Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Curso 2014-15
Nombre:
DNI:
Grado:
Grupo:
Fecha de entrega:
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
PRCTICA 1.
MEDIDAS DE pH. TAMPONES. INICADORES. APLICACIN AL
SEGUIMIENTO DE LA HIDRLISIS DE GRASAS POR LA LIPASA.
INTRODUCCIN
La medida del pH es una de las determinaciones analticas ms utilizadas en disoluciones acuosas y por
tanto en Bioqumica, ya que los fluidos biolgicos son soluciones acuosas. El valor de pH determina las
caractersticas estructurales y funcionales de muchas macromolculas, incluyendo protenas y cidos nucleicos.
En el hombre, el control del pH sanguneo es importante porque sus cambios no altera solo el plasma, sino
adems el pH intracelular, lo que a su vez afecta profundamente al metabolismo. El plasma presenta un pH casi
constante de 7.4, superior al que presenta el citosol intracelular de la mayora de las clulas tisulares. La sangre
es un buen vehculo para suministrar y retirar eficazmente agentes alcalinizantes o acidificantes cuando es
necesario alterar el pH, por estados de acidosis o alcalosis metablica.
El pH es definido como log H+, y su medida es, por tanto, un reflejo en escala logartmica de la
concentracin de protones, es decir, de la acidez del medio. Las medidas se realizan experimentalmente con
electrodos combinados de vidrio, que presentan una respuesta rpida y son sencillos de utilizar. Los electrodos
de vidrio deben, antes de su utilizacin, calibrarse con disoluciones patrn de pH conocido y tener unas
condiciones de conductancia (contenido inico) adecuadas para asegurar una medida precisa. El pH del agua
pura es difcil de medir con precisin por la ausencia de iones. Adems, su pH puede variar drsticamente con
pequeas adiciones de un cido o una base.
El mantenimiento del pH de una solucin acuosa en unos lmites de variacin controlada se consigue
con los denominados tampones, reguladores, amortiguadores o buffers. Estos sistemas estn formados por un
par mezcla de un cido dbil y la sal de su base conjugada que se interconvierten como consecuencia de la
adicin de H+ u OH- gracias al equilibrio qumico entre las dos especies, lo que permite variar sus proporciones
relativas sin un cambio drstico del pH. La relacin fundamental entre las dos especies que constituyen un
sistema regulador es la ecuacin de Henderson-Hasselbalch:
respiratorios. En la sangre, el sistema regulador principal es el CO2/HCO3 , pero tambin participan el sistema
-
2-
fosfato H2PO4 /HPO4 y las protenas plasmticas, gracias a ciertos residuos aminoacdicos, principalmente el
grupo imidazol de las histidinas. Por ejemplo, en la hemoglobina, existen 38 histidinas por tetrmero,
constituyendo el principal sistema regulador del pH intraeritroctico (cuyo valor es aproximadamente 7.2).
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
carbnico/bicarbonato:
pH= pK1 + log -HCO3] / CO2]
De lo cual, conociendo el valor de pK1 (aprox. 6.1) y la relacin entre las concentraciones de bicarbonato y
carbnico, se puede determinar fcilmente el pH. Si la pareja de cido y base conjugada es el fosfato, la
ecuacin sera:
pH= pK2 + log -2HPO4] / -H2PO4] (en este caso, pK2 = 6.8)
Las experiencias a realizar en la primera parte de la prctica intentan familiarizar al alumno con el
uso del pH-metro y constatar el poder tamponante de alguno de estos sistemas. En la segunda parte se utiliza
una medida indirecta del pH para poder seguir la accin de una enzima digestiva, y detectar la liberacin de
cidos grasos.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
MATERIAL
pHmetro con electrodo de vidrio combinado
Papel "cientfico"
1 vaso de 50 y 1 de 100-250 ml
2 Gradillas con 6 tubos de ensayo transparentes
2 Pipetas de 5 o 10 ml
Micropipeta P100 o P200 y puntas desechables.
Propipeta de 10 ml
1 Varilla de agitacin
Pipeta Pasteur de plstico
Pinza de madera
1 Bao termosttico o termobloque para 37 C
7 viales de 20 ml de capacidad y boca ancha para introducir electrodo
REACTIVOS
Disolucin patrn de pH 7
Tampn fosfato 0,1 M pH 7
KCl Saturado
Fenolftalena 1% en etanol
Carbonato sdico 0.1 M
Leche entera
HCl 1N
NaOH 1N
Agua destilada
Pancreatina bovina al 2%
Bilis 2% (o desoxicolato 2%)
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
b) Para realizar la medida, es esencial que la membrana porosa situada en el lateral de electrodo est
totalmente sumergida en la disolucin. Es el rea por donde se produce el intercambio inico entre la
disolucin exterior y la interior del electrodo.
c) En casos donde se necesite agitacin magntica, no agitar a gran velocidad ni con movimientos excntricos
de la barra magntica para evitar que sta pueda golpear y romper el electrodo.
1. Uso del electrodo.
Extraer el electrodo de la capucha con solucin de KCl saturado donde debe mantenerse al finalizar las
medidas. Lavar con agua destilada y secar pasando suavemente un trozo de papel por el electrodo.
Preguntar al profesor encargado de la prctica si el electrodo ha sido calibrado recientemente. Si es
as, pasar directamente al punto 2. De lo contrario, debe calibrarse segn los siguientes pasos:
pH inicial
(1 medida)
1A (agua)
pH final
(tras
adicin)
Id a 1A
Variacin
respecto a 1A
o 1B
2A (agua+ HCl)
Id a 1A
3A (agua+ NaOH)
Id a 1A
12
1B (fosfato)
Id a 1B
2B (fosfato+ HCl)
Id a 1B
6.82
3B(fosfato+ NaOH)
Id a 1B
7.19
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
Acido graso
CH2-OOC-R
CH-OOC-R
lipasa CH2-OH
CH-OH
H2O
R-COOH
CH2-OH
CH2-OOC-R
Glicerol
TAG
RCOO- +
H+
La reaccin se denomina saponificacin. Una vez que acta la lipasa y saponifica el TAG, los cidos
grasos liberan H+, produciendo un descenso del pH medible en un medio no tamponado. Dicho descenso se
podra seguir utilizando un pHmetro, pero en este caso, vamos a utilizar un indicador que cambia de color
como consecuencia del paso de pH de cido a base y que cualitativamente puede reemplazar al electrodo.
Se utiliza pancreatina bovina, que contiene una mezcla de enzimas con lipasa. Como fuente de TAG se
utiliza leche entera de vaca. Mediante fenolftalena, un indicador cido/base, es posible visualizar el descenso
de pH ya que este indicador a pH>7 presenta coloracin rosa, mientras que a pH<7 es incoloro. Puesto que la
leche entera natural tiene un pH inicial inferior a 7, y para acercar el pH al ptimo de actuacin de la lipasa,
prximo a 8, previamente a la accin de la lipasa la leche con la fenolftalena debe basificarse con carbonato
sdico para poder visualizar el descenso de pH.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Aadir unos 25 ml de leche entera al vaso de precipitados y adicionar agitando 5 gotas de fenolftalena.
Ir adicionando disolucin de carbonato sdico con agitacin continua hasta que adquiera un color rosa
homogneo y permanente, con una intensidad semejante a un batido de fresa. A continuacin se numeran 4
tubos de ensayo y se les aaden los reactivos reflejados en la Tabla (cantidades expresadas en ml). Las
adiciones se deben realizar en el orden expresado, y con agitacin cada vez que se aade un nuevo reactivo.
REACTIVOS
Leche basificada
Agua destilada
1.5
0.5
Sales biliares
0.5
0.5
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
Apuntar tiempo, agitar todos los tubos con rapidez y hasta homogenizacin total y situarlos a 37 C en un bao
termosttico o termobloque, observando atentamente lo que sucede con los tubos a lo largo del tiempo.
Anotar donde se producen decoloraciones y el tiempo transcurrido. Interpretar resultados.
A2) Hay alguna relacin entre el pKa de un grupo y su eficacia tamponante en un rango de pH
determinado? Explique por qu.
A3) Segn lo anterior, explique brevemente por qu los grupos imidazol es un buen agente tamponante en
la sangre.
B1) A qu pH fisiolgico actan las lipasas? Qu producto de la accin de las lipasas es el responsable
directo del cambio de color de la fenolftalena?
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
B2) Cul es el efecto de las sales biliares sobre la digestin de triacilglicridos? Afecta a otras clases de
lpidos como los esteres del colesterol?
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
PRCTICA 2.
PROPIEDADES DE AMINOCIDOS Y PROTEINAS.
INTRODUCCION
A. AMINOACIDOS. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.
Los -aminocidos son las unidades estructurales de las protenas. Se caracterizan por la presencia
sobre el mismo carbono (C) de un grupo bsico (amino, NH2 o NH3+) y un grupo cido (carboxilo, COOH
o COO-), adems de una cadena lateral de naturaleza qumica diversa.
La cromatografa se define como la separacin de una mezcla de dos o ms compuestos por distribucin
entre dos fases inmiscibles: una fase mvil, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en
relacin con la otra, denominada fase estacionaria. La fase mvil puede ser un lquido o un gas y la estacionaria
puede ser un slido o un lquido. Estas tcnicas tambin permiten identificar un compuesto comparando su
comportamiento cromatogrfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrn.
En la cromatografa en capa fina (TLC, por Thin Layer Chromatography), la fase estacionaria es una
fina capa de material poroso e hidroflico (gel de slice, almina, etc.) extendida sobre un soporte plano inerte
(vidrio o aluminio), y la fase mvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que migra por la
fase estacionaria por capilaridad. La fase mvil, en su movimiento, arrastra en mayor o menor medida a los
componentes de la mezcla.
Durante la cromatografa, un determinado soluto interacta con las dos fases y experimenta una serie de
procesos (solubilizacin en cada fase, adsorcin en fase slida, arrastre por la fase mvil, etc.) que condicionan
su reparto entre ellas. En el equilibrio, la relacin entre las concentraciones del soluto de ambas fases es
constante. Este parmetro se denomina coeficiente de reparto y depende de la naturaleza del compuesto y la de
las fases, as como de las condiciones en las cuales se corre la muestra (temperatura, vapor de saturacin, etc).
La separacin de los componentes de una mezcla es buena si todos presentan coeficientes de reparto diferentes.
El coeficiente de reparto es poco empleado en la prctica. En su
lugar, e ntimamente relacionado con l, se emplea el denominado Rf,
caracterstico de cada sustancia y definido como la relacin entre la
distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase mvil. Los
componentes de la mezcla ms insolubles en el disolvente empleado
tendrn un Rf prximo a cero, mientras que el de los ms solubles se
acercar a uno.
La cromatografa en capa fina se puede emplear para separar distintos grupos de biomolculas, tales
como aminocidos, fosfolpidos, azcares, etc, y en cada caso cambiara la fase mvil empleada y los reactivos
reveladores. En esta prctica, separaremos aminocidos y revelaremos la placa con ninhidrina, que al
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
reaccionar con el grupo amino de los aminocidos produce un color prpura (en algunos casos puede ser rosa o
rojizo), y con el grupo imino o amino secundario (iminocidos) da un color amarillo/ocre.
B. PROTENAS
Las protenas son las biomolculas ms abundantes de la materia viva. Estn formadas por aminocidos unidos por enlaces peptdicos, lo que origina cadenas lineales. Las protenas conjugadas contienen
otros componentes de distinta naturaleza (no peptdica), que se denominan grupos prostticos. Las propiedades
fisico-qumicas de las protenas pueden ser muy diferentes: as, protenas estructurales como la queratina del pelo
se parecen poco a la hemoglobina o a la hormona insulina.
Para que las protenas cumplan su funcin biolgica tienen que adoptar una estructura espacial
determinada, denominada nativa. La mayora de las protenas globulares son solubles en disoluciones acuosas y a
pH prximos a la neutralidad mantienen su estructura nativa intacta. La alteracin de esta estructura tridimensional
conlleva la prdida de su actividad biolgica, proceso que se denomina desnaturalizacin: las propiedades fisicoqumicas cambian drsticamente y, en el caso de las protenas globulares solubles, generalmente se produce una
insolubilizacin o precipitacin. Agentes desnaturalizantes tpicos son el calor, valores extremos de pH,
disolventes orgnicos, metales pesados (Pb+2, Hg+2, Ag+), agentes caotrpicos y detergentes inicos.
La presencia protenas en una disolucin puede ponerse de manifiesto por gran nmero de ensayos,
basados en la formacin de un compuesto coloreado entre la protena y un reactivo especfico. Dentro de un rango
de concentraciones adecuado, la intensidad del color desarrollado es proporcional a la concentracin de protena,
por lo que se puede cuantificar y correlacionar con la cantidad de protena presente en la muestra. Los distintos
mtodos colorimtricos presentan diferencias de sensibilidad, especificidad y variables como la dificultad o el
precio del ensayo que es importante valorar a la hora de elegir el ms idneo para cada caso. Entre los mtodos
ms utilizados para protenas destacan:
a) Ensayo de Biuret: Compuestos con enlaces peptdicos producen un cambio de color del azul al prpura cuando
reaccionan con Cu (II) en medio alcalino. El ensayo es bastante especfico para protenas (pocos interferentes) y
barato, pero poco sensible: se requieren de 1 a 10 mg de protena.
b) Ensayo de Lowry: Es hasta 10 veces ms sensible que el de Biuret, pero ms tedioso de realizar. El principio de
la reaccin es similar a aqul: se basa en la reaccin de protenas con el Cu (II) en medio alcalino y en la reaccin
de grupos fenlicos (mayoritariamente de tirosina) con un reactivo, denominado de Folin-Ciocalteau, que contiene
fosfomolibdato y fosfowolframato. Como inconvenientes destacan su dependencia del contenido en Tyr y Trp de
la protena y las interferencias debidas a la eventual presencia de compuestos fenlicos en el medio.
c) Ensayo de Bradford: Es un ensayo rpido y muy sensible para cuantificar protenas (1-20 g), aunque la
presencia de detergentes en la muestra puede producir interferencias. El mtodo se basa en el cambio de color que
experimenta el colorante azul coomassie en medio cido en presencia de protenas. Las protenas producen el
cambio de la coloracin parda del reactivo a una tonalidad azulada.
En esta prctica se utilizarn y compararn los ensayos de Biuret y de Bradford.
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A. AMINOACIDOS. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.
MATERIAL.
Placa fina (TL) de Slice o celulosa
Micropipeta 1-10 l y puntas adecuadas (blancas)
Cubeta cromatogrfica para TLC
Batea plana para el revelado
Pinza de madera
Lpiz n 2 con punta fina y regla de 10-20 cm
Secador de aire y Horno de incubacin a 95C
REACTIVOS.
Muestras de aminocidos al 1%
Ninhidrina (1mg/ml en acetona)
Fase mvil: n-butanol/acetona/actico/agua (35/35/20/10)
Importante: Tocar la placa solo por los bordes, sin tocar la superficie, para evitar contaminarla.
1.
Colocar aprox. 20 ml de fase mvil en la cubeta y cerrarla, para saturar su atmsfera. La cromatografa
se efectuar en esa cubeta cerrada.
2.
Trazar con un lpiz, sin apretar demasiado para no daar la placa, una lnea horizontal a 1,5 cm del
borde inferior de la placa. Marcar sobre ella 5 puntos con igual separacin entre s, y aplicar en cada uno de
esos puntos 1 l de cada aminocido con la micropipeta anotando las posiciones en que se han colocado los
diferentes aminocidos y el problema. Es importante que las gotas se extiendan lo menos posible, por lo que se
debe secar la primera antes de aplicar la segunda, si es necesario utilizando el secador.
3.
Colocar la placa en la cubeta, cuidando de que el nivel de disolvente quede por debajo de la lnea de
aplicacin de las muestras. Cerrar y esperar unos 35-45 minutos. La fase mvil no debe llegar al extremo
superior de la placa. En ese tiempo, realizar los otros apartados de la prctica.
4.
Sacar la placa, marcar en un borde el nivel alcanzado por la fase mvil, medir y anotar la distancia
recorrida por la fase mvil en mm (en la Tabla de la seccin de cuestiones, A2) y secarla con aire caliente
del secador. Sumergirla en revelador (20-30 ml de ninhidrina). Introducir la placa en la estufa unos 3-5 min, a
105C, o hasta la aparicin de manchas.
5.
Observar las manchas aparecidas, su forma e intensidad. Calcule en Rf de cada muestra y determine
cul(es) es (son) el (los) desconocido(s) de la muestra problema. Para ello, tener en cuenta que Rf = Distancia
corrida por la muestra / Distancia recorrida por la fase mvil. Anotar los datos de distancias y Rf y rellenar
con ellos la Tabla de la cuestin A2.
45 min
B. PROTENAS
MATERIAL ADICIONAL
Tubos de ensayo (vidrio y plstico seco para Bradford)
Micropipetas de 200l y 1000 l y puntas apropiadas
Pipetas de 1-2, 5 y 10 ml y propipetas adecuadas (azul y verde respectivamente)
REACTIVOS.
Disolucin de albmina (10 mg/ml)
Tampn fosfato pH 7, 10 mM
NaOH 2.5 N
cido tricloroactico (TCA) 10%
Acetona
Acetato de plomo 0.2 M
Reactivo de Biuret
Reactivo de Bradford
10
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
1. Precipitacin de protenas.
Rotular 5 tubos de ensayo, y aadir a cada tubo 1 ml de la disolucin de albmina de 10 mg/ml. A continuacin
agitar bien el contenido en cada tubo y observar los efectos de cada agente sobre la solubilidad de la protena:
Tubo
Condicin
Calor
Medio cido
Medio bsico
Disolv. orgnico
Catin pesado
Tratamiento
Observaciones a apuntar
(precipitado, turbidez)
H2O destilada
1.8
Albmina 2 mg/ml
0.2
Reactivo de Biuret
3. Ensayo de Bradford.
Preparar para este ensayo una disolucin de albmina an mas diluida, de 0,2 mg/ml a partir de la de 2 mg/ml.
Rotular dos tubos de plstico y aadir los reactivos en el orden que se indica. Agitar y observar el color de los 2
tubos y sus posibles diferencias.
1
800 l
700 l
--
100 l
Reactivo de Bradford
200 l
200 l
H2O destilada
11
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
A1) Qu naturaleza tienen las fases estacionaria y mvil empleadas? Con una fase mvil ms polar, la
separacin sera mejor o peor? Razonar como afectara al Rf de los distintos aminocidos.
A2) Anote distancias y calcule el Rf de los Aminocidos patrones y el problema. Identificar ste.
Tubo
Aa patrn
Color de la mancha
Distancia
recorrida
Rf
1
2
3
4
5
PROBLEMA
A3) Qu aminocido de cada una de las siguientes parejas tendr mayor Rf en el sistema cromatogrfico
empleado? Por qu?
a) Ala y Lys;
b) His y Phe;
c) Gly y Ser.
A4) La deteccin precoz de algunas enfermedades congnitas relacionadas con el metabolismo de
aminocidos se realiza por esta tcnica, empleando una muestra de sangre. El caso ms importante es la
fenilcetonuria. Consultar el problema metablico que origina la enfermedad y describir qu observaramos
en la cromatografa de un suero fenilcetonrico con respecto a uno sano.
12
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
A5) Buscar en textos o fuentes informticas la estructura qumica de la ninhidrina y dibujar su reaccin con
los aminocidos y la estructura del compuesto formado en calor, el denominado prpura de Ruhemann.
B1) Cmo operara para transformar 15 ml de la disolucin de albmina 10 mg/ml en otra de concentracin
0.4 mg/ml?Cual es el volumen final obtenido? Cunto disolvente ha de aadirse?
B2) En el ensayo del Biuret, qu color presenta la disolucin del tubo 1? Por qu?
B3) Calcular los mg de albmina presentes en los tubos n 2 de los ensayos de Biuret y de Bradford, y justificar,
en funcin de los resultados, cul de los dos mtodos es ms sensible para detectar protenas.
13
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
PRCTICA 3.
DISOLUCIONES Y DETERMINACIONES ANALITICAS. APLICACIN A LA
HIDRLISIS DEL ALMIDON
INTRODUCCIN.
Una disolucin es una mezcla homognea de dos o ms sustancias, cuyos componentes son un medio
generalmente lquido denominado disolvente, y sustancias disgregadas en su seno, denominadas solutos. En los
seres vivos el disolvente fundamental, el agua, sirve para disolver la mayora de las biomolculas y sales,
aunque en el caso de las biomolculas de gran tamao como las protenas, ms que disoluciones verdaderas son
sistemas coloidales. La composicin de una disolucin se puede expresar de diferentes maneras:
Peso del soluto por volumen de disolucin (por ejemplo g/L o mg/ml).
Porcentaje en peso (% peso): peso de soluto en 100 g de disolucin.
Molaridad (M): moles de soluto por litro de disolucin.
Molalidad (m): moles de soluto por Kg de disolvente.
Mientras que las concentraciones de los diferentes metabolitos en extractos celulares o de los sustratos y
productos en las reacciones enzimticas se suelen expresar en M o mM, en los anlisis de la sangre la
concentracin de diferentes componentes como glucosa o triglicridos se expresa generalmente como mg/dL.
En la determinacin de metabolitos y de muchas actividades enzimticas se utilizan mtodos basados en la
generacin de compuestos coloreados, y el color generado sirve para cuantificar la concentracin y la actividad.
Una de las caractersticas de las disoluciones coloreadas es la de absorber radiaciones del espectro de
luz visible. La ley de Lambert-Beer relaciona la absorcin con las propiedades de la disolucin atravesada por
el haz luminoso. En esta prctica se medirn las absorciones correspondientes a diferentes concentraciones de
una disolucin coloreada, utilizando una cubeta de 1 cm de paso de luz. En el esquema 1 se representa el paso
de luz monocromtica de longitud de onda a travs de una cubeta de anchura l que contiene una disolucin de
concentracin c, y en donde I0 e It son las intensidades de luz antes y despus de atravesar la disolucin.
La ley de Lamber-Beer determina que existe una relacin exponencial entre la transmisin de la luz a
travs de una sustancia (transmitancia) y la concentracin de la sustancia y longitud del cuerpo que atraviesa la
luz. Dicha ley queda reflejada en la expresin
Transmitancia (T) = It/I0 = 10- l c
Si al valor logT se denomina absorbancia (A), la ecuacin anterior queda como
Absorbancia (A) = l c
que nos dice que la absorbancia de una disolucin es funcin directa de la concentracin de dicha disolucin y
de la longitud que atraviesa la luz. Para una cubeta de l = 1 cm la ecuacin se transforma en:
A=c
donde es el coeficiente de absorcin molar o absorbancia molar de la sustancia, y cuyas dimensiones
-1
son M cm-1.
14
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
haz de luz
Io
c,
It
l
A=lc
T = (It/Io) = 10-
A es la absorbancia
T es transmitancia
Io es la intensidad de la luz incidente
It es la intensidad de la luz transmitida
lc
A = -log T
c es la concentracin de la muestra
es el coeficiente de absorcin
l es la distancia que la luz atraviesa
por la disolucin
Esquema 1.
15
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
a) Rotular 6 tubos de plstico y aadir a cada uno de ellos los volmenes de agua destilada y de disolucin
patrn que se indican en la siguiente tabla
1
Agitar los tubos y mediar la absorbancia a =550 nm de cada uno. Para ello se debe de ajustar en primer lugar
los valores de 0 y 100% de transmitancia, utilizando una cubeta de espectrofotmetro llena con la disolucin del
tubo 1. A continuacin medir y anotar los valores de absorbancia de todos los tubos, calculando a continuacin
la concentracin de la sustancia medida en cada uno de los tubos. Medir la absorbancia del problema (P)
Tubo
Absorbancia
Concentracin
A partir de los valores anotados, obtener la representacin grfica de los mismos, utilizando el papel
milimetrado y calcular el coeficiente de absorcin y la concentracin de la disolucin problema:
Coeficiente de absorcin:
Concentracin problema:
NOTA: Es muy importante saber expresar las unidades del coeficiente de absorcin y la concentracin.
16
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
Procedimiento experimental
a) Recolectar saliva utilizando el vaso de plstico, y diluir dicha saliva con un volumen
aproximadamente igual de agua destilada.
Numerar seis tubos. Adicionar a los tubos 1 y 2 los siguientes componentes:
Tubo
Almidn 1% (ml)
Saliva (ml)
Tubo
Almidn 1%
Agua destilada
Disolucin de yodo 1 mM
17
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
18
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
PRCTICA 4.
DETERMINACIN DE CREATININA EN ORINA Y DE OTROS
PARMETROS EN SANGRE.
A. DETERMINACIN DE CREATININA EN ORINA.
El fosfato de creatina es un compuesto que acta como almacn de alta energa fcilmente convertible
en ATP, en msculo y otros tejidos de mamferos. La creatina se sintetiza en hgado y pncreas. Desde estos
rganos se transporta a travs de la sangre a tejidos, donde puede fosforilarse. El contenido muscular de
creatina+fosfocreatina oscila sobre 400 mg/100g. Ambos se convierten espontneamente en creatinina, que
llega por la sangre al rin y es eliminada en la orina.
Cada da, y de forma casi constante, un 2% del contenido muscular se convierte en creatinina. As, sus
niveles plasmticos y en orina dependen de la masa muscular, por lo que su produccin vara segn el sexo y
edad del individuo. Los valores normales de creatinina en plasma son 0.5-1.3 mg/ml para hombres y 0.4-1.0
mg/ml para mujeres. Las determinaciones de creatinina en orina y en plasma sirven para calcular el
aclaramiento (clearance) de creatinina, una prueba utilizada para estimar el filtrado glomerular y valorar la
funcin renal. Existen distintas frmulas empricas para el clculo del aclaramiento, como la de CockcroftGault o la de Jelliffe (buscar esas frmulas en libros de Bioqumica Clnica).
Aunque se han descrito otros procedimientos ms especficos para determinar creatinina en orina, el
mtodo ms rpido es el basado en la reaccin de Jaff, que consiste en la formacin de un complejo con
coloracin amarillo-naranja por reaccin con el picrato en medio alcalino que se cuantifica por la medida de la
absorbancia en el colormetro. Finalmente, se debe calcular la concentracin de la creatinina en la orina
problema utilizando una recta de calibrado obtenida previamente.
MATERIAL Y REACTIVOS
Micropipeta de 1000 l
Tubos de ensayo y gradilla
cido pcrico 14 mM
Colormetro
NaOH 1,4 M
ClH 25 mM
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Rotule 4 tubos y adicione los siguientes reactivos (ml) en el orden establecido en la Tabla (orden horizontal).
AGITE todos los tubos tras la adicin de cido pcrico y espere 15 minutos. Mida la absorbancia en el
colormetro a una longitud de onda de 500 nm. Utilice el tubo n 1, exento de creatinina, para ajustar el cero de
absorbancia. A continuacin, y haciendo uso de la recta de calibrado siguiente:
Absorbancia500 = 0,824 x (miligramos de creatinina)
calcule la cantidad de creatinina en cada tubo, su concentraciones y finalmente en la orina problema.
19
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
REACTIVO / n tubo
HCl 25 mM
1,6
0,8
0,4
--
--
0,8
1,2
1,6
cido Pcrico 14 mM
2,6
2,6
2,6
2,6
NaOH 1,4 M
0,8
0,8
0,8
0,8
Orina problema
(AGITAR)
de creatinina
20
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
Todas las personas que manejen sangre deben conocer las denominadas PRECAUCIONES
UNIVERSALES EN EL MANEJO DE SANGRE Y FLUIDOS CORPORALES, que establecen que toda
muestra de sangre o fluido corporal debe ser considerada como potencialmente infecciosa. Por ello, se
deben adoptar las medidas adecuadas para evitar cualquier posible contagio. El alumno de Ciencias de la
Salud est obligado a conocerlas (consltense en las normativas, manuales o sitios pertinentes) y a
ponerlas en prctica de manera inexcusable. Entre ellas, es fundamental la utilizacin obligatoria de
guantes y evitar el contacto de la sangre o fluidos con heridas, ojos y mucosas.
1. Introducir la sangre en el tubo capilar por capilaridad, sumergiendo ste, con un cierto ngulo
respecto a la vertical, en una gota de sangre por uno de sus extremos. Mantener el otro extremo abierto. No
llenar el capilar menos de 40 mm ni ms de 70 mm.
2. Tapar el extremo del tubo capilar con plastilina u otro tipo de cera. Para ello, tapone con el dedo el
extremo superior del capilar y apritelo en forma vertical sobre dicha lmina, con cuidado de no romperlo.
3. Site el capilar en una hendidura del rotor de la centrifuga de hematocrito, con el extremo tapado
con plastilina hacia la parte exterior.
4. Centrifugue durante 3 minutos y lea el volumen de hematocrito mediante el empleo de la plantilla
excntrica, ajustando el cero en el inicio de la sangre y el 100 en el menisco superior del plasma.
CUESTIONES
B1) Exprese el resultado obtenido para el volumen de hematocrito, e indique si se trata de un valor normal o,
por el contrario, es indicativo de anemia o de poliglobulia.
B2) Explique la diferencia existente entre los trminos sangre entera, plasma y suero.
B3) Qu puede significar la obtencin de un plasma de color rojizo? si se observa, el valor de hematocrito
que se mide es incorrecto?porqu?
21
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
uricasa
---------
peroxidasa
----------
En esta prctica se utiliza un sistema de qumica seca, til para la medida de cido rico y otros
parmetros, tales como hemoglobina, glucosa, colesterol, glucosa, creatinina, urea, triglicridos, GPT, GOT, etc.
El aparato de medida consiste en un fotmetro de reflexin. El fundamento de la medida se basa en la reflexin
de luz sobre una tira portarreactivos que contiene un sustrato cromgeno. Dicha tira dispone de una banda
magntica que contiene todas las informaciones del mtodo necesarias para la ejecucin y calibracin del
aparato de forma automatizada. Slo se necesitan 32 l de sangre y el tiempo de medida es de 3 minutos.
MATERIAL Y REACTIVOS
-Tiras portarreactivos
-Papel cientfico
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
23
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
CUESTIONES
C1) Cul es la enzima responsable de la ltima etapa en la va de formacin del cido rico?sabe de
alguna propiedad de esta enzima?
C2) Busque los valores normales de cido rico en sangre. Porque se produce la enfermedad de la gota? El
alopurinol suele ser utilizado para su tratamiento Cmo acta?
24
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
Glucosa oxidasa
----------------
-D-gluconolactona + H2O2
Peroxidasa
H2O2 + Ind.. reducido (ABTS) ----------
Indicador oxidado + H2O
Glucosa + O2
CUESTIONES
D1) Qu problema tienen los mtodos qumicos basados en la medida del poder reductor de la glucosa?
Cul es la ventaja de los mtodos enzimticos para medir la glucemia?
25
Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15
COMENTARIOS
Utilice este espacio para realizar cualquier comentario o sugerencia que considere necesario para mejorar la
realizacin y comprensin de las prcticas, mencionando el nmero de la prctica si es necesario. Si quiere
realizar el comentario de forma annima, fotocopie o separe esta hoja y depostela en el buzn de su grado.
Gracias por su contribucin.
26