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PROYECTO DE INVESTIGACIN

I DATOS GENERALES
1.1 Ttulo:
FRECUENCIA DE MICROORGANISMOSPRODUCTORES DE
BETALACTAMASAS

DE

ESPECTRO

EXTENDIDO

(BLEE)

EN

LOS

PACIENTES DEL SERVICIO DE UCI DEL HOSPITAL ELEAZAR GUZMN


BARRN DURANTE LOS MESES DE ABRIL- JUNIO DEL AO 2014.

1.2 Personal Investigador:


1.2.1 Autores:
Baluis Fernandez Josselin
Cueto Mogrobejo Luisa
Cotrina Haro Susan
Silva Colquicocha Aracely
Zelaya Vergaray Jessenia
1.2.2 Asesor:
Jos Villanueva Carlos.
Centro de Estudios:
Universidad San Pedro Facultad de Medicina- EAP Farmacia y
Bioqumica.
1.4 rea De Investigacin
- Ciencias de la salud.
1.5 Tipo De Investigacin

1.5.1 De acuerdo al fin que persigue: Aplicada


1.5.2 De acuerdo a su naturaleza: Descriptiva.
1.6 Localidad Donde Se Desarrolla El Proyecto:
1.6.1

Localidad:

Distrito

Nuevo

Chimbote

Provincia

Departamento: Ancash.
1.6.2 Comunidad:Nuevo Chimbote

2. MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO


EQUIPOS:
- Autoclave
- Estufa de cultivo
- Mechero

MATERIALES:
- Guantes
- Mascarilla
- Placas Petri
- Asa bacteriolgica
- Cinta adhesiva
-

Medios de cultivo
Agar McConkey agar comn, medio Mueller Hinton
Discos de:
Piperacilina / tazobactam
Ticarcilina / cido clavulnico
Tubos de ensayo estriles
Trulas estriles (de madera con algodn hidrfilo)
Pinzas estriles
Regla graduada en mm
Cepas

del

Santa,

NaOH 0.1 N

I.

MARCO TEORICO

La resistencia a los antibiticos betalactmicos es atribuible fundamentalmente


a la produccin de enzimas betalactamasas. Se conocen mltiples clases de
enzimas pertenecientes a esta familia que pueden transferirse a travs del
cromosoma bacteriano o mediante genes codificados en plsmidos o
transposones.
De entre este grupo, las betalactamasas de espectro extendido (blees),
tambin

denominadas

betalactamasas

de

espectro

ampliado

(bleas),

constituyen un alarmante problema en la actualidad, debido a que presentan un


amplio espectro de inactivacin frente a la mayora de los antibiticos
disponibles. (1)
Las

betalactamasas

son

el

principal

mecanismo

de

resistencia

betalactmicos, estas enzimas catalticas actan rompiendo el enlace amdico


del anillo betalactmico, lo que hace que el betalactmico pierda la capacidad
de unirse a las protenas de unin a la penicilina y por tanto, su accin
bactericida. (2)
Estas enzimas han sido clasificadas de acuerdo a dos esquemas generales: la
clasificacin molecular de Ambler basada en la similitud de la secuencia de
aminocidos y la clasificacin funcional de Bush-Jacoby-Medeiros que tiene en
cuenta los perfiles del inhibidor y el sustrato. El esquema de Ambler clasifica a
las betalactamasas en 4 grupos nombrados con las letras A y D. La mayora de
las BLEE pertenecen a la clase molecular A y son enzimas que contienen
serina en su sitio activo y nicamente inhibidas in vitro por el cido clavulnico.
Las BLEE poseen un amplio perfil de sustrato y tienen la capacidad de
hidrolizar la gran mayora de antibiticos betalactmicos incluyendo penicilinas,
cefalosporinas de amplio espectro y monobactmicos. Las primeras enzimas
tipo BLEE detectadas fueron las denominadas SHV y TEM, posteriormente han
sido descritas otras con perfiles similares a las mutantes TEM y SHV que

pertenecen tambin a la clase molecular A, pero a diferencia de estas, tienen


un linaje evolutivo bastante diferente a las enzimas mencionadas. Dentro de
este grupo encontramos las enzimas de las familias CTX-M, VEB, PER, GES y
TLE. Aunque inicialmente las enzimas BLEE solo se limitaban al mbito
hospitalario, en la actualidad se ha observado un incremento de los reportes de
bacterias productoras de BLEE como causa de IVU de origen extra
hospitalario. La enzima ms frecuentemente detectada es del tipo CTX-M en
aislamientos de E. colide la comunidad. Recientemente han sido descritos
aislamientos productoras de enzimas SHV pero en menor proporcin. (2)
Existen diferencias cuantitativas en la actividad hidroltica de determinadas
BLEE sobre los sustratos. Esto hace que determinadas cepas productoras de
BLEE puedan parecer sensibles a los oximino -lactmicos, siendo en realidad
resistentes. No es infrecuente que preliminarmente se informe un aislamiento
de una enterobacteria como sensible a cefalosporinas de tercera generacin y
aztreonam y que posteriormente, por pruebas adicionales o ante un fracaso
clnico, se constate que se trata de una cepa BLEE (+).8 Por eso ante el
aislamiento de una cepa de un Gram negativo con unas CMI de cefalosporinas
de tercera generacin elevadas con respecto a lo esperado para dicha cepa en
ausencia de BLEE, o ante el hallazgo de multirresistencia en las pruebas de
sensibilidad, es prioritario descartar la presencia de BLEE. En concreto, la
Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI) ex National Commitee for
Clinical Laboratory Standard (NCCLS) recomienda la investigacin sistemtica
de la produccin de BLEE en cualquier aislamiento de klebsiella o escherichia
coli cuyas CMI de aztreonam, ceftazidima, ceftriaxona o cefotaxima sea
superior a 2 microgramos/mL. (3)

Las cepas productoras de BLEE son multirresistentes. Presentan resistencia a


todos los betalactmicos, excepto, a priori, a las 7--metoxi-cefalosporinas o
cefamicinas y a los carbapenmicos. Adems, los plsmidos que codifican esta
resistencia portan genes de resistencia a otros antibiticos, como cotrimoxazol,
aminoglucsidos y tetraciclinas, y el fenmeno de la resistencia cruzada es
muy frecuente.7 Estas cepas son tambin resistentes a las fluorquinolonas con
mayor frecuencia que otras cepas no productoras de BLEE. La resistencia a

antibiticos no -lactmicos es significativamente ms frecuente en cepas de


escherichia coli productoras de BLEE que en no productoras lo cual fue
constatado en nuestro resultado con el incremento de la resistencia de estas
bacterias a la amikacina. A diferencia de las -lactamasas cromosmicas, la
resistencia de las -lactamasas plasmdicas es transferible. El que se
encuentren codificadas en plsmidos conjugativos, posibilita la diseminacin de
este mecanismo de resistencia no slo entre distintas cepas de la misma
especie sino tambin entre diferentes especies bacterianas. Adems, las BLEE
frecuentemente se incluyen en transposones o integrones, lo cual determina su
asociacin con otros determinantes genticos de resistencia transferibles,
como los que conllevan resistencia a los aminoglucsidos o al cotrimoxazol.
(4)

Las bacterias productores de BLEE tambin pueden ser resistentes a otros


antibiticos

diferentes

los

betalactmicos

como

fluoroquinolonas,

trimetoprim/sulfametoxazol y aminoglucsidos, es decir, se convierten en


microorganismos multiresistentes; esto es debido a que los genes que codifican
para las BLEE pueden localizarse en el mismo plsmido en que se codifican
otros determinantes de resistencia, lo que se traduce en la dificultad a la hora
de escoger un tratamiento eficaz. Para este tipo de infecciones la alternativa de
tratamiento es usualmente el uso de carbapenemes, los cuales son de alto
costo, muy amplio espectro, de aplicacin nicamente parenteral y que adems
inducen una presin de seleccin de cepas resistentes a estos antimicrobianos.
(2)
Las blees derivan mayoritariamente de mutaciones en genes de penicilinasas
originarias de las familias temoniera (TEM), variable sulfidril (SHV) y oxacilin
(OXA), aunque en los ltimos aos han surgido blees pertenecientes a otras
muchas familias.

Un inconveniente asociado a los microorganismos productores de blees radica


en su rpida y amplia diseminacin, favorecida por la existencia de reservorios.

Tanto los pacientes ambulatorios como aquellos que residen en centros de


acogida e instituciones para crnicos podran actuar favoreciendo su difusin.
En una experiencia realizada en Espaa se observ un aumento en la
incidencia de portadores de microorganismos productores de blees en
pacientes ambulatorios, desde el 2,1% en el ao 2001 hasta el 7,5% en el ao
2002(2).

E. coli tiene como hbitat natural el tubo digestivo y colon humanos, y coloniza
vagina y uretra; desde la uretra asciende y causa infeccin del tracto urinario
(ITU). E. coli es la causa principal de ITU adquirida comunitariamente y
hospitalaria, septicemia, meningitis neonatal y gastroenteritis. En infeccin
urinaria los factores que predisponen a ITU en mujeres son la proximidad del
ano a la vagina y uretra as como una pequea uretra; esto lleva a colonizacin
de uretra y vagina por flora fecal; anormalidades anatmicas tambin
predisponen; el uso de sonda urinaria predispone debido a que las cepas
muestran propiedades de adherencia. Las sondas intravenosas predisponen a
septicemia y adems una endotoxina en la pared celular es causante del shock
que se produce en estos casos.(3)
E.

coli

puede

producir

enzimas

betalactamasas

cromosmicas

extracromosmicas (mediadas por plsmidos). Las cepas productoras de BLEE


confieren resistencia a los betalactmicos excepto a las cefamicinas y a los
carbapenmicos; pero adems los plsmidos que codifican las BLEE portan
genes

de

resistencia

(transposones)

otros

antimicrobianos

como

aminoglucsidos, tetraciclinas y cotrimoxazol, es por lo que el fenmeno de


resistencia cruzada es muy frecuente y el tratamiento de las infecciones
producidas por estas cepas tiene una mayor dificultad. Adems, las cepas
productoras de BLEE son ms resistentes a fluorquinolonas que las que no lo
son.(4)

Se han identificado como factores que aumentan el riesgo de produccin de


BLEES una estancia hospitalaria prolongada, ingreso en la unidad de cuidados
intensivos, existencia de ingresos previos, administracin de mltiples ciclos de
tratamiento antibitico, principalmente cefalosporinas de amplio espectro,
insercin de catteres, drenajes biliares y sondas urinarias, intubacin y
ventilacin mecnica y ciertas enfermedades de base como neoplasia y fallo
cardiaco.

II.

ANTECEDENTES

La prevalencia de microorganismos productores de blees es muy variable


cuando se consideran diferentes regiones geogrficas.
El rango en Europa oscila desde un 1-5% en los pases del norte hasta un 3947% en los del este(5). En un estudio espaol reciente se ha reportado un
aumento de la incidencia de blees, desde el 1,6% en el ao 2001 hasta el 4,1%
en el 2003(6)

En Centro Amrica (Cuba), El 63.5% de los pacientes estudiados en el Instituto


Superior de Medicina Militar en Unidad de Cuidados Intensivos de la ciudad de
La Habana, presentaron en la primera evaluacin, bacterias BLEE en algunas
de las muestras estudiadas.(7)

En Sudamrica (Argentina) se report alta frecuencia de cepas BLEE (31,1%)


en pacientes hospitalizados del Hospital Escuela Jos Francisco de San
Martn de Corrientes.
Se encontr en los pacientes con ITU por Enterobacterias productoras de
BLEE, como factor de riesgo al sexo masculino (p < 0.022, OR: 2.32, IC al
95% 1.05 5.26). De la misma manera, se encontr como comportamiento
clnico caracterstico a la hospitalizacin prolongada (p < 0.0043, OR: 4.12, IC
al 95% de 1.39 14.73).(8)

En Per, en el Hospital regional de Lambayeque, Chiclayo, se obtuvo como


resultados: 18 (51,4%) de las cepas de E. coli eran productoras de BLEE tipo
CTXM, de stas, 14 fueron aisladas del sexo femenino y por consulta externa
(en reas de urologa, pediatra, nefrologa, endocrinologa, gastroenterologa,
ginecologa) y 04 de pacientes que estuvieron internados en el Hospital. (9)
Con respecto a la ciudad de Lima se report, en el Hospital Nacional Guillermo
Almenara Irigoyen durante el perodo: 1 de Enero 2009 30 Junio 2010, la
prevalencia de aislamientos de P. aeruginosa con un 15% (112/764) en los
pacientes, las muestras aisladas provienen principalmente de muestras
respiratorias y en menor proporcin de hemocultivo y urocultivo. (10)
Angles et al. (2009) realiz un estudio en el hospital Arzobispo Loayza (Lima),
Se incluyeron cepas de E. coli y Klebsiella Pneumoniae. Aisladas a partir
muestras de pacientes hospitalizados, se realiz el test de susceptibilidad y
confirmacin de fenotipo por el mtodo automatizado VITEK 2 Compact
System demostrando que la prevalencia de aislamientos con fenotipo BLEE fue
del 63 % (51/81) para E. coli y 71,3% (17/23) para K.pneumoniae (11)
Morales J. et al. (2005) Estudi la presencia de enterobacterias productoras de
BLEE en dos hospitales de Lima, se recolect 137 Cepas de Escherichia coli y
18 cepas de Klebsiella pneumoniae. La mayora mostro alta resistencia a las
cefalosporinas de tercera generacin y aztreonam; 2,9% del total de E. Coli y
un 44,4% del total de K. Pneumoniae aisladas fueron confirmadas como
productoras de BLEE. Todas las Cepas Productoras de BLEE fueron
multirresistentes y la Mayora presento una coresistencia a sulfametoxazol /
trimetoprim, amikacina, gentamicina y ciprofloxacina. (12)

En Ancash, Chimbote, no se han reportado estudios respecto al tema.

III.

JUSTIFICACION

Bajo la premisa de que la produccin de betalactamasas de espectro extendido


est ntimamente relacionada con el uso irracional de antimicrobianos, los
fracasos de tratamientos convencionales. Las resistencias, provocan un retraso
en la administracin de tratamiento microbiolgicamente efectivo con
disminucin de la eficacia clnica y tiempo de hospitalizacin, su comprobacin
ser usada para mejorar la orientacin teraputica de dichos frmacos, con los
subsecuentes beneficios para los pacientes en trminos de salud y para el
Hospital de Eleazar Guzmn Barrn en trminos econmicos.

2.3

ENUNCIADO DEL PROBLEMA

Cul es la frecuencia de microorganismos productores de betalactamasas de


espectro extendido (BLEE) en los pacientes del servicio de UCI en el Hospital
Eleazar Guzmn Barrn durante los meses de abril- junio del ao 2014?

2.4

OBJETIVOS:
a) Objetivo General:
-

Determinar

la frecuencia de microorganismos productores de

betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en pacientes de servicio


de UCI el Hospital Eleazar Guzmn Barrn durante los meses mayo,
junio y julio del ao 2014.
b) Objetivos Especficos:
-

Cultivar las muestras obtenidas en Agar McConkey


Aislar microorganismos productores de betalactamasa de espectro
extendido por el mtodo de difusin de discos.

2.5

HIPTESIS:

Implcita
2.6 Metodologa
DISEO DE LA INVESTIGACION
Tipo de Estudio
a. Segn el tiempo de ocurrencia de los hechos y registro de la
informacin cientfica.
El estudio es de tipo prospectivo (aplicada en un futuro)
b. Segn el periodo y secuencia del estudio
Prospectivo y longitudinal.
c. Segn el anlisis y alcance de los resultados
Descriptivo, cuantitativo
rea de Estudio
Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Regional.

Poblacin
Pacientes de ambos sexos, de cualquier edad, que por motivos mdicos o
quirrgicos fueron admitidos, de Mayo, Junio y Julio de 2014, a la UCI del
Hospital Eleazar Guzmn Barrn.

Muestra
Pacientes hospitalizados en UCI productores de betalactamasas.

Criterios de inclusin
Todo paciente hospitalizado en UCI, independientemente de su diagnstico
clnico de base, con presencia

de microorganismos productores de

betalactamasas presentes en orina, sangre y esputo.

Criterios de exclusin
Pacientes hospitalizado en UCI, independientemente de su diagnstico clnico
de base, que no presenten microorganismos productores de betalactamasas.

PROCEDIMIENTOS PARA LA RECOLECCION


Se llevar a cabo la recoleccin de
procesados del

muestras de cultivos (sangre, orina)

laboratorio clnico delHospital Eleazar Guzmn Barrn

procedentes del servicio de UCI durante los meses de mayo, junio y julio,
tomando en cuenta el fundamento de los registros del laboratorio mencionado.
Posteriormente sern llevadas al laboratorio de Microbiologa de la Escuela de
Farmacia y Bioqumica de La Universidad San Pedro de Chimbote, donde se
realizarn los procedimientos de mtodo estandarizado de difusin en disco
descrito por el Laboratorio Internacional de Referencia: National Committee for
Clinical Laboratory Standars (NCCLS).

TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS

MEDIO AGAR MUELLER HINTON


Preparacin
1. El agar Mueller - Hinton debe ser preparado a partir del reactivo
comercial deshidratado y de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
2. Inmediatamente despus de autoclavar dejar enfriar en un bao de agua
a 45 - 50C
3. Verter el preparado fresco y tibio a una placa petri de vidrio o plstica, de
fondo plano en un nivel, superficie horizontal para dar un fondo uniforme
de aproximadamente 4 mm. Esto corresponde a 60 - 70 ml de medio por
placa de dimetro de 150 mm y 25- 30 ml para placas de 100 mm de
dimetro.
4. El medio de agar debe dejarse que enfre a temperatura ambiente, y a
menos que la placa se use el mismo da, debe guardarse en refrigerador
(2 - 8 C).
5. Las placas deberan usarse en un lapso de 7 das despus de la
preparacin a menos que se hayan tomado adecuadas precauciones, tal
como envolver en plstico, para minimizar el secado del agar y que al
menos hayan mostrado correcto funcionamiento con los organismos de
control de calidad especificados en la seccin 10.2.

6. Una muestra representativa de cada lote de placas debera ser


examinada para esterilidad por incubacin a 30 - 35C por 24 horas o
ms.

pH
El pH de cada lote de agar Mueller - Hinton debera ser chequeado cuando
el medio es preparado. El agar debe tener un pH entre 7,2 y 7,4 despus de
gelificar a temperatura ambiente.

Humedad
Un exceso de humedad justo antes del uso se presenta en la superficie del
agar, las placas deberan ponerse en un incubador (35C) o una cmara de
flujo laminar con las placas entreabiertas hasta que el exceso de humedad se
haya perdido por evaporacin (usualmente 10 a 30 minutos). La superficie
debe ser hmeda, pero sin gotas de humedad en la superficie del medio o en la
tapa de la placa antes de ser inoculada.

ESTNDAR DE TURBIDEZ PARA PREPARACIN DEL INCULO


Para estandarizar la densidad del inculo para una prueba de
susceptibilidad, se utiliza estndar de turbidez de BaSO4, equivalente a un
estndar 0.5 McFarland o su equivalente ptico. Un estndar de 0.5 McFarland
de BaSO4 se prepara como sigue:
1.

Una alicuota de 0,5 ml de 0,048 m/L de BaCl2 (1,175% p/v BaCl2 x


2H2O) seagrega a 99,5 ml de H2SO4 de 0,18 mol/L (1% v/v) con
agitacin constantepara mantener la suspensin.

2.

La densidad correcta del estndar de turbidez debera verificarse


usando unespectrofotmetro con una celda de 1 cm de paso de luz con
una

cubeta

decalibracin

para

determinar

la

absorbancia.

La

absorbancia a 625 nm debe ser0,08 a 0,10 para el estndar de 0,5


McFarland.
3. La suspensin de Sulfato de Bario debe transferirse en alicuotas de 4 a
6 ml atubos con tapa atornillada del mismo tamao que aquellos que se
usan para elcrecimiento o dilucin del inculo de bacterias.
4. Estos tubos deben ser bien sellados y almacenados en la obscuridad a
temperatura ambiente.
5. El estndar de turbidez debe ser bien agitado en un vortex mecnico
antes deusar y se debe revisar que haya una apariencia turbia uniforme.
Si aparecenpartculas grandes debe ser reemplazado. Suspensiones de
partculas de latexpueden agregarse para agitar invirtiendo el tubo
suavemente sin usar vortex.
6. El estndar de Sulfato de Bario debe ser reemplazado o verificado su
densidad mensualmente.

PREPARACIN DEL INCULO


Mtodo de crecimiento
1. Al menos 3 a 5 colonias bien aisladas y de del mismo tipo de morfologa
se seleccionan de un agar de cultivo. Se toca la colonia por arriba con
un asa y el crecimiento se transfiere a un tubo con 4 a 5 ml de un medio
2.

de cultivo adecuado, tal como caldo soya tripticasa.


El caldo de cultivo es incubado a 35C hasta que alcance o exceda la
turbidez del estndar de 0.5 McFarland (usualmente 2 a 6 horas). Esto

resulta en una suspensin que contiene aproximadamente 1 a 2 x 108


UCF/mL.
3. La turbidez del caldo se ajusta con solucin salina estril o con caldo
para obtener una turbidez pticamente comparable a un estndar de 0,5
McFarland.

INOCULACIN DE LAS PLACAS

1. En un lapso de tiempo ptimo de 15 minutos despus de ajustar la


turbidez de la suspensin del inculo, una trula de algodn se
sumerge en ella. La trula debe ser rotada varias veces y presionada
firmemente contra la pared interna del tubo sobre el nivel de lquido.
Esto remueve el exceso de inculo.
2. Se inocula la superficie de una placa de agar Mueller -Hinton por
rayado con la trula sobre toda la superficie. Este procedimiento es
repetido

rayando

dos

ms

veces,

rotando

la

placa

aproximadamente 60 C cada vez para asegurar una distribucin


constante del inculo. Como paso final se pasa sobre los bordes del
agar.
3. La tapas de la placa pueden quedar entreabiertas por 3 a 5 minutos,
pero no ms de 15, para permitir que un exceso de humedad de la
superficie se absorba antes de aplicar el disco con la droga
impregnada.
4.

Se debe evitar excesos en la densidad del inculo. Nunca usar


caldos de cultivo de la noche anterior sin diluir u otro inoculo no
estandarizado.

APLICACIN DE LOS DISCOS A LAS PLACAS INOCULADAS


1. Los sensidiscos se dispensan sobre la superficie del agar. Cada disco
debeser presionado para asegurar contacto pleno con la superficie del
agar. Yasea que el disco se ponga individualmente o con un dispensador,
deben serdistribuidos en forma constante y no debe quedar a menos de

24 mm dedistancia entre centros. No ms de 12 discos se deben poner


por placa de150 mm o no ms de 5 en placas de 100 mm. Debido a que
algunas drogasdifunden casi instantneamente, un disco no debe ser
relocalizado una vezque haya tomado contacto con la superficie del agar.
2. Las placas son invertidas y puestas en un incubador a 35C en el lapso
de 15minutos despus de aplicados los discos.

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