo de
separacin de cadenas, hibridacin con los oligos y reaccin con ADN polimerasa, se obtendrn
cuatro molculas de la regin entre los oligos. Los ciclos subsiguientes generarn 8, 16, 32, 64
molculas, y as sucesivamente. (Fig. 3 )
Fig. 3 : Replicacin del ADN, utilizando (PCR)

79

Fuente : Raven, J. Biology, 2002


As, con la tcnica de la PCR se pueden amplificar segmentos especficos de ADN para crear
muchos millones de molculas a partir de unas cuantas, o incluso de una sola. Para esto se
requiri adaptar el concepto bsico haciendo uso de ADN polimerasas provenientes de
microorganismos termfilos (que crecen a temperaturas de ms de 70 grados en manantiales
termales). De otra manera, la enzima se inactivaba cada ciclo, pues se requiere aplicar calor para
separar las molculas del ADN molde. Hoy da un ciclo puede tomar cinco minutos o menos, por lo

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que el proceso de amplificacin se lleva a cabo en menos de dos horas (normalmente 20 o 30


ciclos son suficientes).
La aplicacin de la PCR, en s misma, constituye un avance revolucionario en la investigacin
biolgica moderna.
Capitulo 2: OTRAS TCNICAS UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGA
Leccin 1: Mutagnesis

La tecnologa del DNA recombinante ha abierto todo un nuevo campo de mutagnesis. Mientras
que los mutgenos convencionales actan al azar, mediante el uso de DNA sinttico y las tcnicas
del DNA recombinante es posible introducir mutaciones en sitos determinados con toda precisin
en los genes. Este proceso se denomina mutagnesis dirigida. Es de esperar que las protenas
fabricadas a partir de cepas que cuyas mutaciones tengan propiedades diferentes de las protenas
de las cepas silvestres, propiedades que pueden predecirse al conocerse la estructura de la
protena. A continuacin se esquematiza los procedimientos bsicos utilizados en esta tcnica (Fig.
4)

MUTAGENESIS

Al Azar (Random)

Dirigida
(Site-Specific)

Coloca mutaciones
En cualquier
Sitio del ADN

Mutaciones puntuales en
sitios determinados

1. Mutagnesis dirigida por


oligonucleotidos

2. Mutagnesis por casette

Leccin 2: Mutaciones Dirigidas por Oligonucleotidos

Consiste en sintetizar un corto oligodesoxirribonucleotido que contenga el cambio de bases


deseado y dejar que se hibride con un ADN monocanetario que contenga el gen de inters.

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Fif. 5 Mutagenensis dirigida, utilizando cortos fragmentos


de oligodesorribonucetido

El procedimiento completo de mutagenesis dirigida,


ha sido modificado continuamente, encaminadas a
incrementar la tasa de mutantes obtenido, se debe
empezar con el gen de inters clonado en un ADN
monocaternario. Un vector ampliamente utilizado para
la mutagnesis dirigida es el bacterifago M13que
tiene propiedades utiles en la tecnologa del ADFN
recombinante. El AFN diana se clona en M13. Como
las clulas infectadas con este fago permanece viva, se
dispone de una fuente continua de ADN
Esta tecnologa puede utilizarse para obtener un gen
completo. Insertado en la localizacin deseada.
Aunque es difcil sintetizar el gen de una sola pieza, se
lo puede obtener por partes y luego unirlo para
producir el gen completo. Aadiendo sitios adecuados
en los extremos del gen, ste puede unirse luego a un
vector y ser clonado. Las posibilidades de este mtodo
son prcticamente ilimitadas.

Fuente: Brock, Biologa de los microorganismos,1998

82

Leccin 3: Mutagnesis en Casette o interrupcin gnica

Fig. 6. Interrupcin de un gen


utilizando la mutacin por casette: (a)
Un plasmado que contiene una copia
clonada del gen X del tipo silvestre se
corta con la enzima de restriccin
EcoRi u se mezcla con un fragmento de
ADN (la casette dela kanamicina y que
se ha obtenido utilizando la misma
enzima de restriccin. Se ligan el
plsmido cortado y la casete. (b) El
producto dela unin es un plsmido que
ahora contiene la casette de la
kanamicina como una mutacin por
insercin dentro del gen X. (c) La
clula transformada contiene el
plsmido linearizado con un gen X
interrumpido y su propio cromosoma
con una copia del gen del tipo silvestre.

CAPITULO 3: APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE:

Sin lugar a dudas, estas tcnicas han revolucionado la forma obtener productos y su
comercializacin, sin embargo existen todava muchos inconvenientes de costos y ticos que aun
no se han resuelto. Una de las mayores controversias se ha suscitado ha raz de la obtencin de
animales y vegetales transgenicos con fines teraputicos y /o alimenticios.
Leccin 4: Animales Transgnicos

Las investigaciones con sistemas de microinyeccin y cultivo de embriones, en la actualidad,


permiten introducir genes a varias especies en forma estable, entre las que se encuentran entre
otros animales como las ovejas.. A partir de las ovejas se obtienen grandes cantidades de leche,
rica en protenas. En efecto, en la medida que sabemos acerca de la expresin de los genes de la

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glndula mamaria, podemos pensar en manipular este sistema para que se elaboren en ella
productos diferentes. Utilizando estos conceptos, ya existen los primeros animales transgnicos
que producen protenas de inters mdico.

La posibilidad de utilizar "granjas moleculares" en las que los animales producen leche protenas
de altsimo valor y utilidad es realmente un triunfo maysculo de la biotecnologa moderna.( Fig7).
Con gran seguridad, en pocos aos los enfermos con deficiencias de alguna de estas protenas,
por ejemplo los hemoflicos, dispondrn de una fuente relativamente barata para conseguirlas.
Recientemente se anunci ya la obtencin de vacas transgnicas.
Los animales transgnicos tambin pueden usarse para muchos otros propsitos.
Fig. 7 . Mejoramiento gentico de bovinos

Fuente : Raven, J. Biology, 2002


Leccin 5: Plantas transgnicas

Las posibilidades de beneficiarnos a travs del mejoramiento gentico de las plantas ya existentes
por medio del transplante de genes es enorme, puesto que uno de los problemas que se han
generado a partir del cultivo intensivo es el uso exagerado de fertilizantes y pesticidas. Debido a

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esto, el desarrollo de bioinsecticidas ha recibido importante atencin en los ltimos tiempos. En


particular, el microorganismo, Bacillus thuringiensis, que naturalmente produce una protena txica
(toxina BT) para diversas especies de artrpodos (insectos y arcnidos, por ejemplo). Estas
bacterias pueden ser cultivadas y administradas a los cultivos, y constituyen un insecticida
biodegradable y seguro. El paso siguiente consisti en introducir el gene que codifica para esta
toxina a una planta de tabaco (por supuesto fusionado a una regin regulatoria que permitiera su
expresin en la planta, particularmente en las hojas). Las plantas transgnicas resultantes son
inmunes a las larvas de palomillas que normalmente merman este cultivo. Al cabo de consumir un
poco de la hoja, la larva se vuelve inactiva y muere, envenenada por la toxina BT. Es importante
resaltar que esta toxina es completamente inocua para otros animales, incluido, desde luego, el ser
humano.
Una caracterstica muy interesante del reino de las plantas es que para vivir se han adaptado a
ambientes extremos, ya que no pueden huir de ellos. As, encontrarnos plantas capaces de vivir en
condiciones de sequa, salinidad, etc. Tambin los vegetales han desarrollado funciones para
defenderse de ser ingeridas indiscriminadamente. Cada especie animal gusta slo de ciertas
plantas y las puede comer sin enfermarse.( Por encima de todo esto, los seres humanos tendemos
a ser muy selectivos en nuestra alimentacin. Algunos de nosotros slo compramos frijol "flor de
mayo", sin importarnos si nos resulta un poco ms caro, o si sus propiedades alimenticias no son
tan buenas como las de alguna otra variedad. As que no todas las caractersticas apreciadas se
encuentran juntas en la misma planta. Tpicamente encontraremos que unas variedades son
sabrosas, otras son nutritivas, otras ms, resistentes a las inclemencias del clima, etctera.)
La nueva biotecnologa de plantas permitir ir introduciendo, al principio uno por uno, los genes
que se vayan identificando como responsables de conferir ciertas caractersticas atractivas a las
variedades de plantas que son ms tiles. (Fig. 7)

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Fig. 7 .Ejemplo de plantas genticamente modificas

Fuente: Wisseman A, Principios de Biotecnologa .1886

Leccin 6: Alimentos genticamente modificados


La demanda de alimento global ha aumentado la necesidad de cultivos mejorados. la biotecnologa
ofrece la tecnologa necesaria para producir alimentos ms nutritivos y de mejor sabor,
rendimientos ms altos de cosecha y plantas que se protegen naturalmente contra enfermedades,
insectos y condiciones adversas.

esto permite efectuar la seleccin de un rasgo gentico especfico de un organismo e introducir ese
rasgo en el cdigo gentico del organismo fuente del alimento, por medio de tcnicas de ingeniera
gentica. esto ha hecho posible que se desarrollen cultivos para alimentacin con rasgos
ventajosos especficos u otros sin rasgos indeseables. Resumiendo, se puede decir que la
biotecnologa tiene un amplsimo rango de aplicacin en la industria alimenticia, ofreciendo los
medios para producir alimentos de mejor calidad en forma ms eficiente y segura para la salud y el
medio ambiente. una de las promesas de la biotecnologa es generar innovaciones y mejoras en
los alimentos conduciendo a prcticas agrcolas ms ecolgicas, contribuyendo a una agricultura
sustentable que utiliza con respecto los recursos del medioambiente.
El rea de mayor aplicacin de la biotecnologa en alimentos y la ms antigua, corresponde a las
fermentaciones, de gran importancia dentro de la tecnologa de alimentos y que abarca varios
campos, como fermentaciones alcohlicas, fermentaciones crnicas y fermentaciones lcticas.

86

El rea ms reciente y de mayor proyeccin dentro de la biotecnologa de alimentos est en el


desarrollo de alimentos genticamente modificados o transgnicos, cuyas principales ventajas se
ven en mejoras nutricionales,

mayor productividad de cosechas y

mayor

proteccin

medioambiental. Adems, alimentos gm poseen hoy en da gran importancia en las soluciones de


graves problemas de escasez de alimentos, desnutricin y problemas de salud pblica en general
del mundo en vas de desarrollo.

Actividad: Organice un foro con sus compaeros sobre las ventajas y desventajas de los
alimentos gm en la alimentacin mundial, saque las conclusiones correspondientes y
presntelas en un informe. Para ello busque informacin en pginas Web.

87

UNIDAD 5: PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS DE INTERES ALIMENTARIO

Los microorganismos han sido utilizados durante siglos para modificar los alimentos, y tanto stos
como las bebidas fermentadas constituyen un sector primario y extremadamente importante de la
industria aumentara. En este capitulo se describirn algunos procesos para la obtencin de
compuestos derivados del metabolismo energtico (fermentacin), metabolismo intermedio y
biosntesis
Capitulo 1: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA OBTENCIN DE PRODUCTOS
DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGTICO POR VA FERMENTATIVA.

Leccin 1: Bebidas alcohlicas


Las bebidas alcohlicas se producen a partir de diversas materias primas, pero especialmente a
partir de cereales, frutas y productos azucarados. Entre ellas hay bebidas no destiladas, como la
cerveza, el vino, la sidra y el sake, y destiladas, como el whisky y el ron, que se obtienen a partir de
cereales y melazas fermentadas, respectivamente, en tanto que el brandy se obtiene por destilacin. del vino. Otras bebidas destiladas, por ejemplo el vodka y la ginebra, se elaboran a partir de
bebidas alcohlicas neutras obtenidas por destilacin de melazas, cereales, patatas o lactosuero
Fermentados. Adems tambin se obtienen una gran variedad de vinos de alta graduacin
mediante adicin de alcohol destilado a los vinos normales con objeto de elevar su contenido
alcohlico hasta el 15 o el 20 %; entre stos se incluyen productos tan notables como el jerez, el
aporto y el madeira.
Un detalle comn importante en la produccin de todas estas bebidas alcohlicas es el empleo de
levaduras para convenir los azcares en etanol. Por consiguiente, la primera parte de esta seccin
se concentrar en la biologa de las fermentaciones de levaduras y seguidamente se discutirn los
procesos concretos de obtencin de la cerveza, el whisky y el vino.
Leccin 2: Biologa de las fermentaciones con levaduras
Aproximadamente el 96 % de la fermentacin del etanol se lleva a cabo mediante cepas de
Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas, particularmente S. uvarum. El etanol se
produce en la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), en la que el piruvato producido durante la
glicosilacin se convierte en acetaldehdo y etanol. La reaccin global es la siguiente:
Glucosa + 2ADP-2 Etanol + 2CO~ + 2ATP

El rendimiento terico de 1 g de glucosa es de 0,51 g de etanol y 0,49 g de CO2. Sin embargo, en


la prctica, aproximadamente el 10 % de la glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento en
etanol y CO2 alcanzan el 90 % del valor terico. El ATP formado se utiliza para las necesidades
energticas de la clula.

88

La envoltura de la clula de levadura incluye una membrana plasmtica, un espacio periplsmico y


una pared celular constituida principalmente por polisacridos y una pequea cantidad de pptidos.
La pared tiene una estructura semirrgida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una
considerable fuerza compresional y tensil. Los grupos carboxilo de los pptidos de la pared celular
confieren a las levaduras utilizadas en la elaboracin de cerveza una capacidad de floculacin
importante, lo que facilita la separacin slido-lquido despus de la fermentacin. Se cree que la
floculacin se debe a la formacin de puentes salinos entre los iones calcio y estos grupos
carboxilo de la pared celular.
Leccin 3: Condiciones de la fermentacin
En la fermentacin las levaduras utilizadas para la elaboracin de cerveza (S. cerevisiae) utilizan
los azcares sacarosa, fructosa, maltosa y maltotriosa en este orden. La sacarosa es hidrolizada
primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplsmico extracelular. Los azcares son
transportados a travs de la membrana celular por transporte activo o pasivo mediado por
permeasas producidas constitutivamente o inducibles. La maltosa y la maltotriosa son hidrolizadas
intracelularmente por la -glucosidasa, Saccharomyces uvarum (S. car/sbergensis) se distingue
taxonmicamente del S. cerevisiae en que tambin Utiliza melibiosa. El Kluyveromyces fragilis y
Kluyveromyces lactis, que a diferencia de S: cerevisiae pueden fermentar la lactosa, tienen un
sistema lactosa-permeasa para transportar la lactosa dentro de la clula, donde se hidroliza a
glucosa y galactosa, que entran en la gliclisis. Excepto los Saccharomyces diasraucus, que no
son adecuadas para la elaboracin de cerveza todas las levaduras Saccharomyces son incapaces
de hidrolizar el almidn y las dextrinas, y por consiguiente, el empleo de materiales basados en
almidn para la fermentacin alcohlica requieren la accin de enzimas exgenos como las y amilasas de la malta o enzimas microbianos como a-amilasa, amiloglucosidasa (glucoamilasa) y
pululanasa. Los azcares mayoritarios del mosto son la glucosa y la fructosa y puesto que el S.
cerevisiae metaboliza preferencialmente la glucosa; el azcar no fermentado que permanece en el
vino resultante es la fructosa. Por el contrario, las levaduras del vino de Saurernes fermeman la
fructosa ms rpidamente que la glucosa.
El mosto de cerveza producido a partir de malta contiene 19 aminocidos adems de otros
nutrientes. Estos aminocldos son asimilados a distintas velocidades durante la fermentacin. Un
aminocido permeasa general (GAP puede transportar todos los aminocidos bsicos y neutros
excepto la prolina. En las levaduras existen al menos otros 11 sistemas de transpone de
aminocidos ms especficos. La proln permeasa es inhibida por otros aminocidos: por el
amonaco.

Aunque !as fermentaciones alcohlicas son en gran medida anaerbicas. las levaduras necesitan
algo de oxgeno para sinterizar algunos esteroles y cidos grasas insaturados componentes de la

89

membrana. El mosto de la cerveza contiene normalmente niveles subptimos de esteroles y cidos


grasos insaturados. pero cuando el medio se suplementa con cido oleico u oleanoico, la
necesidad de oxgeno desaparece.

Muchas cepas de S. cerevisiae pueden producir concentraciones de etanol de hasta el 12-14


Existe un cierto inters en el empleo de levaduras tolerantes de cantidades elevadas de alcohol en
los procesos de fabricacin de cerveza con gravedad elevada y la produccin de alcohol para la
destilacin con vistas a incrementar la productividad de la planta y disminuir los costos de destilacin. Existen cepas seleccionadas capaces de producir hasta un 18-20 % de alcohol, aunque la
velocidad de fermentacin se ve fuertemente reducida cando la concentracin de etanol aumenta.
Los mostos con un contenido muy elevado de azcares fermentan nicamente con levaduras
osmoflicas como Saccharomyces rouxii y S. bailli, que poseen una gran capacidad para fermentar
la fructosa.
La composicin en fosfolpidos de la membrana plasmtica es importante para la tolerancia del
etanol, observndose un incremento de sta cuando el contenido de cidos grasos insaturados
aumenta. La tolerancia alcohlica puede elevarse suplementando el medio de crecimiento con
cidos grasos insaturados, vitaminas y protenas. Los factores fisiolgicos tales como la forma de
aporte del substrato, la acumulacin de etanol intracelular, la presin osmtica y la temperatura
influyen en la tolerancia de las levaduras al etanol. Los enzimas glicolticos de las levaduras,
hexoquinasa, gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa son sensibles a
la concentracin de etanol.

En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la mayora de las veces
favorables al crecimiento y actividad fermentara; esta ltima es mayor cuanto mayor sea el pH y
se produce una cada notable a valores de pH de 3-4. El pH influye en la formacin de
subproductos; por ejemplo, a valores de pH elevados se incrementa la formacin de glicerol. El
pH del mosto de uva est generalmente comprendido entre 3 y 3,9 debido a su elevado
contenido de cidos (5-15 g/I), principalmente tartrico y mlico, de forma que, como la mayora
de las bacterias, con excepcin de las bacterias del cido actico y lctico prefieren pH ms
neutros, la susceptibilidad del mosto de vino a la contaminacin bacteriana es reducida.
Las temperaturas ptimas de la fermentacin, la respiracin de las levaduras y el crecimiento
celular son claramente diferentes. La velocidad de fermentacin aumenta. generalmente con la
temperatura entre los 15 y los 35C y los niveles d e glicerol, acetona, buteno-2,3-diol,
acetaldehdo, piruvato y 2-cetoglutarato se elevan en los caldos de fermentacin. La formacin
de niveles elevados de alcohol tambin depende de la temperatura. En los vinos blancos, la
menor temperatura de fermentacin da lugar a vinos ms frescos y afrutados, y el riesgo de
infeccin bacteriana y de produccin de cidos voltiles como resultado es reducido. Para la

90

produccin de vino tinto se utilizan temperaturas ms elevadas, de 22 a 30oC, y la fermentacin


con los hollejos conduce a la intensificacin del color y a la produccin de un rico aroma.
Leccin 4: Compuestos organolpticos:
En la produccin de bebidas alcohlicas deben controlarse las fermentaciones de forma que, por
un lado se asimilen los carbohidratos y otros nutrientes y se conviertan en alcohol y en compuestos
con aromas caractersticos y deseables, y por otro lado, se minimice la formacin de aromas y
sabores indeseables. Entre los componentes del aroma y sabor se encuentran otros alcoholes
diferentes del etanol, steres, compuestos carbnicos, cidos orgnicos, compuestos azufrados,
aminas y fenoles.
Cuantitativamente, y en funcin de su papel en el aroma y sabor, los componentes ms
importantes presentes en las bebidas alcohlicas son los alcoholes superiores, denominados
tambin alcoholes de fusel o aceites de fusel, entre los cuales los ms significativos en la cerveza
Y el vino son el alcohol amlilico, el isoamlico y el 2-fenoetanol. El vino tinto tiene una
concentracin mayor de estos compuestos que el vino blanco. Las bebidas destiladas tienen un
espectro bastante diferente de alcoholes superiores, que incluyen butanoles y pemanoles. El
glicerol, alcohol polihdrico, est presente en casi todas las bebidas alcohlicas. En el vino, el
glicerol se encuentra a concentraciones de hasta el 1 % (peso/volumen) y confiere cuerpo a esta
bebida.
En muchas bebidas y licores, los steres constituyen un grupo importante de compuestos voltiles
debido a su penetrante aroma afrutado. Entre ellos, el acetato de etilo est presente en muchas
bebidas a concentraciones organolpticamente importantes. Otros steres importantes incluyen el
formiato de etilo y el acetato de isoamilo.
El acetaldehido, con propiedades organolpticas indeseables, se produce como un compuesto
intermedio durante las fermentaciones alcohlicas, obtenindose niveles altos por tasas de
levaduras elevadas o excesiva aireacin. El diacetilo y la pentano-2,3-diona, formados fuera de las
clulas de la levadura por decarboxilacin oxidativa del -acetolato y el -cetohidroxibmirato, tienen
aromas y sabores indeseables caractersticos. Las levaduras pueden reducir el diacetilo y la
pentano-2,3-diona. La presencia de exceso de diacetilo en la cerveza se produce cuando el acetolactato aparece en una etapa en la que las levaduras ya han sedimentado o han perdido su
capacidad para reducir el diacetilo a acetona o el exceso de diacetilo en la cerveza tambin puede
deberse a fa presencia de organismos que la deterioran, como Pediococcus y Lacrobacillus.
Durante la fermentacin primaria del mosto de la cerveza se producen cantidades considerables de
SH2 provenientes de la reduccin de los compuestos azufrados. Aunque en la cerveza pueden ser
aceptables cantidades pequeas de compuestos azufrados, y en la cerveza normal el SO2 est
usualmente presente a concentraciones por debajo de su umbral de sabor, el exceso produce
aromas y sabores. desagradables. El dixido de azufre influye positivamente en la fermentacin

91

alcohlica, puesto que se une al acetaldehido y adems inhibe algunas de las reacciones de
oxidacin indeseables. En el mosto del vino, el SO2 inhibe algunos microorganismos indeseables,
entre ellos las bacterias del cido lctico y cido actico, as como algunas levaduras naturales que
producen un exceso de cidos voltiles, piruvato y -cetoglutarato. Adems la produccin del
desagradable sabor del cido actico tambin inhibe las fermentaciones de levaduras,
particularmente combinado con el etanol, Saccharomyces cerevisiae es ms susceptible a esta
inhibicin que Saccharomycoides ludwigii, Schizosaccharomyces pombe. En los mostos cuya
acidez total es baja, es muy til emplear S02 para inhibir la fermentacin malo-Ictica por las
bacterias del cido lctico, impidiendo la disminucin posterior del nivel de cido. Una concentracin elevada de S02 puede retrasar el comienzo de la fermentacin.
El bajo pH del mosto y del vino suministran un medio selectivo para el crecimiento de las bacterias
del cido actico y del cido lctico, aunque la supervivencia de !as primeras sea usualmente corta
debido a las propiedades reductoras del medio. Las bacterias lcticas del vino son anaerobias
facultativas u organismos microflicos que son homofermentivos (todas las Pediococcus y algunos
Lactobacillus producen cido lctico a partir de glucosa) y heterofermentivos (todos los
Leuconostoc y algunos Lactobacillus producen cido lctico, etanol y CO2 a partir de la glucosa).
Las bacterias lcticas pueden metabolizar los cidos mlico y tartrico presentes en el vino a
concentraciones elevadas, as como al cido ctrico, presente en cantidades ms bajas. Existen
mtodos qumicos para reducir la acidez. La reduccin de los cidos puede impedir el deterioro de
los vinos de pH elevado. A pH 3,3-3,4, los Leuconostocoenus fermentan el cido mlico aunque los
Pediococcus no lo hacen. Los Lellconosto se adaptan bien a los pH bajos y generalmente se
prefieren siempre que se desee una fermentacin malo-Ictica. Una fermentacin malo-lctica por
Pediococcus va con frecuencia acompaada de la formacin de diacetilo e histamina, indeseables.
Leccin 5: Alimentos basados en soja fermentada
Las fermentaciones de productos a base de saja y otras materias primas relacionadas se llevan a
cabo desde hace muchos siglos, especialmente en Oriente. Entre las fermentaciones ms
importantes

se encuentran los procesos de produccin de salsas de saja, misa y tempeh,

ilustrados en la Figura 1

92

Aunque existen diversos tipos de salsas de soja, la producida predominantemente en Japn,


denominada koikuchi, se obtiene por fermentacin de una mezcla de saja y trigo, que da lugar a
una salsa con fuerte aroma y color marrn-rojizo oscuro. El proceso consiste inicialmente en una
fermentacin primaria de una mezcla al 50 010 de saja cocida al vapor, empapada y trigo tostado y
triturado, con un nivel de humedad del 27 al 37 %, que se extiende en bandejas y se incuba con
Aspergillus oryzae, que tiene actividad amiloltica y proteoltica elevada, durante 2 3 das a 25-30
o

C. Despus de adherirle agua salada, para hacer que el contenido de sodio alcance el 18 %, la

masa o moromi se transfiere a tinas grandes donde se produce la fermentacin secundaria, con
bacterias holofilicas y levaduras osmofilicas; el proceso tiene lugar a una temperatura de 35-40 oC,
con agitacin intermitente, y el tiempo de fermentacin oscila entre 2 y 12 meses. Al finalizar esta
fermentacin secundaria, se recupera la salsa lquida y se pasteriza. Los enzimas producidos en la
fermentacin primaria o fermentacin koji hidrolizan las protenas a pptidos y aminocidos
libres y convierten el almidn en azcares simples. Estos productos de ruptura son a su vez
metabolizados por otros microorganismos, produciendo diversos compuestos aromatizantes y
saborizantes. Utilizando inculos de levaduras, bacterias y hongos puros el proceso de
fermentacin se controla mejor y se obtiene un producto de calidad, aroma y sabor consistentes.

93

En Oriente, las pastas de soja fermentada se preparaban tradicionalmente en casa para su


utilizacin en sopas y salsas. En Japn, el producto, denominado misa, se elabora en la actualidad
a gran escala, mediante un proceso que implica inicialmente la fermentacin koji del arroz
empapado al vapor (o cebada, o soja, con menor frecuencia), que despus se extiende en
bandejas, se inocula con cepas seleccionadas de A. oryzae y se incuba a 28-35 oC durante aproximadamente dos das. A continuacin el material se mezcla en recipientes con soja empapada y
cocida al vapor en una relacin 1:2, y se aade cloruro de sodio para dar una concentracin del 4
al 13 %, La mezcla se inocula con bacterias y levaduras y se deja fermentar entre 1 y 52 semanas.
Finalmente, el producto se amasa y se pasteriza, pudiendo obtener distintos tipos de miso con diferentes grados de dulzura, salinidad y color, variando la materia prima koji, el contenido de sal, los
edulcorantes y la duracin de la fermentacin.
La produccin de tempeh se basa en una fermentacin en bandejas de soja remojada cocida al
o
vapor inoculada con Rhizopus oligosporus, e incubada a 30-38 C durante 24 horas. El producto,

que usualmente se corta en rebanadas, se sala y se consume frito, tiene una vida corta.
Leccin 6: Productos crnicos fermentados
La mayora de los productos crnicos fermentados consisten en fiambres (secos o semiseco), con
una relacin humedad-protena que oscila entre 1,5 y 3 a 1. En general, la etapa de fermentacin
microbiana tiene lugar a una temperatura ptima, previa a la de calentamiento y/o secado.
La fermentacin microbiana, que da lugar a la formacin de cido, ayuda al procesado de muy
distintas formas, puesto que contribuye a la estabilidad y alarga la vida del producto, facilita la
posterior eliminacin de humedad y genera aromas y sabores caractersticos. Generalmente se
recomienda que el pH del producto sea inferior a 5,3, basados en la creencia de que dicho valor
sirve para controlar los Staphylococcus aureus. El proceso de fermentacin para reducir el pH por
debajo de 5,3 deber ajustarse a las normas de seguridad temperatura/tiempo especificadas,
o
comprendidas entre 23,9 y 43 C durante un perodo de incubacin de entre 80 y 18 horas. Con

frecuencia se utilizan inculos comerciales, como los Pediococcus, que tienen una buena
capacidad para producir cido lctico. Los Staphylococcus carnosus, especies inocuas coagulasa
negativas, se emplean de forma rutinaria en la produccin de embutidos secos. Los nitritos influyen
positivamente en la conservacin de la carne, puesto que controlan el desarrollo de Clostridium
botulinum. Las especies de Micrococcus capaces de reducir los nitratos a nitritos, de forma
controlada, contribuyen a la curacin de la carne as corno al control de los e boculinum. Tambin
pueden utilizarse cultivos startem en el procesado del bacon, con objeto de eliminar cualquier
nitrito residual presente, disminuyendo o anulando la formacin de nitrosaminas, carcingenos,
durante la fritura.
Se puede predecir que a partir del mayor empleo de los inculos comerciales, los procesos de
fermentacin de los productos crnicos se caracterizarn por su elevado nivel de control del

94

proceso, lo que dar lugar a productos de calidad y consistencia reproducibles y manteniendo


siempre las mayores condiciones de seguridad.
Leccin 7: Vinagre
El vinagre es una solucin acuosa de cido actico, se obtiene mediante la fermentacin por
oxidacin de una solucin diluida de etanol. El proceso metablico se basa en la conversin del
etanol, bajo la accin del alcohol deshidrogenasa, en acetaldehdo y del acetaldehdo hidratado en
cido actico por la accin de la acetaldehdo deshidrogenasa:
C2H5OHCH3CHO+H2OCH2CH OH2CH3COOH+H2O
La materia prima de la fermentacin del vinagre de alcohol (white spirit) consiste usualmente en
etanol purificado diluido. Los vinagres de vino, sidra, malta y arroz se obtienen por fermentacin
alcohlica de zumos de uva, manzana, cebada malteada y arroz, respectivamente. La
fermentacin del vinagre requiere tambin una fuente de nitrgeno y una combinacin apropiada
de minerales y con frecuencia es necesaria la suplementacin con nutrientes. Las modernas
fermentaciones de vinagre consisten en procesos sumergidos muy aireados. El acetator Frings
(Fig. 7.8), muy utilizado en la produccin comercial de vinagre, es un fermentador provisto de
deflectores, cuyo fondo contiene una turbina de cuerpo hueco que gira a 1.450-1.750 rpm, cuya
rotacin hace que el aire sea succionado a travs del rotar hueco y se distribuya radialmente a lo
largo de toda la seccin trasversal del fermentador.
Los procesos comerciales tpicos, que producen cido actico del 12 al 15 OJo, se llevan a cabo
de forma semicontinua. Las concentraciones de alcohol y de cido actico al comienzo del ciclo
son del 7-10 % y del 5 1110 respectivamente;
la fermentacin se efecta entre 27 y 32 e hasta q ue la concentracin de alcohol desciende al 0,10,3 %, momento en el cual se descarga una parte del vinagre (aproximadamente la tercera parte) y
el recipiente se vuelve a llenar con una mezcla que contiene del O al 2 % de cido actico y del 12
al 15 % de etanol y el ciclo se repite. Un alcalgrafo mide la concentracin de etanol y hace que las
operaciones de descarga y llenado se puedan llevar a cabo automticameme, sin interrupcin del
proceso de aireacin/mezclado de forma que impida el agotamiento total del etanol en el caldo de
fermentacin. El mezclado rpido continuo es esencial para minimizar los gradientes de
concentracin. Los tiempos del ciclo varan de 24 a 48 horas.

Las bacterias acidoacticas, que oxidan el etanol a cido actico y pueden existir a valores bajos
de pH, pertenecen a los gneros Acetobacter y Gluconobacter, estrechamente relacionados. Los
cultivos puros de estos organismos se caracterizan por su alto grado de variabilidad y en las
fermentaciones industriales se pueden desarrollar posteriormente cultivos mezclados a partir de
cultivos puros. Los cultivos industriales se seleccionan en funcin de que toleren una acidez

95

elevada y de que las velocidades de produccin de acetato sean altas. Estas bacterias son
extremadamente sensibles y se mueren en ausencia de oxgeno y etanol y tambin resultan
daadas a gradientes de concentracin de etanol y acetato. La sensibilidad a la falta de oxgeno
aumenta a medida que lo hace la concentracin total de cido actico ms etanol. No obstante,
con una aireacin suficiente, puede conseguirse una utilizacin del 80 % de oxgeno sin producir
efectos adversos en la fermentacin. La sobreoxidacin, esto es la conversin de cido actico en
CO2 y H20 puede impedirse manteniendo la concentracin de cido actico por encima del 6 % e
impidiendo el agotamiento total del etanol.
Leccin 8: cido Lctico
Aproximadamente la mitad de la demanda mundial de cido lctico se obtiene mediante
fermentacin. Sus principales usos industriales son como acidulante alimentario (50 % del
mercado), y para la manufactura de estearoil-2-lactilato (20 %) as como en la industria
farmacutica y en otras aplicaciones.
El cido L-( + )-lctico se obtiene por fermentacin anaerobia con Lactobacillus de/bruckii y cepas
homofermentativas relacionadas. El medio contiene aproximadamente un 15 % de sacarosa o
dextrosa y nitrgeno en forma compleja. El pH se controla en fa regin de 5,0 a 6,5 mediante
neutralizacin con CaCO3 o Ca(OH)2. la temperatura se mantiene entre 45 y 60 C y el tiempo de
fermentacin es de 3 a 4 das. con lo que se obtiene un rendimiento en cido lctico del 90 al 95
%, basado en el contenido inicial de azcar. El proceso de fermentacin se basa en la conversin
de hexosa en piruvato por la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas y su conversin en L-( + )-lactato
por el enzima L-lactato deshidrogenasa
Leccin 9: Acido Actico
El mercado mundial anual del acetato es de unos 2,5 millones de Tm. Desde 1950 los mtodos
sintticos han proporcionado la mayor parte del suministro mundial de cido actico, pero, como el
etileno es la principal materia prima utilizada y su precio se ha incrementado de 6 centavos/Kg a 30
centavos/Kg desde 1970 a 1980. han ido ganando en importancia distintas rutas de produccin
alternativas, incluyendo los mtodos biolgicos. Brasil produce cido actico por conversin
qumica de etanol, obtenido nicamente a partir de biomasa. Tambin tienen aplicacin potencial
los mtodos de fermentacin para la produccin de acetato como materia prima qumica.
En el Captulo 7 ya se ha descrito el proceso aerobio para la produccin de vinagre. En las
fermentaciones acidognicas anaerobias se producen una gran variedad de cidos grasas
voltiles. El cido actico constituye el componente mayoritario de la mezcla, aunque tambin se
producen cantidades significativas de cido propinico y butrico. Los Clostridium butyricum
producen una mezcla de cido actico y butrico a partir de glucosa. Los Clostridium thermocel/um
y e thermoaceticum fermentan la glucosa y la fructosa casi estequiomtricamente a acetato. En la

96

acidognesis, es imperativo suprimir los metangenos, asociados frecuentemente con los


formadores de cido en los cultivos mixtos, ya que convertiran el cido en metano y C02.
Aunque en el proceso aerobio pueden obtenerse concentraciones de acetato ms elevadas, el
rendimiento terico en el proceso de acidognesis anaerobio es de 1.0 comparado con el 0,66 de
aquel. Las dos molculas de C02 producidas durante la conversin de piruvato en acetil CoA se
asimilan justificando la tercera molcula de acetato formada a partir de glucosa (Fig. 8.5). Adems,
las necesidades energticas para el proceso anaerobio son menores y tambin es menor el valor
de los substratos, puesto que pueden emplearse desechos de destilera y desechos de plantas de
celulosa. En consecuencia., las fermentaciones acetognicas anaerobias pueden llegar a ser el
mtodo de eleccin para la produccin de acetato destinado a la industria qumica.

Capitulo 2: COMPUESTOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA PRODUCCIN DEL METABOLISMO


SECUNDARIO.
Leccin 1: Produccin de acido ctrico
El cido ctrico, ampliamente distribuido en la naturaleza, se utiliza desde hace tiempo en la
manufactura de bebidas refrescantes como acidulante, como auxiliar en la fabricacin de
mermeladas y como aditivo general en las industrias de repostera. Inicialmente se extrajo del
zumo de limn, posteriormente se sintetiz a partir de glicerol y de otros compuestos qumicos y
finalmente, desde 1923, se obtiene por fermentacin industrial. En 1933, la produccin mundial
anual super las 10.000 Tm, de las cuales, ms del 80 % se obtuvieron por fermentacin. Con la
substitucin de los polifosfatos por el citrato de so dio en los detergentes en 1970, el mercado
anual creci rpidamente y actualmente se estima que se producen exclusivamente por
fermentacin unas 300.000 Tm. Inicialmente se utilizaron mtodos de cultivo en superficie con
Aspergillus niger; despus de la segunda guerra mundial se introdujeron procesos de cultivo sumergidos tambin con A. niger y aproximadamente en 1977 se comercializ un' proceso de cultivo
sumergido con levaduras del gnero Candida.

En la Tabla 1 se muestran las principales caractersticas de los procesos industriales empleados en


la produccin de cido ctrico. Actualmente an se utiliza ampliamente el cultivo en superficie con
A. niger, puesto que, aunque es un proceso que requiere ms trabajo que el de cultivo sumergido,
las necesidades energticas son menores. En los procesos sumergidos se prefieren fermentadores
agitados por aire, que permiten utilizar recipientes de mayor tamao, ya que este producto es de
un volumen de produccin alto entre los obtenidos por fermentacin. La materia prima ms
utilizada para la produccin de citratos son las melasas, cuyo mayor problema consiste en la gran
variabilidad del material. En las fermentaciones sumergidas con A. niger las concentraciones
elevadas de azcar estimulan la produccin de citrato obtenindose rendimientos bajos cuando la
concentracin de azcar es inferior a 140 kg m - 3. En general, se suministra nitrgeno a una

97

concentracin de 0,1-0,4 g 1 - l. La adicin de NH4- durante la fermentacin aumenta la produccin


de citrato.

Tabla N 1 ..Caractersticas de la produccin industrial de Acido ctrico

Fuente: Crueger, Manual de


Microbiologa industrial, 1989
La produccin de cido ctrico con A. niger es extremadamente sensible a la concentracin de
iones Mn2+, de forma que su produccin se \'e ya drsticamente reducida a un nivel de

98

manganeso del orden de 3 mg 1- 1. Por tanto, es necesario pretratar las molasas con agentes que
acomplejen o precipiten este metal. por ejemplo con hexacianoferrato (HCF) o con cobre, que
contrarresta el efecto del manganeso al inhibir su absorcin por las clulas. Las condiciones
deficientes en manganeso tambin favorecen la produccin de pequeos grnu los micelianos con
superficies lisas y compactas, caractersticos de las buenas fermemaciones fngicas de citrato.
Cuando la concentracin de manganeso aumenta, la morfologa fngica se vuelve fijamentosa,
incrementando drsticamente la viscosidad del cultivo y disminuyendo rpidamente de forma
concomitante la tensin del oxgeno disuelto. Como la produccin de cido ctrico necesita
oxgeno, la velocidad de produccin de cido aumenta a medida que aumenta la cantidad de
oxgeno disuelto. Adems, una corta interrupcin del suministro d~ oxgeno puede conducir al cese
irreversible de la produccin de citrato. Para la biosntesis de citrato es esencial mantener el pH por
debajo de 2.0, puesto que a pH superiores, el A. niger acumula cido glucnico en vez de citrato.

La produccin de citrato con Candida gullermondi difiere en varios aspectos del proceso
sumergido con A. niger. Por ejemplo, la deficiencia de manganeso no es un prerrequisito, siendo
innecesaria una etapa de pre tratamiento para eliminar este metal del medio; el citrato se produce
a un pH superior (3,5-5,0). Adems, la limitacin de nitrgeno provoca la acumulacin de cido. La
principal ventaja del proceso que emplea Candida respecto al que emplea A. niger consiste en que
la productividad global de la fermentacin es superior, ya que se pueden utilizar concentraciones
de azcar ms altas debido a la naturaleza ms osmotolerante de los organismos y adems la
fermentacin es ms rpida.
- Bioqumica de la produccin de citrato con A. niger
El proceso metablico que conduce a la acumulacin de citrato implica (a) la descomposicin de
las hexosas a piruvato y acetil CoA, (b) la formacin anaplertica de oxalacetato a partir de
piruvato y CO2 y (c) la acumulacin de citrato dentro del ciclo del cido tricarboxliico. En este
esquema no debera eliminarse CO2 durante la produccin de ctrato, puesto que el CO2 liberado
en la decarboxilacin oxidativa del piruvato a acetil-CoA debera utilizarse en la conversin de
piruvato en oxalacetato. El enzima clave que cataliza esta reaccin, la piruvato carboxilasa, lo
producen intrnsecamente las especies AspergiIlus. Las concentraciones elevadas de azcar
aumentan adems la actividad de este enzima as como la de los enzimas glicoliticas y pueden
inhibir algunos de los enzimas del ciclo del cido tricarboxilico. Para que se acumule citrato es
necesario que al menos uno de las enzimas de este ciclo resulte inhibido. Las evidencias recientes
sugieren que la principal etapa reguladora es la de la excetoglutarato deshidrogenasa, etapa
limitante de la velocidad en el ciclo y la nica reaccin irreversible. Este enzima se inhibe al
incrementar las concentraciones fisilogicas de oxalacetato y NADH durante la produccin de

99

citrato. La fosfofructoquinasa es inhibida por el citrato, aunque esta inhibicin puede contrarrestarse con concentraciones intracelulares elevadas de NH4+
La deficiencia de manganeso reduce la actividad de algunos de los enzimas de la ruta de la
pentosa fosfato (que podran desviar las hexosas de la glicolisis y la produccin de citrato) y
tambin inhibe el ciclo del cido tricarboxilico, y adems perjudica el metabolismo anablico en
general, incluyendo el recambio de las protenas y los cidos nucleicos. Durante estas deficiencias,
se forma una proteasa cida y la reserva intracelular de cidos nucleicos y protenas disminuye con
+.

la produccin concomitante de pptidos, aminocidos y niveles elevados de NH4 Por tanto, en


conclusin, el principal efecto de la deficiencia de manganeso es su impacto en el recambio
proteico, haciendo que la concentracin de iones amonio se incremente en tanto que contrarreste
la inhibicin de la fosfofnlctoquinasa por el citrato.
Para la reoxidacin metablica del NADH durante la produccin de cido ctrico se necesita
oxgeno. Durante la acumulacin de citrato, un sistema respiratorio alternativo sensible al cido
salicilhidroxmico (SHAM), mantiene el sistema respiratorio con la reoxidacin del NADH, aunque
sin produccin concomitante de ATP (Fig.2). El hecho de que la acumulacin de cido ctrico est
fuertemente inhibida por el SHAM indica la importancia de este sistema. La respiracin sensible al
SHAM depende de una tensin elevada de oxgeno y el sistema se inactiva por una corta
interrupcin de la aireacin.
La produccin de cido glucnico con A. niger est catalizada por una glucosa oxidasa
extracelular, parcialmente unida al micelio, que se inactiva a pH inferiores a 2,0. A pH superiores,
se produce cido glucnico a partir de glucosa mediante la accin de A. niger. La glucosa induce
este enzima a pH superiores a 4,0, lo que hace necesario mantener en las fermentaciones para la
produccin de citrato un pH inferior a 2,0.

En resumen, la produccin de citrato por A. niger se caracteriza por:

Una actividad elevada de los enzimas glicolticos y de la piruvato carboxilasa inducida por
los carbohidratos que conducen a la sntesis de citrato.

La inhibicin de un enzima del ciclo del cido tricarboxlico que podra causar la
descomposicin del citrato.
La produccin mediada por una deficiencia de manganeso de una concentracin elevada de
NH: intracelular que contrarresta la inhibicin de la fosfofructoquinasa por el citrato.
Una tensin de oxgeno elevada y el suministro continuo de oxgeno para mantener activa la
respiracin sensible al SHAM para la reoxidacin del NADH.
Un pH bajo para inactivar la glucosa oxidasa.

Figura 2 : Ruta de la produccin de citrato por Asspergilluus Nger

100

Fuente : Crueger, Manual de Microbiologa industrial, 1989

Capitulo 3 :PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO SINTETICO


A travs de procesos derivados de la fermentacin es posible obtener un numero amplio de compuestos
orgnicos derivados del anabolismo entre estos se destacan los Biopolmeros que son aplicados en
diferentes campos de la actividad humana por ejemplo : protena unicelular, enzimas, dextrano, pululano
y polihidroxialcanoatos entre otros.
Para fines prcticos en esta leccin nos centraremos en los polisacridos y en polihidroxialcanoatos
(PHAs).
Leccin 1: Polisacridos Microbianos y PHAs

Tradicionalmente, los polisacridos industriales se obtenan a partir de plantas y algas marinas.


Los polisacricos microbianos son una alternativa viable para substituir algunos de los productos
derivados de las plantas o de las algas pero tambin para utilizar las en un amplio rango de nuevas
aplicaciones industriales. La ingeniera gentica de algunos de estos organismos productores y/o la
regulacin de las condiciones medioambientales en las que se lleva a cabo la fermentacin brindan
la posibilidad de manipulacin de las propiedades y caractersticas del producto, ampliando por
tanto la diversidad de biopolmeros disponibles.

101

La goma xantano es el nico polisacrido microbiano obtenido por la fermentacin que representa
una parte significativa del mercado mundial. Su unidad repetitiva bsica consiste en un
pentasacrido que contiene glucosa, manosa, cido glucurnico, acetato y piruvato. Esta goma
tiene una viscosidad elevada a concentraciones bajas, que es estable en un amplio rango de pH y
es independiente de la temperatura y de la presencia de cationes. En solucin acuosa y combinada
con polisacridos de las plantas forma geles estables, por lo que se utiliza como estabilizante de
suspensiones y para controlar la viscosidad. Debido a sus propiedades pseudoplsticas,
combinadas con su estabilidad frente a la temperatura ya los cationes, se emplea como lubricante.
Tambin se utiliza junto con surfactantes e hidrocarburos para mejorar la recuperacin de aceites.
Los alginatos se obtienen a partir de algas marinas, aunque como esta fuente est sujeta a una
gran variabilidad, se ha considerado interesante a nivel industrial el substituirlos por polisacridos
similares obtenidos por fermentacin, por ejemplo el polisacrido de Azotobacter vinelandii. Entre
otros polisacridos microbianos de inters comercial se incluyen el pululano, producido por
Aureobasidium pullulans, el seleroglucano, producido por especies de Selerotium y el gelano,
producido por Pseudomonas elodea.

Los procesos destinados a la produccin de exopolisacridos microbianos se caracterizan por la


elevada viscosidad del medio de fermentacin. Las bajas concentraciones de producto obtenidas y
los cambios conformacionales del polmero ocurridos durante la fermentacin. El control de los
constituyentes del medio as como de otros parrnetros de la fermentacin es crtico para conseguir las velocidades de sntesis deseadas. Los estudios limitados realizados indican que la
modificacin del exopolisacrido mediante manipulacin del medio de cultivo parece influir en el
grado de polimerizacin ms que en la estructura real y en la composicin de la unidad repetitiva.

En el caso de la produccin de goma xantano, el contenido de piruvato como substityete se


puede hacer variar del O al 75 % mediante una seleccin adecuada de la cepa y el medio, lo que
puede influir en las propiedades reolgicas del polmero, cuando la concentracin del polmero
cambia o cuando se alteran la fuerza inica o la temperatura del medio. Algunos medios de
crecimiento para la produccin de xantano dan lugar a la formacin de mutantes 'que no producen
polisridos, aunque esto puede evitarse mediante una eleccin adecuada del medio limitando la
cantidad de nutriente para el crecimiento. En general, en la produccin de polisacridos
microbianos cargados debe controlarse el pH; por ejemplo, el pH ptimo para la produccin de
xantano es de 7.0 cesando el crecimiento y la formacin de producto a un pH de 5,5. A lo largo de
la fermentacin, las propiedades del caldo cambian, pasando de ser un fluido newtoniano con
viscosidad baja a ser un fluido no newtoniano con viscosidad alta, a medida que la concentracin
de exopolisacrido aumenta. Estos cambios influyen profundamente en el mezclado yen la
transferencia de masa y calor en la fermentacin, por lo que el diseo y las condiciones de
operacin del fermentador deben optimizarse ajustndose a estas condiciones reolgicas. La

102

concentracin final de xantano en los caldos de los fermentadores es de unos 50 g. 1

- 1

Y los

rendimientos, basados en la glucosa consumida, son del 50 al 60 %.


La mayora de las sntesis de exopolisacridos bacterianos se producen intracelularmente,
mediante la va de los azcares, activados con un nucletido. Los azcares se transfieren desde
el nucletido a un lpido transportador, activado por transferencia inicial de un azcar fosfato,
dando lugar a la formacin de la unidad repetitiva de azcar. El mtodo exacto de elongacin de
la cadena y de extensin del polisacrido es desconocido.
POLI - HIDROXIBUTIRATO (PHB)
La principal aplicacin potencial del poli--hidroxibutirato (PHB) es como substituto de los plsticos
en casos en los que sus propiedades de biodegradabi!idad representen una ventaja. La capacidad
de las bacterias para reoxidar el NADH llega a ser limitante a concentraciones bajas de oxgeno, y
entonces la reoxidacin da lugar a productos como el PHB, el etanol o el butano!. De esta forma el
PHB es acumulado como material de reserva por una amplia variedad de bacterias entre ellas
Alcaligenes eutrophus, que puede llegar a almacenar el 70-80 % de su biomasa como PHB.
En el PHB la unidad repetitiva o monmero, el -hidroxibutirato, se sintetiza a partir de dos
unidades de acetil CoA; el peso molecular ideal del polmero oscila entre 200.000 y 300.000. La
sntesis de PHB, adems de estar influida por la concentracin de oxgeno, se ve favorecida por la
limitacin del nitrgeno o el fsforo. El proceso de fermentacin para la produccin comercial de
PHB debera consistir probablemente en dos etapas, una de crecimiento, sin limitacin de oxgeno
o substrato, que acumule concentraciones altas de biomasa, y otra de formacin de producto en
condiciones ptimas de limitacin de nutrientes o Aunque la glucosa es Utilizada comnmente
como substrato por los A. eutrophus, comercialmente sera deseable la posibilidad de Utilizar
substratos ms baratos que redujesen de forma significativa los costos de produccin.
Actividades:

Investiga los procesos de produccin de cerveza y vino. Realice comparaciones relacionadas con:
Tipo de Microorganismos utilizados, Substratos y Procesos.
Investiga sobre metabolitos derivados del metabolismo intermedio y su aplicacin en la Industria
alimenticia.
Elabore un mapa conceptual que permita visualizar las diferentes aplicaciones de la Biotecnologa
en la industria alimenticia
Consulte un proceso Biotecnolgico, y realice un estudio de casos, a partir del proceso que se
desarrolla y sustntelo ante sus compaeros.

103

BIBLIOGRAFIA BASICA

1. Ayala Francisco. Evolucin molecular, Edicin Omega, Barcelona 1980


2. Burges A. Biologa del suelo. Edicin Omega S.A. Barcelona 1971
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Zaragoza, Espaa. 1989
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Universidad de la Habana. 1997
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