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Trabajo N1.

Bioqumica II
Hematologa Bsica, ADN-ARN
Castillo, Yaviely;Centeno, Brbara

1. Introduccin
Al igual que otras ciencias biomdicas, en la ltima dcada la hematologa ha
presentado importantes avances, tanto en el campo de la fisiopatologa y diagnstico,
como tambin en las estrategias de tratamiento. Los problemas hematolgicos que
afectan a los seres humanos han sido estudiados por diversos grupos de hematlogos,
a lo largo de los ltimos 60 aos del siglo XX, en investigaciones fundamentalmente
clnicas. La hematologa se dedica al diagnstico y tratamiento de pacientes que
presentan enfermedades sanguneas, o cualquier tipo de cuadro clnico que puede ser
detectado mediante anlisis sanguneos [1].
Por otro lado, los cidos nucleicos, las protenas y los polisacridos son
biomolculas que en su conjunto realizan diversos procesos qumicos que constituyen
la materia viva. De ah la importancia e inters para los cientficos, del estudio de sus
propiedades y funciones. Cabe mencionar que estas sustancias existen en forma de
macromolculas, que son polmeros en los cuales cada tipo, est formado por la unin
de un nmero limitado de clases de unidades monomricas. Donde en cada caso la
secuencia de unidades es especfica. Existen dos tipos de acido nucleico que son: ADN
(cido desoxirribonucleico) y ARN (cido Ribonucleico) que actan como
depositarios y transmisores de la informacin gentica de cada clula, tejido y
organismo. As la informacin contenida en el ADN puede ser copiada por partes, en
molculas especficas de ARN denominadas ARN mensajeros (ARNm), este proceso se
denomina transcripcin y la informacin codificada en el ARNm es luego traducida en
una secuencia especfica de aminocidos que forman una protena. Este ltimo
proceso se denomina traduccin. El avance en el estudio de estas molculas ha sido
vertiginoso, encontrando hoy tecnologas aplicadas con nanomateriales, polmeros,
tecnologa PCR de amplificacin del ADN, entre otros [2, 3]

Trabajo N1. Bioqumica II


Hematologa Bsica, ADN-ARN
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2. Hematologa Bsica
La hematologa es la rama de la ciencia mdica que se encarga del estudio de los
elementos de la sangre y sus precursores, as como de los trastornos estructurales y
bioqumicos de estos elementos, que puedan conducir a una enfermedad [1].
En general las enfermedades sanguneas pueden afectar a al sistema
eritrocitario,

sistema

leucocitario,

hemostasia

hemopatas

malignas

(leucemias/linfomas, discrasias y otros) [4].


Las enfermedades de la sangre bsicamente, pueden afectar elementos celulares
(eritrocitos, plaquetas y leucocitos), plasmticos (inmunoglobulinas, factores
hemostticos), rganos hematopoyticos (mdula sea) y rganos linfoides (ganglios
linfticos y bazo). Debido a las diversas funciones que los componentes sanguneos
cumplen, sus trastornos darn lugar a una serie de manifestaciones que pueden
englobarse en diversos sndromes [1, 4].
De sta manera para comprender sta rama se debe conocer las definiciones
bsicas relacionadas a la sangre.
2.1 Sangre y sus componentes
Bsicamente la sangre est constituida por dos grupos;
-

Elementos Formes: son elementos semislidos y particulados en sta


categora entran las clulas sanguneas; glbulos blancos se originan en la
mdula sea mediante un complejo proceso de diferenciacin y maduracin
celular. En este proceso denominado hematopoyesis participan varios
factores de maduracin. Y tambin se encuentran los derivados celulares que
son los eritrocitos (glbulos rojos) y plaquetas [5].

El plasma sanguneo: un fluido traslcido y amarillento que representa la


matriz extracelular lquida en la que estn suspendidos los elementos

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formes. Este representa un medio isotnico para las clulas sanguneas, las
cuales sobreviven en un medio que est al 0,9 % de concentracin.

Fig. N1. Esquema de la Hematopoyesis para produccin de los


componentes de la sangre

Elementos Formes
Glbulos Rojos
Los glbulos rojos son clulas anucleadas que se forman en la mdula sea a
partir de stem cells. Una vez en la circulacin tienen como principal funcin
transportar oxgeno a los tejidos, tarea que desarrollan por aproximadamente 120
das, hasta que el sistema los retira de la circulacin. Los glbulos rojos tienen como
funcin principal y utilizando su protena ms abundante, la hemoglobina transportar
el oxgeno desde los pulmones a los tejidos
Glbulos Blancos
Los glbulos blancos o leucocitos incluyen linfocitos, granulocitos (neutrfilos,
eosinfilos y basfilos) y monocitos, que se forman en la mdula sea a partir de

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clulas pluripotentes, en un proceso finamente regulado y con la participacin de
diversas citoquinas y receptores para las mismas. Los leucocitos forman parte del
sistema inmune, el que se incluye entre los mecanismos biolgicos destinados a
mantener la organizacin estructural y funcional de los individuos y est
genticamente programado para la neutralizacin y eliminacin, tanto de agentes
infecciosos, clulas y molculas extraas [1]
Plaquetas
Son pequeas clulas que circulan en la sangre; participan en la formacin de
cogulos sanguneos y en la reparacin de vasos sanguneos daados. Las plaquetas
son producidas en el proceso de formacin de las clulas sanguneas llamado
(trombopoyesis) en la mdula sea, por fragmentacin en los bordes citoplasmticos
de los megacariocitos. Desempean un papel fundamental en la hemostasia
(mecanismos para la detencin de hemorragias en el organismo) y son una fuente
natural de factores de crecimiento. Estas circulan en la sangre de todos los mamferos
y estn involucradas en la hemostasia, iniciando la formacin de cogulos o trombos
[6].
Plasma Sanguneo
El plasma sanguneo es la porcin lquida de la sangre en la que estn inmersos
los elementos formes. Es salado y de color amarillento traslcido y es ms denso que
el agua. El volumen plasmtico total se considera como de 40-50 mL/kg peso. El
plasma sanguneo es esencialmente una solucin acuosa de composicin compleja
conteniendo 91% agua, y las protenas el 8% y algunos rastros de otros materiales
(hormonas, electrolitos, etc.). Estas protenas son: fibrgeno, globulinas, albminas y
lipoprotenas. Otras protenas plasmticas importantes actan como transportadores
hasta los tejidos de nutrientes esenciales como el cobre, el hierro, otros metales y
diversas hormonas. Los componentes del plasma se forman en el hgado (albmina y
fibrgeno), las glndulas endocrinas (hormonas), y otros en el intestino. Adems de

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vehiculizar las clulas de la sangre, tambin lleva los alimentos y las sustancias de
desecho recogidas de las clulas. El suero sanguneo es la fraccin fluida que queda
cuando se coagula la sangre y se consumen los factores de la coagulacin [4].

Fig. N2. Diagrama resumen de la composicin de la sangre.

2.2 Anlisis y recoleccin de muestras de sangre


El estudio de la sangre es fundamental en la etapa de diagnstico y control de la
evolucin en las enfermedades hematolgicas. Los procedimientos para los anlisis de
sangre son dependientes de la calidad de las muestras la cual debe ser recolectada,
identificada, transportada y almacenada adecuadamente para no provocar hemlisis
(desintegracin de los glbulos rojos) todo lo cual contribuir a un buen anlisis de la
muestra [7].
En primer lugar una muestra de sangre lleva algunos componentes para
preservar su constitucin, a continuacin se mencionan estos, juntos con otros
aspectos a tomar en cuenta para el anlisis y recoleccin de muestras [1].

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Anticoagulantes
Cuando la sangre se recibe en frascos sin anticoagulantes sta se coagula dentro
de los 5 a 10 minutos de recolectada la muestra. Luego se produce la retraccin del
cogulo liberndose el suero. Cuando se requiere obtener plasma (contiene los
factores de la coagulacin), estudiar algunas propiedades de la sangre total o analizar
algunos de sus componentes celulares es necesario agregar un anticoagulante. Es
importante el tipo de anticoagulante, la concentracin del mismo y la relacin
sangre:anticoagulante; cuando sta es no es correcta pueden ocurrir importantes
errores. Las sales de sodio o potasio son los tipos de anticoagulantes ms efectivos y
usados, puesto que no se produce hemlisis ni deformacin celular. Algunos de los
anticoagulantes ms usados [4]:
-

EDTA (cido Etilendeaminotetraactico): La coagulacin requiere de iones


calcio (Ca2+), por lo que su quelacin inhibe el proceso, uno de los agentes
quelantes ms utilizados es el EDTA, la concentracin recomendada es de 1 a
5 ppm [8].

Citrato de Sodio: Inhibe la coagulacin porque precipita de los iones calcio


La concentracin sugerida es de 109 mM y se debe usar en una relacin 9:1;
se utiliza en las pruebas de hemostasia [8].

Heparina: La inhibicin de la coagulacin la realiza aumentando


significativamente la velocidad de accin de la antitrombina III, inhibidor
natural de las serino-proteasas de la coagulacin, y causa menos hemlisis
que el EDTA concentracin recomendada es de 15 a 20 ppb [4].

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Fig. N3. Estructuras qumicas de anticoagulantes ms utilizados en la toma


de muestras de sangre [4].

Recoleccin de Muestras
Los tubos son los elementos ms usados para la recoleccin de muestras de
sangre. Estos pueden ser al vaco (aspiran automticamente la sangre) o no, de
plstico o vidrio, con o sin anticoagulante. Pueden diferenciarse por el color de la tapa
del tubo, segn si contienen o no anticoagulante y en el primer caso identifican el
anticoagulante; los colores usados internacionalmente son: rojo (sin anticoagulante),
lila (EDTA), celeste (citrato de sodio) [4].
Antes de la recoleccin de la muestra, el primer paso es una adecuada
identificacin del (los) tubo(s) en que se depositar la muestra; al menos debe incluir
el nombre y apellido del paciente, examen, y fecha [4].

2.2.1 Tipos de recoleccin


Entre los tipos de recoleccin ms comn podemos destacar:

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Puncin Venosa: la tpica puncin venosa, El material a usar en la puncin


venosa

debe

ser

estril

(jeringa

desechable).

tamao

de

las

El

agujas

depender de la cantidad de
sangre a recolectar y de la
edad
Fig. N4. Ilustracin de puncin venosa directa [8]

del

paciente;

una

combinacin de un nmero y

una letra indica el dimetro y longitud, as por ejemplo la ms usada 21G1


indica que la aguja tiene un dimetro de 21 mm y 4 cm de longitud. Se deben
descartar las zonas que presentan hematomas, quemaduras, cicatrices y
edema. Las posibles venas a puncionar deben ser evaluadas aplicando un
torniquete por un perodo no superior a 1 minuto, ya que un mayor tiempo se
asocia con hemoconcentracin. Antes de la puncin se debe limpiar la zona
elegida con un algodn impregnado en alcohol 70%, luego se debe fijar la vena
traccionando suavemente la piel, introducir la aguja en el mismo sentido de la
vena y liberar inmediatamente el torniquete; la sangre debe ser aspirada
suavemente. Luego se retira la jeringa y con un algodn se presiona el lugar de
puncin para evitar sangramiento. Antes de depositar la sangre en el tubo se
retira la aguja, la sangre se agrega lentamente por las paredes del tubo. Luego
de tapar sta (si no es al vaco) y si la sangre fue recolectada en un tubo con
anticoagulante, se mezcla inmediatamente por inversin en forma suave, para
evitar alteraciones y dao celular [8, 4].

Puncin Capilar: Cuando por diversas razones no se puede realizar la puncin


venosa o la cantidad de la muestra
requerida

es

pequea,

se

puede

obtener sangre por puncin capilar. La


sangre capilar es obtenida por una
Fig. N5. Ilustracin de puncin capilar y
sitios adecuados para la puncin en pie y
mano [8]

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puncin con una lanceta; en adultos y nios el lugar a eleccin es la parte
lateral de un dedo de la mano y en recin nacidos es la parte lateral de la planta
del pie. Se debe hacer una puncin fuerte y certera, se elimina la primera gota
de sangre y para tener una adecuada recoleccin se debe presionar muy
suavemente, evitando la salida de lquido tisular [8, 4].

2.2.2 Almacenamiento y transporte de muestras de sangre


Dentro de la primera hora de tomada la muestra de sangre los cambios en las
clulas sanguneas son imperceptibles; stos se hacen ms importantes a partir de las
tres horas hasta completarse a las 8 horas, a temperatura ambiente. Las alteraciones
incluyen: leucocitos, desintegracin de los glbulos rojos, incremento del hematocrito,
y tambin alteracin del tamao y distribucin de las plaquetas. Todas estas
alteraciones son evitables si la muestra de sangre se almacena a 4C [1].
Cuando una muestra de sangre va a ser transportada se deben tomar
precauciones para evitar las alteraciones descritas; aunque el transporte se realice
entre lugares cercanos se aconseja hacerlo en contenedores refrigerados [8].
Las condiciones para las pruebas de coagulacin son ms exigentes que para
anlisis regulares de sangre [1].

2.2.3 Tincin de May Grnwald-Giemsa


Es una tcnica de tincin derivada del mtodo de Romanowsky que se utiliza
principalmente para el coloreo de muestras de frotis (extendido de sangre sobre un
portaobjeto) sanguneos o extendidos de mdula sea. Emplea dos soluciones
colorantes [8]
La solucin de May-Grnwald, que contiene el colorante ninico eosina y el
colorante catinico azul de metileno ambos disueltos en metanol. La solucin de
Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y una serie de productos de la oxidacin

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de este ltimo tales como el azur A, el azur B, el violeta de metilo y el azul de metilo
[8].
Todos estos colorantes se encuentran en estado no ionizado mientras se
mantienen en solucin de alcohol metlico, pero al aadir agua se ionizan y se unen
selectivamente a los constituyentes celulares precipitando como sales insolubles. Los
componentes celulares de naturaleza aninica (cida) se unen selectivamente a los
tintes catinicos tindose en variados tonos de azul. Estos componentes son
llamados basfilos: (ADN, mitocondrias, ribosomas y citoplasma de clulas ricas en
ARN). Los componentes celulares de naturaleza catinica (bsicos) se unen
selectivamente al tinte cido eosina, tiendose en variados tonos de naranja y rojo. A
estos elementos se los denomina acidfilos o eosinfilos. Este es el caso de la
hemoglobina, y de las protenas contenidas en las granulaciones de los granulocitos
eosinfilos. Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de
colorantes se denominan neutrfilos y se tien en variados tonos de violeta [1].

Fig. N6. Tincin May Grnwald-Giemsa

2.3 Hemograma
El hemograma es un examen hematolgico fundamental. El estudio cuantitativo
y citolgico de las clulas sanguneas, permite avanza significativamente en la mayora
de las

enfermedades hematolgicas, en que los glbulos rojos, leucocitos y/o

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plaquetas se ven afectados, ya sea por la falta de produccin en la mdula sea o por
destruccin perifrica. En la actualidad, se recomienda expresar los resultados de los
parmetros biolgicos de acuerdo con el llamado sistema internacional de unidades
[1].
La forma clsica de expresar el hematocrito (Hto) en porcentaje (%) ha sido
substituida por las unidades correspondientes de acuerdo con el sistema SI. Debido a
que el Hto corresponde a la relacin existente entre el volumen de hemates y el de
sangre total, su unidad resulta de un cociente entre dos unidades de volumen
idnticas (L/L), por lo que equivale a 1. De acuerdo con ello, un Hto de 45%
corresponde segn el sistema SI a 0.45 L/L o simplemente 0,45 [4, 8].
La de hemoglobina es el parmetro hematolgico cuya forma de expresin ha
sido ms discutida. As mientras se ha preconizado expresarlo en milimoles por litro
(mmol/L), todava se considera aceptable hacerlo en gramos por litro (g/L). La
variacin del nuevo valor con respecto al de concentracin de hemoglobina expresada
en unidades clsicas (g/dL) [4].

Tabla N1. Ejemplo de un hemograma [4]

La informacin cualitativa y cuantitativa que proporciona el hemograma


podemos separarla en globulos rojos y blancos.

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Glbulos rojos

El hematocrito corresponde al volumen de glbulos rojos expresado


porcentualmente respecto a un volumen de sangre; de esta forma provee
un valor estimativo del grado de anemia. El valor del hematocrito se
obtiene por centrifugacin de sangre anticoagulada. El procedimiento es
simple y reproducible. Brevemente, a un capilar (7.5 cm x 1 mm), se
agrega sangre anticoagulada con EDTA y luego de sellar un extremo se
centrifuga (5 min. a 12.000 r.p.m). Realizado el procedimiento sepueden
distinguir tres capas: glbulos rojos,buffy coat (glbulos blancos y
plaquetas), y plasma. El porcentaje de hemates (hematocrito), se obtiene
a partir de una tabla graduada [8, 1].

La funcin primordial de la hemoglobina, principal protena de los


glbulos rojos, es transportar el oxgeno y el dixido de carbono hacia y
desde los tejidos, respectivamente. Su determinacin ayuda a establecer
el grado de la anemia. Para determinar la concentracin de la
hemoglobina

en

la

sangre,

se

utiliza

el

mtodo

de

la

cianmetahemoglobina (HiCN), recomendado por el International


Committee for Standarization in Hematology (ICSH). Brevemente, la
sangre es diluida con el reactivo de Drabkin (incluye ferricianuro de
potasio y cianuro de potasio). Todos los tipos de hemoglobina son
oxidadas por el ferricianuro de potasio a metahemoglobina, que en
presencia de ferricianuro de potasio forma un compuesto estable,
cianmetahemoglobina. Para determinar la concentracin de las muestras
se debe interpolar en una curva de calibracin previamente preparada
usando un estndar [8, 1].

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La relacin entre hematocrito y hemoglobina o recuento de glbulos


rojos permite obtener ndices que ayudan a clasificar las anemias segn el
tamao y cromia de los glbulos rojos. Las constantes ms usadas son
Volumen Corpuscular Medio (VCM) y Concentracin de Hemoglobina
Corpuscular Media (CHCM) [8].

Hay tambin otras anomalas de tipo cualitativas, como cambio en la forma o en


el color de los glbulos y a la presencia de agentes extraos en su estructura.
Glbulos blancos
Las alteraciones que pueden presentar los leucocitos en el hemograma son de
dos tipos, cuantitativos y cualitativos (citolgicos).

El recuento normal de leucocitos flucta entre 5.00010.000/L y en


recin nacidos entre 15.000-20.000/L.

El extendido o frotis sanguneo, es un elemento muy importante en la


realizacin del hemograma. Es posible obtener informacin con respecto
a la morfologa de las tres series sanguneas glbulos rojos, leucocitos, y
plaquetas. Adicionalmente, el citohematlogo experimentado puede tener
una apreciacin sobre aspectos cuantitativos: ndices hematolgicos,
recuento de leucocitos y recuento de plaquetas [8].

3. Citometra Hemtica
Se refiere a la medicin de las clulas de la sangre (citos = clulas; metro =
medida). La interpretacin correcta de ste anlisis permite establecer diagnsticos
definitivos sobre las enfermedades sanguneas. La evaluacin correcta de los
parmetros citomorfolgico de la citometra hemtica completa (CHC) ofrece
informacin acerca de los padecimientos primarios del tejido hematopoytico, y de

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otros trastornos no hematolgicos y permite ampliar la variedad de diagnsticos
diferenciales [9, 10].
Consta de 2 partes;
1.- Frmula roja: Determina los parmetros relacionados con los eritrocitos.
2.- Frmula blanca: Determina los parmetros relacionados con los leucocitos.
La biometria hematica completa generalmente incluye los siguientes
componentes [11]:
-

Recuento de leucocitos

Recuento diferencial leucocitario

Conteo de glbulos rojos (RBC o recuento de eritrocitos)

Hematocrito (Hct) o valores normales de hemoglobina (HBG)


-

El volumen corpuscular medio

Hemoglobina corpuscular media (promedio en cantidad de la

hemoglobina en los glbulos rojos)


-

La concentracin media de hemoglobina corpuscular (la

concentracin media de hemoglobina en un volumen dado de sangre).


-

El recuento de plaquetas:

El volumen medio de plaquetas (MPV) es una medida que

describe el tamao medio de las plaquetas en la sangre [4].


Las tcnicas para realizar stas mediciones van desde tcnicas instrumentales
como espectrofotometra, utilizando de colormetros, entre otras. A continuacin se
describen algunas tcnicas relacionadas.

3.1 Determinacin de Hematocrito


Puede determinarse por mtodos manuales o mtodos automticos. Los
mtodos manuales consisten en la centrifugacin de la muestra de sangre y los

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mtodos automticos pueden basarse en el clculo de estos a partir de valores de
VCM, o el anlisis de la sombra que produce la poblacin eritrocitaria, al reflejarse en
un campo oscuro [8].

3.2 Determinacin de Leucocitos


La sangre anticoagulada se deposita en un
lquido que permite evidenciar los leucocitos,
mantenindolos visibles. La cmara de Neubauer es
una cmara de contaje adaptada a un microscopio de
campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
porta-objeto con una depresin en el centro, en el
fondo de la cual, con la ayuda de una punta diamante,
se ha marcado una cuadricula [8, 11].

Fig. N7. Identificacin de reas para el conteo


de eritrocitos y leucocitos.

4. ADN y ARN
Los cidos nucleicos son los componentes ms fundamentales de la clula viva.
Parece probable que la vida en s empezara su evolucin con los cidos nucleicos,
puesto que stas son las nicas sustancias biolgicas que poseen la propiedad de
autoduplicacin. Hoy en da, los cidos nucleicos actan como depositarios y
transmisores de la informacin gentica de cada clula, tejido y organismo. Existen
dos tipos de cido nucleico el ARN (cido ribonucleico) y el ADN (cido
desoxirribonucleico). Cabe mencionar que estas estructuras son tan importantes que
Los planos para la construccin de un organismo estn codificados en su cido

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nucleico [2, p. 95] en molculas de gran tamao como la que se muestra en la Fig. N
8.

Fig.N8. ADN de un solo cromosoma humano [18]

Gran parte del desarrollo fsico de un organismo a lo largo de su vida est


programado en estas molculas. Las protenas que elaboran sus clulas y las funciones
que realizarn estn todas registradas en esta cinta molecular [2]. Por ello el estudio
de sus propiedades, de su estructura, entre otras caractersticas, ha sido de gran
inters para la ciencia, a continuacin brevemente se har un recuento de la
investigacin evolutiva de estas estructuras ADN y ARN hasta la actualidad.
Desde finales de los aos 50 y la dcada de los 60, los investigadores en busca
del origen de la vida admiten cada vez ms la naturaleza especfica y compleja de la
vida unicelular y de las biomacromolculas de las que dependen esos sistemas.
Adems, estos investigadores han caracterizado esta complejidad y especificidad en
trminos de informacin. Haciendo referencia al ADN, ARN y a las protenas como
portadores o depsitos de informacin. Infiriendo que la vida se origino de la
informacin contenida en estas biomacromolculas [12].
Durante gran parte del siglo XX, ya los investigadores conocan la composicin
qumica del ADN, saban que adems de fosfatos, el ADN se compona de cuatro bases
nucleotdicas diferentes, llamadas adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C), y
que el ARN difera con respecto al ADN en que la T estaba reemplazada por (U)
uracilo, en la Fig. N9, se muestra las estructuras de las unidades monomricas del
ADN Y ARN. En 1909, el qumico P. A. Levene propuso que las cuatro bases

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nucleotdicas siempre se daban en cantidades iguales dentro de la molcula de ADN.
l formul lo que llam la hiptesis tetranucleotdica, luego est ms tarde result
incorrecta [12].

Fig.N9. Estructuras qumicas [2]

Como consecuencia esta concepcin comenz a cambiar a mediados de los aos


40 por varias razones. En primer lugar, los famosos experimentos de Oswald Avery
fueron cruciales ya que apuntaron al ADN como material gentico, debido a que los
estudios sobre cepas virulentas y no virulentas de Pneumococcos identificaron el ADN
como un factor clave a la hora de explicar las diferencias hereditarias entre distintas
estirpes bacterianas. En segundo lugar, Erwin Chargaff, de la Universidad de
Columbia, a finales de los aos 40 puso en duda la hiptesis tetranucleotdica.
Chargaff demostr, en contradiccin con los primeros trabajos de Levene, que las
frecuencias de nucletidos difieren realmente entre especies, incluso cuando a
menudo dichas frecuencias se mantienen constantes dentro de las mismas especies o
dentro de los mismos rganos o tejidos de un nico organismo [2, 12]
Y por ltimo mediante estos experimentos se haba llegado a la conclusin de
que el ADN era una sustancia gentica, surgiendo as nuevas preguntas, Cmo podra
transmitir esa informacin a la clula?, Esta respuesta fue encontrada tras el

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descubrimiento de la estructura tridimensional del ADN por Watson y Crick en 1953.
El modelo propuesto por Watson y Crick conceba una estructura de doble hlice
para explicar la forma de cruz de Malta de los patrones obtenidos por los estudios del
ADN realizados por Franklin, Wilkins y Bragg a comienzos de los aos 50 mediante
cristalografa de rayos X en la Fig. N10 , se muestra una fotografa de difraccin de
rayos X producido por fibras de ADN hmedas [2, 12]

Fig.N10. Pruebas sobre la esctructura del ADN [2]

De acuerdo con el modelo de Watson y Crick, ahora bien conocido, las dos
hebras de la hlice estaban hechas de molculas de azcar y fosfato unidas por enlaces
fosfodister. Las bases nucleotdicas estaban unidas horizontalmente a los azcares en
cada una de las hebras de la hlice y a una base complementaria de la otra hebra para
formar un peldao interno en una escalera torsionada. Por razones geomtricas,
su modelo requera el apareamiento (a lo largo de la hlice) de adenina con timina y
de citosina con guanina [12]
Estos descubrimientos pronto demostraron que las secuencias de ADN no solo
eran muy complejas sino tambin altamente especficas en lo relativo a sus
requerimientos biolgico-funcionales. El descubrimiento de la complejidad y la
especificidad de las protenas haban llevado a los investigadores a sospechar un
papel funcional especfico para el ADN. La estructura del ADN descubierta por Watson
y Crick sugera un medio por el que la informacin o la especificidad podan
codificarse a lo largo de la espiral del esqueleto de azcar-fosfato. Su modelo sugera
que las variaciones en la secuencia de bases nucleotdicas pudieran encontrar

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expresin en la secuencia de aminocidos que forman las protenas. La hiptesis de
secuencia sugera que las bases nucleotdicas en el ADN funcionaban como letras de
un alfabeto o caracteres en una mquina de codificar. Del mismo modo como las letras
de un alfabeto en un lenguaje escrito pueden realizar la funcin de comunicacin
dependiendo de su secuencia, igualmente podran las bases nucleotdicas del ADN
originar la produccin de una molcula funcional de protena dependiendo de su
preciso ordenamiento secuencial [2, 12]
Por otro lado los cidos nucleicos mencionados anteriormente ADN y ADN estn
involucrados en la sntesis de protenas o expresin gnica la cual consista en
primer lugar en la copia de largas cadenas de bases nucleotdicas durante un proceso
conocido como transcripcin. Es decir, para que la informacin contenida en el ADN
pueda ser utilizada por las clulas debe transcribirse a una molcula de ARN, donde la
molcula de ARN se copia fielmente a partir de la molcula de ADN. La copia
resultante, un transcrito, fabrica una hebra sencilla de ARN mensajero que ahora
contena una secuencia de bases de ARN que refleja con precisin la secuencia de
bases de la hebra original de ADN. El transcrito es entonces transportado hasta un
orgnulo complejo denominado ribosoma. En el ribosoma, el transcrito es traducido
con ayuda de molculas adaptadoras altamente especficas (llamadas ARNtransferentes) y de enzimas especficas (llamadas aminoacil ARNt sintetasas) para
producir una cadena de aminocidos en crecimiento [12]
Se puede inferir de lo antes mencionado que un gen est compuesto, por una
secuencia lineal de nucletidos en el ADN, dicha secuencia determina el orden de los
aminocidos en las protenas. Sin embargo el ADN no proporciona directamente de
inmediato la informacin para el ordenamiento de los aminocidos y su
polimerizacin, sino que lo hace a travs de otras molculas, los ARN.
Como se ha mencionado anteriormente, la ciencia ha seguido una investigacin
constante acerca de estas biomolculas como son el ADN, ARN y las protenas, por
nombrar algunas de las tecnologas que se estn utilizando actualmente, se

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encuentran:

seguimiento

ptico

de

nanopartculas

de

slice

modificado

orgnicamente, como vehculos de ADN: Un enfoque no viral de la nanomedicina para


la entrega de genes [13]. Estudio de Nanoparticulas bioconjugadas para la proteccin
del ADN de escisin, la ingeniera gentica ha trado consigo nuevos retos y
oportunidades para la medicina y la investigacin biomdica. Sin embargo, la
ingeniera gentica la tecnologa est limitada en las manipulaciones de ADN porque
sus hebras se escinden en entornos celulares. Aunque se han tomado algunas medidas
para proteger el ADN de la escisin, tales como la adicin de inhibidores en soluciones
de ADN y este atrapado en liposomas, estos mtodos pueden dificultar an ms la
manipulacin de ADN, por ello los nanomateriales con propiedades nicas como gran
superficie de rea, estructura de poros, efecto encajado, y el efecto del tamao; han
sido utilizados con eficacia en bioanlisis y la administracin de frmacos. Es por lo
tanto que utilizando estos se espera puedan proteger a las secuencias de ADN
incrustados debido a sus grandes estructuras de superficie y poros [14], la Fig. N11,
muestra una micrografa correspondiente a las nanoparticulas utilizadas en este
estudio.

Fig.N11. Imagen TEM de las nanopartculas de slice modificada


con amino (45 4) nm [14]

Otras investigaciones utilizan dendrmeros que forman complejos con el ADN en


la utilizacin de vectores no virales en la liberacin de material gentico. Los
dendrmeros

son

polmeros

que

presentan

estructuras

con

dimensiones

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nanomtricas, baja polidispersin y una alta densidad funcional en la superficie con
un pequeo volumen molecular. La Fig. N12 muestra un esquema del mecanismo de
accin del complejo dendrmero-plsmido ADN el cual se inicia con una interaccin
entre el complejo y la membrana celular
seguida de una endocitosis dependiente de
energa. El ADN o el complejo debe salir de la
cavidad endosmica-lisosmica, sin que se
produzca la degradacin cida o enzimtica,
y alcanzar el ncleo en donde se produce la
transcripcin sobre el mRNA y ste en el
citosol codifica la protena teraputica [15, 16]

Fig.N12. Representacin esquemtica


de la internalizacin celular de
plsmidos asociados a dendrmeros y
transcripcin de la protena teraputica.

4.1 Tecnologa (PCR) para generar copias de secuencias de ADN


Las tcnicas de biologa molecular actuales estn basadas en la manipulacin y
deteccin de gran nmero de molculas y los pasos para realizar proyectos consisten
en la amplificacin de secuencias de ADN [17].
Tradicionalmente, la amplificacin del ADN se ha realizado in vivo, mediante un
proceso conocido de forma genrica como clonacin. sta abarca la manipulacin,
replicacin del ADN y la transformacin de clulas con dicho ADN, hasta alcanzar un
nmero suficiente que permita su estudio por las tcnicas clsicas [17].
Sin embargo estos estudios presentan como desventaja que con llevan procesos
muy laboriosos. Actualmente se ha empleado como tecnologa la amplificacin de ADN
mediante nuevos mtodos de secuenciacin como lo es la llamada Reaccin en Cadena
de la Polimerasa (PCR; del ingls, Polymerase Chain Reaction). Se puede considerar
la PCR como una clonacin in vitro, ya que se puede amplificar en un tubo de ensayo

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una secuencia de DNA determinada muchas veces y adems en un tiempo mnimo de
horas o incluso minutos. La PCR puede sustituir a la clonacin in vivo clsica en
muchos casos, siendo en otros un aliado esencial para simplificar el proceso e
incrementar la probabilidad de xito [17, 18].
Abarcando un poco de historia en 1985, el qumico Kary Mullis desarroll la
tcnica PCR permitiendo la amplificacin exponencial de una molcula de ADN,
generando millones de copias de un fragmento. Esto se lleva a cabo con
oligonucletidos que contienen un grupo extremo 3 libre, que es complementario con
la cadena molde de ADN. Los oligos funcionan como punto de inicio para la adicin
de nucletidos y para copiar la cadena molde en el PCR. Una vez que el
oligonucletido se une a su blanco, la polimerasa de ADN puede seguir extendiendo la
hebra complementaria. En una reaccin tpica de PCR se usan dos oligonucletidos
que flanquean la regin de ADN que se desea amplificar. El nmero de copias del
fragmento de ADN que se encuentra entre los dos oligonucleotidos se amplifica con
varios ciclos de reaccin. Cada ciclo de una reaccin de PCR consta de tres pasos,
como se muestra en la Fig. N13. Estos tres pasos de desnaturalizacin, hibridacin y
polimerizacin se repiten n veces, duplicndose en cada ciclo el nmero de cadenas
delimitadas por los oligos [18].

Fig.N13. Ciclo de reaccin de PCR [18].

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4.1.1 Pasos del mtodo de secuenciacin PCR
-

Desnaturalizacin: El templado es el fragmento de ADN que se desea


amplificar, junto con la regin que reconocen los oligonucletidos. Para que
el oligonucletido se pueda unir, es necesario que el templado sea de cadena
sencilla (9 pg. 23). Es decir, este paso es para separar las cadenas de ADN,
esto se consigue incrementando la temperatura, con una incubacin breve
del tubo de reaccin a 94 C [17].

Hibridacin o apareamiento de los oligos al DNA molde. Para ello se baja la


temperatura de reaccin, de forma que pequeas secuencias de ADN se unan
a sus secuencias complementarias [17, 18].

Extensin de la cadena de ADN: Se consigue elevando la temperatura de


reaccin normalmente a 72C, la cual es ptima para la polimerasa de DNA.
En este paso, la polimerasa extiende la cadena complementaria del templado.
La sntesis de la cadena complementaria tiene como punto de inicio el
complejo oligonucletido/templado. El tiempo de incubacin de este paso
depende del tamao del segmento que se desea amplificar. El resultado son
dos hlices completas Watson & Crick en la regin delimitada por los oligos.
Por lo cual se puede inferir que se duplica el nmero inicial de molculas de
ADN [17, 18].

Actualmente esta tcnica tiene gran importancia en biologa molecular para


amplificar secuencias de ADN que luego son fcilmente clonadas y/o secuenciadas.
Asimismo, tiene otras mltiples y muy interesantes aplicaciones. Por ejemplo, para
generar mutaciones aleatorias o dirigidas; identificar genes expresados de forma
diferencial; rastrear rpida y eficientemente bibliotecas gnicas; construccin de
bibliotecas sustractivas de cDNA (subtractive cDNA libraries); secuenciar mediante
secuenciacin cclica; entre otras [17].

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5. Conclusiones
La Hematologa es una rama esencial para el desarrollo en el diagnstico de
enfermedades y anomalas relacionadas con la sangre, el fluido ms importante,
despus del agua, en nuestro cuerpo; por tanto su estudio conlleva a una mejor
comprensin de todos los parmetros y variables relacionados con la sangre.
Obtener herramientas para la interpretacin de los hemogramas es otra parte
fundamental de los estudios en hematologa, as como las tcnicas analticas
necesarias para el anlisis cuantitativo y cualitativo de las diferentes clulas que
componente la sangre, todo esto mediante la citometria hemtica, o biometra
hemtica completa
Otra parte importante de nuestro funcionamiento como seres humanos, a parte
de los fluidos sanguinos, son las protenas, las funciones de stas en nuestro
organismo son de suma importancia y vienen dictadas por las secuencias de
aminocidos, y estas a su vez dependen de la secuencia de bases de ADN, ya que las
secuencias de las regiones codificantes del ADN poseen un alto grado de especificidad.
El ADN se copia a ARN en un proceso que se llama "transcripcin", se puede
inferir que transcribe un texto, es decir lee y lo copia, pero no se copia a otra molcula
de ADN sino a una molcula de ARN. Estas molculas, luego, van a ser "ledas" por un
ribosoma, en un proceso llamado "traduccin".

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6. Bibliografa
[1] J. San Miguel y F. Sanchez-Guijo, Hematologia: Manual Basico Razonado,
Barcelona: Elsevier, 2009.
[2] C. Mathews, K. Holde y A. K, Bioqumica, Espaa: Pearson, 2008.
[3] J. A. Mndez Aranguren y colaboradores, Los microsatlites (STRs), marcadores
moleculares de ADN por excelencia para programas de conservacin: una
revisin, vol. 13, n 1, pp. 30-42, 2005.
[4] J. Palomo, J. Pereira y J. Palma, Hematologia: Fisiopatologia y Diagnostico, Talca:
Editorial Universidad de Talca, 2009.
[5] R. Tallitsch, M. Frederic y T. Michael, Human anatomy, San Francisco:
Pearson/Benjamin Cummings, 2006.
[6] J. Pereira, Estructura, produccin, cintica y funcin de las plaquetas, de
Fisiologa de la sangre, Universitaria, 1993.
[7] J. Henry, Clinical diagnosis and managementby laboratory methods, Philadelphia:
WB Saunders, 1996.
[8] E. Anne, Clinical Hematology principles, procedures, correlations, Ed. Lippincott
Williams & Wilkins, 1998.
[9] R. Argelles, Capitulo 2: Citometria Hematica, de Fundamentos de Hematologia,
Barcelona, Editorial Medica Panamericana, 2009, pp. 13-32.
[10] R. Monrroy y Y. Ortiz, Semiologa de la citometria hematica, Revista de la
Facultad de Medicina de la UNAM , vol. 53, n 4, pp. 36-43, 2010.
[11] R. Argelles, Fundamentos de Hematologia, Barcelona: Editorial Medica
Panamericana, 2009.
[12] S. C. Meyer, El ADN y el Origen de la Vida: Informacin, Especificidad y
Explicacin.
[13] R. Indrajit y colaboradores, Optical tracking of organically modified silica
nanoparticles as DNA carriers: A nonviral, nanomedicine approach for gene
delivery, vol. 102, n 2, pp. 279-284, 2005.
[14] H. Xiao-xiao y colaboradores, Bioconjugated Nanoparticles for DNA Protection
from Cleavage, vol. 125, n 24, 2003.
[15] V. Jato y J. Luis, NANOTECNOLOGA FARMACUTICA: UNA GALNICA
EMERGENTE, 2006.
[16] S. L. Pal y colaboradores, Nanoparticle: An overview of preparation and

25

Trabajo N1. Bioqumica II


Hematologa Bsica, ADN-ARN
Castillo, Yaviely;Centeno, Brbara
characterization, vol. 1, n 6, pp. 228-234, 2011.
[17] G. D. Prez, Amplificacin de DNA mediante PCR (Reaccin en Cadena de la
Polimerasa).
[18] R. Campion De Necochea, Mtodfos Fisicoqumicos en Biologa: Secuenciacin
de cidos Nucleicos, 2004.

26

Contenido
1. Introduccin ........................................................................................................................................ 1
2.

Hematologa Bsica .......................................................................................................................... 2


2.1

Sangre y sus componentes..................................................................................................... 2

2.2

Anlisis y recoleccin de muestras de sangre ................................................................ 5

2.2.1

Tipos de recoleccin ........................................................................................................ 7

2.2.2

Almacenamiento y transporte de muestras de sangre ...................................... 9

2.2.3

Tincin de May Grnwald-Giemsa ............................................................................. 9

2.3
3.

4.

Hemograma .............................................................................................................................. 10

Citometra Hemtica .................................................................................................................... 13


3.1

Determinacin de Hematocrito ........................................................................................ 14

3.2

Determinacin de Leucocitos ............................................................................................ 15

ADN y ARN ........................................................................................................................................ 15


4.1

Tecnologa (PCR) para generar copias de secuencias de ADN ............................ 21

4.1.1

Pasos del mtodo de secuenciacin PCR .............................................................. 23

5.

Conclusiones .................................................................................................................................... 24

6.

Bibliografa........................................................................................................................................ 25

Trabajo N1. Bioqumica II:


Hematologa Bsica
ADN
ARN

Profesor(a)
- Lic. Carolina Prez

Realizan:
- T.S.U Castillo, Yaviely
- T.S.U Centeno, Brbara

16 de enero de 2015