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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

Tema 2. TOMA, MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS

Tipos de muestras

Recipientes de recolección

Variables que afectan a la toma de muestra

Transporte de muestras

Criterios para el rechazo de muestras

Estabilidad y conservación

Preparación de muestras para el análisis

Métodos de separación: centrifugación, precipitación, extracción, cromatografía y electroforesis

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

COAGULACIÓN SANGUINEA

Sangre entera : suspensión de células en una matriz de proteínas y sales denominada plasma

SUERO (parte líquida) 1. coagulación SANGRE ENTERA 2. centrifugación COÁGULO
SUERO
(parte líquida)
1. coagulación
SANGRE ENTERA
2. centrifugación
COÁGULO

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

TIPOS DE MUESTRAS

SANGRE

ORINA

OTROS LIQUIDOS ORGÁNICOS: Líquido cefalorraquídeo y amniótico

HECES

ASPIRADOS GÁSTRICOS

CÁLCULOS RENALES Y BILIARES

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

COAGULACIÓN SANGUINEA

Los coágulos de sangre se forman por interacción de aproximadamente una docena de proteínas denominadas FACTORES DE COAGULACIÓN que funcionan simultáneamente

denominadas F A C T O R E S D E C O A G U

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

COAGULACIÓN SANGUINEA

Factores de coagulación

PROTROMBINA TROMBINA FIBRINÓGENO FIBRINA Polimerización
PROTROMBINA
TROMBINA
FIBRINÓGENO
FIBRINA
Polimerización
REDES DE FIBRINA
REDES DE FIBRINA

Coágulo: Redes de fibrina + plaqueta + glóbulos rojos

Hemostasia: Propiedad de autosellado del sistema circulatorio

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RECIPIENTES DE RECOLECCIÓN

1. JERINGAS

2. TUBOS DE VACÍO:

*Stat (del latín statim=inmediatamente)
*Stat (del latín statim=inmediatamente)

3. OTROS RECIPIENTES DE RECOLECCIÓN

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TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

VARIABLES QUE AFECTAN A LA TOMA DE MUESTRA

 

Criterio para el rechazo de muestras

 

Variables diurnas

1. Inadecuada identificación

Postura del paciente

2. Recogida de volumen de sangre inadecuado

Estasis (acumulación de sangre sobre una constricción)

3. Utilización de tubos inadecuados

Hemólisis (pérdida de hemoglobina por parte de los eritrocitos)

4. Presencia de hemólisis

Conservación

5. Transporte inapropiado

Transporte

6. Presencia de interferentes

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ESTABILIDAD Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS

La alteración de muestras puede ser debida a:

1. Adsorción sobre las paredes del vidrio del recipiente

2. Evaporación de sustancias volátiles

3. Paso de agua de los hematíes al plasma (adición de anticoagulantes)

4. Alteraciones en la permeabilidad de los eritrocitos

5. Actividades metabólicas de hematíes y leucocitos (consumo de O 2 y producción de CO 2

6. Hidrólisis

7. Glucólisis

8. Fenómenos de autodegradación

9. Contaminación por bacterias u hongos.

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Conservantes químicos

1. SANGRE

1.1. Los que evitan transformaciones químicas: KF y yodoacetato

1.2. Los que tienen acciones antibacterianas:

timol / KF + monoclorobenceno / KF + monobromobenceno / Antibióticos

2. ORINA

Suelen añadirse agentes antibacterianos:

formaldehído / timol / ac. bórico / tolueno / cloroformo.

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ESTABILIDAD Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS

1. Alteración de la temperatura

2. Alteración del pH

3. Liofilización de muestras

4. Conservantes químicos

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PROCESADO DE MUESTRAS

1. OBTENCIÓN DE SANGRE ENTERA Y PLASMA

1. En ausencia de agentes químicos

2. En presencia de agentes químicos:

Heparina Sales de AEDT Oxalatos NaF Citrato sódico Polietanol-sulfonato sódico

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PROCESADO DE MUESTRAS

1. OBTENCIÓN DE SUERO. SEPARACIÓN POR CENTRIFUGACIÓN

1. Separadores de suero

2. Filtro tipo émbolo

2. PRECIPITACIÓN PARA LA ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS

Ultracentrifugación Absorción sobre sustancias como el caolín Combinación de las proteínas con los correspondientes anticuerpos Precipitación por desnaturalización por calor, pH adecuado Precipitación mediante procedimientos químicos

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

3. EXTRACCIÓN

3.1. Extracción líquido-liquido

- Extracción simple

- Extracciones múltiples

- Condiciones óptimas de extracción:

* Elección del disolvente

* Control del pH

* Control de la fuerza iónica

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PROCESADO DE MUESTRAS

PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS POR PROCEDIMIENTOS QUÍMICOS

Precipitaciones que dependen de la deshidratación de proteínas

- Por adición de disolventes miscibles

- Por fraccionamiento salino (“salting out”)

Precipitaciones que dependen de la formación de sales insolubles

- Precipitantes aniónicos: ácidos tungstico, tricloroacético, metafosfórico, perclórico,etc

- Precipitantes catiónicos: Hg 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ , combinaciones de Hg 2+ - Ba 2+ y de Ba 2+ - Zn 2+

Precipitación mediante adición de cloroformo

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 3. EXTRACCIÓN 3.1. Extracción líquido-liquido
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
3. EXTRACCIÓN
3.1. Extracción líquido-liquido de forma continua

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

3. EXTRACCIÓN

3.2. Extracción sólido-líquido de forma continua

disolvente
disolvente

Muestra

sólida

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PROCESADO DE MUESTRAS

4. CROMATOGRAFIA

Clasificación según la fase móvil y los aparatos físicos:

DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Clasificación según la fase mó vil y los aparatos

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

3.3. Extracción a contracorriente

3.4. Procesado de extractos

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Clasificación según el
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Clasificación según el mecanismo de separación de la fase estacionaria:

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

4. CROMATOGRAFIA

Diagrama de un sistema de cromatografía líquida:

Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Diagrama de un sistema de cromatografía líquida:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Cromatograma típico de
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4.
CROMATOGRAFIA
Cromatograma típico de un sistema de cromatografía líquida en columna:
t
R2
t
R1
t
M
V
(mL
0
1
2
3
4
t
(min)
Respuesta del detector
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Componentes básicos de
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4.
CROMATOGRAFIA
Componentes básicos de un equipo de cromatrografía gaseosa:

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PROCESADO DE MUESTRAS

4. CROMATOGRAFIA

Parámetros de retención:

Tiempo de retención (tr)

Tiempo muerto (tm)

Factor de retención o capacidad: k´= tr –tm tm

Selectividad o retención relativa: α = (tr) B - tm (tr) A – tm

Platos teóricos : N = 16 tr 2 w 2

N = 5.55 tr 2 2

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PROCESADO DE MUESTRAS

4. CROMATOGRAFIA

Parámetros de retención:

Factor de retención o capacidad: k´= tr –tm tm

tr tm
tr
tm
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Parámetros de retención:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4.
CROMATOGRAFIA
Parámetros de retención:
Platos teóricos : N = 16 tr 2
w 2
N = 5.55 tr 2
w½ 2
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Parámetros de retención:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4.
CROMATOGRAFIA
Parámetros de retención:
Selectividad o retención relativa: α = (tr) B - tm
(tr) A – tm
(tr) B
(tr) A
tm
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Parámetros de retención:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4.
CROMATOGRAFIA
Parámetros de retención:
Resolución: R =
t 2 – t 1
½ (w 1 +w 2 )

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PROCESADO DE MUESTRAS

4. CROMATOGRAFIA

Parámetros de retención:

Resolución: R =

t 2 – t 1

½ (w 1 +w 2 )

PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Parámetros de retención: Resolución: R = t 2 – t 1

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

4. CROMATOGRAFIA

Cuantificación usando un patrón interno: determinación de teofilina utilizando betahidroxietilteofilina como patrón interno

utilizando betahidroxietilteofilina como patrón interno Selección del patrón interno: • Debe estar

Selección del patrón interno:

Debe estar completamente separado de

otros picos

Debe ser eluído cerca de la sustancia

analizada

Debe comportarse de forma similar a la

sustancia analizado durante el pretratamiento de muestra

Debe tener una altura o área del orden de

un patrón en el intervalo de concentración

deseada

No debe estar presente en la muestra

Debe poder obtenerse comercialmente

Debe ser agregado en forma líquida

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PROCESADO DE MUESTRAS

4. CROMATOGRAFIA

Cuantificación usando un patrón externo:

Concentración del patrón externo Altura ó área de pico
Concentración del patrón externo
Altura ó área de pico

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

4. CROMATOGRAFIA

Cuantificación utilizando la adición estándar:

0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 y = 0,0411x + 0,0101 R 2 = 0,9995 0,01
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
y = 0,0411x + 0,0101
R 2 = 0,9995
0,01
0
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Absorbancia (u. A.)
Altura o área de pico

Cromo (mg/l)

Concentración de patrón añadida

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

4. CROMATOGRAFIA

Derivatización

derivatizante

producto

DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Derivatización derivatizante producto Derivatización de barbitúricos por tetrametilación

Derivatización de barbitúricos por tetrametilación

muestra

Agente
+

Nuevo

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4.
CROMATOGRAFIA
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 4. CROMATOGRAFIA Muestras para HPLC:
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
4. CROMATOGRAFIA
Muestras para HPLC:

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

5. ELECTROFORESIS

0. Definición

1. Fuerzas ejercidas sobre la partícula

2. Movilidad de una partícula

3. Efecto del pH sobre la movilidad

4. Electrolitos

5. Movimiento y conductividad de los iones

6. Otros factores que afectan a la movilidad:

carga y conformación Atmósfera iónica y potencial Z energía térmica: efecto de relajación efecto electroforético

7. Medios de soporte

8. Técnicas de aumento de la resolución

9. Métodos de separación en base al tamaño molecular

10. Métodos de separación en base al tamaño y la carga

11. Localización del compuesto de interés

12. Aplicaciones clínicas

13. Electroforesis capilar

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

5. ELECTROFORESIS

Aplicación de un campo eléctrico a una disolución iónica:

DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 5. ELECTROFORESIS Aplicación de un campo eléctrico a una disolución iónica:

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

5. ELECTROFORESIS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 5. ELECTROFORESIS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

5. ELECTROFORESIS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 5. ELECTROFORESIS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

5. ELECTROFORESIS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 5. ELECTROFORESIS
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 5. ELECTROFORESIS
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 5. ELECTROFORESIS PERSONA SANA PRESENCIA
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS
PERSONA SANA
PRESENCIA DE CIRROSIS
HEPÁTICA
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS PROCESADO DE MUESTRAS 5. ELECTROFORESIS CAPILAR
TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS
PROCESADO DE MUESTRAS
5. ELECTROFORESIS CAPILAR
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS
5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS

PROCESADO DE MUESTRAS

5. ELECTROFORESIS CAPILAR

Diámetro capilar 5µm Campo eléctrico 25 KV Detector electroquímico Capilar Neurona Serotonina 3µM Tiempo (min)
Diámetro capilar 5µm
Campo eléctrico 25 KV
Detector electroquímico
Capilar
Neurona
Serotonina 3µM
Tiempo (min)
Respuesta detector