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Crecimiento Microbiano

Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores fsicos y


qumicos. Entre los factores fsicos tenemos la temperatura, el pH y la
presin osmtica. Los factores qumicos necesarios para el crecimiento
bacterial son diversos elementos constitutivos de las clulas.
Requisitos Fisicos
Temperatura
El patrn de crecimiento bacterial se ve profundamente influenciado por la
temperatura. La temperatura a crecimiento ptimo permite el
crecimiento ms rpido de las bacterias durante un perodo de tiempo,
usualmente entre 12 y 14 horas. La temperatura mnima de crecimiento
es aquella temperatura menor a la cual la especie puede crecer.
La Temperatura de crecimiento mximo es la temperatura mayor en la
cual el crecimiento es posible. Los microorganismos se dividen en 3
grandes grupos en base a su preferencia de rango de temperatura.
Sicrfilos son capaces de crecer a 0C menos, pero crecen mejor a una
temperatura mayor. Estas bacterias son capaces de crecer a 0C, pero
tienen una temperatura ptima de 15C menos y una mxima de
aproximadamente 20C. Los sicrfilos estrictos mueren si se exponen a la
temperatura de saln. Un ejemplo de sicrfilos estrictos son las bacterias
que crecen en la Antrtica. An a una temperatura ptima estas bacterias se
tardan en crecer de 2 a 3 semanas. Los sicrfilos facultativos o
sicrotrofos son aquellos organismos que pueden crecer a 0C, pero crecen
mejor a una temperatura de entre 20 a 30C. Los mesfilos crecen mejor a
temperaturas que fluctan de entre 25C a 40C. Aqu encontramos los
patgenos de humanos y animales de sangre caliente, stos crecen mejor a
37C. Los termfilos son bacterias que crecen a una temperatura ptima
sobre los 45C. La regin de crecimiento de muchos termfilos se extiende
a la regin de los mesfilos. Estas se conocen como termfilos
facultativos. La temperatura ptima de crecimiento para estos ltimos
microorganismos es entre 50 a 60C. Los termfilos extremos crecen a
una temperatura mayor de 90C. Es muy importante sealar que una
bacteria no manifiesta las mismas caractersticas de cultivo cuando se
crece a diferentes temperaturas, un ejemplo lo observamos en Serratia
marcescens, esta bacteria produce un pigmento rojo solamente a cierta
temperatura de cultivo.
pH

En la mayora de las bacterias el crecimiento ptimo es entre 6.5 y 7.5.


Muy pocas bacterias crecen a un pH menor de 4.0. Sin embargo, las
bacterias clasificadas como acidfilos son tolerantes a la acidez, un
ejemplo es Thiobacillus thiodans que crece a un pH ptimo de entre 2.0 a
3.5.
Presin osmtica
Los microorganismos requieren agua para su crecimiento, adems para
obtener nutrientes de sta. Una presin osmtica alta causa prdida de
agua y plasmlisis de la clula, por lo que se utiliza este fenmeno para
conservar los alimentos ya sea aadiendo sal o azcar, lo que previene el
crecimiento bacterial. Sin embargo algunas bacterias se han adaptado a
altas concentraciones de sal, a stas se les conoce como halfilos
extremos. Por otro lado, los halfilos facultativos no requieren una alta
concentracin de sal, pero pueden crecer hasta una concentracin de 2%.
Otras bacterias pueden tolerar hasta un 15% de sal.
Requisitos Qumicos
Carbno (C) todos los organismos requieren C para sintetizar los
componentes celulares.
Nitrgeno, azufre.y fsforo. Estos elementos se requieren para la sntesis
de DNA, RNA, protenas y ATP. Las bacterias pueden obtener nitrgeno
(N) ya sea fijndolo directamente de la atmsfera, como por ejemplo el
gnero bacteriano Rhizobium. Tambin pueden obtener este elemento de
compuestos inorgnicos que contengan N como nitritos, nitratos, sales de
amonia o amino cidos. Las bacterias pueden obtener azufre de iones de
sulfato, sulfito de hidrgeno y amino cidos con azufre. El fsforo es
esencial para la sntesis de cidos nucleicos y membranas celulares. Una
fuente para obtener fsforo son los iones de fosfato y el ATP.
Elementos trazas. Otros elementos como hierro, cobre, molibdeno y zinc
son requeridos por los microorganismos en pequeas cantidades.
Usualmente tienen funcin de cofactores.
Oxgeno No todos los microorganismos necesitan 02, sin embargo, muchas
formas de vida requieren oxgeno para llevar a cabo respiracin aerbica.
Los microorganismos que utilizan oxgeno molecular son
llamados aerbicos. Estos se clasifican en aerbicos obligados que son los
que
requieren
oxgenos
molecular
para
vivir,
y
los aerbicos facultativos los cuales utilizan el oxgeno molecular cuando

est presente, pero en su ausencia continan su crecimiento por la va de


fermentacin o respiracin anaerbica, un ejemplo es Escherichia coli. Por
otro lado tenemos los anaerbico obligados que necesitan ausencia de
oxgeno molecular para crecer y donde este generalmente es txico, un
ejemplo es el gnero Clostridium. Estos microorganismos obtienen el
tomo de oxgeno molecular del agua. Tambin se observan
microorganismos anaerbicos aerotolerantes los cuales no utilizan el
oxgenos molecular para su crecimiento, pero pueden tolerarlo.
Los microaeroflicos slo pueden crecer en concentraciones de oxgeno
molecular menor a las encontradas en el aire.
Factores orgnicos de crecimiento Estos son compuestos orgnicos
esenciales que el organismo no puede sintetizar, aqu se incluyen las
vitaminas, los amino cidos, las purinas y las pirimidinas.
Medios de cultivo

Es un material nutriente preparado para el crecimiento de


microorganismos en el laboratorio. Un medio quimicamente definido es
aquel donde su composicin qumica exacta es conocida. Un medio
compleio es aquel donde su composicin exacta vara de un lote a otro, ya
que este medio esta hecho de nutrientes como extractos de levaduras,
carne, partes de plantas o protenas digeridas. Hay medios especficos
para crecer anaerbicos, es estos se utiliza un ingrdiente reductor como
tioglicolato de sodio, que se combina con el oxgeno molecular disuelto
para eliminarlo del medio. Tambin hay medios selectivos, stos medios
en particular proveen nutrientes que ayudan al crecimiento y
predominancia de un tipo particular de bacterias, y a su vez inhibe que
otros tipos de microorganismos estn presentes, un ejemplo de estos es el
medio para crecer la bacteria Neisseria gonorrhoeae. El Medio
diferencial nos permite diferenciar entre varios tipos de bacterias al
incorporar a ste ciertas substancias como sangre, sal, tintes y otros. Si
inoculamos el medio con bacterias que destruyen las clulas rojas mientras
que otras bacterias no destruyen este tipo de clulas, podemos diferenciar
unas de otras en el mismo medio.

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2.3.- Fases del crecimiento de un cultivo


En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de
microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le
denomina cultivo batch y podramos traducirlo por cutivo discontinuo por contraposicin
con el cultivo continuo que desarrollaremos ms adelante. El desarrollo de un cultivo
discontinuo se ajusta al representado en la siguiente figura:
Se pueden
distinguir
cuatro fases en
el cultivo: (1)
la fase lag en
la que el
microorganism
o se adpata a
las nuevas
condiciones y
pone en
marcha su
maquinaria
metablica
para poder
crecer
activamente.
La duracin de
esta fase es
variable y en
general es
mayor cuanto
ms grande sea
el cambio en
las
condiciones en
las que se
encuentra el
microorganism
o. (2) La fase
exponencial cu

ya cintica
explicamos en
la pgina
anterior. (3)
La fase
estacionaria e
n la que no hay
aumento neto
de
microorganism
os, lo que no
significa que
no se dividan
algunos, sinio
que la
aparicin de
nuevos
individuos se
compensa por
la muerte de
otros. (4)
La fase de
muerte en la
que el nmero
de
microorganism
os vivos
disminuye de
forma
exponencial
con una
constante k qu
e depende de
diferentes
circunstancias.

En la fase de mmuerte decimos que el nmero de microorganismos vivos


disminuye exponencialmente. Pero qu es un microorganismo vivo en trminos
microbiolgicos?. Consideramos vivo al microorganismo que puede multipicarse
(dividirse), y muerto al que ha perdido irreversiblemente la capacidad de
dividirse. Es importante entender este concepto porque los microorganismos
microbiolgicamente muertos no tienen porqu estar metablicamente inactivos.

2.4.- Medida del crecimiento microbiano


Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parmetros
algunos de los cuales presentar a continuacin. No debemos olvidar que en
condiciones de crecimiento equilibrado todos los parmetros del cultivo
evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de ellos (el
de medida ms fcil) podemos medir el resto.
En este apartado revisaremos los principales mtodos de recuento de
microorganismos. Una informacin ms completa puede encontrarse en la
conexin Mtodos de recuento.
Los mtodos para el seguimiento de la evolucipon de un cultivo microbiano
pueden clasificarse en directos e indirectos. Los mtodos directos se basan en la
medida de la evolucin del nmero de clulas vivas (tcnicas de plaqueo) o del
nmero de partculas (tcnicas microscpicas y de contadores de partcuas). Ls
mtodos indirectos se basan en la medida de algn parmetro del cultivo que nos
permite deducir informacin sobre la evolucin del nmero de microorganismos.
La eleccin de un mtodo de seguimiento del cultivo en concreto depende de las
caractersticas del cultivo y del proceso.
Entre los mtodos principales de recuento de microrganismos podemos
destacar:
1.- Las tcnicas de recuento microscpico de clulas sin fijar usando microscopa
de contraste de fae. Para ello se cuenta el nmero de partculas en un volumen
determinado usando una clula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos
modificado en e que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos
observando). El procedimiento es rpido y sencillo; pero no permite distinguir
clulas vivas inmviles de clulas muertas.
2.- Contaje de partculas utilizando sistemas automticos del tipo Coulter
Counter. La operacin de estos sistemas es sencilla (mtodo de empleo) y
permite rpidamente determinar el nmero de patculas presentes en una
suspesin y la distribucin de sus tamaos. El problema es que no distingue
entree clulas vivas y muertas ni entre clulas y agregados de material insoluble
presente en la suspensin del cultivo.
3.- Tcnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultuivo
adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las clulas aisladas
dar lugar, despus de la incubacin correspondiente, a una colonia de forma que
el nmero de estas nos permitir estimar el nmero de clulas presentes en la

muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fcil de utilizar en el caso de clulas


aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede
realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra
sobre el medio de cultivo slido) o en profundidad (mezclando un volumen dado
de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta ltima opcin
permite realizar el recuendto de microorganismos microaerfilos que no crecen
bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en
placa tenga validez estadstica, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con
objeto de disminuir el error de la medida.
4. Tcnicas turbidomtricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de
cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es
proporcional a la masa de las partculas en suspensin (clulas) y su medida nos
permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la
medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colormetro, por
ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente
en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad
ptica. La limitacin de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no
distingue clulas vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar
densidades celulares menores a 10.000 clulas por mililitro.
5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtracin del cultivo a travs
de una membrana que retenga las clulas y su posterior desecacin hasta peso
constant. El sistema, obviamente, no disferencia clulas vivas de muertas y su
sensibilidad es limitada.
6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisiin
de luz por la luciferasa de lucirnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de
ATP. De esta forma se puede medir la concentracin de ATP en un volumen dado
de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentracin de ATP decae
rpidamente en las clulas muertas, de forma que esa medida indirecta detecta
nicamenta las clulas vivas.
Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado tcnicamente
para poder ser utilizados como sistemas online. En una opracin on line no es
necesario extraer la muestra del cultivo para realizar la medida. Esto es muy
importante en el caso de fermetaciones en gran volumen porque permite realizar
medidas en tiempo real y disminuye los riesgos de contaminacin.
Antes de cerrar este apartado hay que sealar que en la naturaleza hay
muchsimos ms microorganismos de los que podemos detectar por la mayora de
los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en el suelo o en el agua

podemos cultivar nicamete proporciones menores al 1% de los microorganismos


vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se cuenta la falta de medios de
cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para el cultivo
debido a procesos de sintrofa y la oligotrofa (inhibicin por altas
concentraciones de nutrientes) que muestran algunos microorganismos.