PREPARACIN DE LA MUESTRA POR INMUNOFLUORESCENCIA

A. Mtodos de conjugacin : Es posible conjugar las protenas en el suero completo o en

fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos.
Se debe aadir al suero un amortiguador de carbonato-bicarbonato para mantener
condiciones ptimas de pH (9.0), se agita en bao de hielo aadiendo fluorocromo en
un perodo de 15 minutos, se debe permitir una agitacin toda la noche ya que la
conjugacin es del orden del 100% en 24 horas.
Purificacin

del

conjugado: Se

logra

mediante

eliminacin

de

las

sales

amortiguadoras y los elementos utilizados como solventes del fluorocromo (acetona).

Se utiliza extraccin con carbn o filtracin en columna de sephadex para eliminar
las sustancias fluorescentes Que no reaccionaron lo cual puede ocasionar tincin
inespecfica.
C. Concentracin del Anticuerpo : Se logra mediante tratamiento con sales de amonio
saturado. El almacenamiento es el solucin salina amortiguada con fosfato a pH 7.1.
D. Preparacin de anticuerpos : Se obtienen mediante inmunizacin en animales, la globulina
humana se aplica en 2 o 3 inyecciones a intervalos de 3-4 semanas, la respuesta de
anticuerpos se mide mediante mtodos serolgicos y el suero se recoge 7-10 das luego de la
ltima inyeccin.

E. Manejo de cortes y tejidos : Los frotis y cortes montados que no se estudien de inmediato
se pueden proteger por sumersin en carbowax y almacenamiento a -20C. Los cortes
liofilizados protegidos con resina de poliester se pueden conservar varios meses en un
desecador

0C

sin

que

pierda

sus

antgenos.

Es preferible trabajar con cortes fijados ya que la tincin inmunofluorescente en cortes sin
fijar

se

acompaa

de

difusin

prdida

del

antgeno

adems

se

reduce

la

autoinmunofluorescencia tisular (vesculas y partculas). Se deben usar fijadores que no

alteren la estructura antgeno-anticuerpo, el ms empleado es alcohol etlico al 95% entre 430C, alcohol metlico, acetona o formol. Para bacterias es muy til la fijacin mediante
calor. La inclusin en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr una localizacin
ms precisa y una tincin ms viva que con cortes en congelacin.Se deben utilizar
colorantes que formen uniones con las protenas pero sin afectar los grupos de combinacin
especfica del anticuerpo. La reaccin de unin ocurre entre los grupos amino y carboxilo de
la protena y los grupos tiocianato o cloruro de sulfonilo de los colorantes. El fenmeno de
fijacin disminuye la fluorescencia de los fluorocromos de tal manera que los conjugados solo
muestran

de

15-30%

de

la

fluorescencia

del

colorante

libre.

El pH afecta la fluorescencia y por esta razn se debe trabajar a pH estable y adecuado

dependiendo del colorante : fluorescena (pH 8), rodamina (pH 7), DANS (pH 1.6-14).

1.
2.
3.
4.

lavar la muestra con PBS dos veces

fijar las clulas con 2 ml de solucin de paraformaldehdo al 4% durante 15 min.
lavar la muestra con PBS dos veces
permeabilizar las clulas mediante incubacin con 2 ml de 0,1% Triton X-100 en
PBS 15 min lavar tres veces con PBS
5. Se incuban las clulas con buffer durante 1 hora aadir el anticuerpo primario
(diluido en la solucin tampn)
6. Incubar a 4 | durante toda una noche
7. Dia 2. Lavar con solucin de pbs por 5 min.
8. Incubar las muestras con la fluresceina conjugada en el segundo anticuerpo a 4
durante una hora
9. Lavar nuevamente con pbs por 5 min.
10. Montar las muestras para su observacin
11. Realizar la observacin en el microscopio de fluorescencia.