Seleccin de cepas de Bacillus sp.

potenciales
para la produccin de hidrolasas.

Becario
Rubn Montoya Lpez
Estudiante de Ingeniera Bioqumica de la Universidad
Autnoma de Aguascalientes, Mxico.

Orientador
Dr. Sindlia Freitas Azzoni / CTBE
Campinas, SP.
2012

CNPEM: LNLS CTBE LNBio LNNano

AGRADECIMIENTOS

Debo comenzar agradeciendo infinitamente la gran oportunidad que me fue otorgada

para participar en el 21 Programa de Becas de Verano del CNPEM, esta ha sido una de
las mejores experiencias de mi vida.

Al apoyo y comprensin recibido por el Comit Gestor del 21 Programa Becas de

Verano del CNPEM especialmente a Tatiane Madruga y Roberto Medeiros por su gran e
incondicional ayuda y atenciones.

A mi asesor, la Dr. Sindlia Freitas por darme la oportunidad de trabajar en su

laboratorio, compartir sus conocimientos y por su asesora para la realizacin del
proyecto. Fue un gran honor para m el haber estado en su equipo de trabajo.

A Aline Tavares, por trabajar a la par conmigo en este proyecto, tambin a Aline Moreira
por todo su apoyo y asesora durante el trabajo en laboratorio y para Mateus Silva, de
quien agradezco de sus consejos.

A todo el personal del CTBE, a los investigadores por sus consejos y especialmente al
personal de apoyo a Vania y Rebeca cuya ayuda fue de gran importancia para el
desarrollo del proyecto.

A todos mis compaeros y grandes amigos becarios del programa por compartir grandes
momentos y experiencias juntos, por su compaa y apoyo durante esta gran vivencia.

A mis padres Rubn y Lourdes por todo lo que me han enseado, por estar conmigo
incondicionalmente siempre que los necesito, a ellos les debo lo que soy.

CNPEM: LNLS CTBE LNBio LNNano

NDICE
ndice...........................................................................

ndice de Figuras......................................................................................

ndice de Tablas......................

1.0
2.0

Resumen..............

3.0

Objetivos...
3.1 Objetivo general............
3.2 Objetivos especficos.

4.0

Materiales y Mtodos....
4.1 Cepas de Bacillus sp. .....
4.2 Screening cualitativo de produccin de celulasas......
4.3 Fermentacin sumergida ....
4.3.1 Mantenimiento de las cepas de Bacillus sp. ...
4.3.2 Medios de cultivo ...
4.3.3 Preparacin de inculo..
4.3.4 Condiciones estndar de fermentacin...
4.3.5 Preparacin del extracto enzimtico....
4.4 Mtodos analticos....
4.4.1 Seguimiento de la cintica de crecimiento durante las fermentaciones
4.4.2 Actividad enzimtica sobre Papel filtro (FPasa).....
4.4.3 Actividad enzimtica sobre Carboximetilcelulosa (CMCasa) ......
4.4.4 Actividad enzimtica sobre Xilana (Xilanasa).....
4.4.5 Determinacin de azucares reductores por el mtodo de DNS...
4.4.6 Determinacin del contenido de protena por el mtodo de Bradford.
4.4.6 Actividad enzimtica proteoltica.......
4.5 Screening cuantitativo de produccin de celulasas.....
4.5.1 Seguimiento de la cintica de crecimiento durante las fermentaciones...
4.6 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas y
hemicelulasas........
4.6.1 Efecto de la agitacin.....
4.6.2 Efecto de la presencia Cu+2 en el medio....
4.6.3 Efecto de la fuente de carbono.
4.6.4 Efecto de la fuente de nitrgeno.....
4.7 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de las
celulasas y hemicelulasas de Bacillus sp. BH19 y BH62..

6
7
7
7
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19
19
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20
21
21

Introduccin........
2.1 Definicin de las hidrolasas......
2.2 Hidrlisis de la celulosa........
2.3 Microorganismos potenciales para la produccin de celulasas.....
2.4 Ventajas de las celulasas bacterianas en comparacin a las de origen fngico........
2.5 Aplicaciones industriales de las celulasas..................................
2.6 Materiales lignocelulsicos como fuentes renovables de carbono....
2.7 Bioetanol de segunda generacin...

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21
21
22
22
22
23

6.0

Resultados y Discusiones......
5.1 Screening cualitativo y cuantitativo de produccin de celulasas..
5.2 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas y
hemicelulasas.......
5.2.1 Efecto de la agitacin.....
5.2.2 Efecto de la presencia Cu+2 en el medio......
5.2.3 Efecto de la fuente de carbono.....
5.2.4 Efecto de la fuente de nitrgeno......
5.3 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de las
celulasas y hemicelulasas de Bacillus sp. BH19 y BH62...
Conclusiones .....

7.0

Referencias Bibliogrficas... 38

5.0

24
24
27
27
29
30
31
33
37

NDICE DE FIGURAS.
Figura 2.2.1 Mecanismo de la hidrlisis de la celulosa

Figura 2.6.1 Estructura de la lignocelulosa 11

Figura 2.6.2 Residuos agroindustriales en Brasil

12

Figura 2.7.1 Transformacin de la biomasa lignocelulsica en biocombustibles 13

Figura 5.1.1 Anlisis cualitativo de la produccin de celulasas, tincin de Rojo
Congo.. 24
Figura 5.1.2 Cintica de crecimiento de las cepas de Bacillus sp. en medio mineral
CMC 1%........................................................................................................ 26
Figura 5.1.3 Electroforesis del ADN genmico de muestras con O. D. ... 27
Figura 5.2.2.1 Efecto de Cu+2 sobre el crecimiento en las cepas de Bacillus sp 29
Figura 5.2.4.1 Efecto de la fuente de nitrgeno sobre el crecimiento de BH19 y BH62 32
Figura 5.3.1 Comparacin del efecto de temperatura y pH sobre la actividad de
CMCasa en Bacillus sp. BH19 34
Figura 5.3.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad de CMCasa de una muestra
de Bacillus sp. BH19 a pH ptimo 6.0. 34
Figura 5.3.3 Efecto de la temperatura sobre la actividad de CMCasa en una muestra
de Bacillus sp. BH62 a un pH ptimo 6.0 35
Figura 5.3.4 Efecto de temperatura sobre la actividad de Xilanasa en Bacillus sp. BH19
a pH ptimo 6.0.. 35
Figura 5.3.5 Efecto de la temperatura sobre la actividad de Xilanasa en Bacillus sp.
BH62 a pH ptimo 7.0.... 36

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NDICE DE TABLAS.

Tabla 2.3.1 Genes de inters industrial en Bacillus sp ............................................

Tabla 2.6.1 Algunos de los desechos lignocelulsicos producidos por distintas

industrias y con potencial aplicacin para biotransformacin

12

Tabla 4.1.1 Cepas de Bacillus sp preseleccionadas.. 15

Tabla 5.1.1 Comparacin cuantitativa de las cepas de Bacillus sp. mediante su
25
capacidad para desarrollarse en fermentacin sumergida
Tabla 5.1.2 Relacin entre O. D. y el ADN total extrado durante el desarrollo de
Bacillus sp. BH19 en medio LB..
27
Tabla 5.2.1.1 Velocidades especficas de crecimiento (h-1) de las cepas de Bacillus
sp. registradas en la fermentacin de medio mineral con CMC 1% con
distintas velocidades de agitacin.. 28
Tabla 5.2.3.1 Efecto de la fuente de carbono sobre la produccin de celulasas y
hemicelulasas medido mediante la actividad de CMCasa y Xilanasa
respectivamente.... 30
Tabla 5.2.3.2 Actividad proteoltica registrada en las muestras de 24 horas de
fermentacin en las cepas BH19, BH51 y BH62 en todos las fuentes de
carbono probadas.. 31
Tabla 5.2.4.1 Efecto de la fuente de nitrgeno sobre la actividad Xilanasa (U/ml)
registrada en las cepas BH19 y BH62 .................................... 32
Tabla 5.3.1 Comparacin entre la actividad enzimtica determinada bajo condiciones
36
ptimas respectivas y condiciones estndar (pH 4.8, 50C).

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1.0 RESUMEN.
Las celulasas y hemicelulasas son las enzimas hidrolticas responsables de la
degradacin de la lignocelulosa, la fuente de carbono renovable ms abundante en la
naturaleza. La aplicacin de este material para la produccin de combustibles lquidos
ha motivado intensos estudios en la bsqueda de nuevos microorganismos productores
de enzimas y el desarrollo de procesos de produccin basados en stos
microorganismos. El gnero Bacillus es reconocido industrialmente atractivo por sus
altas tasas de crecimiento, gran capacidad para la secrecin de enzimas extracelulares,
as como su desarrollo bajo condiciones ambientales extremas, anlisis del genoma de
sus especies han descrito su potencial para la produccin de las enzimas hidrolticas.
En este contexto fueron estudiadas cinco cepas de Bacillus sp. a partir de un una previa
seleccin de 25 cepas potenciales de un banco de 107 cepas aisladas de jugos despus
del proceso de pasteurizacin. En general las cinco cepas presentaron una baja
actividad, sin embargo Bacillus sp. BH19 y BH62 fueron seleccionadas con el mayor
potencial para la produccin de hidrolasas al desarrollarse adecuadamente en medio
mineral con carboximetilcelulosa como fuente nica de carbono tanto en placa con
medio slido y en fermentacin sumergida. Fueron investigados los efectos que tienen
algunos factores nutricionales y ambientales de los cuales se encontr que el salvado de
trigo y de soya como fuente de carbono inducen una mayor produccin de celulasas y
hemicelulasas,

as

mismo

las

fuentes

de

nitrgeno

orgnicas

junto

con

carboximetilcelulosa como fuente de carbono promueven un mayor desarrollo y

produccin de estas enzimas. En un rango de agitacin de 0 a 150 rpm no se present
una diferencia significativa en el desarrollo y produccin de hidrolasas. Dadas las bajas
actividades que se registraron fue realizada una optimizacin en las condiciones de
reaccin para la medicin de actividad de celulasas y hemicelulasas, encontrndose que
las mencionadas por los protocolos estndar no son las mejores para las muestras de
las cepas aqu estudiadas, lo cual pudo haber interferido en la subestimacin de las
actividades enzimticas.

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2.0 INTRODUCCIN
2.1 Definicin de las hidrolasas.
Las hidrolasas constituyen un grupo de enzimas cuya accin consiste transferir el
grupo escindido del sustrato al hidroxilo del agua. En este grupo se incluyen las
esterasas, tiolesterasas, fosfatasas, pirofosfatasas, peptidasas y las glicosidasas (Pea
A., 1988). Las glicosidasas catalizan la hidrlisis del enlace glucosdico de los
polisacridos liberando carbohidratos simples. Actualmente las glicosidasas de mayor
inters biotecnolgico son las

-1,4-glucanasas (Celulasas) y las -xilosidasas

(hemicelulasas) que catalizan la degradacin de los polmeros naturales renovables ms

abundantes de la naturaleza, celulosa y hemicelulosa (Palls V., 2008).
2.2 Hidrlisis de la celulosa.
La accin enzimtica para llevar a cabo la hidrlisis de la celulosa implica la
operacin secuencial y la accin sinergsta de un grupo de celulasas que presentan
diferentes sitios de enlace, debido a la naturaleza compleja de la celulosa (Figura 2.2.1).
El sistema de celulasa tpico incluye tres tipos de enzimas: la endo--1,4-glucanasa (E.
C. 3.2.1.4) la exo--1,4-glucanasa (E.C. 3.2.1.91) y la -1,4-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21)
(Lee J., 1997).
El mecanismo propuesto para la degradacin de la celulosa se resume en tres
etapas: Primero la endo--1,4-glucanasa acta al azar sobre los enlaces -1,4glucosidicos internos presentes entre las unidades de glucosa que forman la molcula
de la celulosa y convierte las cadenas largas a oligosacridos los cuales mantienen la
configuracin de su estructura. La accin de esta enzima es sobre las regiones
amorfas de la molcula de celulosa o sobre la superficie de las microfobrillas, y tiene
como resultado la disminucin de la longitud de la cadena de celulosa y la creacin de
nuevos extremos reactivos que sirven de sustrato en la Segunda etapa para la posterior
accin de la exo--1,4-glucanasa que corta la cadena -1,4-glucano a partir del extremo
no reductor de la molcula de celulosa y de las celodextrinas, lo que provoca la
remocin de unidades de celobiosa o glucosa (Ryu D. y Mandels M., 1980).
Una vez degradada las zonas amorfas de la celulosa, tiene lugar la Tercera etapa
de la hidrlisis, en donde la regin cristalina comienza a ser hidrolizada, como resultado
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de la accin sinergsta de las endo y exo glucanasas. Finalmente las molculas de

celobiosa son hidrolizadas por la -glicosidasa a glucosa.

Figura 2.2.1. Mecanismo de la hidrlisis de la celulosa, accin

sinrgica de las celulasas (Karmakar M., 2011).

2.3 Microorganismos potenciales para la produccin de celulasas.

Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aerbicos o
anaerbicos, mesfilos o termfilos. Sin embargo solo algunos de ellos producen
celulasas extracelulares capaces de hidrolizar la celulosa. A partir de los hongos
aerbicos, tales como: Trichoderma reesei, Penicillium pinophilum, Fusarium solani y
Taloromyces emersonii de los cuales se han obtenido los complejos celulolticos que
presentan un sistema enzimtico completo de celulasas (Erikson K. y Wood T., 1985).
Otros microorganismos productores de celulasas incluyen a las bacterias
aerbicas mesoflicas y termoflicas (Cellulomonas sp., Cellvibrio sp y Thermomonospera
sp.), y las bacterias anaerbicas mesoflicas y termoflicas (Acetivibrio cellulolyticus,
Ruminococcus albus y Clostridium thermocellum) (Beguin P. y Aubert J., 1993).
Bacterias del genero Bacillus aerobias y termoflicas producen enzimas celulolticas con
actividad bsicamente endo--1,4-glucanasa y exo--1,4-glucanasa; pero tienen la
caracterstica particular de presentar resistencia a ser inhibidas por la glucosa o
celobiosa que es liberada al medio luego de la hidrlisis (Erikson K. y Wood T., 1985).
En el caso especfico del genero Bacillus sus especies son atractivas
industrialmente por varias razones incluyendo sus altas tasas de crecimiento que
permiten tiempos de fermentacin cortos, su gran capacidad de secrecin extracelular
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de enzimas, esta capacidad secretoria presenta un potencial para la produccin

heterologa de protenas, adems estas bacterias son consideradas GRAS (generaly
regarded as safe) por la FDA (Schallmey M. et al 2004). Algunos de los potenciales
genes de inters industrial responsables de la degradacin de polisacridos se muestran
en la Tabla 2.3.1.

Gen
abfA
bglC
bglH
bglS
yhlE
yjeA
ynfF

Posicin en el
cromosoma.

2939
1940
4023
4011
1095
1281
1943

Enzima
-L-arabinofuranosidasa
endo-1,4--glucanasa
-glucosidasa
endo-1,3- y -1,4--glucanasa
Glucanasa
endo-1,4--xilanasa
endo-xilanasa

Tabla 2.3.1. Genes de inters industrial en Bacillus sp.

Adaptada de Schallmey M. et al (2004).

Actualmente el mercado mundial de las enzimas se estima en 1.6 millones de

dlares, se ha determinado que las enzimas de Bacillus sp. representan cerca del 50%
de este mercado. La mayor produccin de estas enzimas (37%) pertenece a serinproteasas alcalinas, el segundo grupo ms importante son las amilasas con un 13% del
mercado seguida por otras enzimas pectatoliasas y las -glucanasas (Schallmey M. et al
2004).
2.4 Ventajas de las celulasas bacterianas en comparacin a las de origen fngico.
Tanto hongos como bacterias han sido fuertemente explotados por sus
habilidades para producir una amplia variedad de celulasas y hemicelulasas. Sin
embargo se ha tenido mayor nfasis en el uso de hongos debido a su capacidad para
producir importantes cantidades de celulasas y hemicelulasas que son secretadas al
medio siendo sencilla su extraccin y purificacin. No obstante el aislamiento y
caracterizacin de nuevas glicosidasas en eubacterias est siendo ampliamente
estudiado. Estos organismos presentan una serie de ventajas, la primera, es que tienen
tasas de crecimiento mayores que los hongos permitiendo una mayor produccin de
enzimas. En segunda, las

glicosidasas bacterianas son ms complejas y son

expresadas en complejos multienzimticos aumentando su actividad y sinergismo. Los

factores favorables ms importantes son la baja demanda de nutrientes para su
crecimiento y la capacidad de desarrollarse en una amplia variedad de ambientes,
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teniendo cepas celulolticas altamente resistentes a factores de estrs ambientales,

entre las cuales se encuentran cepas termoflicas o psicroflicas, alcalfilas o acidfilas y
cepas que son halfilas. Estas bacterias no solo pueden sobrevivir en estos ambientes,
sino que producen enzimas que son estables bajo condiciones extremas que podran
mantenerse en procesos de bioconversin incrementando las tazas de actividad
enzimtica, fermentacin y recuperacin de producto (Maki M. et al, 2009).
2.5 Aplicaciones industriales de las celulasas.
Las celulasas tienen un amplio rango de aplicaciones potenciales en
biotecnologa y muchas endoglucanasas termoestables tienen un gran potencial para
usos industriales. En la mayora de los casos son usadas junto con hemicelulasas,
pectinasas,

ligninasas

otras

enzimas

relacionadas

(Karmakar

M.,

2011).

Especficamente tienen importantes aplicaciones en la agricultura, en la industria

papelera, en textiles especialmente en la mejora de la calidad de telas as como en
detergentes que proporcionan mejor limpieza sin degradar las fibras; en la industria de
alimentos mejorando texturas, sabores y aromas; en la mejora de las fermentaciones de
cervezas, vinos y otras bebidas alcohlicas; pero principalmente en la industria de la
bioconversin de materiales celulsicos en alimentos para ganado altos en energa con
mejores tasas de digestin y absorcin de nutrientes, en la produccin de protena
unicelular, lpidos, cidos orgnicos, etanol solventes y otros productos qumicos con un
alto valor agregado como biocombustibles (Chander R. K. et al. 2011).
2.6 Materiales lignocelulsicos como fuentes renovables de carbono.
La biomasa lignocelulsica es producida mediante fotosntesis la cual convierte la
energa solar en energa qumica, almacenndola en carbohidratos mediante la fijacin
del carbono atmosfrico, por lo cual la lignocelulosa es considerada el recurso natural
renovable ms abundante en el planeta, con cerca de 200 billones de toneladas
producidas anualmente (Zhang Y., 2008).
La lignocelulosa proporciona la estructura de las plantas encontrndose en las
races, tallos y hojas; como se muestra en la Figura 2.6.1 est formada de tres
componentes principales: celulosa (38-50%), lignina (15-30%) y hemicelulosa (23-32%),
esta proporcin vara entre especies (Sierra R. et al, 2008). La celulosa es un polmero
de D-glucosa unida por enlaces glucosdicos -1,4 que se estructuran en largas cadenas
lineales (microfobrillas) unidas por puentes de hidrgeno y fuerzas de van der Waals
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10

intramoleculares, formando una estructura cristalina resistente a la hidrlisis y regiones

amorfas suceptibles a la degradacin enzimtica (Ovando C. & Waliszewski N., 2005), la
lignina es un polmero de unidades de fenil propano unidas mediante enlaces ter la cual
acta como pegamento en las fibras de celulosa, adems acta como barrera
impidiendo la degradacin enzimtica. La hemicelulosa es un polmero complejo de
heteropolisacridos formado por pentosas (D-xilosa y L-arabinosa) y hexosas (Dglucosa, D-manosa y D-galactosa) que forman cadenas ramificadas y los cidos 4-Ometilglucurnico, D-galacturnico y D-glucornico, los azucares estn unidos por
enlaces -1,4 y ocasionalmente por enlaces -1,3 (Perez, et al, 2002).

Figura 2.6.1 Estructura de la lignocelulosa, La celulosa, la hemicelulosa y la lignina

forman estructuras llamadas microfibrillas, organizadas en macrofibras que regulan la
estabilidad de la pared celular de las plantas (Adaptacin de Rubin E., 2008).

Actualmente se analiza la posibilidad de crear cultivos con el objetivo de sustituir y

mejorar a la sacarosa de la caa de azcar y almidn de semillas de maz como fuente
renovable

de

carbono

mediante

una

produccin

sustentable

de

biomasa

ligninocelulsica, sin embargo otras fuentes importantes de carbono renovable estn

disponibles en los desechos lignocelulsicos los cuales son producidos en grandes
cantidades por distintas industrias incluyendo la forestal, la de pulpa y papel, agricultura,
alimentos y algunos desechos comunes de basurero (Tabla 2.6.1). Estos materiales
potencialmente valiosos fueron considerados como basura en muchos pases en el
pasado, e inclusive hoy en da lo siguen siendo en algunos pases en vas de desarrollo
provocando problemas ambientales. Muchos esfuerzos han intentado convertir estos

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11

residuos lignocelulsicos en productos valiosos como biocombustibles, productos

qumicos y alimento para animales con alto valor nutricional (Dashtban M. et al, 2009).

Desechos lignocelulsicos
Desechos agrcolas
mundiales

Produccin mundial anual

Millones de toneladas por
ao

Paja de maz
Paja de cebada
Paja de avena
Paja de arroz
Paja de trigo
Paja de sorgo
Bagazo

203.62
58.45
10.62
731.34
354.35
10.32
180.73

Tabla 2.6.1 Algunos de los desechos lignocelulsicos producidos por

distintas industrias y con potencial aplicacin para biotransformacin
(Dashtban M. et al, 2009).

En Brasil son producidas aproximadamente 350 millones de toneladas de

residuos agroindustriales y agrcolas siendo producidos principalmente de la caa de
azcar y la soya, (Figura 2.6.3), seguidos luego por residuos de maz (Pereira N. et al,
2008).

Figura 2.6.2 Residuos agroindustriales de los principales cultivos

nacionales de Brasil (Pereira N. et al, 2008).

2.7 Bioetanol de segunda generacin.

En la actualidad Estados Unidos y Brasil son los lderes en la produccin de
combustibles basados en almidn y sacarosa a partir de cultivos de maz y de caa de
azcar respectivamente, stos son conocidos como biocombustibles de primera
generacin cuya produccin utiliza tecnologa convencional de fermentacin, no
obstante estas fuentes de carbono renovables no sern suficientes para satisfacer la
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12

creciente demanda (Greene N. 2004) as mismo son considerados como recursos

controversiales para la bioconversin al contraponerse al abastecimiento alimenticio. La
biomasa lignocelulsica es el recurso natural con un gran potencial para la produccin
de biocombustibles dada su gran abundancia, disponibilidad y bajo valor econmico, sin
embargo los altos costos de las tecnologas requeridas son una de las mayores
limitaciones para la produccin y comercializacin

de biocombustibles de segunda

generacin (Zhang Z., 2010).

La produccin de biocombustibles utilizando materiales lignocelulsicos (Figura

2.7.1), involucra la recoleccin de la biomasa, la descomposicin de los polmeros de la
pared celular en azucares simples (pretratamiento y sacarificacin) y la posterior
conversin de estos azucares en los biocombustibles (Rubin E. 2008).

Figura 2.7.1. Transformacin de la biomasa lignocelulsica en

biocombustibles, (Rubin E, 2008).

Aunque existen mtodos fisicoqumicos que permiten utilizar la biomasa en la

produccin de biocombustibles, una alternativa conveniente es propuesta por los
mtodos biolgicos que utilizan organismos celulolticos para obtener azucares
fermentables mediante procesos energticamente econmicos (Lynd et al, 2002). Por tal
motivo en la actualidad muchos esfuerzos de investigacin se estn enfocando en la
produccin costeable de enzimas hidrolticas para poder ser aplicadas en la produccin
del bioetanol. En el presente trabajo se realiz una seleccin de cepas con el mejor
potencial para la produccin de hidrolasas, en especfico celulasas y hemicelulasas.
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13

3.0 OBJETIVOS.
3.1 Objetivo general.
En este proyecto se pretende determinar y comparar el potencial celuloltico y
hemiceluloltico de seis cepas de Bacillus sp. previamente aisladas de jugos despus del
proceso de pasteurizacin, dichas cepas han sido preliminarmente identificadas como
posibles productoras de celulasas y hemicelulasas. Para este trabajo se pretende hacer
un anlisis ms detallado de este potencial mediante la medicin de actividad celuloltica
y hemiceluloltica de las cepas sometidas a diversas condiciones de cultivo (temperatura,
pH, aireacin, fuente de carbono, fuente de nitrgeno, presencia de iones, uso de otros
compuestos que pudieran aumentar la actividad) finalmente determinar cul o cules de
stas son las mejores y bajo qu condiciones para poder hacer un anlisis ms preciso y
detallado mediante cultivos en biorreactor.

3.2 Objetivos especficos.

Hacer una comparacin cualitativa y cuantitativa del desarrollo de las cepas de
Bacillus sp. y seleccionar aquellas que sean las mejores.
Determinar cuantitativamente en funcin de las actividades de FPasa, CMCasa y
Xilanasa el potencial celuloltico y hemiceluloltico de las cepas de Bacillus sp.
mediante cultivo en medios con distintas fuentes de carbono: bagazo de caa de
azcar explotado con vapor y deslignificado (BED), bagazo de caa de azcar
explotado con vapor no deslignificado (BEX) y bagazo de caa de azcar
pretratado hidrotrmicamente (HT).
Determinar cuantitativamente el efecto que tienen el pH, la aireacin, la
temperatura, as como la utilizacin de diversas fuentes de nitrgeno sobre la
produccin de celulasas y hemicelulasas.

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14

4.0 MATERIALES Y METODOS.

4.1 Cepas de Bacillus sp.
Para la seleccin de los linajes con el posible potencial de produccin de
hidrolasas se parti de los resultados de un aislamiento de 107 cepas de Bacillus sp.
que fueron encontradas en jugos de frutas despus de haber sido sometidos a la
pasteurizacin. Una preseleccin fue hecha a partir del anlisis de actividad enzimtica
en funcin de la cantidad de azucares reductores totales y la actividad enzimtica de
xilanasa presentes despus de 72 horas de crecimiento en medio Luria Bertani estril
con 0.5% de distintas fuentes de carbono como sustrato incubando en placas de pozo
profundo a 37C con una agitacin de 250 RPM. Las diferentes fuentes de carbono
utilizadas fueron: bagazo de caa de azcar explotado con vapor no deslignificado
(BEX), bagazo de caa de azcar explotado con vapor (BED), pulpa de bagazo,
eucalipto explotado, espelta de avena, xilana, avicel, -celulosa, y pectina. De estos
experimentos fueron observadas 25 cepas con el mayor potencial para la degradacin
de celulosa y hemicelulosa. Para el presente trabajo fueron seleccionadas cinco cepas
las cuales presentaron en general una mayor actividad celuloltica y hemiceluloltica para
cada uno de los sustratos utilizados (Tabla 4.1.1).
Cepa
Bacillus
sp.
BH 02
BH 05
BH 19
BH 51
BH 62

Bagazo
explotado

Eucalipto
explotado

Bagazo
molido

Xilana
comercial

Avicel

Bagazo
(pulpa)

celulosa

Pectina

Actividad
(U/mL)

0.0980
0.4569
0.2128
0.4853
0.0533

0.0328
0.4428
0.2949
0.3861
0.0373

0.0177
0.3302
0.1554
0.7220
0.0772

1.2215
0.1496
0.7280
0.4253
0.9585

0.0189
0.2518
0.2316
0.4904
0.1929

0.4462
0.4247
0.3656
0.3965
0.2071

-0.0323
0.4440
0.2787
0.5441
0.1677

-0.2605
1.6897
0.3725
0.8528
0.1226

0.3427
0.0764
0.2603
0.1541
0.4162

Tabla 4.1.1. Cepas de Bacillus sp preseleccionadas. Cinco de las mejores veinticinco preseleccionadas
cepas de acuerdo a la mayor actividad registrada en los distintos tipos de sustrato. La tabla muestra la
absorbancia (540 nm) de los azucares reductores del medio (Anlisis por DNS).

4.2 Screening cualitativo de produccin de celulasas.

La deteccin de las cepas de Bacillus sp. con mejor produccin de celulasas fue
realizada a partir del anlisis cualitativo de actividad celuloltica mediante la aplicacin
del tinte Rojo Congo propuesto por Ariffin H. et. al. (2006). Para ello las cinco cepas
fueron inoculadas en un medio mineral con CMC 1% (Conteniendo (g/L): KH2PO4 1.0,
MgSO47H2O 0.5, FeSO47H2O 0.01, MnSO4H2O 0.01, NH4NO3 0.3, CMC 10, Agar 12)
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15

con un pH ajustado a 7.0 con NaOH 1M. Las placas de CMC fueron incubadas a 37C
durante 5 das permitiendo la secrecin de celulasas. Una vez terminado ese tiempo las
placas fueron tratadas con 10 ml una solucin acuosa de Rojo Congo (0.5% p/v) durante
15 minutos. La solucin de tinte fue retirada de las placas y posteriormente fueron
cubiertas por 10ml de NaCl 1M durante 10 minutos para desteir la zona con actividad.
La formacin de una halo decolorado indica la degradacin de la celulosa (Teather R.
M., y Wood P. J., 1982). La cepa con mayor radio del halo fue considerada como la de
mayor actividad celuloltica.

4.3 Fermentacin sumergida.

4.3.1 Mantenimiento de las cepas de Bacillus sp.
Las 5 cepas fueron almacenadas mediante crioconservacin, para lo cual cada
una de ellas fue inoculada en un medio mnimo M9 e incubada a 37C con agitacin
orbital a 250 RPM hasta alcanzar una OD de 0.6 a 1.0, posteriormente las bacterias
fueron centrifugadas descartando el sobrenadante y resuspendidas en medio mnimo
M9 con glicerol 10%, en seguida estas se alicuotaron en viales de 2mL y almacenaron
en nitrgeno lquido. Para la preparacin de inculos a partir de picadura en colonia
fueron preparadas placas con medio LB (NaCl 1%, Bacto-Triptona 1%, Extracto de
levadura 0.5% y Agar 1.5%) las cuales fueron inoculadas con diluciones de las bacterias
criopreservadas permitiendo la formacin de colonias aisladas.

4.3.2 Medios de cultivo.

1. Medio de cultivo mineral: El medio de cultivo estndar utilizado para las
fermentaciones realizadas se prepar de la siguiente forma (g/L): KH2PO4 1.0,
MgSO47H2O 0.5, FeSO47H2O 0.01, MnSO4H2O 0.01, NH4NO3 0.3, CMC 10, aforando
a 1000 mL con agua destilada y con un pH ajustado a 7.0 con NaOH 1M (Ariffin H. et. al.
2006).
2. Medio Luria Bertani (LB) para preparacin de inculo: Para el desarrollo del
inculo utilizado para cada una de las fermentaciones las cepas fueron crecidas en
medio LB conteniendo (g/L): NaCl 10, Bacto-Triptona 10,

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Extracto de levadura 5,

16

aforando a 1000 mL con agua destilada con un pH ajustado a 7.0. Agar a una
concentracin de 1.5% fue utilizado en medio slido.

4.3.3 Preparacin de inculo.

Para cada fermentacin realizada con las cinco cepas la preparacin del inoculo
fue realizada de la misma forma. En condiciones estriles fue tomada una colonia
aislada de una placa con medio LB mediante un palillo de madera estril y este fue
inoculado en 50 ml de medio LB en matraz Erlenmeyer de 250 mL, el cultivo fue
incubado a 37C con agitacin orbital a 250 rpm dejando crecer toda la noche (14 horas
hasta alcanzar una O.D. de hasta 2.0). Luego las bacterias fueron centrifugadas y
resuspendidas en 10 mL de medio LB fresco.

4.3.4. Condiciones estndar de fermentacin.

Cada una de las fermentaciones realizadas se llev a cabo en matraces
Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 30 ml del medio mineral estril y fueron inoculados
con la cantidad suficiente del inculo concentrado en medio LB fresco para ajustar una
densidad ptica de 0.2 al inicio de la fermentacin, la incubacin se realiz a 37C con
agitacin orbital a 150 rpm durante mximo 72 horas.

4.3.5 Preparacin del extracto enzimtico.

Durante la fermentacin fueron tomadas muestras de 1 mL a intervalos de tiempo
regulares, cada una de las muestras fueron centrifugadas a 13,000 rpm durante 5
minutos a 4C, los sobrenadantes obtenidos fueron utilizados para la determinacin de
las actividades enzimticas (Abou-Taleb K. et. al., 2009). Las muestras fueron
almacenadas a -20C hasta ser analizadas.

4.4 Mtodos analticos y mediciones.

4.4.1 Seguimiento de la cintica de crecimiento durante las fermentaciones.
Para el seguimiento de la cintica de crecimiento de las bacterias se recurri a la
medicin de la densidad ptica (O. D.) de las muestras en funcin de la absorbancia del
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17

medio para las fermentaciones con medios translucidos (Medio mineral con CMC
nicamente). Para el caso de las fermentaciones con medio mineral y los distintos
bagazos la tcnica de O.D. no fue la adecuada por lo que se propuso la estandarizacin
de un mtodo ms rpido para la cuantificacin del crecimiento bacteriano presente en
el medio de cultivo basado en la cuantificacin de ADN genmico total de las diversas
muestras.
Para el ensayo se inocul la cepa BH19 en 30 mL de medio LB incubado a 37C
con agitacin orbital a 250 rpm durante 6 horas, cada hora se tom una muestra, se
determin su O. D. (600 nm) y posteriormente fue realizada la extraccin de ADN
genmico total mediante el mtodo de Hai-Rong Cheng & Ning Jiang (2006) en el cual 1
ml del cultivo fue centrifugado a 13, 000 rpm durante 5 minutos descartando el
sobrenadante y posteriormente lavando las clulas con 400 L de Buffer STE (NaCl
100 mM, Tris/HCl 10 mM, EDTA 1mM, pH 8.0) dos veces, en seguida las clulas fueron
centrifugadas nuevamente y las bacterias fueron resuspendidas en 200 L de buffer TE
(Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0). Luego se agregaron 100 L de Fenol saturado
con Tris (pH 8.0) seguido de 120 segundos de agitacin en vortex para producir la lisis
celular. Subsecuentemente las muestras fueron centrifugadas a 13, 000 rpm durante 5
minutos a 4C para separar la fase acuosa de la fase orgnica. 160 L del sobrenadante
fueron transferidos a nuevos microtubos. Posteriormente se realizaron varias
extracciones con cloroformo para purificar las muestras, luego se agreg 1 L de
ARNasa e incub a 37C por 20 minutos, finalmente se realiz otra purificacin con
cloroformo y la solucin de ADN fue utilizada directamente para su cuantificacin y
determinacin de pureza mediante NanoDrop 2000 de ThermoScientific. Fue realizada la
electroforesis en gel de agarosa 1% para observar la integridad de las muestras

4.4.2 Actividad enzimtica sobre papel filtro (FPasa).

La actividad de FPasa fue medida de acuerdo al mtodo descrito por Mandels M.
y Weber J. (1969) con algunas modificaciones. La actividad se determin utilizando
trozos de papel filtro Watman no.1 en buffer citrato 50 mM (pH 4.8) como sustrato. La
mezcla de reaccin consisti en 5 mg de papel filtro en 100 L de buffer citrato (50 mM,
pH 4.8) y 50 L del extracto enzimtico, estas muestras fueron incubadas a 50C
durante 60 minutos, luego la reaccin fue detenida con la adicin de 300 L de reactivo
de DNS, en seguida fue determinada la cantidad de azucares reductores que fueron
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18

liberados por la enzima durante el periodo de incubacin. Una unidad de actividad de

FPasa fue determinada como 1 mol de glucosa liberada por mL de enzima por minuto.

4.4.3 Actividad enzimtica sobre Carboximetilcelulosa (CMCasa).

La actividad de la CMCasa fue determinada de manera similar a la actividad de
FPasa de acuerdo con el mtodo descrito por Mandels M. y Weber J. (1969) con
algunas adaptaciones. La actividad se determin utilizando una solucin acuosa de
CMC 0.5% diluida con buffer citrato 50 mM (pH 4.8) como sustrato. La reaccin fue
llevada en placa de PCR de 96 pocillos y la mezcla de reaccin consisti en 50 L de
solucin acuosa de CMC 0.5%, 40 L de buffer citrato y 10 L del extracto enzimtico.
Posteriormente las muestras fueron incubadas en termociclador a 50C durante 30
minutos, la reaccin fue detenida al instante mediante la adicin de 100 L de reactivo
de DNS. En seguida fue determinada la cantidad de azucares reductores liberados en el
periodo de incubacin, una unidad de actividad de CMCasa fue determinada como 1
mol de glucosa liberado por ml de enzima por minuto.

4.4.4 Actividad enzimtica sobre Xilana (Xilanasa).

La actividad de la Xilanasa fue determinada de manera similar a la actividad de
CMCasa. La actividad se determin utilizando una solucin acuosa de Xilana 0.5%
diluida con buffer citrato 50 mM (pH 4.8) como sustrato. La reaccin fue llevada en placa
de PCR de 96 pocillos y la mezcla de reaccin consisti en 50 L de solucin acuosa de
Xilana 0.5%, 40 L de buffer citrato y 10 L del extracto enzimtico. Posteriormente las
muestras fueron incubadas en termociclador a 50C durante 30 minutos, la reaccin fue
detenida al instante mediante la adicin de 100 L de reactivo de DNS. En seguida fue
determinada la cantidad de azucares reductores liberados en el periodo de incubacin,
una unidad de actividad de Xilanasa fue determinada como 1 mol de xilosa liberado
por ml de enzima por minuto.

4.4.5 Determinacin de azucares reductores por el mtodo de DNS.

Este ensayo se realiz de acuerdo con el mtodo planteado por Miller G. L. (1959)
con algunas modificaciones. Luego de haber agregado el reactivo de DNS a cada una
de las muestras para detener la reaccin enzimtica, stas fueron llevadas a bao mara
en ebullicin durante 5 minutos, en seguida la reaccin fue detenida al pasar las
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19

muestras a un bao de hielo. Fue medida la absorbancia de las muestras a 540 nm y se

calcul la cantidad de glucosa o xilosa liberadas en cada muestra mediante una curva
patrn de glucosa o xilosa estndar.

4.4.6 Determinacin del contenido de protena por el mtodo de Bradford.

El contenido de protena fue determinado mediante el Ensayo de Protena de BioRad (Bio-Rad Protein Assay) basado en el mtodo de Bradford M. (1976). La reaccin
fue llevada en placa de 96 pocillos en la cual se agregaron 80 L de muestra
debidamente diluida con 20 L del reactivo de Bradford. Posteriormente la mezcla fue
incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos. La absorbancia de las muestras
fue medida a 595 nm utilizando agua mili-Q como blanco.

4.4.7 Actividad enzimtica proteoltica.

Dados algunos problemas concurridos durante las determinaciones de las
actividades enzimticas se realiz un ensayo para cuantificar la actividad proteoltica
presente en el extracto enzimtico para verificar la posibilidad de interferencia debido a
estas enzimas. La actividad proteoltica fue determinada en base a la metodologa
propuesta por Charney J. y Tomarelli R. M. (1947) con algunas modificaciones y
adaptaciones. La actividad se determin utilizando una solucin de azocaseina 0.5% en
buffer acetato 50 mM (pH 5) como sustrato y en base a la formacin de derivados
coloridos en medio alcalino a partir de la hidrlisis del sustrato. La reaccin se llev a
cabo en microtubos de 1.5 mL, la mezcla de reaccin consisti en 50 L de azocasena
en buffer acetato (50 mM, pH 5, estabilizado previamente por 10 minutos a 37C) y 50
L del extracto enzimtico, luego sta se incub a 37C por 40 minutos. Posteriormente
la reaccin se detuvo mediante la adicin de 50 L de cido tricloro-actico para
precipitar el sustrato no digerido, en seguida las muestras fueron centrifugadas a 10,000
rpm durante 15 minutos y 100 L de sobrenadante fueron transferidos a una placa de 96
pocillos para posteriormente adicionar 100 L de KOH 5N para la formacin de
compuestos coloridos (para cada muestra se prepara un blanco al cual se adiciona el
cido tricloro-actico antes de adicionar el extracto enzimtico), las muestras fueron
analizadas en espectrofotmetro a 428 nm. La actividad proteoltica se expres como la
diferencia de absorbancia entre las muestras analizadas con sus respectivos blancos,
siendo: 1 Unidad= Absorbancia /0.01/ tiempo de reaccin por mL de extracto enzimtico.
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20

4.5 Screening cuantitativo de produccin de celulasas.

Fue realizada una fermentacin en medio mineral CMC 1% con las cinco cepas
bacterianas para el seguimiento de la cintica de crecimiento, la determinacin de la
velocidad especifica de crecimiento () mediante la medicin de O. D. en cada una de
stas as como la determinacin de la actividad celuloltica (FPasa y CMCasa) utilizando
las condiciones de fermentacin estndar, el tiempo de desarrollo fue de 64 horas. Para
ello fueron tomadas muestras a 16, 40 y 64 horas de cultivo.

4.6 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas

y hemicelulasas.
Durante el desarrollo del trabajo experimental en base a trabajos previos realizados
acerca de la produccin de celulasas y hemicelulasas en diferentes cepas de Bacillus
(Abou-Taleb K. A. et. al., 2009; Shankar T. et. al., 2011; Nasr S., et. al., 2009; Heck J. X.
et. al., 2002; Otajewo F. D. 2011; Ariffin H. et. al., 2006; Kummar S. G. et. al., 2009; LiJung Yin, et. al., 2011; Immanuel G. et. al., 2006; Kotchoni O. S., et. al., 2003; Wizna H.,
et. al., 2007 y Femi-Ola T. et. al., 2008) fueron determinadas las condiciones que
podran aumentar la produccion de las hidrolasas, en base a ello fueron analizados los
siguientes efectos:

4.6.1 Efecto de la agitacin.

Fueron inoculadas las cepas BH62, BH51 y BH19 en condiciones de fermentacin
estndar con CMC 1% y una modificacin de la fuente de carbono por BED 1%, as
mismo la agitacin del medio fue cambiada por las siguientes: sin agitacin, 50 rpm, 100
rpm y 150 rpm, esto para conocer las condiciones apropiadas de aireacin para la
mxima produccin de celulasas y hemicelulasas. Fueron tomadas muestras a las 6, 12,
24, 48 y 72 horas de la fermentacin y en cada una de estas fue determinada la
actividad enzimtica sobre carboximetilcelulosa (CMCasa) y sobre Xilana (Xilanasa), asi
mismo fue medida la O. D. de las muestras y determinada la cintica de crecimiento en
los cultivos con CMC 1%

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21

4.6.2 Efecto de la presencia de Cu+2 en el medio.

Fue evaluado el efecto de la presencia de iones de cobre sobre la produccin de
celulasas y hemicelulasas. Las

cepas BH62, BH51 y BH19 fueron inoculadas en

matraces Erlenmeyer de 125 ml con 30 ml medio mineral CMC 1% complementado con

5 mM de CuSO4 (Akel H. et. al., 2009; Servinic N. y Demircan E., 2011; Shafee N. et. al.,
2000) incubados a 50 rpm a 37C. Fueron tomadas muestras a las 24, 48 y 72 horas de
la fermentacin y en cada una de estas fue determinada la actividad enzimtica sobre
carboximetilcelulosa (CMCasa) y sobre Xilana (Xilanasa), as mismo fue medida la O. D.
de las muestras y observada la cintica de crecimiento en los cultivos.

4.6.3 Efecto de la fuente de carbono.

Fueron inoculadas las cepas de Bacillus sp. BH19, BH51 y BH62 en condiciones
de fermentacin estndar. Para este experimento la fuente de carbono del medio mineral
fue sustituida por su equivalente 1% de : bagazo de caa de azcar explotado con vapor
y deslignificado (BED), bagazo de caa de azcar explotado con vapor no deslignificado
(BEX) y bagazo de caa de azcar pretratado hidrotrmicamente (HT).Salvado de Soya
(FS), Salvado de Trigo (FT) y licor del pretratamiento hidrotrmico de bagazo (LQ)
(Tambin se trabaj con CMC 1% como control) esto con el objetivo de obtener una
mayor induccin de produccin de celulasas y hemicelulasas con alguna fuente de
carbono especfica. Fueron tomadas muestras a las 6, 12, 24, 48 y 72 horas. En este
experimento fue determinada la actividad CMCasa y Xilanasa. Adems en las muestras
de 24 horas fue determinada la actividad proteoltica.

4.6.4 Efecto de la fuente de nitrgeno.

Fueron seleccionadas e inoculadas las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62 en
condiciones de fermentacin estndar. Para este experimento fueron utilizados los
bagazos con pretratamiento (BED, BEX y HT) como fuente de carbono la fuente de
carbono (1%). Del medio mineral la fuente de nitrgeno (NH4NO3) fue sustituida por dos
fuentes de nitrgeno orgnicas y dos inorgnicas: Triptona y extracto de levadura, as
como NH4Cl y (NH4)2SO4 respectivamente en una composicin del 0.2%. Esto con el
objetivo de encontrar una mejor produccin de celulasas y hemicelulasas mediante el
sinergismo de una fuente de carbono y una de nitrgeno en especfico. En este
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22

experimento fue determinada la actividad CMCasa y Xilanasa. La cantidad de protena

total del extracto enzimtico tambin fue determinada.

4.7 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de

las celulasas y hemicelulasas de las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62.
Para muestras de extractos enzimticos que mostraron actividad endoglucanasa y
xilanasa en las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62, fueron probadas diferentes
condiciones de reaccin en cuanto a pH y temperatura. Para ello se realiz un gradiente
de pH/temperatura, para la fijacin del pH fueron utilizados los siguientes buffers (50
mM): citrato pH 3.5, citrato pH 4.8, citrato pH 6.0, fosfato pH 7.0 y fosfato pH 9.0 y el
gradiente de temperatura facilitado por termociclador a 40.4, 45.8, 51.1, 56.2 y 60C.
Una vez determinado el pH optimo, fue analizado un rango de temperatura de reaccin
mayor (60.1, 65.6, 70.9, 76 y 80C).

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23

5.0 RESULTADOS Y DISCUSIONES

5.1 Screening cualitativo y cuantitativo de produccin de celulasas.
La tcnica de zona clara en medio de carboximetilcelulosa (Carboximethilcellulose
clear zone) exhibe cualitativamente la habilidad de las cepas para producir celulasas
dado a que el colorante Rojo Congo presenta fuertes interacciones con polisacridos
unidos por enlaces -1,4 as como significantes interacciones con -1,3-D-glucanos, al
producirse la hidrlisis de estos compuestos las interacciones entre el colorante y los
polisacridos se pierden, perdindose a su vez la coloracin en el halo correspondiente
al rea en el que la bacteria secret las celulasas, el dimetro del halo es equivalente al
potencial celuloltico del microorganismo (Teather R. y Wood P., 1982), en funcin a lo
anterior luego de 120 horas de desarrollo de las cepas de Bacillus sp. (Figura 5.1.1) se
encontr que la mejor en produccin de celulasas en sustrato solido es BH19, BH05 y
BH62, seguidas por las cepas BH51 y BH02 estas ltimas con baja actividad.

A
5 mm
A

D
6 mm
A

B
15 mm

19 mm
A

E
12 mm
A

---A

Figura 5.1.1. Zona clara de colorante Rojo Congo en medio mineral con carboximetilcelulosa 1%. A
Bacillus sp. BH02, B Bacillus sp. BH05, C Bacillus sp. BH19, D Bacillus sp. BH51, E Bacillus sp. BH62
y F Control. En la parte inferior se indica la longitud en milmetros del halo producido por cada cepa.

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24

El screening cualitativo fue realizado en condiciones de fermentacin en sustrato

slido, por su parte en el caso del screening cuantitativo se prob el potencial mediante
fermentacin sumergida, de esta forma fue comparada la capacidad de las cepas de
Bacillus sp para desarrollarse bajo stas condiciones que son mayormente sencillas en
el caso de un escalamiento del proceso. Los ensayos de actividad enzimtica sobre
papel filtro (FPasa) y sobre carboximetilcelulosa (CMCasa) no mostraron resultados
favorables, pues ninguna de las cepas de Bacillus sp. registr la liberacin de azucares
reductores al medio. A pesar de no detectarse actividad enzimtica en las muestras, fue
posible observar un aumento en la poblacin bacteriana para todas las cepas en el
intervalo de 16 y 40 horas de crecimiento (Tabla 5.1.1), posterior a ello a las 64 horas se
registr un crecimiento estacionario.

CEPA

16 Horas

40 Horas

64 Horas

(h )

BH02

0.100

0.180

0.197

0.024

BH05

0.087

0.182

0.186

0.031

BH19

0.102

0.141

0.164

0.013

BH51

0.165

0.323

0.347

0.028

BH62

0.213

0.545

0.565

0.039

-1

Tabla 5.1.1. Comparacin cuantitativa de las cepas de Bacillus sp. mediante su

capacidad para desarrollarse en fermentacin sumergida en medio mineral CMC 1% en
funcin de su velocidad especifica de crecimiento. La tabla muestra los valores de O. D.
y registrados a cada intervalo de tiempo determinado. La ltima columna registra la
velocidad especfica de crecimiento.

Tal como se observa en la Tabla 5.1.1 y Figura 5.1.2 no se tuvo un aumento

importante en la poblacin microbiana para ninguna de las cepas, por lo tanto es posible
que la actividad enzimtica que pudiera registrarse en este cultivo es demasiada baja
para poder ser determinada. Por tanto en este caso solo fue considerada velocidad
especfica de crecimiento para comparar el potencial celuloltico de las cepas (Tabla
5.1.1) para lo cual se encontr que la cepa BH62 presenta la mayor velocidad especfica
de crecimiento 0.039 h-1 seguida de BH05 con 0.031 h-1 y por BH51 con 0.028 h-1, bajo
estas condiciones de cultivo la cepa BH19 presenta un crecimiento muy lento, en
relacin a ello Stainer R. Y. (1992) reporta que en promedio para algunas cepas de
Bacillus sp. cultivadas en medio complejo, condiciones de aerobiosis y una temperatura
-1

de incubacin de 40C alcanzan una velocidad especifica de crecimiento de 1.61 h ,

valor muy por encima del encontrado en estas condiciones de cultivo lo que indica la
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25

dificultad que tienen las cepas de Bacillus sp. para desarrollarse en un medio que
contiene solo celulosa como fuente de carbono.

Figura 5.1.2. Cintica de crecimiento de las cepas de Bacillus sp. crecidas en medio mineral con
CMC 1% en funcin de la O. D. medida de las muestras tomadas en 16, 40 y 64 horas de
fermentacin.

Por tanto de acuerdo a los resultados presentados anteriormente se determin

que las cepas de Bacillus sp. con mayor potencial para la produccin de celulasas y
hemicelulasas fueron: BH62, por presentar la mayor velocidad especfica de crecimiento
y uno de los mejores dimetros en el ensayo de zona clara en medio con CMC 1%,
BH51, por ser el segundo con mayor velocidad especifica de crecimiento y por ltimo la
cepa BH19 al tener el mayor dimetro en la prueba de zona clara en medio con CMC
1%. El anlisis de la variacin de condiciones de cultivo fue realizado nicamente con
estas tres cepas al presentar la mayor viabilidad a la produccin de celulasas y
hemicelulasas.
Dentro de esta parte del desarrollo experimental fue probada la tcnica de
seguimiento del crecimiento microbiano en funcin de la cantidad de ADN genmico total
presente en las muestras, Treimo J. et. al. (2006) ha aplicado esta metodologa para
medir el crecimiento bacteriano de una forma sencilla. La Tabla 5.1.2 muestra la
comparacin entre la cintica de crecimiento comparando el incremento de la poblacin
bacteriana en funcin de la medicin de la densidad ptica (O. D.) as mismo la cantidad
de ADN genmico total extrado de cada muestra, en esta se observ que no existe
correlacin alguna entre la cantidad de ADN total extrado para las muestras tomadas en
cada intervalo de tiempo y estas a su vez no tienen correlacin alguna entre la turbidez
CNPEM: LNLS CTBE LNBio LNNano

26

de las muestras y la cantidad de ADN total, la Figura 5.1.3 muestra la integridad del ADN
extrado. De esta forma se determin que esta metodologa no es apropiada para el
seguimiento del crecimiento bacteriano en muestras de fermentaciones con bagazo.
Dada la dificultad que representa la medicin del crecimiento bacteriano no se determin
la cintica de crecimiento bacteriano para los siguientes experimentos, nicamente fue
determinada en aquellos casos en los que el medio es translucido.

Tiempo (h)

O. D. (600 nm)

ADN
(ng/mL)

0
1.2
2.1
3.2
4

0.200
0.752
1.730
2.470
2.630

2017.1
1883.5
1867.5
1831.8
1923.5

Tabla 5.1.2 Relacin entre O. D. y el ADN total

extrado durante el desarrollo de Bacillus sp.
BH19 en medio LB.

Figura 5.1.3. Electroforesis del ADN genmico

extrado en: A Tiempo cero, B 1.2 horas de
crecimiento, C 2.1 horas de crecimiento, D 3.2
horas de crecimiento y E 4 horas de crecimiento,
MPM es el marcador de peso molecular de 1 Kb
como referencia.

5.2 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas

y hemicelulasas.
5.2.1 Efecto de la agitacin.
Al igual que en el caso del anlisis cuantitativo del potencial para la produccin de
celulasas y hemicelulasas durante el screening de las cepas en las muestras tomadas
para este experimento no se encontr ninguna actividad, lo que hace suponer que las
condiciones a las que se realiz el experimento no son las adecuadas para inducir la
secrecin de una cantidad considerable de celulasas y hemicelulasas como para ser
detectadas por los mtodos analticos utilizados, en este caso la agitacin no tuvo efecto
alguno sobre esta situacin. Solo pudo ser comparado el crecimiento de las bacterias
mediante la determinacin de la velocidad especfica de crecimiento (Tabla 5.2.1.1). Sin
embargo, los resultados obtenidos no aportan informacin alguna ya que no existe una

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27

diferencia significativa entre la velocidad especfica de crecimiento, la cual sigue siendo

muy baja.
CEPA
BH19
BH51
BH62

No Rotacin
0.030
0.008
0.041

50 RPM
0.036
0.020
0.036

100 RPM
0.017
0.000
0.028

150 RPM
0.013
0.028
0.039

-1

Tabla 5.2.1.1. Velocidades especficas de crecimiento (h ) de las cepas de Bacillus

sp. registradas en la fermentacin de medio mineral con CMC 1% con distintas
velocidades de agitacin.

En relacin al efecto de la rotacin Abou-Taleb K. A. et. al. (2009) encontr que

para las cepas Bacillus alcalophillus S39 y Bacillus amyloliquefaciens C2 la mxima
actividad fue encontrada con una agitacin de 150 rpm, de la misma forma Amwarali K.
(2006) menciona que en las cepas de Bacillus Amyloliquefaciens UMAS existe un
marcado incremento en la actividad celuloltica en el medio de fermentacin en
condiciones adecuadas de agitacin en comparacin a condiciones de no agitacin pues
encontr que en condiciones de agitacin la actividad celuloltica era el doble en
comparacin a la registrada en la fermentacin sin agitacin registrando una actividad
de 2.97 U/ml y 1.38 U/ml respectivamente. Immanuel G. et. al. (2006) y Nasr S. et. al.
(2001) utilizaron predeterminadamente una agitacin de 200 rpm y 150 rpm
respectivamente para la produccin de celulasas en cepas de Bacillus sp. Por tanto para
la produccin de celulasas es conveniente utilizar una agitacin orbital de 150 rpm, pues
como fue observado por los mencionados, la aeracin favorece la secrecin de
celulasas.

5.2.2 Efecto de la presencia de Cu+2 en el medio.

La nica fuente de carbono utilizadas en los medios de cultivo en los anteriores
experimentos fue carboximetilcelulosa y bagazo explotado por vapor y deslignificado,
por tanto para que sea posible el crecimiento de las bacterias tal como fue registrado es
necesaria la produccin de las celulasas, sin embargo esta actividad no fue posible
determinar en los experimentos anteriores, esta situacin hizo pensar en la posibilidad
de que las celulasas del extracto crudo estn siendo degradadas por proteasas
secretadas por la misma bacteria ya que especies del genero Bacillus sp. presentan una
importante produccin de proteasas de una forma muy eficiente (Boominadhan U.,2009).
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28

Akel H. (2009) demostr que la presencia de 5 mM de CuSO4 y CdCl2 provocan un fuerte

efecto inhibitorio en la actividad de las proteasas de una cepa de Bacillus
hipertermoflica. De la misma forma el efecto de reduccin de actividad proteoltica fue
demostrado por Servinic N. y Demircan E. (2011) en una cepa de Bacillus sp quienes
reportan la disminucin de esta actividad con la presencia de los iones Cu+2, Mg+2, Ba+2 y
Zn+2. Shafee, N. et. al. (2000) menciona que a las 24 h de incubacin los iones Cu+2 y Li+
se presenta una notable disminucin de la actividad proteoltica en una cepa de Bacillus
cereus. Otros inhibidores de proteasas como PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) y
EDTA fueron analizados, sin embargo el primero tiene una vida media de 40 minutos,
por lo que no es viable, y la segunda de acuerdo con que Kotchoni O. S. (2003) el EDTA
tiene en fuerte efecto inhibitorio en celulasas de Bacillus sp. en relacin a lo anterior
Mawadza C. (2000) menciona que la actividad celuloltica en cepas de Bacillus sp. no se
ve afectada por algunos iones como K+, Mg+2, Ca+2 y Cu+2. Sin embargo de acuerdo a
los resultados obtenidos el uso de CuSO4 inhibi el crecimiento de las cepas BH51 y
BH62 tal como se observa en la Figura 5.2.2.1, en el caso de BH19 no se present un
efecto inhibitorio total sobre su desarrollo, a pesar de ello en la determinacin de
actividad CMCasa y Xilanasa no se encontr actividad alguna. Por tanto el uso de
CuSO4 5 mM no tiene efectos importantes de mejora sobre la actividad celuloltica y
hemiceluloltica.

Figura 5.2.2.1 Efecto de Cu

+2

sobre el sobre el crecimiento en las cepas de Bacillus sp.

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29

5.2.3 Efecto de la fuente de carbono.

La fuente de carbono mostr un efecto importante para la produccin de celulasas
y hemicelulasas ya que contrario a los experimentos anteriores, en ste fue posible
encontrar actividad enzimtica en algunos de los tratamientos (Tabla 5.2.3.1).

Cepa Sust.
BH19 FS
BH19 FT
BH19 LQ
BH51 LQ
BH62 LQ
BH62 FS

12 Horas
CMCasa Xilanasa
(U/mL)
(U/mL)
0
0
0
0
0.223
0
0.177
0
0
0
0
0

Tiempo de Fermentacin
24 Horas
48 Horas
CMCasa Xilanasa
CMCasa
Xilanasa
(U/mL)
(U/mL)
(U/mL)
(U/mL)
0.178
0.171
0
0.166
0.170
0.150
0
0
0.247
0
0
0.151
0
0
0
0
0
0.168
0
0.174
0.240
0
0
0

Tabla 5.2.3.1. Efecto de la fuente de carbono sobre la produccin de celulasas y hemicelulasas. *En la tabla
solo fueron incluidos los tratamientos que mostraron actividad, en el resto de los tratamientos no se encontr
actividad.

La mayor actividad hidroltica fue encontrada en muestras de 24 horas de

fermentacin, sto coincide con lo determinado por Ariffin H. et. al. (2006) quien
encontr en la cepa Bacillus pumilus EB3 que la mayor actividad celuloltica fue
registrada a las 24 horas de crecimiento, menciona de ello que las celulasas son un
producto asociado al crecimiento, es decir, se produce durante la fase de crecimiento
exponencial.
El salvado de trigo, salvado de soya y el licor de pretratamiento hidrotrmico son
las mejores fuentes de carbono para la produccin de celulasas en estas cepas,
contrario a ello Nars S. et. al. (2011) y Abou-Taleb K. et. al. (2006) reportaron en cepas
de Bacillus sp. una mayor induccin de la produccin de celulasas en medios de cultivo
que contienen CMC 1%, reportaron a su vez una baja actividad en medios con celulosa.
En relacin a la actividad presentada en el licor de pretratamiento trmico, no se tiene
total certeza sobre los resultados, ya que en un estudio preliminar por HPLC la
composicin del licor encontr que sus constituyentes fuentes de carbono ms
abundantes son nicamente 0.506 g/L de glucosa y 0.098 g/L de xilosa, por tanto es
preciso determinar la posible presencia de xilooligosacaridos para describir mejor este
efecto.
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30

En relacin a la actividad proteoltica en muestras de 24 horas de fermentacin no

fueron encontradas actividades significativas que evidenciaran el efecto de la
degradacin de las celulasas (Tabla 5.2.3.2), en la mayora de los casos la actividad
proteoltica fue nula, solo en la Cepa BH19 con fermentacin de Salvado de trigo se
encontr la actividad mxima con 0.748 U/ml, de acuerdo con Boominadhan U. (2009)
una actividad con esta magnitud no presenta efectos sobre la deteccin de actividades
enzimticas, la baja actividad fue de esperarse ya que en el medio no hay componentes
que induzcan esta actividad enzimtica. En tanto los problemas de medicin de actividad
enzimtica no estn relacionados a una posible degradacin proteoltica.

CMC
BH19 0.197
BH51 0.323
BH62 0.000

Actividad Proteoltica (U/mL)

BED
BEX
HT
FS
FT
0.000 0.043 0.000 0.130 0.749
0.000 0.014 0.000 0.009 0.241
0.000 0.000 0.063 0.000 0.002

LQ
0.000
0.000
0.000

Tabla 5.2.3.2 Actividad proteoltica registrada en las muestras de 24 horas de

fermentacin en las cepas BH19, BH51 y BH62 en todos las fuentes de carbono
probadas.

5.2.4 Efecto de la fuente de nitrgeno sobre la produccin de celulasas y

hemicelulasas.
Como se observa en la Figura 5.2.4.1 la presencia de ciertas fuentes de nitrgeno
en el medio de cultivo es un factor determinante en el crecimiento de las cepas de
Bacillus sp. En comparacin con las fuentes inorgnicas, las fuentes de nitrgeno
orgnicas estimularon un mejor desarrollo en el crecimiento, sin embargo ambas
presentaron mucho mejores efectos en comparacin a la fuente de nitrgeno
preestablecida originalmente en el medio de cultivo (NH4NO3), ya que en anteriores
fermentaciones ninguna haba logrado tener un crecimiento en la poblacin bacteriana
considerablemente grande. Una mayor poblacin bacteriana presenta mejores
actividades hidrolticas.
En relacin a la actividad celuloltica y hemiceluloltica los resultados no fueron
favorables, ya que la actividad CMCasa nicamente fue encontrada en la cepa BH19
con fermentacin en medio con triptona y CMC 1%, la actividad registrada fue de 0.1914
U/ml. En la actividad de Xilanasa se tuvieron mejores resultados, pues fue encontrada
actividad en las fermentaciones con las fuentes de nitrgeno orgnicas en medio con
CMC 1%, la mayor actividad registrada fue principalmente en las primeras 24 horas de
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31

fermentacin, sin embargo a las 12 horas de crecimiento ms cepas registraron

actividad (Tabla 5.2.4.1). La influencia de las fuentes de nitrgeno sobre el desarrollo y
aumento en la actividad celuloltica concuerda con Abou-Taleb et. al. (2009), Shankar T.
(2011) y Nasr S. et. al. (2011) quienes en cepas de Bacillus sp. encontraron que las
fuentes orgnicas de nitrgeno, principalmente el extracto de levadura aumentan
considerablemente la produccin de celulasas. En cuanto a las fuentes inorgnicas la
mejor fue NH4Cl, coincidiendo con Abou-Taleb et. al. (2009) y Nasr S. et. al. (2011)
quienes encontraron que la mejor es NH4Cl seguida de (NH4)2SO4.

Figura 5.2.4.1. Efecto de las fuentes de nitrgeno sobre el crecimiento de las cepas de Bacillus
sp. BH19 y BH62.

CEPA / Sustrato
BH19 CMC-Triptona
BH19 CMC-Yeast Ext.
BH19 CMC-NH4Cl
BH19 CMC-(NH4)2SO4
BH19 HT-Yeast Ext.
BH62 CMC-Triptona
BH62 CMC-Yeast Ext.
BH62 BEX-Yeast Ext.

Tiempo de Fermentacin
12 Horas
24 Horas
0.2989
0
0.1898
0.4793
0
0.5058
0.1564
0
0.1877
0
0.1975
0.5377
0.2011
0.4516
0.1728
0

Tabla 5.2.4.1. Efecto de la fuente de nitrgeno sobre la actividad Xilanasa (U/ml) registrada en
las cepas BH19 y BH62.* El resto de los tratamientos no fue puesto en la presente ya que no se
encontr actividad alguna.

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32

5.3 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de

las celulasas (CMCasa) y hemicelulasas (Xilanasa) de las cepas de Bacillus sp.
BH19 y BH62.
Para la medicin de actividad enzimtica fueron utilizados protocolos estndar
con condiciones de pH y temperatura preestablecidos, sin embargo, durante la medicin
de la actividad en las muestras tomadas para cada experimento no se detect actividad
en la mayora de las muestras, una hiptesis fue una muy baja actividad o un posible
problema con los protocolos de medicin, a pesar de ello el visible aumento de la
poblacin bacteriana sugera la presencia de las hidrolasas, siguiendo el desarrollo
experimental varias condiciones de fermentacin fueron implementadas a lo largo del
trabajo con el objetivo de optimizar el desarrollo bacteriano en bsqueda del aumento en
la actividad enzimtica, no obstante ninguna de las condiciones probadas gener una
diferencia significativa ya que en stas slo unas cuantas muestras presentaban
actividad sin permitir establecer una correlacin verdadera.

Las enzimas tienen un pH y temperatura ptimos en las cuales se presenta la

mayor actividad sobre un sustrato (Devlin M.T, 2004), en base a esto se decidi realizar
una caracterizacin de pH y temperatura para determinar las condiciones especficas a
las cuales la actividad endoglucanasa (CMCasa) o hemicelulasa (Xilanasa) se llevan a
cabo de forma ptima, puesto que las condiciones preestablecidas en los protocolos
(pH 4.8 y 50C) no mostraron los resultados esperados. El gradiente de temperatura / pH
se realiz con muestras de fermentaciones de las cepas BH19 y BH62 las cuales
presentaron actividad en ensayos previos.

En una primera prueba utilizando un gradiente de temperaturas de entre 40 y

60C con pH de entre 3.5 y 9 se encontr que el pH ptimo es 6.0 y la temperatura 60C,
registrando una actividad mxima de 0.309 U/mL (Figura 5.3.1), sin embargo debido a
que la temperatura ptima se posicion en un extremo del rango, fue analizado un
intervalo hasta 80C usando el pH 6, observndose que el valor optimo real es a 65C
con una actividad de 0.344 U/mL (Figura 5.3.2)

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33

Figura 5.3.1. Comparacin del efecto de temperatura y pH sobre la actividad de CMCasa en

Bacillus sp. BH19.

Figura 5.3.2. Efecto de la temperatura sobre la actividad de CMCasa de una muestra de Bacillus
sp. BH19 a pH ptimo pH 6.0.

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34

En el caso de la actividad CMCasa en la cepa BH62, slo se encontr actividad

en las reacciones a pH 6.0, junto con ste una temperatura de 45.8C resultaron ser las
condiciones ptimas alcanzndose una actividad de 0.218 U/mL (Figura 5.3.3).

Figura 5.3.3. Efecto de la temperatura sobre la actividad de CMCasa en una muestra de

Bacillus sp. BH62 a un pH ptimo 6.0.

Para la actividad hemiceluloltica de la muestra de la cepa BH19 se encontr un

valor de pH ptimo de 6.0 y una temperatura de 60C presentando una actividad de
0.395 U/mL (Figura 5.3.4), no obstante con el pH ptimo en el rango de temperatura de
40-60C no se registr una variabilidad muy grande entre sus actividades, sin embargo
es necesario probar un rango de temperatura mayor y menor a los aqu utilizados.

.
Figura 5.3.4. Efecto de temperatura sobre la actividad de Xilanasa en Bacillus sp. BH19
a pH ptimo 6.0.

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35

As mismo, en la muestra de BH62 se determin que un pH

7.0 y una

temperatura de 60C son las condiciones ptimas para la reaccin, habindose

registrado una actividad de 0.427 U/mL. Al igual que en la muestra de BH19 no se
observ una gran diferencia entre la actividad a diferentes temperaturas (Figura 5.3.5).

Figura 5.3.5. Efecto de la temperatura sobre la actividad de Xilanasa en Bacillus

sp. BH62 a pH ptimo 7.0.

En sntesis como lo muestra la Tabla 5.3.1, existe una gran diferencia entre las
actividades determinadas a condiciones de temperatura y pH optimas en comparacin
con las cuantificadas bajo condiciones estndar, siendo en la mayora de los casos
imposible registrar alguna actividad.

Tabla 5.3.1. Comparacin entre la actividad enzimtica determinada bajo

condiciones ptimas respectivas y condiciones estndar (pH 4.8, 50C).

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36

6.0 CONCLUSIONES.

La actividad hidroltica de las cinco cepas de Bacillus sp. preseleccionadas de una

previa caracterizacin de 25 potenciales es baja en las condiciones de operacin
analizadas, sin embargo dos de ellas BH19 y BH62 presentan la mayor zona de
despolimerizacin de carboximetilcelulosa y la mayor velocidad especfica de
crecimiento en fermentacin sumergida en medio mineral con carboximetilcelulosa
mostrando el mayor potencial para la produccin de hidrolasas.
De las variaciones de las condiciones de operacin, la agitacin, en las
velocidades que fueron utilizadas no tiene efectos significativos sobre el crecimiento y la
produccin de hidrolasas en las cepas de Bacillus sp. BH19 y BH62, as mismo el uso de
Cu+2 para la inhibicin de proteasas potenciales a la degradacin de las celulasas inhibe
el crecimiento de la cepa BH62, y en BH19 disminuye el crecimiento sin efectos sobre
una mayor actividad celuloltica. El salvado de trigo y el salvado de soya como fuente de
carbono indujeron una mayor produccin de hidrolasas, el licor de pretratamiento
hidrotrmico de bagazo de caa tambin indujo la produccin de estas enzimas. El
factor con ms influencia en el desarrollo de las cepas Bacillus sp. es la fuente de
nitrgeno, siendo las de origen orgnico, triptona y extracto de levadura las que inducen
un mayor crecimiento y usando carboximetilcelulosa como fuente de carbono se genera
la mayor actividad de celulasas y hemicelulasas.
Los valores de pH y temperatura ptimos de las enzimas hidrolticas producidas
por Bacillus sp. BH19 y BH62 son distintos

a las condiciones establecidas en los

protocolos estndar de determinacin de actividades celulolticas. Esto se present

como un parmetro importante ya los posibles problemas presentados en la
determinacin de actividades enzimticas serian causa de una subestimacin. La
determinacin de las condiciones ptimas para la medicin de actividades enzimticas
abre la brecha para una exploracin ms profunda en la caracterizacin especfica de la
actividad hidroltica de las cepas de Bacillus en trabajos posteriores.

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37

7.0 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

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