Está en la página 1de 83

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

CAPTULO VIII
PURIFICACIN DE ENZIMAS
CONTENIDO
Precauciones que se deben tomar al trabajar con enzimas
Etapas generales de un proceso de purificacin
Preparacin del extracto de purificacin
Tcnicas de purificacin por precipitacin
Tcnicas cromatogrficas
Mtodos auxiliares de purificacin
8.1.

INTRODUCCIN
La purificacin de una enzima es un proceso complejo debido a la
alta inestabilidad que muestran estas molculas y resulta ser un reto para
el Enzimlogo pues durante el mismo debe aplicar una serie de
estrategias, seleccionando de muchos mtodos aquellos que hagan al
procedimiento ms rentable.
La purificacin enzimtica desarroll enormemente gracias a la aparicin
de nuevas tcnicas bioqumicas all por los aos 50s y 60s del siglo
pasado y esto ha permitido tambin el avance de la Enzimologa pues
recin con una enzima pura se pudo determinar los mecanismos
catalticos, las propiedades qumicas, la masa molecular, los residuos
aminoacdicos que forman parte del centro activo, etc. de la misma.
Antes de considerar los aspectos prcticos de una purificacin es
necesario definir cual es el propsito u objeto de uso de la enzima
purificada; si se quiere por ejemplo hacer una caracterizacin molecular
de la misma, esta debe estar con un alto grado de pureza y en grandes
cantidades; pero si el objetivo es utilizarla para estudios cinticos, se
requerir en pequeas cantidades y no totalmente pura. Una vez
establecido el propsito de la enzima, se debe definir el nmero de
requerimientos mnimos para el producto final en trminos de calidad,
cantidad y eficiencia de la purificacin, o que se traduce en trminos de
pureza, rendimiento y economa.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

8.2. PRECAUCIONES QUE SE DEBEN TOMAR AL TRABAJAR


CON ENZIMAS
Las enzimas se desnaturalizan e inactivan fcilmente, por esta
razn al manipularlas deben tomarse en cuenta las siguientes
consideraciones:

Deben evitarse los tratamientos violentos (cidos o lcalis fuertes,


altas temperaturas, reactivos fuertes, etc.)
No exponer a las enzimas a temperaturas mayores de 37C No
exponer a las enzimas a pHs menores de 5 ni mayores de 9.
Al adicionar cidos o lcalis debe hacerse por las paredes del
recipiente para evitar la produccin de una zona de destruccin
alrededor del chorro del reactivo cuando este penetra a la solucin; la
solucin debe estar en permanente agitacin durante el agregado.
Muchas enzimas se desnaturalizan en la superficie de la solucin por
la presencia de aire y esto se manifiesta por la formacin de espuma,
por lo tanto debe evitarse; por ejemplo al agregar sales slidas, estas
trasladan burbujas de aire que pueden desnaturalizar a la enzima, si
esto ocurre es mejor adicionar las mismas como una solucin
saturada.
Los solventes orgnicos inactivan a la mayora de enzimas a
temperatura ambiente, el fraccionamiento con alcohol o acetona debe
realizarse a la menor temperatura posible; asimismo, se debe evitar el
calentamiento que produce la mezcla de algunos solventes orgnicos
con el agua.
Las centrifugaciones deben hacerse en centrfugas refrigeradas; si las
diferencias de densidad entre las fases slida y lquida es pequea, es
mejor usar filtracin que centrifugacin.
Se deben realizar los procesos de purificacin en el menor tiempo
posible. Algunas enzimas se estabilizan a altas concentraciones de sal
(por ejemplo de sulfato de amonio.
El secado de una enzima es mejor hacerlo en vaco y a temperaturas
bajas a partir de soluciones congeladas (liofilizacin).
Se deben tomar precauciones para evitar la contaminacin
microbiana.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

8.3. ETAPAS
GENERALES
DE
UN
PROCESO
DE
PURIFICACIN
La seleccin y secuencia de los mtodos de purificacin a
emplearse deben hacerse con cierto criterio lo cual implica tomar en
cuenta los siguientes aspectos:
8.3.1. Conocimiento de la enzima:
Se debe estar al tanto de todo lo conocido hasta el momento, antes
de iniciar la purificacin: caractersticas moleculares como PM, PI;
conocer sus sustratos y productos, cofactores y coenzimas si los hay,
participacin de moduladores positivos o negativos; propiedades
fisicoqumicas de la enzima como pH y temperatura ptimas.
Se debe saber tambin sobre el medio natural de la enzima, si es
intracelular o extracelular; si esta unida a membrana celular u otra
estructura subcelular. Si existen impurezas en la fuente de extraccin que
pueden inhibir a la enzima, o la presencia de proteasas en la misma, etc.
Es importante hacer una revisin amplia sobre lo informado en la
literatura acerca de la enzima a purificar.
8.3.2. Seleccin de un mtodo que permita la identificacin y
cuantificacin de la enzima a purificar y de la protena total
Durante toda la purificacin es necesario detectar la presencia de la
enzima en forma activa; pero como la enzima est adems acompaada
de una gran variedad de molculas proteicas, se hace imprescindible la
22evaluacin de protena en cada etapa.
Existen varios mtodos para determinar la protena total (Lowry, Biuret,
microbiuret, Bradford, etc.), la seleccin de uno de ellos depende de las
caractersticas del extracto de partida, dado que la diferencias de los
mismos es su sensibilidad.
La evaluacin de la enzima se hace a travs de la medida de su actividad,
utilizando un mtodo que debe ser lo ms especfico y sencillo posible.
Estos dos ensayos permiten evaluar la eficiencia de una etapa de
purificacin, mediante los parmetros de control de la misma: actividad
especfica, rendimiento y pureza.
La actividad especfica es la actividad de la enzima por miligramo de
protena presente en cada etapa y se calcula de la siguiente forma:

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Actividad enzimtica por mililitro de muestra


__________________________________________________________

Miligramos de protena por mililitro de muestra


Este va aumentando a medida que progresa la purificacin, de lo
contrario el procedimiento utilizado no es correcto.
El Rendimiento es el porcentaje de la actividad remanente de la enzima
total de una etapa de purificacin (n), respecto a la etapa inicial (1) y se
obtiene:
Actividad enzimtica total (etapa n)
x 100
Actividad enzimtica total (etapa 1)

_______________________________________________

Este debe ir disminuyendo al aplicar las distintas etapas de purificacin,


debido a que siempre se pierde algo de enzima en cada etapa de
purificacin.
La Pureza indica las veces que se va purificando la enzima y es el
indicador de la eficiencia del proceso y se determina de la siguiente
manera:
Actividad especfica (etapa n)
_______________________________________

Actividad especfica (etapa 1)


Este parmetro debe ir aumentado a medida que progresa la purificacin.
8.3.3. Seleccin de la fuente
La fuente debe ser aquella donde la enzima se encuentre en mayor
cantidad y sea ms estable, aunque muchas veces no hay posibilidad de
seleccin pues la fuente ya est definida; en este caso, se puede
incrementar en ella el contenido de la enzima, por ejemplo, evitando su
degradacin a travs del uso de inhibidores de proteasas, adicionando
agentes estabilizadores de la enzima, estimulando su sntesis por
agregado de sustrato; e incluso, con la ayuda de la Ingeniera gentica, se
puede introducir varias copias del gen responsable de su sntesis,
desreprimir el gen directamente o mutarlo, o en el mejor de los casos,
introducir varias copias del gen de la enzima a utilizar, en el genoma de

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

una bacteria la cual por su corto tiempo de generacin, fcil cultivo y por
tener un nmero menor de contaminantes que una clula eucaritica, nos
va a proporcionar un mejor rendimiento.
8.3.4. Extraccin de la enzima
La localizacin de la enzima es un elemento importante para
hacer la seleccin del mtodo a emplear. Si la enzima se segrega al
medio, el procedimiento se simplifica, primero porque en la purificacin
hay menos contaminantes y segundo, por ser una protena que se va a
enfrentar a un medio distinto al de su sntesis, con seguridad que esta
dotada de una alta capacidad de resistencia a los cambios del medio (alto
nmero de puentes disulfuro, tamao pequeo, protena monomrica,
etc.).
Si la enzima es endocelular, el procedimiento de extraccin es ms
complejo; si esta est soluble en el citosol, es ms fcil de extraer que si
se encuentra en algn organoide, pues solo basta una ruptura de la
membrana plasmtica. Si purificamos una enzima de una clula
eucaritica que est localizada dentro de una organela, la ruptura de las
membranas intracelulares requiere de un tratamiento ms vigoroso; en
este caso es ms recomendable hacer previamente un fraccionamiento
por centrifugacin (centrifugacin diferencial) para obtener primero el
organoide y luego recin hacer la extraccin.
Las enzimas unidas a la membrana plasmtica o a membranas
intracelulares no se pueden extraer si no se utilizan medios apropiados
que permitan la ruptura de la interaccin protena-lpido que se presenta
en estos casos (empleo de detergentes).
8.3.5. Estructuracin de un plan de purificacin
La separacin de una enzima implica el aislamiento de la misma
de una mezcla compleja de protenas por lo que se hace necesario utilizar
una combinacin adecuada de tcnicas de separacin, cuyos fundamentos
sean diferentes (separacin por diferente PM, PI, polaridad, solubilidad,
etc.).
La estructuracin de un plan de purificacin se hace indispensable, el
mismo que combina adecuadamente diferentes tcnicas y en el orden
adecuado, en base a las propiedades especficas de la enzima a purificar y
de las molculas contaminantes. Existen incontables tcnicas de
separacin, pero las podemos agrupar en dos grandes grupos: tcnicas de
baja y alta resolucin.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

8.3.5.1.

Tcnicas de baja resolucin


Aqu se encuentran las tcnicas que se basan en diferencias de
solubilidad de las protenas; su capacidad de procesamiento es alta pero
tienen un bajo poder resolutivo, por lo general estas se aplican al inicio
de la purificacin con la finalidad de eliminar los contaminantes que se
encuentran en mayor proporcin. Estas tcnicas tambin se emplean para
concentrar el componente deseado.
A este grupo pertenecen las precipitaciones, salina, isoelctrica, por calor
y por solventes orgnicos.
8.3.5.2.

Tcnicas de alta resolucin


Estas muestran una baja capacidad de procesamiento pero un
alto poder resolutivo; a estas pertenecen todos los tipos de
cromatografas: de adsorcin, de particin, de exclusin molecular, de
intercambio inico, de afinidad y por supuesto la cromatografa HPLC, la
cual puede utilizar el principio de cualquiera de las anteriores pero a alta
presin, esto permite reducir el tiempo del procedimiento, lo cual es
siempre adecuado en una purificacin enzimtica. Estas tcnicas se
aplican en las ltimas etapas del proceso.
8.4. PREPARACIN DEL EXTRACTO
La preparacin del extracto crudo es una etapa clave en el proceso
de purificacin, esta depende del origen de la fuente y de las
caractersticas de la enzima; la obtencin de enzimas microbianas resulta
ser ms rentable que obtenerlas de clulas animales o vegetales, como
hemos visto; por lo tanto el proceso se inicia con un cultivo de las
mismas, el que puede ser slido o lquido.
Cultivo slido
Aqu el microorganismo crece y se desarrolla sobre la superficie del
medio de cultivo; se emplea fundamentalmente para enzimas
exocelulares. El microorganismo es lavado de la superficie del medio
utilizando un buffer apropiado, luego se filtra y el filtrado que contiene la
enzima segregada constituye el extracto.
Cultivo lquido o sumergido
El microorganismo crece en el interior del medio, el cual se encuentra en
permanente agitacin; se emplea para purificar tanto enzimas
exocelulares como endoenzimas. Una vez completado el tiempo de
cultivo, se centrifuga la mezcla y se obtiene en el precipitado la masa

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

microbiana que contiene las enzimas endocelulares y si es exoenzima, el


extracto lo constituye el sobrenadante.
Si la fuente es un tejido u rgano de origen animal, este debe ser
separado lo ms rpidamente posible despus de la muerte del animal y
guardarse en fri para disminuir la autlisis. Hay situaciones en que la
frescura absoluta puede ser un inconveniente, por ejemplo al utilizar
msculo esqueltico como fuente de la enzima, si este contiene grandes
cantidades de fosfocreatina y glucgeno al momento de la separacin del
mismo, el sistema enzimtico de las clulas siguen funcionando y van a
producir gran cantidad de ATP; el exceso del mismo, provoca la
destruccin de miofibrillas si iniciamos la homogenizacin en esas
circunstancias, pasando parte de estas protenas a la solucin,
contaminndola innecesariamente; si se deja que el msculo pase el rigor
mortis, indicativo del agotamiento del ATP, se logra obtener un preparado
superior.
Muchas veces se debe congelar el tejido antes de utilizarlo (por ejemplo
cuando se tiene una gran cantidad de material que debe ser procesado
poco a poco); en estas circunstancias, la congelacin y descongelacin
debe ser considerada. Al congelar una solucin, primero se congela el
agua libre, esta destruye las membranas y organelos, produciendo
liberacin de protenas; tambin puede ocurrir cristalizacin de las sales,
provocando cambios drsticos en el pH, antes de que toda la solucin se
congele. Si se congela entre -15 y -25C, la solucin que permanece sin
congelar presentar un pH muy distinto al de la solucin original; por
esta razn, se debe congelar a - 80C.
La descongelacin del extracto debe ser rpida y la mejor forma es
sumergir el recipiente que contiene la muestra en agua tibia (40 a 50C)
agitando constantemente; la temperatura de la muestra no debe subir de
10C.
Una enzima intracelular, es menos estable que una extracelular, debido a
que el medio intracelular es ms reducido que el extracelular, de tal
manera que cuando la enzima sale, tiene que ser protegida de la
oxidacin. Las exoenzimas tienen la ventaja de presentar en su estructura
caractersticas especiales que les permiten soportar estas condiciones
como mayor nmero de puentes disulfuro, tamao pequeo y estructura
monomrica. Deben tomarse, por lo tanto, todas las medidas de
precaucin posible para que la enzima se conserve en forma activa.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

8.4.1. RUPTURA CELULAR


Existen muchos mtodos de desintegracin celular, porque hay
muchos tipos de clulas; no es recomendable utilizar un tratamiento ms
vigoroso que el necesario, pues este puede inestabilizar a la enzima.
Los tejidos animales varan desde aquellos que se rompen fcilmente
como los eritrocitos, hasta materiales sumamente duros como el tejido
muscular liso, con alto contenido en fibras de colgeno. Las clulas
vegetales son muy difciles de romper, debido a la estructura celulsica
que presentan sus paredes. En relacin a los microorganismos, hay una
gran variedad de tipos, desde aquellos medianamente frgiles que se
pueden romper con shock osmtico, hasta aquellas especies con pared
celular gruesa que necesitan de tratamientos mecnicos vigorosos. En la
tabla 8.1 se hace un listado de estos procedimientos.
En algunos casos es preferible romper los tejidos previamente (cuando
hay varios tipos celulares en el mismo) para obtener poblaciones
homogneas de clulas intactas, esto se puede hacer por mtodos
mecnicos o enzimticos o la combinacin de ambos; los mtodos
mecnicos como agitacin y homogenizacin suave a menudo daan la
integridad de las clulas as que los mtodos enzimticos son los de
eleccin. En cualquiera de ellos es normal incluir EDTA pues los iones
calcio estn involucrados en adhesin celular; asimismo, la adicin de
albmina de suero de bovino es beneficiosa pues acompleja cidos
grasos que podran daar las membranas celulares.
La enzima ms utilizada para la desagregacin celular es la colagenasa
de Clostridium histolyticum a una concentracin entre 0,01 a 0,1 g% por
periodos entre 15 minutos a una hora. Asimismo son usadas tambin
tripsina, elastasa y pronasa. La separacin de las clulas se hace de
acuerdo a su tamao o por su densidad a la centrifugacin.
Cuando la enzima por purificar est presente en algn organoide, es
mejor romper la membrana plasmtica primero, con un tratamiento no
tan vigoroso, para luego aislar el organelo por centrifugacin
diferencial y recin con un tratamiento fuerte, romper la membrana del
mismo para obtener el extracto, mucho menos contaminado.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Tabla 8.1: Mtodos para romper clulas


Mtodo

Tipo de clula o
Tejido

Principio

Suaves
Lisis celular

Eritrocitos

Ruptura osmtica de la membrana


celular.

Digestin enzimtica

Bacterias

Digestin de la pared celular con


Lisozima por ejemplo y liberacin del
contenido
celular
por
ruptura
osmtica.

Homogenizador
Potter-Evehjem

Oocitos

Las clulas son forzadas a pasar por


un estrecha brecha (0,05 - 0,6mm)
entre el mbolo y un recipiente de
vidrio (presin).

Solubilizacin qumica
con tolueno y autlisis

Levadura

La solubilizacin de las membranas


celulares libera las enzimas lticas de
los lisosomas las que completan la
digestin.

Hgado

Desgarramiento
celular

de

Tejidos vegetales
y animales

Trituracin a alta velocidad

Trituracin
con
abrasivos: arena o
almina

Tejidos vegetales
y bacterias

Las microasperezas destruyen las


paredes celulares

Prensa francesa

Bacterias
y
clulas vegetales

Las clulas pasan a alta presin por


pequeos orificios.

Ultrasonicacin

Suspensiones
celulares

Ondas snicas de alta presin causan


la ruptura de las membranas.

Molino de bolas

Suspensiones
celulares

Vibraciones rpidas con bolas de


vidrio.

Homogenizador
Mantn Gaulin

Suspensiones
celulares

Como prensa francesa pero a gran


escala.

Moderados
Homogenizacin
manual
(homogenizador
vidrio)
Homogenizador
cuchillas de acero

de

la

membrana

de

Vigorosos

En muchos tejidos, los lisosomas son el almacn de enzimas proteolticas


que al ser liberadas al medio, degradan al resto de las protenas de la

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

clula. Se debe entonces tomar ciertas precauciones para evitar esto: la


utilizacin de sacarosa entre 0,15 y 0,3M durante la ruptura, estabiliza la
membrana lisosomal; tambin se pueden agregar inhibidores de
proteasas.
En condiciones de baja fuerza inica muchas protenas se inestabilizan,
por lo que se utilizan buffers a concentraciones medias (0,01M por
ejemplo) y pH fisiolgico. A veces, dependiendo de la enzima que se
desea aislar, es conveniente oxidar los grupos sulfdrilo de las cistenas
de la enzima, para evitar que un medio oxidante cause la formacin de
puentes disulfuro y de hidrgeno, y con ello la agregacin y la
desnaturalizacin de las protenas. Esto se puede evitar agregando
mercapto etanol o ditiotreitol.
La adicin de EDTA ayuda a evitar la inhibicin de enzimas por iones
metlicos y evita tambin la oxidacin de las enzimas, la cual es
favorecida por los propios iones. Algunas veces se puede incrementar la
estabilidad de una enzima agregando su sustrato o algn inhibidor
competitivo de la misma, facilitndose la extraccin.
Durante la extraccin es muy frecuente que el extracto sea turbio, por lo
tanto se debe clarificar; esta turbidez puede deberse a partculas de grasa
que pueden flotar luego de una centrifugacin o eliminarse por filtracin
a travs de lana de vidrio o una tela muy fina. En otros casos puede
deberse a material particulado en suspensin como organoides y/o restos
de membranas; en estos casos, se pasa el extracto a travs de una
columna de celita, la cual adsorber este material.
Los tejidos animales tienen tambin un alto contenido de grasa y
estructuras membranosas que quedan en suspensin; la acidificacin a
pH entre 6,0 y 5,0 provoca generalmente la agregacin y el material
puede ser separado por centrifugacin a baja velocidad, igual se procede
con los ribosomas. Para bajar el pH se debe usar cido actico 1M y
luego de la centrifugacin, se debe regresar el pH al valor inicial.
Los tejidos vegetales son ms acdicos y presentan menos cantidad de
material particulado, el problema en ellos es la presencia de compuestos
fenlicos los que se oscurecen por oxidacin y se unen covalentemente a
las protenas, inactivando muchas enzimas; esto se debe a la actividad de
fenol oxidasas endgenas. La inclusin de compuestos tilicos como el
mercaptoetanol, disminuye la actividad cataltica de las fenol
oxidasas; tambin puede usarse polivinilpirrolidona en polvo, que
adsorbe compuestos fenlicos.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

La extraccin de enzimas a partir de microorganismos tiene tambin sus


problemas, el primero es que tienen mayor cantidad de cidos nucleicos,
ya que son clulas de rpida proliferacin y en segundo lugar, durante la
ruptura celular las paredes celulares se dispersan en partculas muy finas
o se solubilizan parcialmente en forma mucilaginosa, provocando
problemas en la purificacin. Un ejemplo de esto se tiene al obtener
extractos bacterianos usando la prensa francesa, la ultrasonicacin o
lisozima. Los cidos nucleicos pueden precipitarse adicionando
macromolculas policatinicas como el quiiosan el cual facilita la
agregacin; la protamina de salmn y la clupena de arenque cuya
funcin natural es unirse al DNA, cumplen tambin con este rol y son los
materiales ms usados. Sulfato de protamina es lo que ms se usa (5mg
por gramo de material crudo), aunque algunas veces puede precipitar
protenas; si esto ocurre con la enzima a purificar, es mejor emplear
DNAsa y los ribosomas pueden precipitarse con estreptomicina.
Si el extracto contiene polisacridos capsulares mucilaginosos, estos
interfieren con los mtodos usuales de precipitacin de protenas, por tal
razn, es mejor precipitar toda la protena de la muestra (por ejemplo con
sulfato de amonio al 80% de saturacin o con acetona al 55%),
quedando en solucin el material mucilaginoso. Los geles de agarosa
tambin se usan para este fin, cuando el extracto esta a un 70 a 80% de
saturacin con sulfato de amonio, adsorben a las protenas y a travs de
varios lavados, se puede eliminar todo el material no proteico y por
supuesto el exceso de sal.
La lisozima tambin se emplea sobre los polisacridos capsulares,
provocando su degradacin sin ocasionar la ruptura celular, lo cual se
consigue agregando luego un detergente no inico y de esta forma
obtenemos un extracto limpio.
Los hongos y levaduras como fuente enzimtica muestran varios
inconvenientes: su pared celular es mucho ms gruesa y requiere del uso
de mtodos vigorosos que incrementan la cantidad de material
particulado de baja densidad en el extracto, que no se elimina fcilmente
por centrifugacin. La turbidez que muestra el extracto puede eliminarse
agregando solventes orgnicos como acetona fra al 20-25%. La
autlisis de las levaduras con tolueno produce extractos muy claros pero
estas condiciones pueden favorecer la protelisis; se puede emplear la
citolisis amoniacal la cual sube el pH entre 9,5 y 10, rango en el cual las
proteasas tienen muy poca actividad.
Si la enzima a purificar est asociada con partes insolubles de la clula

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

ZONAS HIDROFBICAS

como
membranas mitocondriales, cloroplastos, retculo endoplsmico,
GRUPO POLAR SIN CARGA
etc.,+ -GRUPO
hay que
solubilizar este material usando detergentes los cuales
POLAR
enlazan a la protena y ocupan el lugar de los componentes lipdicos de
las membranas; el inconveniente es que al eliminar el detergente, la
protena puede desnaturalizarse o al menos agregarse y precipitar.
Un mtodo clsico empleado en estos casos es la extraccin del material
lipdico con acetona para obtener los denominados polvos cetnicos; el
mtodo consiste en una deshidratacin gradual con acetona hasta que esta
disuelva a los componentes grasos de las membranas, se liberan las
protenas y luego se evapora el solvente orgnico. El residuo slido
obtenido es luego dispersado en un buffer acuoso donde se recupera a la
enzima.
8.5. TCNICAS DE PURIFICACIN POR PRECIPITACIN
El principio bsico de esta tcnica es provocar una alteracin de
alguna propiedad del solvente original, que promueva la precipitacin de
sustancias; estas sustancias precipitadas pueden ser separadas mejor por
centrifugacin a velocidades relativamente bajas. Estas tcnicas son
aplicadas al inicio de un proceso de purificacin y pueden tener el fin de
eliminar contaminantes o concentrar el extracto.
La distribucin de los residuos hidrofilicos e hidrofbicos en la superficie
de las protenas, es el factor que determina la solubilidad en diferentes
solventes; aquellas protenas muy solubles en agua presentan una baja
hidrofobicidad en la superficie de la molcula, mientras las menos
solubles presentan un mayor nmero de grupos hidrofbicos
superficiales. Aunque la tendencia de los grupos hidrofbicos es
concentrarse en el interior de la molcula de protena, pueden existir
cierto nmero de estos residuos en la superficie, en contacto con el
solvente. Ver figura 8.1.

Figura 8.1.- Representacin de la distribucin de diferentes grupos

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

superficiales en una protena.


Por esta razn, los grupos hidrofbicos superficiales son tan importantes
en la determinacin del comportamiento de las molculas proteicas,
como los grupos cargados y otros grupos polares. Esto hace comprensible
la posibilidad de aislar una protena integral de membrana utilizando
solventes no acuosos, ya que presenta una gran cantidad de grupos
hidrofbicos superficiales que interactan con la zona hidrofbica de la
bicapa lipdica. Las propiedades de solubilidad de las protenas en
solventes acuosos se pueden alterar mediante cambios en la fuerza inica,
pH, adicin de solventes orgnicos miscibles o de solutos inertes o
polmeros, as como la combinacin de esos cambios con variacin de la
temperatura.

1.5.1. PRECIPITACIN POR LA ADICIN DE SALES


NEUTRAS
La mayora de las enzimas se presentan en los fluidos celulares en
forma soluble, en un medio muy concentrado que puede tener alrededor
de un 40% de protena. Generalmente las enzimas son muy solubles en
condiciones salinas fisiolgicas, a una fuerza inica, generalmente ente
0,150,2M y a pH neutro. Cuando se realiza la extraccin, estas
condiciones cambian rpidamente y por tanto el incremento de la
concentracin de las protenas, al eliminar solvente o la disminucin
sustancial de la fuerza inica, por la eliminacin de iones de baja masa
molecular, pudiera convertirse en un inconveniente durante el proceso.
La solubilidad es el resultado de las interacciones polares con el solvente
acuoso, las interacciones inicas con las sales presentes y la existencia de
fuerzas electrostticas repulsivas entre molculas o agregados
moleculares pequeos y solubles con cargas idnticas. Los agregados
moleculares pequeos enmascaran fuerzas electrostticas de atraccin,
permitiendo que se presenten interacciones repulsivas que dan como
resultado una solubilizacin del agregado.
En la figura 8.2 se muestran en forma esquemticas las diferentes
interacciones electrostticas que pueden presentarse entre molculas y
pequeos agregados moleculares, y que permiten comprender la

Enzimologa
solubilidad en solvente acuosos.

Ivn Paz Aliaga

ATRACCIN

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Figura 8.2.- Fuerzas electrostticas entre molculas proteicas y pequeos


agregados moleculares.
Algunas protenas forman precipitados en un rango de fuerza inica entre
cero y el valor fisiolgico, debido a que las fuerzas repulsivas son
insuficientes. En estos casos se presenta una alta hidrofobicidad
superficial, lo que implica una baja interaccin con el agua, (si a fuerza
inica es cero) o con la solucin salina (si la fuerza inica es mayor que
cero), ya que hay poca interaccin de los grupos cargados y las sales.
Un incremento de la fuerza inica, por la adicin de sales neutras
provoca un aumento en la solubilidad de la protena ya que los grupos
cargados de la protena interactan ms con los iones de la sal y se
favorece un mayor nmero de zonas superficiales cargadas, que provocan
repulsiones moleculares. Este fenmeno se denomina salting in o
solubilizacin por salado; ver figura 8.3.

Figura 8.3.- Representacin esquemtica del salting in y su efecto en la


solubilidad de la protena.
La solubilidad por ejemplo de las globulinas disminuye cuando la
concentracin salina decrece; esta caracterstica es aprovechada en la
purificacin de enzimas ya que al disminuir la fuerza inica del extracto
ya sea por agregado directo de agua o por dilisis contra agua, ocurrir la
inversin de la solubilizacin por salado, precipitando algunas protenas.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Esto puede tambin constituir un inconveniente pues la desalinizacin


como etapa de purificacin puede provocar la formacin de precipitado.
Cuando la desalinizacin se realiza mediante dilisis, el precipitado
puede recuperarse por centrifugacin y redisolucin en un buffer de
fuerza inica apropiada, pero si se desaliniza en una columna
cromatogrfica como la de sephadex G20, se corre el riesgo que la
precipitacin ocurra en la columna.
El salting in describe la baja solubilidad de algunas protenas a baja
fuerza inica y a pHs cercanos a su punto isoelctrico; sin embargo, la
gran mayora de las protenas muestran una baja solubilidad a altas
concentraciones salinas (salting out). El salting out o precipitacin por
salado depende fundamentalmente de la hidrofobicidad de la protena,
mientras que la solubilizacin por salado depende ms de la distribucin
de cargas elctricas superficiales y de las interacciones polares con el
solvente.
Se ha planteado que los iones provocan un incremento de la densidad de
carga y una mayor repulsin intramolecular, facilitando su solubilizacin.
De esta forma, la interaccin de las zonas hidrofbicas con el agua
disminuye, facilitndose la formacin de una capa de solvatacin.
Despus de la adicin de cierta cantidad de sal, se establece una
competencia entre los iones de la sal entre los grupos cargados de la
protena, por las molculas de agua, afectando la capa de solvatacin; en
estas circunstancias, los grupos hidrofbicos superficiales al ponerse en
contacto con el agua, originan un ordenamiento de las molculas del agua
alrededor de estas zonas, disminuyendo la entropa. Desde el punto de
vista termodinmico, esto es inestable; el resultado final es la agregacin
y la precipitacin de la protena. Ver figura 8.4.
< > = AGUA

Figura 8.4.- Representacin esquemtica del salting out.


Aquellas protenas con un gran nmero de restos hidrofbicos

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

superficiales, agregarn ms pronto que aquellas que presentan poca


hidrofobicidad superficial; estas ltimas requieren de concentraciones
salinas mucho ms altas para precipitar.
La solubilidad de una protena pura se describe con la siguiente ecuacin
emprica:
'
s

Log S = k
Donde:

S = solubilidad de la protena
= logaritmo de la solubilidad de la protena a fuerza
inica de cero, (depende da la naturaleza de la
protena, del pH y la temperatura)
'
s

k = constante de salting out (depende de la sal utilizada)


0,5

= fuerza inica
Es 0la figura 8.5 se puede observar el comportamiento de algunas
protenas al incrementar la concentracin de sulfato de amonio.
-0,5 que a pequeos cambios en la fuerza inica se producen
Obsrvese
cambios drsticos en la solubilidad de una protena.
-1,0

Log. Solubilidad
2

Figura 8.5.- Solubilidad de algunas protenas en sulfato de amonio.


La precipitacin por salado aunque fundamentalmente depende de las
interacciones hidrofbicas, existen otros factores pueden estar
contribuyendo a la misma, como por ejemplo el pH, ya que cambios en el
pueden eliminar centros cargados o viceversa; a pH 7 la solubilidad en

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

sales es generalmente mayor, ya que las protenas tienen all el mayor


nmero de grupos cargados. A pH coincidente con el PI, la agregacin
ocurre con mayor facilidad. Tambin la naturaleza de la sal es un
elemento importante, as como sus caractersticas fsicas; la alta
solubilidad de una sal por ejemplo permitir su utilizacin a altas
concentraciones.
Las caractersticas del catin y del anin son tambin importantes. Las
sales ms efectivas para la precipitacin son las que presentan aniones
polivalentes, tales como el sulfato, fosfato, citrato; mientras que el catin
es menos importante. La capacidad de precipitacin por salado de los
aniones sigue la serie de Hofmeister. Para algunos aniones comunes la

serie tienen el siguiente orden ascendente: SCN , I , ClO4 , NO , Br ,


Cl-, acetato, SO42- PO43-.
Aunque el fosfato aparece como el ms efectivo, en la prctica a pH
neutro consiste en una mezcla de HPO42- y H2PO4- (dibsico y
monobsico), los cuales son menos efectivos que el PO 43-. En la figura
8.6 se muestra el efecto de diferentes sales sobre la solubilidad de una
protena; en la fase de salting out se puede observar la mayor eficacia de
los aniones polivalentes, mientras que los cationes no presentan
diferencias marcadas; no obstante, se prefieren los monovalentes, siendo
el NH

el ms eficiente, despus el K+ y por ltimo el Na+.

Figura 8.6.- Solubilidad de una protena en funcin de su fuerza inica y

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

del tipo de sal.


En la zona de salting in los cationes son ms importantes que los aniones,
siendo ms efectivos los cationes monovalentes. La sal ms utilizada es
el sulfato de amonio debido a tres razones principalmente:
1. Es altamente soluble en agua
'
s

2. Tiene una alta k (constante de salting out), lo que permite la


precipitacin de la protena en un intervalo estrecho de concentracin
de sal.
3. Tiene un efecto estabilizante sobre las protenas, lo que favorece la
purificacin enzimtica.
SOLUBILIDAD

Las enzimas precipitadas con sales neutras mantienen su conformacin


nativa y se pueden redisolver sin prdidas apreciables de su actividad; un
precipitado proteico de sulfato de amonio es frecuentemente una de las
mejores formas de conservar una protena durante el proceso de
purificacin o cuando ya est pura.
8.5.2. PRECIPITACIN ISOELCTRICA
El pH 86 10 4 12
es un factor que puede hacer variar la carga superficial de las
molculas proteicas; la repulsin electrosttica de grupos con igual tipo
de carga, facilita el incremento de la solubilidad, mientras que la
eliminacin de de la repulsin facilita la agregacin y por tanto la
precipitacin. Cerca al PI estas repulsiones disminuyen, siendo mnimas
al valor del pH isoelctrico, al cual la carga neta es cero. Ver figura 8.7.

Figura 8.7.- Solubilidad de las protenas en funcin del pH.

Enzimologa

SOLVENTE
ORGNICO
ZONAS HIDROFBICAS

Ivn Paz Aliaga

La precipitacin isoelctrica se puede combinar con el efecto salino para


hacer ms eficiente la insolubilizacin. Esto se puede utilizar para separar
la enzima de inters si se conoce su PI o para precipitar contaminantes
mayoritarios de puntos isoelctricos conocidos.
A pHs extremos se produce desnaturalizacin de las protenas ya que en
determinadas zonas de la molcula se presentan cargas idnticas que
originan una repulsin interna; o tambin se pierden cargas que estn
involucradas en fuerzas de atraccin necesarias para el plegamiento de la
molcula, en la conformacin nativa.
8.5.3. PRECIPITACIN CON SOLVENTES ORGNICOS
Los solventes orgnicos miscibles en agua son utilizados para la
precipitacin de protenas, especialmente en procesos industriales. Son
muy usados el etanol y la acetona, los cuales originan una gran variedad
de efectos los cuales provocan la precipitacin de la protena disuelta en
el extracto. El efecto principal es la disminucin de la actividad del agua.
El poder de sotvatacin del agua por la molcula cargada disminuye
cuando la concentracin del solvente orgnico aumenta; esto puede
describirse en trminos de una reduccin de la constante dielctrica o
sencillamente como el desplazamiento de una gran parte del agua desde
el soluto hacia el solvente orgnico para hidratarlo.
Adems, el solvente orgnico desplaza las molculas de agua altamente
organizadas que se encuentran alrededor de las zonas hidrofbicas, lo
cual implica la solubilidad relativamente mayor de estas reas. Este
efecto es el que provoca que protenas extremadamente hidrofbicas
como las localizadas en membranas puedan disolverse con solventes
orgnicos libres de agua; sin embargo, el efecto neto sobre protenas
citoplasmticas y otras protenas solubles en agua es la disminucin de su
solubilidad, hasta producir la precipitacin.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Figura 8.8.- Formacin de agregados proteicos en la mezcla de aguasolvente orgnico.


En la figura 8.8 se esquematiza la agregacin de las protenas como
resultado de las interacciones entre zonas con cargas opuestas en la
superficie de las molculas proteicas.

Al seleccionar un solvente se deben tener en cuenta varios aspectos


como, el solvente debe ser completamente miscible con el agua, no
reaccionar con la protena y tener un buen efecto precipitante. Adems
del etanol y la acetona, tambin se han empleado metanol, n-propanol,
isopropanol, dioxano, 2-metoxietanol, entre otros, pero la nocividad as
como la inflamabilidad de algunos han hecho que hayan sido descartados
para procesos de purificacin, como el dioxano y el 2-metoxietanol.
La temperatura a la cual se realiza la precipitacin por solventes
orgnicos debe ser baja, ya que desde los 10C los efectos
desnaturalizantes comienzan a manifestarse. La desnaturalizacin se debe
a que el solvente orgnico afecta las interacciones hidrofbicas
intramoleculares de las protenas, que estabilizan la estructura
tridimensional nativa de la molcula. A bajas temperaturas es difcil que
el solvente pueda penetrar a la estructura interna de la molcula; sin
embargo, a temperaturas superiores, las pequeas molculas del solvente
orgnico pueden entrar a travs de brechas que se presentan
espontneamente en la superficie, debido a la flexibilidad natural de la
estructura.
Una ventaja del fraccionamiento con solventes orgnicos es que el
proceso se puede realizar a temperaturas por debajo de cero grados, ya
que los solventes orgnicos miscibles en agua disminuyen el punto de
congelacin de la mezcla por debajo de 0C. Los alcoholes de cadena
larga estn siendo utilizados ltimamente.

8.5.4. PRECIPITACIN CON POLMEROS ORGNICOS


Polmeros solubles en agua, neutros y con alta masa molecular
tienen la capacidad de agregar protenas, sin provocar desnaturalizacin,

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

por lo cual se pueden emplear como agentes precipitantes en la


purificacin de enzimas. Su uso es limitado debido a que estos presentan
una alta viscosidad. Uno de los polmeros ms usados es el
polietilenglicol, que se presenta con diferentes grados de polimerizacin.
Las soluciones de polietilenglicol al 20% no son tan viscosas, existen
muchas protenas que precipitan a concentraciones incluso menores a
esta. El comportamiento de las protenas es muy similar al que ocurre en
la precipitacin con solventes orgnicos y en este sentido el
polietilenglicol puede considerarse como un solvente orgnico
polimerizado, aunque el porcentaje requerido para provocar la
precipitacin es ms bajo que con el solvente orgnico.
El polietilenglicol ni es tan fcil de eliminar de la fraccin proteica como
las sales o los solventes orgnicos, ya que no dializa fcilmente y su
separacin en columnas de exclusin molecular no es buena. A pesar de
esto, un nivel residual bajo de polietilenglicol no es un inconveniente
para muchos procedimientos. La precipitacin por salado, las
cromatografas de intercambio inico, de afinidad o gel, pueden
realizarse sin la necesidad de eliminar primero el polmero en mencin.
Tambin se han utilizado polmeros cargados, especialmente en
aplicaciones industriales. En estos casos la precipitacin se debe a
complejos electrostticos entre la protena y el polmero cargado, por lo
que debe tomarse en cuanta el pH de trabajo, de forma tal que la protena
presente la carga necesaria para formar el complejo con el polmero. En
este sentido se han utilizado poliacrilatos, DEAE-dextrano, entre otros.
8.5.5. PRECIPITACIN
POR
DESNATURALIZACIN
SELECTIVA
Una protena desnaturalizada en condiciones de baja tuerza inica
y lejos de su PI puede permanecer soluble y solo precipitara cuando el
pH se ajuste. Esto se debe a las fuerzas de repulsin entre las cadenas al
azar que hace que se mantengan apartadas.
El objetivo de la desnaturalizacin selectiva como una etapa de
purificacin enzimtica, es crear las condiciones para que la enzima de
inters no se desnaturalice, mientras que muchas otras protenas
contaminantes si lo hagan y precipiten por el tratamiento.
La temperatura afecta a todas las protenas, pero algunas son ms
termoestables que otras. En la figura 8.9 se muestran algunas curvas de

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

desnaturalizacin para diferentes protenas hipotticas; cuando se conoce


el valor mximo de la temperatura a la cual la enzima es estable, en un
periodo de tiempo determinado, se puede aplicar este principio como una
etapa que elimina a aquellos contaminantes no estables a la temperatura
utilizada.

100

75

80

50

% ESTRUCTURA NATIVA REMANENTE

Figura 8.9.- Curvas de desnaturalizacin trmica de un grupo de


protenas hipotticas.
8.6. TCNICAS CROMATOGRFICAS
En estas tcnicas el principio de separacin est relacionado con
una propiedad25
particular de la molcula proteica, lo que les confiriere un
mayor poder resolutivo. Entre las tcnicas cromatogrfcas podemos
encontrar una gran variedad de tipos, que adems de diferenciarse en el
principio de separacin, tambin pueden presentar distintos grados de
40
50
60
70
T que
C
resolucin y capacidad. La
gran variedad
de
tcnicas
cromatogrfcas
existen se debe al desarrollo tecnolgico alcanzado hasta el presente.
8.6.1. CROMATOGRAFA DE REPARTO
En ella las sustancias se colocan en un sistema que consta de dos
componentes distinguibles, una fase mvil y una fase estacionaria; los
solutos se separan debido a diferencias de distribucin entre ambas fases.
El movimiento relativo de cada molcula es el resultado de un equilibrio
entre la fuerza de transmisin (el movimiento de la fase mvil) y la
fuerza que tiende a frenar este desplazamiento (la fase estacionaria).
A la fase estacionaria se le llama sorbente; s este es un lquido que es
mantenido en forma estacionaria por un slido, este ltimo recibe el

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

nombre de soporte o matriz. La fase mvil es el disolvente o revelador.


La cromatografa de reparto se basa en que, si dos fases se encuentran en
contacto y si una de las dos contiene un soluto, este se distribuir entre
las dos fases; esto se conoce como reparto y viene descrito por el
coeficiente de reparto, es decir, la relacin entre las concentraciones del
soluto en las dos fases.
La cromatografa de reparto empleada en purificacin enzimtica consta
de una columna (un tubo de material fcilmente cortabe), lleno de un
sorbente y un disolvente; una solucin que contiene el soluto se coloca en
la parte superior del sorbente y puede penetrar en su interior. A
continuacin se permite fluir el disolvente a travs de la columna.
Aunque el sorbente y el disolvente adoptan una disposicin continua a
todo lo largo de la columna, esta puede considerarse formada por un gran
nmero de capas individuales (lminas tericas) que contienen cada una
las dos fases.
Considrese 256 molculas idnticas que se distribuyen equitativamente
entre las dos fases: estacionaria y mvil, y una columna de dieciocho
lminas (ver figura 8.10). En la lmina superior las 256 molculas estn
distribuidas de forma que 128 se encuentran en cada fase. Cuando las 128
molculas de la fase mvil pasan a la segunda lmina, en est ltima se
distribuyen 64 y 64 en cada fase; de las 128 que permanecen en la lmina
1, tambin se distribuirn en ella 64 y 64 respectivamente. Si la fase
mvil vuelve a avanzar una lmina ms, vuelve a tener lugar la
redistribucin de las molculas: lmina 1:32 y 32; lmina 2:64 y 64 y
lmina 3:32 y 32. Despus de 20 transferencias sucesivas se consigue lo
mostrado en la figura 8.10 (cifras del interior de la columna, a la
izquierda en redondilla la fase mvil y a la derecha en cursiva la fase
estacionaria).
Si 256 molculas pero de un tipo distinto al anterior, se encuentran
tambin en la mezcla, y cuya distribucin entre la fase estacionaria-mvil
es de 3:1, la figura 8.10 muestra como seria su distribucin en las
diferentes lminas tericas luego de 20 transferencias (cifras que estn a
ambos lados de la columna, a la derecha la fase estacionaria y a la
izquierda la fase mvil). Las distribuciones de estos dos tipos de
molculas sin diferentes y a lo largo del proceso se separa una fraccin
sustancial de las molculas; a medida que aumenta el nmero de lminas
tericas (es decir la longitud de la columna), se conseguir una mayor
separacin.

Nmero de Molculas

Extremo superiorNmero de lminas


de la columna

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Asimismo, a medida que aumenta el nmero de lminas, el material se


extiende a travs de una zona cada vez mayor de la columna; por otra
parte, el grado de difusin disminuir en el sentido de que un porcentaje
1:1
cada vez mayor del material se encuentra en un nmero reducido de
lminas. Por ejemplo en la figura 8.10, el 40% de las molculas que se
distribuyen en una proporcin 1:1, despus de 8 transferencias se
encuentran contenidas en 4/8 de las lminas; al cabo de 20 transferencias
el 40% se encuentran en 6/16 en 3/8 de las lminas. Estas
consideraciones ponen de manifiesto que en un caso ideal en el que la
fase mvil (en redondilla) y la fase estacionaria (en cursiva); forman la
clase 1:1. La clase 1:3 (en trazo ms fino) se distribuye de modo que el
25% se encuentra en la fase mvil y el 75% en la fase estacionaria. El
1:3
esquema
muestra la distribucin luego de 20 transferencias.

64 128128 19248
16

6464

14436

3232

1089

11

252

00

60

00

6464

4824

6464

7221

77

6010

00

301

00

3232

1220

2121

6015

22

465

00

17

10

3535

3214

66

4210

00

30

3535

1112

1515

3512

00

36

2121

26

2424

1412

11

36

77

13

2828

810

66

31

11

2424

47

1212

19

1515

24

1818

11

66

2222

22

2222

11

1818
1212
666
22
11

13

20

Nmero de Transferencias

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Figura 8.10.- Funcionamiento de una columna de cromatografa de


reparto.
La matriz utilizada en este tipo de cromatografa no debe adsorber a los
solutos; los materiales ms comunes son la tierra de diatnicas (celite),
el gel de slice, celulosa en polvo y algunos dextranos como el
Sephadex LH20.
8.6.2. CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
En este tipo de cromatografa, una superficie slida con una
amplia variedad de sitios de unin, por ejemplo, regiones con una
densidad electrnica elevada (cargadas negativamente), con una densidad
electrnica baja (cargadas positivamente), no polares, etc, se ponen en
contacto con un lquido que contiene un soluto. Si la unin es reversible,
el nmero de molculas unidas a la superficie depender de la
concentracin del soluto. Esta dependencia se muestra en la figura 8.11;
las curvas de este tipo reciben el nombre de isolneas de adsorcin.
Soluto Adsorbido
Concentracin de Soluto

Figura 8.11.- Distribucin de tres solutos distintos en una columna de


adsorcin, en funcin de su concentracin.
El tipo ms corriente es la isolnea convexa, es decir, los sitios de unin
con una afinidad elevada son rellenados en primer lugar, de modo que
cantidades adicionales de soluto se unen con menos fuerza. La isolnea
de unin es caracterstica de cada molcula en particular y de cada
sorbente. Si se aplica un conjunto de partculas a una columna que
contiene un soporte slido y se deja fluir un disolvente a travs de ella,
una cantidad fija de molculas se unir al soporte y el resto se desplazar
a lo largo del mismo. El material que avanza podr volcerse a enlazar
pero con dos diferencias: 1) la fuerza de retraso es la unin o adsorcin y

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

2) la fraccin que se une no es una fraccin constante, s no que


disminuye a medida que disminuye la concentracin; la velocidad con
que se mueve la sustancia est relacionada con la fuerza de unin, siendo
ms lento el movimiento cuanto ms firme es la unin. En consecuencia,
las molculas pueden separarse si tienen isolneas de adsorcin
diferentes, debido a que sufrirn un grado diferente de retraso.
Una columna cromatogrfica consiste en un tubo que se llena con el
material de la fase estacionaria, ms un solvente. A continuacin se
coloca un pequeo volumen de la muestra (una capa delgada) sobre la
fose estacionaria; se la deja penetrar en la columna (esto se llama carga
de la columna). La cromatografa se desarrolla al dejar fluir un disolvente
(fase mvil) a travs de la columna, (ver figura 8.12). Este ltimo
proceso toma el nombre de elusin de la columna; segn se van
moviendo las diferentes sustancias a travs de la columna, se van
separando y aparecen en el efluente cuando han atravesado la columna,
en distintas fracciones de recoleccin.

Figura 8.12.- Funcionamiento de una columna de adsorcin, vase las


dos etapas diferentes de elucin.
El volumen total del material de la columna tanto slido como lquido,
recibe el nombre de volumen del lecho. El volumen de la fase mvil es
el volumen vaco o volumen de retencin. La cantidad de volumen que se
debe aadir para producir un pico de un soluto concreto en el efluente se
llama volumen de elucin.
La forma en la que se prepara el lecho de una columna se denomina

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

empaquetamiento. Es muy importante que el lecho sea homogneo y no


presente burbujas, grietas o espacios entre las paredes; el flujo desigual
que dificulta el proceso se denomina flujo acanalado. El efecto normal de
este acanalamiento es la distorsin del patrn de elusin, de forma que
una sustancia aparece en picos mltiples; ello es el resultado del
movimiento rpido de la fase mvil a travs de la columna en estas
desigualdades y el restablecimiento del reparto o la adsorcin en un
nuevo punto.
El lquido que abandona la columna se recoge en fracciones discretas
utilizando un colector de fracciones como puede verse en la figura 8.13.
Los componentes que ya estn separados se encuentran e identifican
titulando alcuotas de cada fraccin (midiendo actividad enzimtica).
Las columnas pueden ser eluidas de tres formas: el mtodo ms sencillo
consiste en un flujo continuo del disolvente a travs de la columna. El
segundo mtodo es la elucin por pasos, que se utiliza cuando la columna
funciona con propsitos preparativos; la columna es eluda con un
disolvente hasta que se alcance un volumen predeterminado; a
continuacin se aade un segundo disolvente. Este mtodo tiene la
ventaja que un material concreto puede eluirse en un volumen bastante
pequeo. Considrese una mezcla de sustancias en que la sustancia X
sufre un fuerte retraso cuando se emplea el disolvente A, mientras que las
dems sustancias experimentan un retraso muy pequeo; adems, X
experimenta un retraso muy dbil con el disolvente B. Por lo tanto, s se
lava la columna con un exceso de disolvente A, la mayor parte del
material es eludo de la columna, mientras que la mayor parte de X queda
unido a ella. Si a continuacin se lava la columna con el disolvente B, se
eluye X con rapidez y en un volumen relativamente pequeo.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Figura 8.13.- Colector de fracciones automtico: a medida que se


recolecta una fraccin definida, el colector gira al siguiente tubo. La
fraccin recolectada puede ser un volumen fijo, un nmero de gotas
determinado o un tiempo especfico de recoleccin.
El tercer mtodo es el de elucin en gradiente, que consiste en cambiar
la relacin de los dos disolventes o elevar la concentracin de uno de los
componentes del disolvente (por ejemplo la concentracin de una sal o la
concentracin de hidrogeniones). Este mtodo es el ms utilizado en las
columnas de adsorcin y de intercambio inico. Las gradientes se
preparan en aparatos similares a 1 mostrado en la figura 8.14.

Figura 8.14.- Aparato utilizado para preparar una gradiente de elusin:


Consta de dos recipientes, un depsito (A) y una cmara de mezcla (B)
que estn conectados por sus bases; el depsito contiene el solvente ms
concentrado y la cmara de mezcla el solvente en menor concentracin;
el lquido sale de la cmara de mezcla y entra en la columna; el lquido
fluye simultneamente del depsito a la cmara de mezcla.
La cromatografa de adsorcin utiliza una fase lquida mvil y una fase
estacionaria slida; la separacin puede realizarse en columnas o en capa
fina. La tabla 8.1 indica los adsorbentes ms comunes y sus diferentes
usos.
Tabla 8.1
MATERIALES DE USO CORRIENTE EN CROMATOGRAFA
DE ADSORCIN
MATERIAL

COMPUESTOS QUE SEPARA

Almina

Pequeas molculas orgnicas, protenas

Gel de slice

Esteroles, aminocidos

Enzimologa
Carbn activado
Gel de fosfato de calcio
Hidroxiapatita

Ivn Paz Aliaga


Pptidos, aminocidos, glcidos
Capa de la
muestra

Protenas, polinucletidos
cidos nucleicos

8.6.3. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR


Llamada tambin cromatografa en gel o de tamiz molecular, es
un tipo especial de cromatografa de reparto en la que la separacin se
basa en el tamao molecular. Se prepara una columna de partculas muy
finas de una sustancia inerte, que contenga poros muy pequeos. Si se
hace pasar una solucin con molculas de distintas dimensiones a travs
de la columna, las molculas con tamao mayor al de los poros se
movern solo en el espacio que queda entre las partculas y, por lo tanto,
no sufrirn retraso en su recorrido a travs del material de la columna.
Sin embargo, las molculas con un tamao menor que el de los poros,
difunden hacia el interior de las partculas con una probabilidad que
aumenta a medida que disminuye el tamao molecular. Debido a ello, se
movimiento de descenso a travs de la columna se hace ms lento. Por lo
tanto, las molculas son eludas de la columna por orden de tamaos
decrecientes. Ver figura 8.15

Figura 8.15.- Separacin por cromatografa en gel: las molculas


mayores que los poros se mueven ms rpidamente que las pequeas,
debido a que estas ltimas se mueven por el interior y el exterior de los
poros.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Un gel es un retculo tridimensional cuya estructura se dispone por lo


general al azar Los geles que se utilizan como tamices moleculares
constan de polmeros entrecruzados, por lo general inertes, que no se
unen ni reaccionan con el material analizado y que no presentan carga
elctrica. El espacio interior del gel est ocupado por un lquido que
rellena la mayor parte del gel.
Los geles de uso corriente son de tres tipos: dextrano, agarosa y
poliacrilamida, para soluciones acuosas. El dextrano es un polisacrido
compuesto por restos de glucosa y producido a partir de sacarosa por la
bacteria Leuconostoc mesenteroides. Se prepara con diversos grados de
entrecruzamiento para controlar el tamao del poro y es suministrado en
forma de granos secos, con diversos grados de finura, que se dilatan
cuando se les aade agua. El proceso por el que los granos quedan llenos
de lquido recibe el nombre de hinchazn. El dextrano se obtiene
comercialmente con el nombre de Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals,
Inc.).
La agarosa es un polmero lineal de D-galactosa y 3,6 anhidro-1galactosa; se obtiene de ciertas algas marinas y forma un gel que se
mantiene compacto sin necesidad de entrecruzamiento, por medio de
puentes de hidrgeno. Se disuelve en agua hirviendo y forma un gel
cuando se enfra. La concentracin del material en el gel determina el
tamao de los poros (que son mucho mayores que los del Sephadex).
Este se emplea para separar grandes protenas globulares. Es
suministrada en forma de granulos hmedos que reciben el nombre de
Sepharosa (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) y de Bio-gel A (Bio-Rad
Laboratories).
Los geles de poliacrilamida se preparan entrecruzando acrlamida con
N,N-metiln-bis-acrilamida. Ac tambin el tamao del poro viene
determinado por el grado de entrecruzamiento. Estos geles reciben el
nombre de Bio-gel P (Bio-Rad Laboratories), tienen la ventaja sobre los
dextranos de poder obtenerse comercialmente en un amplio margen de
tamaos de poro. Recientemente han salido a la venta otros materiales
para este tipo de cromatografa como el vidrio poroso (Bio Glas, Bio-Rad
Laboratories).
Todos los geles descritos hasta el momento se dilatan en agua o en unos
pocos solventes orgnicos: glicol o formamida. Actualmente se estn
desarrollando otro tipo de geles para poder utilizar solventes apelares. En
la tabla 8.2 se muestran materiales empleados en cromatografa en gel.

Enzimologa
VENTAJAS DE
MOLECULAR

Ivn Paz Aliaga


LA CROMATOGRAFA DE

EXCLUSIN

1. Debido a que el comportamiento cromatogrfico de casi todas las


sustancias en los geles es independiente de la temperatura, pH, fuerza
inica y composicin de tampones, se pueden realizar separaciones
prcticamente bajo cualquier condicin. Cuando se trabaja con
materiales muy lbiles como las enzimas, se puede mantener las
condiciones para una mxima estabilidad.
2. Como no hay adsorcin, la mayora de sustancias lbiles no son
afectadas.
3. Existe menor dispersin de las bandas que con cualquier otra tcnica
cromatogrfica.
4. El volumen de elucin se relaciona de forma sencilla con el peso
molecular.
TABLA 8.2
MATERIALES EMPLEADOS EN LA
CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR
Material y nombre comercial

Margen de fraccionamiento (peso molecula

Dextrano
Sephadex G1O
Sephadex G25
Sephadex G75
Sephadex G200

700
1000 5000
3000 70000
5000 800000

Potiacrilamida
Bio-gel P2
Bio-gel P6
Bto-gel P150
Bio-gel P300

200 2000
1000 6000
15000 150000
80000 400000

Agarosa
Sepharosa 2B
Sepharosa 4B
Bio-gel A-0,5 M
Bio-gel A-15 M
Bio-gel A-150 M

2 x 106 - 25 x 108
3 x 105 - 3 x 106
30000 500000
30000 - 15 x 106
5 x 106 - 150 x 106

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

8.6.4. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO


Un intercambiador inico es un slido que tiene enlazados
qumicamente grupos cargados, a los que se unen iones por fuerzas
electrostticas; puede intercambiar estos iones por iones de una solucin
acuosa. Los intercambiadores inicos pueden utilizarse en columnas para
separar molculas de acuerdo con su carga.
El principio de la cromatografa de intercambio inico es que las
molculas cargadas se adsorben a los intercambiadores de forma
reversible, de modo que dichas molculas pueden ser unidas o desunidas
cambiando el ambiente inico. La separacin mediante intercambiadores
inicos se realiza en dos fases: en la primera, las sustancias a separar se
unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin
fuerte y estable; a continuacin, se eluye la columna con tampones de
diferente pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del
tampn con el material, por los sitios de unin.
Si el intercambiador inico tiene grupos cargados negativamente, podr
intercambiar iones positivos y ser un intercambiador de cationes o

catinico. Un grupo tpico que se utiliza es el sulfnico, SO . Si se une


un H+ al grupo se dice que el intercambiador se encuentra en forma cida,
y puede, por ejemplo, intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca
2

.
Otros grupos que se usan corrientemente son el carboxilo y el hidroxilo
fenlico. Si el grupo cargado es positivo (por ejemplo, un grupo amino
cuaternario) es un intercambiador de aniones o amnico.
La matriz puede estar hecha de diferentes materiales; los de ms uso son
el dextrano, la celulosa y los copolmeros de estireno y divinil
benceno. La tabla 8.3 muestra los intercambiadores inicos de ms uso.
Tabla 8.3
PROPIEDADES DE ALGUNOS
INTERCAMBIADORES INICOS
Matriz

Intercambiador

Grupo Funcional

Nombre Comercial

Enzimologa
Dextrano

Celulosa

Acrilico
Feniica
Epoxiamina

Ivn Paz Aliaga


FC
DC
FA

Sulfopropilo
Cartoximetito
DietIl-(2 hidroxipropil)
aminoetilo
Dietilaminoetilo

SP-Sephadex
CM-Sephadex
QAE-Sephadex
DEAE-Sephadex

C
C
A
A
A

Carboximetilo
Fosfo
Dietilaminoetilo
Polietilenimina
p-aminobenzilo

CM-celulosa
P-cel
DEAE-celulosa
PEl-celulosa
PAB-celulosa

DC
FC
DA

Carboxlico
cido sultnico
amino terciario

Bio Rex-70
Bio Rex-40
AG-3

La capacidad total de un intercambiador inico es una medida de la


captacin de iones intercambiables y se expresa como los
miliequivalentes de grupos intercambiables por miligramo de peso seco.
Este nmero es suministrado por el fabricante y es importante debido a
que si se excede en su capacidad, los iones pasarn a travs de la
columna sin unirse.
La carga del intercambiador depende del pH, asimismo, de la fuerza
inica, debido a que los iones pequeos situados cerca de los grupos
cargados compiten con las molculas de la muestra por estos grupos; por
lo tanto, conforme aumenta la concentracin del tampn, la competicin
se hace ms intensa.
Los intercambiadores inicos vienen en distintos tamaos de malla. Las
mallas ms finas presentan una mayor relacin superficie-volumen y, por
lo tanto, aumentan la capacidad del intercambiador. Por otra parte las
mallas finas implican una velocidad de flujo menor, con lo que pueden
aumentar la extensin por difusin. La porosidad de la matriz es tambin
un factor importante.
La eleccin del intercambiador inico depende de muchos factores:
Si ser aninico o catinico dependiendo de si los materiales a unirse
tienen una sola carga: No obstante las protenas presentan cargas
positivas y negativas y su garga neta depende del valor de pH. En tales
casos el factor principal es la estabilidad de la sustancia a diversos
valores de pH.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

La mayora de las protenas son estables dentro de un margen de pH


determinado en el que estn cargadas o positiva o negativamente. Por lo
tanto, si una protena es estable a valores de pH por encima del PI, se
debe utilizar un intercambiador aninico; si es estable por debajo del PI,
utilizaremos un intercambiador catinico. La eleccin entre
intercambiadores fuertes o dbiles tambin es importante y esta basada
en el efecto del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se va a
cromatograar una sustancia dbilmente cida que necesita pHs muy
altos o muy bajos para su ionizacin, se requiere de un intercambiador
fuerte debido a que este funciona a pHs extremos. No obstante, se la
sustancia es lbil, es preferible utilizar intercambiadores dbiles. Los
intercambiadores dbiles son tambin buenos para separar molculas con
una carga elevada de aquellas con poca carga, debido a que los iones
dbilmente cargados no se unen por lo general al intercambiador. Los
intercambiadores dbiles permiten una mayor resolucin si las
diferencias de carga son muy pequeas.
8.6.5. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Es un tipo de cromatografa que utiliza la afinidad especfica entre
la sustancia que debe aislarse y una molcula a la que esta puede unirse
de forma especifica (un ligando). R1 material de la columna se sintetiza
por unin covalente del ligando con una matriz insoluble; a partir de este
momento la columna es capaz de adsorber en forma especfica, de la
solucin, la sustancia que va a ser aislada. La elucin se realiza
cambiando las condiciones de manera que la unin ya no tenga lugar.
Para esta cromatografa deben cumplirse ciertos requisitos:
1. La matriz no debe adsorber por si misma a ninguna molcula.
2. El ligando debe unirse a la matriz sin alteracin de sus propiedades
de unin.
3. Debe escogerse un ligando cuya unin sea fuerte.
4. Debe ser posible la elucin sin destruccin de la muestra.
El principal uso de esta cromatografa es la purificacin de protenas,
membranas y polisacridos: Para la purificacin de enzimas se puede
acoplar a la matriz el sustrato, un inhibidor que se una con fuerza o un
cofactor. Si se hace pasar a travs de la columna una mezcla de protenas
o un extracto celular crudo, solo permanecern en la columnalos
materiales que se unan al ligando. Este mtodo podra considerarse como
el ms adecuado para purificar enzimas, sin embargo, debido a que
muchas enzimas pueden unirse al mismo sustrato, solo se consigue una

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

purificacin parcial.
8.7. MTODOS AUXILIARES DE PURIFICACIN
Durante una purificacin es posible que la enzima que se est
purificando no est en condiciones apropiadas para aplicar el siguiente
paso de purificacin, por ejemplo puede estar en baja concentracin o en
una solucin con un alto contenido de sales; para solucionar estos
problemas se aplican mtodos especficos que por sus caractersticas y el
objetivo para los que son utilizados no constituyen, con algunas
excepciones, verdaderos mtodos de purificacin pero que, sin embargo,
son muy tiles y a veces imprescindibles.
8.7.1. CONCENTRACIN
Existen varias formas de concentrar la muestra enzimtica en
purificacin, una de ellas es la concentracin por precipitacin por la
adicin de sulfato de amonio, aunque tambin puede hacerse agregando
acetona. La desventaja de este mtodo es que el precipitado redisuelto
contiene el agente precipitante, que muchas veces se debe eliminar. Estos
mtodos de precipitacin son adecuados solamente cuando el contenido
proteico del extracto est por encima de 1 mg por ml.
Otra forma de concentrar es por adsorcin, por ejemplo en un
intercambiador inico, en este caso, solo se requiere que la enzima se
adsorba totalmente sin que importe el resto de protenas. Aunque los
mtodos ms importantes son aquellos en los que se produce eliminacin
de agua conjuntamente con solutos de bajo peso molecular; esto puede
lograrse con una gran variedad de procedimientos utilizando membranas
semipermeables (dilisis) o el principio de cromatografa en gel. Las
partculas secas de un Sephadex G-25 por ejemplo, cuando se hinchan
absorben agua ms no protenas, pues el tamao de sus poros es pequeo;
si tratamos 100 mi de solucin de purificacin con 20 gramos secos del
Sephadex en mencin, se obtiene un volumen final de 30 mi que
contienen un 80% de la protena original.
En la utilizacin del principio de dilisis, la muestra se coloca en una
bolsa de dilisis que se rodea de un polvo que atrae el agua. Las
sustancias ms utilizadas pare este fin son el polietilenglicol (PM 20000)
y carboximetil celulosa; el inconveniente son las impurezas de bajo peso
molecular que pueden estar presentes en estos materiales.
El sistema ms usado para eliminar agua es la ultrafiltracin; en este

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

mtodo el agua es forzada a salir a travs de una membrana dejando atrs


la solucin de protena ms concentrada. Se ejerce una presin de hasta 5
atmsferas utilizando nitrgeno sobre la muestra que se encuentra en
agitacin constante para evitar la obstruccin de la membrana, ver figura
8.16. La velocidad de ultrafiltracin disminuye a medida que la
concentracin de protena va aumentando. Este mtodo permite reducir el
volumen de la solucin hasta en 20 veces y tiene la ventaja de eliminar
sales u otras sustancias de bajo peso molecular, e inclusive, si se maneja
bien el tamao del poro, hasta protenas de bajo peso molecular. Sin
embargo, si la protena tiene un tamao solo de 50% ms que el poro, lo
atravezar.

Agitador Magntico

Figura 8.16.- Equipo de ultrafltracin.


El mtodo preferiblemente usado para conservar las muestras de una
protena es la liofilizacin. Este mtodo conocido tambin como
criodesecacin consiste en secar una solucin o un cuerpo embebido en
agua, manteniendo la temperatura lo suficientemente baja, para que la
mayor parte del agua que contiene se congele. La extraccin del agua se
lleva a cabo por sublimacin.
La lioflizacin se aplica a sustancias acuosas de fcil descomposicin y
gran labilidad como suero y plasma sanguneos; el mtodo no solo se
limita a soluciones acuosas sino a sistemas con solventes distintos.
Esta tcnica presenta la ventaja de la congelacin y deshidratacin, lo

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

cual conserva durante largos periodos de tiempo, sustancias que


mantienen prcticamente todas sus propiedades iniciales, incluyendo
organismos vivos. Consta de 3 etapas fundamentales:
1. Precongelacin; el producto se congela completamente
2. Deshidratacin primara: se mantiene congelado el producto y se
extrae el agua por sublimacin (agua no ligada)
3. Deshidratacin secundaria: una vez desaparecidos todos los cristales
de hielo, el producto es cuidadosamente calentado y comienza la
eliminacin del agua que no form hielo (agua ligada) que se
encuentra fuertemente unida al producto, por fenmeno de adsorcin.
8.7.2. ELIMINACIN DE SALES
Los dos mtodos ms empleados para eliminar sales son la
dilisis y la cromatografa en gel, este ltimo se coment anteriormente.
El uso convencional de bolsas de dilisis est basado en las fuerzas
osmticas; las altas concentraciones de sales o solventes orgnicos en la
muestra provocan que el agua entre el interior del saco, antes que las
sales lo abandonen (aumento de volumen de la bolsa en los primeros
momentos si la concentracin del soluto es alta). Por esta razn la dilisis
se usa tanto para eliminar exceso de soluto de bajo peso molecular como
para introducir una solucin nueva de buffer a la muestra.
La eliminacin completa de las sales endgenas no se puede lograr en
una sola dilisis; si el volumen del buffer es 50 veces el de la bolsa,
entonces la mejor dilucin que se puede lograr es de 50 veces en el
interior del saco. Un sistema con agitacin continua alcanza el equilibrio
entre 2 a 3 horas. Mientras mayor es el volumen del buffer contra el que
se dializa, menos cambios se requieren, por ejemplo un volumen de
tampn 100 veces mayor que el de la muestra, justificara solo una
dilisis.
Antes de dializar es recomendable tratar las membranas para eliminar
una serie de sustancias contaminantes que se introducen durante su
manufactura. Un buen mtodo es hervirlas con una solucin de EDTAbicarbonato. Para guardar membranas ya usadas es recomendable
conservarlas en una solucin de bicarbonato-EDTA.
8.7.3. MTODOS PARA DETERMINAR CONCENTRACIN
PROTEICA
Para la elaboracin de la tabla de purificacin es imprescindible

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

conocer el contenido proteico total por mililitro de muestra, para poder


determinar la actividad especfica y la pureza en cada etapa de
purificacin. Los mtodos ms utilizados son el Biuret, Lowry-Folin
Ciocalteu, absorcin de luz a 280 nm o 205 nm y unin a colorantes.
Cada uno de estos mtodos tienen ventajas y desventajas particulares,
pero es bueno indicar que todos ellos mientras no se equilibran con una
protena de idntica composicin, brindan una respuesta aproximada (con
error); en la prctica esto sigmifica que mediciones exactas de protenas
solo pueden hacerse para protenas puras, despus de estandarizarlas
frente a una determinacin de peso seco para algn mtodo.
MTODO DE BIURET
Se basa en la reaccin del cobre alcalino con los grupos alfa amino de los
aminocidos que conforman las protenas, produciendo un complejo de
color morado. El mtodo cuantifica cantidades de protena entre 0,5 y 5,0
mg (poca sensibilidad). Una mayor sensibilidad se logra si la medicin al
espectrofotmetro en lugar de hacerla a 540 nm se hace entre 310 -330
nm (UV cercano). Esta variante conocida como micro Biuret (, Biuret)
es cinco veces ms sensible que la convencional (0,1 a 1,0 mg), sin
embargo requiere de varios blancos para restar la absorcin inespecfica a
esa longitud de onda.
Es importante indicar que el amoniaco interfiere la determinacin al
acomplejarse con el cobre, por lo que las fracciones con sulfato de
amonio no brindan resultados adecuados.
MTODO DE LOWRY
Es la tcnica ms utilizada, a pesar de sus desventajas; este se basa en la
combinacin de la reaccin de cobre del mtodo de Biuret con la
reaccin del reactivo de Folin-Ciacalteu con fenoles, tales como la
tirosina de las protenas. Esta combinacin brinda un color fuerte con las
protenas y su sensibilidad oscila entre 0,05 y 0,5 mg. Sin embargo
muchos compuestos usados en los procesos de purificacin interfieren
con la reaccin. Otra desventaja es la diferencia en el contenido tirosinas
entre las distintas a protenas.
ABSORCIN DE LUZ UV
Las protenas por la presencia de tirosina y triptofano en su estructura
absorben luz a 280 nm; el contenido de estos aminocidos vara mucho
de protena a protena, por lo que los coeficientes de extincin
expresados para un mg de protena por mi de solucin oscilan entre 0,4 a

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

1,5 para distintas protenas.


La absorcin a 280 nm brinda una idea aproximada de la concentracin
de protena; sin embargo, durante una purificacin, es posible utilizar esta
medicin para tener un criterio relativo sobre la eliminacin de protenas
en cada paso de purificacin. Para protenas puras, este es el mtodo ms
adecuado ya que no requiere de ninguna manipulacin (excepto la
dilucin si es necesaria); asimismo se dice que este mtodo es no
destructivo por cuanto la cantidad utilizada en la determinacin puede
ser devuelta a la muestra original. El requerimiento principal sera el
conocer el coeficiente de extincin para una protena en particular. Este
mtodo tambin requiere de un blanco apropiado.
La absorcin en el UV lejano es un mtodo ms sensible y menos
dependiente dla composicin aminoacdica de la protena. Requiere de
espectrofotmetros ms costosos pues la lectura se hace entre 200 y 220
nm; la longitud de inda con menos variacin en su coeficiente de
extincin es la de 205 nm, donde las distintas protenas oscilan entre 28,5
y 33. Este mtodo requiere de cubetas limpias, buffers con mnima
absorcin y tiene una sensibilidad entre 0,01 a 0,05 mg.
UNION A COLORANTES
Tiene una alta sensibilidad y rapidez similares al mtodo de Lowry.; el
colorante ms usado es el azul de Coomassie G-250, en cido (cido
fosfrico), toma un color pardo rojizo pero cuando se une a las protenas
restaura el color azul. Se lee a una longitud de onda de 595 nm y su
sensibilidad oscila entre 0,01 y 0,05 mg y el color desarrollado depende
moderadamente de la composicin de aminocidos de la protena.

EJERCICIOS CAPITULO VIII


1. De que forma se puede evitar la presencia de compuestos fenlicos
en un extracto de origen vegetal?
1. Qu desventajas muestra el mtodo de Biuret para determinar
protenas totales durante un proceso de purificacin?
2. Qu ventajas muestra el sulfato de amonio respecto a otras sales,
como precipitante de protenas en una purificacin enzimtica?

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

3. Qu ventajas muestra la cromatografa de exclusin molecular sobre


las otras cromatografas en una purificacin enzimtica?
4. Cul es el mtodo ms recomendable para concentrar una muestra
cuando el contenido proteico esta por debajo de un mg/ml?

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

CAPITULO IX

CONTENIDO

PRODUCCIN DE ENZIMAS MICROBIANAS


Las enzimas han sido empleadas en la industria desde hace muchos aos;
hasta los aos 60 del siglo pasado, las enzimas provenientes de plantas y
tejidos animales eran econmicamente las de mayor importancia; la
dcada de los 70s se inicia con una revolucin industrial en cuanto a la
produccin de enzimas, pues se empiezan a producir enzimas de origen
microbiano en gran escala, gracias al desarrollo de la Microbiologa,
Biologa molecular e Ingeniera gentica.
El explosivo desarrollo de las enzimas proteolticas de origen bacteriano
empleadas en la fabricacin de detergentes, invirti ms rpido de lo
esperado esta situacin. Para 1969 las ventas de la empresa Novo
aumentaron 50 veces respecto a las de aos anteriores en que solo
producan enzimas de origen eucaritico. Pero la tecnologa del DNA
recombinante permita ya la obtencin de enzimas de organismos
superiores a partir de microorganismos.
EL MICROORGANISMO
El primer aspecto en considerar en el desarrollo de un sistema de
produccin de enzimas es, desde luego, la seleccin del microorganismo
adecuado para el proceso. En este sentido se tienen muchos avances
recientes en Biotecnologa. Consideremos primeramente las
caractersticas deseables de los microorganismos:
1. No debe ser patgeno ni producir toxinas. La reglamentacin de la

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

FDA (Food and Drug Administraron), considera GRAS a una enzima


producida por un microorganismo GRAS (Generalmente reconocido
como seguro). De no ser as, la enzima es catalogada como aditivo y
se ve sujeta a largas y costosas pruebas para demostrar su inocuidad
lo que puede retrasar su aplicacin unos 8 aos. Por esta razn, un
gran nmero de enzimas comerciales son producidas por A. niger, A.
oryzae y R. oryzae, ver tabla 9.1.
2. Es preferible que la enzima sea producida extracelularmente ya que
los procedimientos de recuperacin son ms sencillos puesto que
adems de enfrentarnos a una enzima ms robusta, evitaramos la
etapa adicional de ruptura celular, as como un extracto crudo que
contiene al menos 1500 protenas contaminantes, mientras que un
extracto extracelular contiene solo unas cuantas.
3. La enzima debe ser producida con altos rendimientos, por lo que el
desarrollo del microorganismo implica algn tipo de mutacin.
4. El costo de produccin debe ser razonable, lo que implica que el
microorganismo pueda crecer rpidamente en sustratos grado
industrial, consumindolos totalmente y con pocos requerimientos
especficos. Por esta razn se prefiere a las enzimas constitutivas con
respecto a aquellas que necesitan de algn agente inductor en el
medio, mxime cuando el requisito sea algn ion que hiciese
imposible la aplicacin de la enzima en alguna industria (un ejemplo
tenemos en los iones arsenato y molibdato en la obtencin de glucosa
isomerasa por la industria alimentaria).
TABLA 9.1
ALGUNOS MICROORGANISMOS GRAS Y ENZIMAS QUE
PRODUCEN
Aspergillus Niger
Aspergillus oryzae
Rhizopus oryzae
Bacillus subtilis
Rhizopus nveas
Saccharomyces cerevisiae
Streptomyces rubiginosus
Bacillus cereus
Mucor mihei

alfa amilasa, celulasa, glucoamilasa, lactasa, pectinasa,


catalasa, glucosa oxidasa, proteasa, lipasa.
alfa amilasa, glucoamilasa, lactasa, lipasa
alfa amilasa, glucoamilasa, pectinasa
alfa amilasa, proteasa
Glucoamilasa
Invertasa
glucosa isomerasa
Renina
renina, lioasa, esterasa

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

5. La seleccin del organismo puede hacerse igualmente en trminos de


las caractersticas deseadas para la enzima; como ejemplo tenemos la
seleccin de organismos termfilos para obtener enzimas
termoestables o bien la seleccin de una fuente de nitrgeno proteica
que obligue a la induccin de ciertas proteasas (como queratinasas).
HACIA QUE APUNTAN LAS INVESTIGACIONES ACTUALES
1. El uso eficiente de los nutrientes del medio de cultivo; en este sentido
el aprovechamiento de la celulosa y la lignina, representa una tarea de
gran impacto. Se han modificado levaduras de cervecera para
introducir genes que codifiquen para glucoamilasas; de esta forma, es
posible producir cervezas ligeras al ser degradadas las dextrinas
residuales que dan el sabor amargo.
2. Produccin de enzimas microbianas de origen vegetal o animal, por
ejemplo el gen que codifica para la quimosina de ternera ha sido
clonado en E. coli y en S. cerevisiae, renina se obtiene de A. oryzae,
etc.
3. Produccin de enzimas termoestables; por mutacin dirigida ha sido
posible modificar un aminocido de superficie, incrementando as la
termoestabilidad; por ejemplo la isoleucina 3 de la lisozima ha sido
cambiada por cisterna.
4. Sobreproduccin de enzimas mediante el incremento del nmero de
genes que codifican para su sntesis.
5. Mayor tolerancia a los cambios de pH, modificacin de la
especificidad de la enzima, mayor resistencia a la inhibicin por
iones, modificacin de la estructura de las enzimas para facilitar su
inmovilizacin.
MECANISMOS DE BIOSNTESIS
Para controlar la sntesis enzimtica, las clulas microbianas cuentan con
mecanismos de induccin y represin; el conocimiento de estas formas
de regulacin a permitido ha permitido desarrollar sistemas de alta
productividad, no solo a travs de mutaciones, sino tambin mediante el
manejo del medio ambiente y de la ingeniera gentica.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Enzimas inducibles
La mayor parte de las enzimas comerciales son inducibles, es decir,
requieren de una sustancia, generalmente el sustrato de la enzima, como
inductor. De acuerdo con el modelo de Jacob y Monod (1961), el
inductor permite la sntesis de la enzima al unirse con el represor que
bloquea al gen operador impidiendo su transcripcin. Cuando el inductor
es de alto peso molecular y no puede atravesar la pared celular de la
bacteria, por ejemplo celulosa, el dmero celobiosa puede actuar como
inductor. En la tabla 9.2 se muestran algunos ejemplos de enzimas
inducibles.
TABLA 9.2
EJEMPLOS DE ENZIMAS INDUCIBLES
ENZIMA
Dextransacarasa
Dextranasa
Alfa amilasa
Naringinasa
Pululanasa
Invertasa
Glucosa isomerasa
Tirosinasa

MICROORGANISMO
Leuconostoc mesenteroides
Penicillium funiculosum
Bacillus subtilis
Aspergillus niger
Klebsiella pneumonidae
Pullularia pullulans
Bacillus coagulans
Neurospora crassa

INDUCTOR
Sacarosa
Dextranas
Almidn
Naringina
Maltosa
Monopalmitato de sacarosa
Xilosa
Tirosina D o L

Mecanismos de represin
Es la inhibicin en la sntesis de una enzima generalmente inducible, por
intermediarios producidos en el rpido catabolismo de la fuente de
carbono. Un ejemplo es la represin de lactasa por glucosa en E. coli. El
cAMP juega un rol clave en el mecanismo de represin, ya que su
concentracin intracelular se ve disminuida hasta 1000 veces cuando el
microorganismo crece en glucosa y la represin puede ser revertida
mediante su reposicin al medio. En la tabla 9.3 se muestran algunos
ejemplos de enzimas sujetas a este tipo de represin conocida como
represin catablica.
Un mecanismo menos frecuente de inhibicin lo constituye la
retrorrepresin, en el cual la sntesis de la enzima se ve reprimida por la
presencia de productos finales de biosntesis. Un ejemplo lo constituye el
efecto de ciertos aminocidos del medio de cultivo en la sntesis de
protenas.
TABLA 9.3

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

ENZIMAS SUJETAS A REPRESIN CATABLICA


ENZIMA
Invertasa
Lactasa
Dextransacarasa
Celobiasa
Proteasas
Catalasa
Alfa amilasa

MICROORGANISMO
Neurospora crassa
Escherichia coli
Leuconostoc mesenteroides
Trichoderma viride
Bacillus subtilis
Rhodotorula mucilaginosa
Bacillus estearthermophilus

REPRESO
Glucosa-fruc
Glucosa
Sacarosa
Celobiosa
Glucosa
Glucosa
Fructosa

Mejoramiento gentico
Una vez conocidos los mecanismos regulatorios de la produccin de una
enzima, se podr mejorar la productividad a travs de procesos de
mutacin y seleccin o bien mediante un adecuado manejo del medio
ambiente. En la tabla 9.4 se presentan algunas estrategias para la
obtencin de mutantes.
TABLA 9.4
ESTRATEGIAS EN LA SOBREPRODUCCIN DE ENZIMAS
MICROBIANAS

ENZIMAS INDUCIBLES
Obtencin de mutantes con necesidades reducidas o nulas de inductor (cuando el
es caro)
ENZIMAS SUJETAS A RETRORREPRESIN
Evitar la presencia de productos finales en el medio de cultivo
Evitar la acumulacin de productos finales mediante la adicin de algn inhibid
ruta metablica
Limitar la disponibilidad de un factor de crecimiento a un mutante auxtrofo
Eliminacin de los productos finales (dilisis, ultrafiltracin)
Obtencin de mutantes no sujetos a represin por productos finales
ENZIMAS SUJETAS A REPRESIN CATABLICA
Evitar el uso de la fuente de carbono que ocasiona la represin, sustituyndola por
mas lenta asimilacin
Limitar el crecimiento del microorganismo ya sea cultivo en quemostato o ferme
retroalimentada
Obtencin de mutantes resistentes a la represin catablica
Medida de la actividad enzimtica durante la produccin

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Una vez definidas las condiciones del ensayo, se selecciona la tcnica


analtica ms adecuada para determinar la concentracin de producto
obtenido o bien la de sustrato y se procede a cuantificarlos durante los
primeros minutos de la reaccin, se obtiene as la velocidad inicial de
reaccin. Un problema muy comn de las enzimas con aplicacin en el
rea de la industria alimentaria es la imposibilidad de aplicar las
Unidades de actividad enzimtica, ya que los sustratos y su
transformacin, no pueden expresarse en forma molar; por esta razn es
que se aplican definiciones arbitrarias, basadas en consecuencias
adicionales de la accin de las enzimas. Ver tabla 9.5
TABLA 9.5
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR
CARACTERSTICAS DISTINTAS A LAS CONVENCIONALES
ENZIMA
Proteasas

Alfa
amilasas

Pectinasas

Celulasas

METODOLOGA

Capacidad para coagular la leche

Liberacin de algn aminocido especfico


soluble en
cido tricloroactico

Accin sobre pelculas fotogrficas

Prdida de la capacidad de formar complejos coloreados


entre yodo y amilosa

Disminucin de la viscosidad inicial

Incremento del poder reductor

Capacidad para clarificar el jugo de manzana

Disminucin de la viscosidad inicial

Incremento en el poder reductor

Disminucin del precipitado alcohlico del medio de


reaccin

Solubilizacin de papel

Disminucin de la viscosidad inicial

Incremento en el poder reductor

Para enzimas extracelulares, la actividad se determina por unidad de


volumen del medio de fermentacin y despus de determinar la
concentracin de protena total del medio, se expresa como actividad
especfica. Para enzimas intracelulares existen diversas posibilidades:
- La enzima es activa a pesar de su ubicacin; el sustrato y el producto
pueden atravesar libremente la pared celular por lo que la medicin

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

puede hacerse directamente con una cantidad conocida de clulas; o bien


es necesario llevar a cabo un proceso de permeabilizacin de clulas para
evitar que la difusin a travs de la membrana sea el paso limitante. Para
esto ltimo se emplea tolueno, alcohol isoamlico, sales, etc. En ambos
casos la actividad medida puede referirse a la cantidad de clulas
empleadas en el ensayo.
- Es necesario romper las clulas para extraer la enzima pues de otra
forma la actividad no se expresa. Se procesa una cantidad conocida de
clulas, para poder posteriormente referir la actividad a una unidad de
biomasa.
CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS PROCESOS DE
FERMENTACIN PARA LA PRODUCCIN DE ENZIMAS
MICROBIANAS
Tcnicas de fermentacin en cultivo semislido
Existen dos formas de fermentacin, en cultivo semislido y en cultivo
sumergido; la primera se llama comnmente fermentacin slida y la
segunda fermentacin lquida.
El cultivo semislido conocido tambin como sistema Koji, es la forma
ms comn de produccin de enzimas extracelulares a partir de hongos
en el Japn. Este tipo de fermentacin tiene la ventaja de tener una alta
productividad por unidad de volumen de fermentacin (el medio de
cultivo no libera agua). Esta tcnica requiere de bajos consumos
energticos y muestra una baja contaminacin por aguas residuales.
Las fermentaciones slidas se llevan a cabo en charolas delgadas; las
metodologas empleadas no han desarrollado mucho a pesar del avance
tecnolgico actual. En este sentido vale destacar los avances logrados por
la Universidad Autnoma Metropolitana de Iztapalapa en Mxico y la
fundacin CIEPE en Venezuela (dentro de Amrica latina).
El cultivo semislido tiene la desventaja de mostrar un difcil control de
las condiciones ambientales que influyen en la produccin (pH,
temperatura, humedad, etc.); dificultades para la esterilizacin y es
frecuentemente limitada por fenmenos de transferencia de masa. Es
muy difcil regular el pH; es difcil tambin pensar en utilizar este
mtodo para enzimas intracelulares. La tabla 9.6 muestra algunas

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

enzimas producidas por fermentacin slida y en la figura 9.1 se observa


la produccin de celulasa por Trichoderma viride en cultivo semislido.
TABLA 9.6
ALGUNAS ENZIMAS PRODUCIDAS POR CULTIVO
SEMISLIDO
ENZIMA
Amiloglucosidasas
amilasa
Celulasas
Proteasas
Pectinasas

MICROORGANISMO
Rhizopus sp.
Aspergillus oryzae
Aspergillus niger
Trichoderma viride
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Aspergillus soyae

SUSTRATO
Salvado de trigo
Salvado de trigo
Arroz
Salvado de trigo
Salvado de trigo
Salvado de trigo

Figura 9.1.- Produccin de celulasas utilizando el mtodo de Koji. A.cultivo sumergido para inoculacin de Trichoderma
viride, B.compresor de aire, C.- filtro de aire, D.- Inoculacin, E.- aire de salida,
F.- colector de muestra, G.- bomba de centrfuga, H.- cultivo de T. viride

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

sobre salvado de trigo, I.- aspersin de agua, I.- Sulfato de amonio,


acetona, alcohol y agua, J.- transportador de cinta, J.- transportador de
tornillo, K.- tolva, L.- columna de extraccin, M.- tanque de
almacenamiento, Q.- columna de intercambio inico, R.- concentrador de
membrana, S.- secador de pulverizacin, T.- filtro prensa, U.- secador
rotatorio, V.- mezclador.
El cultivo sumergido
La casi totalidad de enzimas producidas por el mundo occidental
provienen de procesos que usan cultivo sumergido. Su gran ventaja sobre
el cultivo slido es la homogeneidad que es posible establecer en el
cultivo, de tal forma que no existen gradientes de temperatura, de pH, o
de concentracin de nutrientes. Los factores que con ms frecuencia
influyen en la produccin de enzimas microbianas por cultivo sumergido
son:
Temperatura y pH:
Son reguladas a lo largo de todo el proceso de fermentacin;
generalmente la temperatura y el pH ptimos de crecimiento del
microorganismo productor, coinciden con los de produccin de la
enzima. Sin embargo en ciertos casos, la temperatura de mximo
crecimiento puede no ser la adecuada para la estabilidad de la enzima,
hacindose necesaria una optimizacin con el objeto de encontrar la
temperatura de proceso adecuada para una mxima produccin y
preservacin de la enzima durante la fermentacin.
Es frecuente entonces encontrar temperaturas de mxima produccin de
la enzima, inferiores a la de mximo crecimiento del microorganismo;
por ejemplo, la alfa amilasa de Bacillus coagulans si se produce a 55C,
la enzima es 10 veces mas estable a la temperatura de 90C que si se
produce a 35C. Siempre al finalizar el proceso de produccin la
temperatura debe ser disminuida rpidamente si la enzima es termolbil.
En cuanto al pH se distinguen 4 valores que no necesariamente
coinciden:

El pH de mximo crecimiento del microorganismo productor


El pH de mxima produccin de la enzima
El pH de mxima estabilidad de la enzima
El pH de mxima actividad de la enzima

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Estas diferencias son ms notorias para las enzimas intracelulares; as por


ejemplo, la fenilalanina amonio liasa de Rhodotorula glutinis es
producida sin regulacin del pH, a un valor inicial de 7,0 y al final del
proceso es extrada a pH de 8,0. La dextransacarasa de Leuconostoc
mesenteroides es secretada con mxima productividad a pH 6,5,
adecuado para el crecimiento del microorganismo, siendo el pH de
mxima actividad y estabilidad de 5,2. La subtilisina de Bacillus
licheniformis es estable entre 5 y 10, tiene ptima actividad entre 9 y 11 y
la mxima produccin se obtiene entre 6,5 y 6,8.
Es evidente que en el caso de todas las enzimas proteolticas, el pH de
mxima estabilidad no coincide con el de mxima actividad pues la
enzima se autodigerira. Para la regulacin del pH, as como para los
ajustes al inicio y al final del proceso, el cido y la base deben
seleccionarse, despus de asegurarse que no tengan efectos negativos
sobre la enzima. El hidrxido de sodio y el cido ortofosfrico son los
ms empleados.
Aunque no constituye un mtodo de purificacin en el sentido estricto del
trmino, muchas veces se emplean tratamientos de pH y/o temperatura al
final de un proceso de purificacin para eliminar actividades enzimticas
contaminantes menos estables que la de la enzima de inters; en ese
sentido, tratamientos trmicos destruyen la actividad transglucosidasa de
la glucoamilasa. El proceso de regulacin del pH puede evitarse en
algunos casos, incrementando el poder amortiguador del medio de
cultivo en la zona de mxima productividad.
El medio de cultivo
Algunas enzimas requieren de ciertos iones en el medio para su
produccin, estos cumplen roles importantes como cofactores o como
estabilizadores de la enzima, por ejemplo la sntesis de alfa amilasas
requiere la presencia de calcio y magnesio. Una vez determinados los
requerimientos para la produccin de la enzima por parte del
microorganismo, los elementos restantes se basan en los requerimientos
para el crecimiento del propio microorganismo como la fuente de
carbono y la fuente de nitrgeno.
En la tabla 9.7 se presenta algunos ejemplos en los cuales la fuente de
carbono del medio es el substrato de la enzima que se desea producir,

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

desempeando entonces varias funciones, fuente de carbono y de energa


para el microorganismo e inductor de la enzima.
Por otro lado, para la fuente de nitrgeno existen muchas alternativas, la
tabla 9.8 muestra las principales fuentes de nitrgeno disponibles para la
produccin de enzimas microbianas, aunque por lo general se prefieren
las formas complejas por ser ms econmicas.
TABLA 9.7
MEDIOS DE CULTIVO DONDE LA FUENTE DE CARBONO ES
EL SUSTRATO DE LA ENZIMA
ENZIMA
amilasa
celulasas
dextranasa
glucoamilasa
dextransacarasa
naringinasa
lactasa
levansacarasa
glucosa oxidasa

FUENTE DE
CARBONO
Almidn
Celulosa
Dextrana
Almidn
Sacarosa
Naringina
Lactosa
Sacarosa
Glucosa

MICROORGANISM

Bacillus subtilis
Trichoderma viride
Penicillium funiculosu
Aspergillus niger
Leuconostoc mesenteroi
Aspergillus niger
Kluyveromyces lactis
Bacillus subtilis
Aspergillus niger

En ocasiones la relacin carbono/nitrgeno es importante, por ejemplo en


Aspergillus sojae una alta relacin favorece la produccin de proteasas,
mientras que una baja relacin, favorece la produccin de amilasas.
TABLA 9.8
PRINCIPALES FUENTES DE NITRGENO EMPLEADAS EN
MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIN DE ENZIMAS
MICROBIANAS
FUENTES INORGNICAS
Sulfato de amonio
Nitratos (potasio, calcio)
FUENTES PROTEICAS VEGETALES
Pasta de soya
Pasta de girasol
Pasta de algodn

FUENTES ORGNICAS NO PROTEICAS


Urea
Bases nitrogenadas
FUENTES PROTEICAS ANIMALES
Casena
Protenas de suero de leche
Peptonas

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Salvado de trigo
Salvado de arroz
Agua de cocimiento de maz
Diversos hidrolizados
Malta (cebada)
FUENTES
PROTEICAS
MICROBIANAS
Extracto de levaduras
Vinazas

Hidrolizado de pescado
Hidrolizado de carne

La adicin de agentes surfactantes al medio de cultivo, especficamente


Tween 80 o triton aumenta la produccin de un gran nmero de enzimas
extracelulares y aunque el mecanismo de accin es desconocido, se
piensa que modifican la permeabilidad de la membrana celular. En la
tabla 9.9 se puede ver esta aplicacin.
TABLA 9.9
EFECTO DE LA ADICIN DE TWEEN 80 AL 0,1% EN LA
PRODUCCIN DE ENZIMAS MICROBIANAS
EXTRACELULARES
ENZIMA

MICROORGANISMO

Celulasa
Invertasa
Dextranasa
Alternansacarasa

Trichoderma viride
Pullularia pullulans
Penicillum
funiculosum
Leuconostoc
mesenteroides
Aerobacter aerogenes

Pululanasa

Relacin de produccin
MEDIO + TENSIOACTIVO
MEDIO SOLO
20
16
2
2
1,5

Normalmente los estudios de laboratorio emplean medios de cultivo


sintticos de alta pureza y alto costo; en el escalamiento del proceso se
sustituyen las materias primas por equivalentes de menor costo. Se debe
tener en cuenta que la menor pureza puede ocasionar variaciones en el
proceso, aunque algunas veces beneficiosas, por ejemplo un in no
considerado. Las materias primas pueden llegar a comprender entre el 50
a 70% del costo de la produccin, por lo que es importante esta
sustitucin. Para enzimas que van a ser purificadas, el costo del medio de
fermentacin se hace menos importante con respecto al costo de

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

produccin, por lo que es posible emplear materias primas de alto costo,


pero de tal pureza que faciliten las etapas subsecuentes de purificacin.
La aireacin
Por los requerimientos de oxgeno los procesos fermentativos se dividen
en aerobios, microaerobios, anaerobios y anaerobios estrictos. El oxgeno
es siempre difcil de incorporar por su baja solubilidad en el medio, de
all la necesidad de un sistema muy eficiente de inyeccin de oxgeno y
un sistema de mezcla apropiado, para la correcta distribucin del mismo
en todo el medio de cultivo.
Existe una concentracin ptima de oxgeno para cada enzima, as la Lasparraginasa de E. coli creciendo en glucosa, en condiciones de
aerobiosis el rendimiento en clulas es elevado, pero se produce poca
enzima; mientras que en anaerobiosis, se producen pocas clulas pero
con un alto contenido de enzima.
Cintica de produccin de enzimas
La produccin de enzimas est asociada al crecimiento de los
microorganismos, as hay unas cuya sntesis se detiene al llegar a la
fase estacionaria; sin embargo, lo comn es encontrar la produccin
de enzimas en la fase post exponencial, sin ninguna relacin con el
crecimiento.
A diferencia de lo que sucede para muchos metabolitos primarios, en el
caso de produccin de enzimas no pueden establecerse relaciones
estequiomtricas en la fermentacin. El rendimiento en enzima es muy
variable, pero los sistemas industriales sobre todo los basados en
Aspergillus, llegan a producir ms de 15 g/L de protena til secretada al
medio, mientras que por manipulacin gentica por ejemplo, se ha
llegado a que 25% de la protena intracelular de un mutante sea solo una
enzima.
RECUPERACIN DE LA ENZIMA
La mayor parte de las enzimas microbianas son producidas en cultivo
sumergido, por lo tanto uno de los principales objetivos de la operacin
de recuperacin es eliminar el agua al menor costo posible. Cuando la

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

concentracin de la enzima al inicio de la purificacin es alta, su precio


de venta es menor; mientras menos concentrada est al inicio (implica
una metodologa de purificacin mas costosa), su precio ser cada vez
mayor. En este sentido se tiene algunos ejemplos: las amilasas
microbianas tienen una concentracin en el extracto inicial de 500mg%
aproximadamente y se venden a un dlar el Kg; renina de origen
microbiano inicia su proceso de purificacin a una concentracin de 10
mg% y tiene un precio cercano a 1000 dlares el kg. Glicerofosfato
deshidrogenasa tiene una concentracin inicial de alrededor de 0,5 mg%
y se vende aproximadamente a 100000 dlares el kilo y uroquinasa y la
mayora de enzimas teraputicas inician su purificacin en el extracto
microbiano a una concentracin de 0,001 mg% y cuestan luego del
proceso de purificacin, alrededor de 100000 dlares el gramo.
El tamao de la produccin tambin est relacionado con el costo de la
misma, mientras menor sea la produccin enzimtica, mayor ser el
precio de la enzima; para tener una idea, papana se produce en lotes de
100000 kilos, costando el kg alrededor de 50 dlares; renina se produce
en cantidades de 10000000 de kilos, siendo el costo de la produccin de
3 dlares el Kg; mientras que glucoamilasa y amilasa se produce en lotes
de 50000000 de kilos, con un costo por kilo de un dlar.
El grado de purificacin de la enzima depende del rea de aplicacin
final: alimentos, farmacia, industria textil, industria curtidora, industria
papelera, etc., y de la forma en que va a ser aplicada, diagnstico, aditivo
en alimentos, medicamento, catalizador en la industria, etc. Estos
criterios se aplican igualmente en la formulacin del producto final; as
por ejemplo, los productos usados en detergentes biolgicos contienen
hasta un 10% de enzimas, mientras que las preparaciones amilolticas
empleadas como aditivos para harinas, contienen no mas de 0,1% de alfa
amilasa.
PRINCIPALES ETAPAS EN LA RECUPERACIN DE ENZIMAS
MICROBIANAS:

EXTRACCIN:
Si la enzima est ligada a la pared celular o a alguna membrana celular,
se usa solventes como el isobutanol, alcohol isoamlico y tolueno. Para

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

enzimas intracelulares ligadas, se emplean detergentes como el


deoxicolato, SDS, tween, triton, los cuales en condiciones de baja
fuerza inica y a un pH adecuado, se combinan con las protenas ligadas,
formando miscelas y de esta forma las solubilizan. Un ejemplo es la
extraccin de uricasa de Candida utilis, la que se extrae con
mercaptoetanol y triton N-101.
Se puede tratar tambin enzimticamente a los microorganismos:
lisozima, lipasas, fosfolipasas, proteasas, quitinasas o glucanasas se
agregan para degradar parcial o totalmente las paredes celulares. Para
bacterias grampositivas que tienen mureina, se emplea lisozima; las
gramnegativas requieren de tratamientos adicionales de lipasas y
fosfolipasas para eliminar la capa de lipopolisacrido.
Pueden emplearse tambin quitinasas para el tratamiento de pared
celular de hongos y glucanasas para levaduras. La presencia de
policationes favorece el proceso, de all que se use quitosan, quitosan
hidroglutamato, polilisina y algunos antibiticos. El policatin
desestabiliza la pared celular.
RUPTURA CELULAR:
Existen muchas tcnicas a nivel de laboratorio, pero slo dos mtodos
mecnicos som empleados a gran escala: el el homogenizador de alta
presin basado en el diseo de Manton Gaulin para leche (4 a 21 kg de
levadura seca por hora) y el molino de esferas de alta velocidad, el Dyno
mill (20 Kg de levadura seca por hora) tanto vertical como horizontal. A
nivel de laboratorio el mtodo ms usado es el ultrasonido.
Para ambos mtodos, el fluido debe pasar varias veces por el equipo,
dependiendo de la dureza de la clula. La optimizacin consiste en
determinar el nmero mnimo de pasos por el equipo, la mxima
concentracin de alimentacin y las condiciones de ruptura (tiempo de
molido o presin) para obtener la mxima extraccin, sin que la enzima
pierda actividad por calentamiento y sin reducir demasiado el tamao de
las clulas, pues esto dificulta la separacin posterior de los residuos.
Mas del 50% de los procesos industriales de obtencin de enzimas
intracelulares emplean el homogenizador, alrededor del 10% emplean el

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

molino de alta velocidad y las dems, otras tcnicas ya descritas


anteriormente. Por su dureza, las clulas microbianas se clasifican en
orden creciente en:
1.- Miscelio, 2.- bacilos gramnegativos y cocos, 3.- bacilos
grampositivos, 4.- levaduras, 5.- cocos gramnegativos y 6.- esporas.
En las bacterias grampositivas la gruesa capa de murena puede llegar a
constituir el 90% del peso seco de la pared, de all su dureza; en tanto que
en las bacterias gramnegativas es tan solo el 10%.
Algunos mtodos adicionales de ruptura celular exclusivos para
microorganismos son: tratamiento alcalino, lisozima y EDTA para
bacterias grampositivas, tratamiento con detergentes, choque frio para
bacterias gramnegativas, choque osmtico, congelamiento y
descongelamiento, etc.

SEPARACIN DE SLIDOS:
La eliminacin de clulas al final de la fermentacin, la eliminacin de
residuos celulares despus de la ruptura y la recuperacin o eliminacin
de precipitados (protenas y cidos nuclicos), se efecta por
centrifugacin o por filtracin. La seleccin del equipo mas adecuado
depende de varios factores dentro de los que podemos destacar, tamao
de partcula, diferencia de densidades entre las fases a separar, viscocidad
del medio, la aglomeracin y caractersticas pegajosas del precipitado. En
todos los procesos prcticamente es necesario el agregado de floculantes
(hidrocoloides o polielectrolitos) con el fin de aglomerar las partculas y
facilitar su separacin.
La operacin de separacin mas empleada en la recuperacin de enzimas
es la centrifugacin; el tiempo y la velocidad deben ser cuidadosamente
seleccionadas en cada etapa en que se requiera. Otra operacin
importante es la ultrafiltracin; con el conocimiento del PM de la enzima
a procesar, se selecciona la membrana o la fibra con el tamao de poro
adecuado para su retencin, permitiendo al sistema concentrar la muestra

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

al eliminar agua, dializar y purificar parcilmente ya que las protenas


pequeas atravezarn el poro.
La ultrafiltracin tiene la ventaja de no cambiar de fase a la enzima, de
poder operarse a bajas temperaturas, no se agregan sustancias ajenas al
sistema, tiene bajos requerimientos energticos y es fcilmente operada.
Tiene la desventaja del mantenimiento y cuidado de las fibras o
membranas, que pueden bloquearse con facilidad. Muchas enzimas son
comercializdas en forma lquida sin mayor procesamiento que la
eliminacin de clulas, la ultrafiltracin y la formulacin.

PRECIPITACIN, EXTRACCIN
CROMATOGRAFAS:

LQUIDO-LQUIDO

Ya hemos estudiado los mtodos de precipitacin, todos los cuales son


aplicados en la extraccin de enzimas microbianas; la extraccin lquidolquido utiliza polmeros como el polietilenglicol, dextranos o fosfatos
los cuales al ser agregados al medio, atrapan a la enzima, extrayndola;
aunque como hemos visto, el polietilenglicol es usado tambin para
concentrar la muestra a travs de una membrana semipermeable y como
agente precipitante y estabilizante de protenas. En relacin a las
cromatografas, tambin casi todas son aplicables para microorganismos.

SECUENCIA DE OPERACIONES:
Existe poca informacin disponible sobre que operaciones seleccionar y
en qu secuencia, al disear un proceso de purificacin de enzimas
microbianas. De un anlisis de 8 revistas peridicas efectuado en 1984,
en 100 publicaciones sobre purificacin de enzimas, se encontr que la
operacin mas usada es la cromatografa de intercambio inico (75% de
los

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

procesos la empleaban, 75% de los cuales empleaban soportes con


derivados DEAE). En 57% de los casos se empleaba la precipitacin y en
75% de estos se hacia con sulfato de amonio.
Sobre el orden en que aparecen las operaciones, la homogenizacin
prevalece como la primera (enzimas intracelulares), mientras que en el
40% de los casos, la precipitacin es la segunda opcin. El intercambio
inico aparece desde el segundo hasta el sptimo lugar, aunque en un
40% de los casos es la cuarta operacin del proceso. En promedio se
aplican 4 operaciones, con un rendimiento total del 28% y un factor final
de purificacin promedio de 6380, lo que representa en promedio una
eficiencia por etapa del 74% y un factor de purificacin por etapa de 8.

ESTABILIZACIN, SECADO Y FORMULACIN:


Las preparaciones enzimticas comercializadas en forma slida, son
secadas generlmente en secadores de espreas, mientras que cuando la
actividad es inestable, o no se preparan grandes volmenes de muestra o
se requiere de un manejo estril, la liofilizacin es la tcnica ms
apropiada.
En la formulacin del producto es necesario tomar en cuenta varios
factores en relacin con la dosis de enzima en la aplicacin final para
facilitar su uso y evitar grandes diluciones. En este sentido las
formulaciones lquidas son de ms fcil manejo, pero tiene el
inconveniente de una menor estabilidad.
Generalmente las preparaciones lquidas contienen agentes estabilizantes:
glicerol, sorbitol, polietilenglicol, etc., as como agentes
preservantes:benzoatos, sorbatos, etc. Por otro lado, el material inerte
consiste de azcar (glucosa, lactosa, etc.) o de slidos de almidn
(adicionados antes del secado tienen un efecto protector sobre la enzima),
sal (preparaciones de papana para ablandamiento de carnes) o inclusive
talco. No existe una regla general sobre la formulacin de productos.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

COSTOS:
Se debe optimizar el proceso en cuanto a costos, sacrificando etapas de
purificacin por su alto costo de reactivos o por su menor rendimiento en
relacin a otras etapas. Un valor promedio de costos es, 200 dlares por
litro de capacidad del fermentador.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

CAPITULO X

CONTENIDO

INMOVILIZACIN DE ENZIMAS
La biotecnologa en los ltimos aos ha experimentado grandes avances
as como sus aplicaciones industriales en la obtencin de productos
qumicos, en la industria alimentaria y farmacutica. Los procesos
catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya
que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores
convencionales no biolgicos: Presentan una gran actividad cataltica;
muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad
y regioespecificidad); son muy activos a temperatura ambiente y presin
atmosfrica.
A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha
generalizado en los procesos qumicos industriales debido a que la
mayora de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo, por
otra parte al ser solubles en agua, su separacin de los sustratos y
productos es difcil y por tanto, no se pueden reutilizar. Con la
inmovilizacin de las enzimas se han podido superar estos ltimos
inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea
econmicamente rentable.
GENERALIDADES SOBRE LA INMOVILIZACIN DE ENZIMAS
La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o
localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a
formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha ampliado


a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los
grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por
su unin a un soporte.
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:
1. El aumento de la estabilidad de la enzima.
2. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes
del proceso.
3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y
control, adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada. Los
diferentes tipos de reactores enzimticos aparecen en la Figura 10.1.
Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas
elevadas de enzima, la cual mantendr su actividad durante ms tiempo.
Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtencin de
productos con mayor pureza.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son 4:
1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado
nativo.
2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden
existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente
nmero de uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la
movilizacin.
4. El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.

Tanque agitado
Tanque agitado de
Alimentacin contnua

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Figura 1.- Reactores enzimticos que emplean enzimas inmovilizadas.


En general, los mtodos de inmovilizacin se suelen clasificar en dos
grandes categoras: Retencin fsica y Unin qumica.
MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN
FSICA
Atrapamiento
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de
una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros
fotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno,
alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de
inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en
una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin
por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo
qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser
ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda
atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la
enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra
sinttica.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental,


requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como
ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura.
De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las
condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la
naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la
protena. Los geles de poliacrilamida son los ms utilizados en el
atropamiento de enzimas, aunque se pueden usar geles que se forman a
partir de polmeros naturales como la gelatina, el k-carragenano, el
alginato, el agar, etc.

Figura 10.2.- Mtodos de inmovilizacin mediante retencin fsica.


El atrapamiento de las enzimas en las fibras sintticas se realiza tras la
adicin de un agente coagulante (como el tolueno o el eter de petrleo) a
una emulsin formada por una solucin acuosa que contienen la enzima y
un disolvente inmiscible con el agua donde esta disuelto el polmero. Al
entrar en contacto, se producen los filamentos de fibra que contienen
microgotas de solucin enzimtica atrapadas en las microcavidades del
polmero (principalmente acetato de celulosa). El atropamiento en fibras
presenta como ventaja principal frente a los geles la elevada superficie de
unin a la enzima sobre todo si las fibras son finas. Por otra parte, las
fibras son resistentes a cidos dbiles y fuertes, a soluciones de fuerza
inica elevada y algunos disolventes orgnicos. Segn el tipo de
polmero, determinadas fibras pueden mostrar una gran resistencia al
ataque microbiano. Sin embargo, la posible desactivacin enzimtica por
parte del disolvente puede ser un serio inconveniente a tener en cuenta.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

En la actualidad, la tecnologa sol-gel se esta imponiendo como mtodo


general para el atropamiento de enzimas, debido a su gran sencillez y
nmero de aplicaciones como la preparacin de biosensores,
biocatalizadores e incluso rganos artificiales. En general, la hidrlisis
cida de un precursor tetra-alcoxi-silano origina un gel tras la
neutralizacin del cido y la eliminacin del alcohol liberado. Con el fin
de que el gel posea poros o canales de un tamao suficiente para que
difundan los sustratos y productos, se pueden aadir diferentes agentes
durante la encapsulacin de las enzimas. Estos compuestos, como la
gluclosa o el sorbitol, son eliminados tras sucesivos lavados. Despus de
una etapa de envejecimiento del gel (12-24 horas), este se puede secar
hasta alcanzar el estado de xerogel. En este ltimo estado, la difusin de
los sustratos y productos no se ve alterada; en cambio la enzima no puede
atravesar los poros, ya que se encuentra totalmente atrapada en la
estructura de la slice, ver figura 10.3.

Figura 10.3.- Inmovilizacin de enzimas mediante el mtodo sol-gel


Inclusin en membranas: Dividida en dos tipos:
1. Microencapsulacin: En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de
membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de
sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas
semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerizacin
interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, tambin
llamadas micelas reversas). Las microcpsulas obtenidas son de forma
esfrica, con tamaos comprendidos entre 1 y 100 m de dimetro.
Mediante este mtodo se pueden encapsular simultneamente una gran
variedad de enzimas, clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

cabo determinadas reacciones que suceden en mltiples pasos. Ver figura


10.4
Los liposomas son miscelas formadas por una doble capa surfactante, de
tal manera que el disolvente exterior es acuoso, en vez de ser orgnico
como sucede con las miscelas reversas. Las enzimas incluidas en estos
microentornos permanecen activas y en algunos casos mejoran su
actividad y estabilidad trmica (figura 10.5).

Figura 10.4.
Mtodo de microencapsulacin de enzimas por
polimerizacin interfacial

Figura 10.5. Enzimas incluidas en micelas reversas y liposomas

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

10.2.2. Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas


que contengan enzimas atrapadas ha despertado gran inters en la
industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto
final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la
enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de sustrato
que atraviesa el reactor; en su interior sucede la reaccin y el producto
formado difunde libremente por la membrana.
Este mtodo esta principalmenrte indicado para sustratos de elevado peso
molecular y solubles en agua. El control selectivo de sustratos y
productos se realiza mediante el tamao del poro de la membrana.
Existen algunos inconvenientes en este tipo de inmovilizacin como la
imposibilidad de trabajar con concentraciones bajas de sustrato, ya que
puede existir una posible adsorcin del mismo a la membrana. Tambin
la enzima puede sufrir desactivacin a consecuencia de las fuerzas de
cizalla o de agitacin, sobre todo aquellas incluidas en membranas de
ultrafiltracin (o bolsas de dilisis) ver fig.10.6

Figura 10.6.

Ejemplos de enzimas incluidas en membranas

En general, en esta metodologa, se procede inicialmente a la adsorcin


de la enzima sobre la membrana que formar el reactor. Estas membranas
sintticas, disponibles comercialmente, tienen un tamao de poro
definido (en un intervalo de 500 a 300.000 Da). La adsorcin de
membrana se puede realizar de dos formas:
1. mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a travs de la
membrana;
2. por contacto continuo de una solucin de enzima con la membrana.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

10.3.- MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR


UNIN QUMICA
10.3.1. Unin a soportes
Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se
dispone de una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de
enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del
biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la
afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ample el intervalo de
pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Adems
el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de
operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para
que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de
materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas.
Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad y forma,
aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas,
fibras y ms corrientemente en forma de esferas.
Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
Soportes inorgnicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad
de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra
pmez, slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y
vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no poroso, almina,
cermicas, gel de slice, etc.). Los materiales inorgnicos tienen poca
superficie de unin.
Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en:
Polmeros naturales: a su vez divididos en: polisacridos (celulosa,
almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc).
protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc).
Polmeros sintticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno)
Polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.)
Otros tipos (alcohol polivinlico, poliamidas, etc).
Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorcin o por
unin covalente, ver figura 10.7).

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Figura10.7. Mtodos de inmovilizacin mediante unin qumica.


10.3.1.1. Adsorcin
En este tipo de inmovilizacin, la enzima se une a un soporte sin
funcionalizar mediante adsorcin de tres tipos: fsico, inico o por
quelacin o unin a metales. La adsorcin fsica es el mtodo ms
sencillo de inmovilizacin ya que slo consiste en poner la solucin de
enzima en contacto con el soporte al que se une electrostticamente. La
adsorcin inica se efecta al utilizar resinas de intercambio inico
(como CM-celulosa, DEAE-celulosa, sephadex, amberlite, etc.), las
cuales contienen grupos funcionales por otros iones de la misma carga,
sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.
Los principales factores que influyen en la inmovilizacin de enzimas por
adsorcin, son:
1. El pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las cargas que
presenta la superficie de la protena y del slido.
2. La fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la desorcin
de la enzima, ya que los iones inorgnicos se unen con ms fuerza al
soporte que la protena.
3. La permeabilidad y el rea superficial: en la mayora de los casos es
conveniente una gran rea superficie (mayor a 100 m2/g) y un dimetro
de poro grande, aproximadamente dos veces el tamao del eje mayor de
la enzima (mayor a 30 nm) para que la enzima y el sustrato puedan
penetrar fcilmente.
4. La presencia de iones que acten como cofactores de la enzima, ya
que pueden incrementar la carga enzimtica del derivado.
Como principales ventajas de este mtodo destacan:

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

1. Su preparacin sencilla.
2. Su bajo costo.
3. No hay cambios de especificidad enzimtica.
4. Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en
agua.
Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente:
1. La optimizacin rigurosa de las variables que controlan la adsorcin.
2. Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista
mecnico.
3. La unin al soporte es dbil.
Una variante dentro de la tcnica de la adsorcin consiste en emplear
resinas de intercambio inico, las cuales contienen grupos funcionales y
contraiones mviles. Estos contraiones se pueden intercambiar
reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan
cambios en la matriz insoluble.
10.3.2. Unin covalente
La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de
inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La
metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos
qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas
(ver tabla 10.1)
De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura
de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el
soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina,
y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido
asprtico y glutmico. El resto de aminocidos, debido a su carcter
hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie
proteica, y no pueden intervenir en la unin covalente. Este mtodo
presenta las siguientes ventajas:
1. La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla;
2. La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin;
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo,
empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la
temperatura, de los disolventes orgnicos o del pH, al tener estabilizada
su estructura terciaria.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una


serie de inconvenientes:
1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de
superficie, ya que condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su
geometra, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.
2. El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro
activo. Para evitar esta posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en
presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.
3. La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas
muy sensibles a cambios de pH, fuerza inica, etc.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

10.4. Reticulado
Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica
que ha sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas
enzimas. El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos
bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas
de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehdos,
diiminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si
estn activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas
con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones
extremas de pH y temperatura.
El co-reticulado, permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica
debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las
enzimas con una protena sin actividad enzimtica y rica en residuos de
lisina (por ejemplo, la albmina bovina). Un procedimiento mixto de
inmovilizacin muy comn consiste en inmovilizar la enzima por
adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un soporte polimrico
(con lo que se consigue una elevada carga enzimtica) y posteriormente
aadir el reactivo bifuncional.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Figura 10.8. Microfotografas (250x) de unos cristales reticulados


(CLECs) de penicilina acilasa de E-. coli (A) y de lipasa de
Pseudomonas cepacia (B)
Actualmente el mtodo ms novedoso de cross-linking consiste en la
cristalizacin de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehdo
(Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se
basa en la obtencin de un entramado cristalino, donde las molculas de
enzima estn rodeadas exclusivamente por otras molculas de protena.
De esta manera la propia enzima acta como soporte, y su estructura
terciaria est estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La
estructura cristalina posee canales microscpicos (20-50) que permiten
el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza
la reaccin. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH
extremos, as como la accin de las proteasas. Esta tecnologa se ha
aplicado a enzimas muy diferentes, las cuales se han utilizado en la
obtencin de compuestos enantiomricamente puros y en la sntesis de
pptidos.
10.5. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIN
A menudo, la inmovilizacin altera significativamente el comportamiento
de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad.
En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en
el cual todos los componentes que intervienen en el proceso cataltico
(pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

encuentran en interfase: en el medio de reaccin y en la fase constituida


por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad
enzimtica se ve afectada por efectos de tipo difusional, estrico y del
microentorno.
10.5.1. Efecto de la inmovilizacin en la estabilidad de las enzimas
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas
despus de su inmovilizacin, que se debe principalmente a las siguientes
razones:
1. Una estabilizacin conformacional de la enzima debido a la existencia
de uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la
enzima adquiere una mayor rigidez y se hace ms resistente a la
desactivacin trmica o qumica. Este tipo de estabilizacin se obtiene
nicamente en aquellos mtodos en los que intervienen enlaces de tipo
covalente, como el reticulado o la unin a soportes activados.
La inmovilizacin covalente multipuntual se puede combinar con la
adicin de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura
de la enzima.
2. Una proteccin frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la
unin de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteoltica, y evita
su autolisis.
3. Se evita la agregacin intermolecular al mantener las molculas de
enzima retenidas en una determinada regin del espacio.
4. Existe una alteracin del microentorno del enzima debida a la
interaccin de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima
sensible al oxgeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sita en
la superficie de un soporte cargado, la fuerza inica efectiva en el
microentorno de la enzima ser muy alta y, como consecuencia, la
concentracin de oxgeno disuelto ser mucho menor en esa zona que en
el medio de reaccin. En otros casos el soporte tiene un efecto
tamponador de tal manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en su
microentorno, aunque en la disolucin se produzcan cambios importantes
de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas
inmovilizadas en presencia de disolventes orgnicos, la acuofilia del
soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la
enzima. Cuanto mayor es la acuofilia del soporte, ms agua adsorbe y la

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

enzima poseer la cantidad necesaria de agua en su microentorno para


mantener su conformacin activa.
10.5.2. Efectos de la inmovilizacin sobre la actividad enzimtica
Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e
incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad
enzimtica puede ser debido a que:
1. La unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al
centro activo est impedido.
2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que
forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad
cataltica de la enzima.
3. La inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da
lugar a una forma inactiva.
4. las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalizacin
o desactivacin de la enzima.
Si la prdida de actividad no es total despus de la inmovilizacin, los
cambios (disminucin o aumento de la actividad enzimtica) se debern
principalmente a efectos difusionales, electrostticos, estricos y/o del
microentorno.
1) Efectos difusionales:
Como consecuencia de la inmovilizacin, la difusin de los sustratos
hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias
de tipo externo e interno.
a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en
el medio de reaccin, el sustrato deber atravesar la pelcula lquida
estacionaria (capa de Nernst o de disfusin) que rodea el soporte. En las
proximidades de un soporte no cargado, la concentracin de sustrato es
menor que en el resto de la disolucin, puesto que existe un gradiente de
concentracin a travs de la zona de difusin. Por tanto, los valores de
KM para las enzimas inmovilizadas son siempre aparentes (KM ap.).

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos


tienen que atravesar el interior del gel, microcpsula, fibra o poro del
soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada.
Existen diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales como
por ejemplo: disminuir el tamao del biocatalizador, aumentar la
concentracin de sustrato, incrementar la agitacin o el flujo en el
reactor, etc. Con estas medidas se consigue reducir el grosor de la capa de
Nernst, y como consecuencia, el valor de km disminuye.
2) Efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte:
Si el sustrato y el soporte tienen la misma carga existe una repulsin
mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atraccin. Cuando el
sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km aparente
puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en
disolucin. Hornby y col. desarrollaron una expresin matemtica que
permite calcular la actividad de las enzimas inmovilizadas, teniendo en
cuenta tanto los factores de difusin como los electrostticos. La
expresin de Michaelis-Menten en este caso es:
Vmax
Vo =
KM + X Vmax
D

RT
RTxzFV

donde x=espesor de la capa de Nernst; D=coeficiente de difusin;


T=temperatura (K); z=valencia del sustrato; F=constante de Faraday;
R=constante universal de los gases y V=gradiente de potencial en el
soporte. Se puede disminuir el valor de K M ap., variando tanto el trmino
de difusin como el trmino electrosttico. En el primer caso, la
disminucin del valor de KM ap. se consigue al disminuir el tamao del
soporte (con lo que disminuye el trmino x) o al aumentar el flujo o la
agitacin. En el trmino electrosttico, si z y V tienen el mismo
signo, es decir si el soporte y el sustrato tienen la misma carga, el trmino
electrosttico es menor de 1 y K M ap. aumenta. Si tienen cargas opuestas,
la KM ap. disminuye. Si no poseen carga, KM ap. slo depender del
trmino de difusin.
3) Impedimentos estricos o de tamao de sustrato:
En un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya
una prdida apreciable de su actividad. Este hecho suele ser vlido en el

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de


sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima
inmovilizada disminuye drsticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas
unidas covalentemente a soportes slidos, a pesar de que son muy activas
frente a sustratos pequeos, muestran una actividad muy baja hacia
protenas, polisacridos y cidos nucleicos. Este efecto estrico se
puede evitar mediante una inmovilizacin covalente a travs de un brazo
espaciador enzima-soporte ms largo.
4) Efectos en el microentorno:
La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual,
especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados elctricamente. El
efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH ptimo
de la catlisis enzimtica y, muchas veces, un ensanchamiento en el
intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una
enzima unida a un soporte cargado negativamente (como el CMsephadex) tendr en su microentorno una concentracin mayor de
hidrogeniones que en el medio de reaccin. Como resultado, la enzima
inmovilizada ser ms activa a un pH ms alcalino. La enzima sera ms
activa a pH ms cidos si estuviera unida a un soporte cargado
positivamente (v.g. DEAE-sephadex).
10.6. INMOVILIZACION DE COFACTORES
Todas las tcnicas de inmovilizacin mencionadas son vlidas para
aquellas enzimas que no requieran cofactores, o para aquellas cuyos
cofactores se encuentren fuertemente ligados como por ejemplo flavinas).
Pero otras enzimas requieren otros cofactores que son sensibles al medio,
caros y por tanto, es necesaria su regeneracin. Cuando se trata de
cofactores cargados, que se disocian rpidamente en el medio (como
NADPH y el ATP), se deben coinmovilizar junto con la enzima (Enzima
1) para asegurar su participacin en la catlisis. En esta coinmovilizacin debe estar presente otra enzima (Enzima 2 que permita la
regeneracin del cofactor, para que pueda funcionar en sucesivos ciclos
catalticos. El reciclado de los cofactores se puede solucionar de dos
maneras:

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

1. El cofactor se puede unir a la superficie del entramado de una


enzima reticulada, o por otro lado, se puede fijar a un soporte
junto con la enzima.

Figura 10.9.- Mtodos para el reciclado de cofactores, (a) en enzimas


reticuladas; (b) en enzimas unidas a soportes
En ambas situaciones es fundamental que el brazo se separa del cofactor
del soporte sea lo suficientemente largo para que sea accesible a las dos
enzimas.
2. En reactores de membrana se ha desarrollado un sistema que
consiste en aumentar artificialmente el peso molecular del
cofactor mediante su unin a polietilenglicol. De esta manera el
cofactor sigue en solucin, pero puede atravesar los poros de la
membrana semipermeable. Por ejemplo, se ha conseguido la
regeneracin del NADH en un reactor de membrana que se
emplea en la obtencin industrial de L-leucina a gran escala. El
NAD(H) se une covalentemente al polietilenglicol PEG-20000, lo
que impide su difusin a travs de la membrana y permite la
reduccin del ceto-isocaproato en presencia de una L-leucina
deshidrogenasa dependiente de NAD (Figura 10.11). En el mismo
reactor esta presente la formato deshidrogenasa que permite el
reciclado del cofactor.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

Figura 10.11.- Regeneracin de NADH durante la sntesis de L-leucina


en presencia de formato deshidrogenasa (FDH)
10.7. ELECCIN DEL MTODO DE INMOVILIZACIN
Aunque se han desarrollado y aplicado muchas tcnicas de
inmovilizacin a numerosos enzimas, se reconoce que no existe un
mtodo universal vlido para todos los enzimas en todos los casos. No
obstante, gracias a toda la informacin disponible en la actualidad, se
pueden hacer generalizaciones sobre cada mtodo de inmovilizacin
(Tabla 10.2) y as, podremos seleccionar el ms adecuado para cada
aplicacin especfica. La eleccin ha de tener en cuenta las condiciones
de la reaccin biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el
tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros factores.

Tabla 10.2.- Comparacin de los diferentes mtodos de inmovilizacin


METODO

Inclusin en
Atrapamiento
Reticulado
Adsorcin
Unin
Membranas
qumica
covalente
Preparacin
Intermedia
Difcil
Intermedia
Sencilla
Difcil Fuerza de
unin
Dbil
Media
Dbil-Media
Media
Fuerte
Actividad enzimtica Media-Alta
Baja
Baja
Media
Alta
Regeneracin soporte Posible
Imposible
Imposible
Posible
Difcil
Coste proceso
Medio-Alto
Medio
Medio
Bajo
Alto
Estabilidad
Media
Alta
Alta
Baja
Alta
Validez
General
General
Limitada
General
Limitada
Resistencia microbiana S
S
S
No
No

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

En general, los mtodos de preparacin difcil y de mayor coste


proporcionan biocatalizadores ms estables y duraderos; en cambio
aquellos mtodos ms sencillos como el atrapamiento o la adsorcin,
donde la unin de la enzima con el soporte es dbil, originan derivados
inmovilizados que presentan prdidas de actividad y que deben ser
repuestos continuamente. Una vez elegido el mtodo ms conveniente,
los derivados que preparemos deben estar caracterizados segn las
indicaciones establecidas por el Working Party on Immobilized
Biocatalysts:
Tabla 10.3.- Caracterizacin de un derivado inmovilizado
Descripcin
1. Esquema de reaccin general
2. Enzimas a insolubilizar
3. Tipo de soporte empleado
4. Mtodo de inmovilizacin
Preparacin
1. Condiciones de reaccin
2. Rendimiento en peso seco
3. Actividad residual del sobrenadante
Caracterizacin fsico-qumica
1. Configuracin del biocatalizador fisico-qumica
2. Grado de hinchamiento
3. Grado de compresibilidad en columna
4. Abrasin en sistemas de agitacin
5. Velocidad mnima de fluidizacin Cintica
Cintica
1. Estabilidad de la enzima almacenada
2. Estabilidad operacional
3. Posibilidad de reutilizacin
4. Grado de conversin
5. Limitaciones difusionales

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

10.8. APLICACIONES DE LA ENZIMAS INMOVILIZADAS


Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se
pueden clasificar en:
1. Aplicaciones analticas: biosensores
2. Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
3. Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica,
alimentaria y de tratamiento de residuos.

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

BIBLIOGRAFA

ARROYO, Miguel. Tecnologa enzimtica aplicada. Editorial


Complutense S.A. Espaa, 2001

BECKER, J.M.: Biotecnologa: Curso de prcticas de laboratorio.


Editorial Acribia, S.A.. Zaragoza, Espaa. 1999

CHAVEZ PLANES, M. Temas de Enzimologa. Tomo I. Universidad


de la Habana, Cuba. 1990

CHAVEZ PLANES, M. Temas de Enzimologa. Tomo II.


Universidad de la Habana, Cuba, 1990.

DEVLIN, T. Bioqumica: Libro de texto con aplicaciones clnicas.


Tercera edicin. Editorial Revert, S.A. Espaa. 1999

EISENTHAL R and DANSON J. Enzyme Assays: a practical


approach. IRL Press. Great Britain, 1995

FREIFELDER D. Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular.


Editorial Revert, S.A. Mexico, 1991.

HARTMEIER, W. Immobilized biocatalysts: from simple to complex


systems. Trends Biotechnol. 3: 149-153. 1985

KLEI, H.E.; SUNDSTROM, D.W.; SHIM, D. Immobilization of


enzymes by microencapsulation en Immobilized cells and enzymes: a
practical approach J. Woodward, ed. IRL Press, pg. 49-54. 1985

KLIBANOV, A.M. Immobilized enzymes and cells as practical


catalysts. Science 219: 722-727. 1983

LEHNINGER: Principios de Bioqumica, Nelson D. y Cox M.


Tercera edicin, Ediciones Omega S.A., Barcelona, Espaa. 2001

MARGOLIN, A.L. Novel crystalline catalysts. Trends Biotechnol.


14: 223-230. 1996

Enzimologa

Ivn Paz Aliaga

MARTINEK, K.; MOZHAEV, V.V. Immobilization of enzymes: an


approach to fundamental studies in biochemistry. Adv. Enzymol. 57:
179-249. 1987

MONTGMERY, CONWAY, SPECTOR y CHAPPELL: Bioqumica


casos y texto. Sexta edicin, Harcourt Brace. Madrid, Espaa. 1998

NEZ DE CASTRO I. Enzimologa. Editorial Pirmide. Madrid


Espaa, 2001.

RESLOW, M. ADLERCREUTZ, P.; MATTIASSON, B. On the


importance of the support material for bioorganic synthesis. Influence
of water partition between solvent, enzyme and solid support in
water-proof reaction media. Eur. J. Biochem. 172: 573-578. 1988

SMITH, John. Biotecnologa. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,


Espaa. 2004

STRYER L. Bioqumica. Segunda edicin. Editorial Revert, S.A.


Barcelona, Espaa. 1985

STRYER, L., Berg, J. y Tymoczko J. Bioqumica. Quinta edicin.


Editorial Revert, S.A. Barcelona, Espaa. 2003.

TAYLOR, R.F. Protein Immobilization:


applications, Marcel Dekker, New York. 1991.

WONG, S.S.; WONG, L.J.C. Chemical cross-linking for the


stabilization of proteins and enzymes. Enzyme MicroTechnol. 14:
866-874. 1992

fundamentals

and