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Se han aislado orgenes de replicacin en levadura: se tom el DNA

fragmentado y se vio qu fragmento era capaz de replicarse autnomamente


en una clula de levadura. Se aislaron as los ARS (secuencias de replicacin
autnoma, equivalente a oriC en E. coli). Si se comparan muchos ARS se ve
que tienen una composicin modular:
A: hay 11 pares de bases conservados en todos los ARS llamados ACS (ARS
Consensus Sequences); si esos pb estn mutados este ARS no es capaz de
funcionar como origen de replicacin.
B: DUEs: sitios de interaccin de factores de transcripcin (no tan indispensable
como la secuencia de 11 pares de bases de A) No se ha aislado ningn ARS de
organismos superiores que no sean levaduras.
Hace aos se vio por footprint in vitro e in vivo, que haba un conjunto de seis
protenas que reconocan especficamente estas secuencias: ORCs (complejo
de reconocimiento del origen). Si existen mutaciones en ORC no hay
reconocimiento de las secuencias ARS y no ocurre la replicacin. Los ORC
permanecen unidos a los orgenes a lo largo de todo el ciclo. Por tanto no
parece que las ORCs sean las responsables de la iniciacin de la replicacin,
aunque sean necesarias.
Los ORC no son factores de competencia ya que estn constantemente unidos
al origen; se necesitan para la activacin de los orgenes pero no son el nico
requisito. Se cree que los ORC actan como seales de reconocimiento
(muelles de anclaje) para una serie de protenas que realmente van a iniciar la
replicacin. Se han aislado protenas que interaccionan especficamente con
ORC, por ejemplo Cdc6p y Cdc 45: sus niveles comienzan a subir al principio
de G1, fase en la cual interaccionan especficamente con ORC. Cdc6 es una
protena altamente inestable (vida media < 5min) Se sintetiza al final de G1, a
travs de G1 y tpicamente se une a ORC entre la salida de mitosis y el final de
G1. Su rpida degradacin implica que no habr protena disponible mas tarde
en el ciclo. La presencia de Cdc6 permite a otra protena unirse al complejo
estas son las protenas MCM (MiniCromosomal Manteinance) complejo
compuesto por seis protenas y esto es lo que le confiere competencia al origen
de replicacin , ya que este complejo es el que participa en la inciacin de la
replicacin. El complejo existe en una configuracin globular que contiene una
cavidad central y tiene una masa de ~560 kDa. El motivo ATPasa mostrado por
miembros de esta familia sugiere que este complejo hexamrico puede estar
asociado con actividades ATPasa y/o helicasa, hassta el momento esto no ha
sido confirmado pero la analoga estructural del complejo con la Dna B de
procariontes entre otras razones hace seguir buscando esta confirmacin. . Las
protenas MCM ms involucradas en la replicacin son las Mcm2 a la Mcm7 y
homlogos estructurales a estas han sido encontradas en todos los organismos
eucariontes, desde levaduras hasta el hombre.

La secuencia de eventos durante la transicin de fase G1 a fase S, que


permiten la inciacin de la replicacin se pude considerar como un esquema
universal del control de la inciacin de la replicacin para que esta ocurra en
fase S.
Todo esto se ensambla gracias a que hay quinasas activas (la ciclina B-CDK y
Cdc7-Dbf4). En este instante el origen de replicacin est listo para ser
activado, solo se necesita la seal de comienzo en el punto START. La actividad
quinasa fosforila protenas de ese complejo y hace que el DNA comience a
replicarse. Al fosforilarse estas protenas se desensamblan y probablemente
Cdc6p se degrade proteolticamente al igual que lo hacen las ciclinas de las
quinasas, es decir al activarse el origen se desensambla el complejo de
competencia, Cdc6p no se puede volver a unir y el origen no puede volver a
activarse. Las protenas que permanecen en los orgenes de replicacin, entre
ellas ORC, forman el complejo post-replicacin. As puede entenderse como en
una clula en fase G1 s se activaba la fase S y no se activaba en caso de que
la clula est en fase G2. Es decir lo que activa el origen de replicacin es la
actuacin de quinasas dependientes de ciclinas que desensamblan el complejo
de prereplicacin desapareciendo as el estado de competencia, por lo que no
puede volver a ser activado dicho origen.
Se ha propuesto que MCM podra tener actividad helicasa y estar implicado en
la apertura del DNA y el desensamblaje de la cromatina. Si esto fuera as se
podra establecer un paralelismo con la activacin de orgenes procariticos.
Cdc6 actuara como dna C y MCM como dna B. Pero no se ha demostrado que
MCM tenga actividad helicasa.
Un mecanismo hipottico propuesto por TyeB (1999) puede ser:
1)
El pre-RC se ensamblado durante la fase G1. El complejo de
reconocimiento del origen (ORCV) proporciona una plataforma en la cual son
reclutados secuencialmente Cdc6 y MCM2-7. Durante la fase G1, las quinasas
C1b estn inactivas, pero la quinasa Cdc7-Dbf4 estn activa. La protena Cdc6
mediante su interaccin con ORC permite la unin de MCM2-7 en los orgenes
de replicacin.
2)
Una vez que el pre-RC es ensamblado, se procede a su activacin
mediada por quinasas, la ciclina B-CDK y Cdc7-Dbf4 interactan con el
complejo MCM. La fosforilacin de MCM2 por Cdc7-Dbf4 induce un cambio
conformacional que es crtico para el subsecuente desenrollamiento del dplex
del Dna en el origen. En este punto la activacin de las quinasas C1b de fase S
es requerida para la unin de Cdc-45 al pre-RC
3)
Cdc45 interacta fsicamente con el complejo MCM y se cree queste es
movido del origen de replicacin a las regiones ente los orgenes, posiblemente
como un componente del complejo de elongacin (EC). La iniciacin de la

sntesis del DNA ocurre cuando RFA, primasa y la ADN pol a son reclutadas en
la horquilla de replicacin.
4)
ORC se vuelve a unir a los orgenes de replicacin para formar el
complejo post-RC en la medida que ocurre la transicin del complejo de
replicacin RC en complejo de elongacin (EC), es decir una vez que ya ha
ocurrido la iniciacin pero antes de que inicie la sntesis de ADN.
TyeB.K. (1999). MCM Proteins in DNA Replication, Annual Rev. Biochem.
68:649-686