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Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica.

Curso 2014-15

PRCTICAS BSICAS EXPERIMENTALES PARA


GRADOS EN CIENCIAS DE LA SALUD
CURSO 2014-2015

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR B e


INMUNOLOGIA. UNIVERSIDAD DE MURCIA

P1. Medida de pH. Poder regulador. Accin de la lipasa


P2. Propiedades de aminocidos y protenas
P3. Disoluciones y determinaciones analticas. Accin de amilasa
sobre el almidn
P4. Determinacin de creatinina en orina y de otros parmetros en
sangre

Datos del alumno

Nombre:
DNI:
Grado:
Grupo:
Fecha de entrega:

Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia. Prcticas de Bioqumica. Curso 2014-15

PRCTICA 1.
MEDIDAS DE pH. TAMPONES. INICADORES. APLICACIN AL
SEGUIMIENTO DE LA HIDRLISIS DE GRASAS POR LA LIPASA.
INTRODUCCIN
La medida del pH es una de las determinaciones analticas ms utilizadas en disoluciones acuosas y por
tanto en Bioqumica, ya que los fluidos biolgicos son soluciones acuosas. El valor de pH determina las
caractersticas estructurales y funcionales de muchas macromolculas, incluyendo protenas y cidos nucleicos.
En el hombre, el control del pH sanguneo es importante porque sus cambios no altera solo el plasma, sino
adems el pH intracelular, lo que a su vez afecta profundamente al metabolismo. El plasma presenta un pH casi
constante de 7.4, superior al que presenta el citosol intracelular de la mayora de las clulas tisulares. La sangre
es un buen vehculo para suministrar y retirar eficazmente agentes alcalinizantes o acidificantes cuando es
necesario alterar el pH, por estados de acidosis o alcalosis metablica.
El pH es definido como log H+, y su medida es, por tanto, un reflejo en escala logartmica de la
concentracin de protones, es decir, de la acidez del medio. Las medidas se realizan experimentalmente con
electrodos combinados de vidrio, que presentan una respuesta rpida y son sencillos de utilizar. Los electrodos
de vidrio deben, antes de su utilizacin, calibrarse con disoluciones patrn de pH conocido y tener unas
condiciones de conductancia (contenido inico) adecuadas para asegurar una medida precisa. El pH del agua
pura es difcil de medir con precisin por la ausencia de iones. Adems, su pH puede variar drsticamente con
pequeas adiciones de un cido o una base.
El mantenimiento del pH de una solucin acuosa en unos lmites de variacin controlada se consigue
con los denominados tampones, reguladores, amortiguadores o buffers. Estos sistemas estn formados por un
par mezcla de un cido dbil y la sal de su base conjugada que se interconvierten como consecuencia de la
adicin de H+ u OH- gracias al equilibrio qumico entre las dos especies, lo que permite variar sus proporciones
relativas sin un cambio drstico del pH. La relacin fundamental entre las dos especies que constituyen un
sistema regulador es la ecuacin de Henderson-Hasselbalch:

pH = pKa + log [BASE CONJUGADA / [CIDO]


Volviendo a la sangre humana, el intervalo compatible con la vida es, a lo sumo, entre 6.8 a 7.8. Por
ello, la sangre posee sistemas muy eficaces de regular el pH de tal forma que no vare significativamente frente
a una aparicin ms o menos masiva de cidos o bases como consecuencia de desrdenes metablicos y/o
-

respiratorios. En la sangre, el sistema regulador principal es el CO2/HCO3 , pero tambin participan el sistema
-

2-

fosfato H2PO4 /HPO4 y las protenas plasmticas, gracias a ciertos residuos aminoacdicos, principalmente el
grupo imidazol de las histidinas. Por ejemplo, en la hemoglobina, existen 38 histidinas por tetrmero,
constituyendo el principal sistema regulador del pH intraeritroctico (cuyo valor es aproximadamente 7.2).

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Segn la ecuacin de Henderson-Hasselbalch

en el plasma siempre se cumple respecto al sistema

carbnico/bicarbonato:
pH= pK1 + log -HCO3] / CO2]

(ya que el cido carbnico H2CO3 H2O + CO2)

De lo cual, conociendo el valor de pK1 (aprox. 6.1) y la relacin entre las concentraciones de bicarbonato y
carbnico, se puede determinar fcilmente el pH. Si la pareja de cido y base conjugada es el fosfato, la
ecuacin sera:
pH= pK2 + log -2HPO4] / -H2PO4] (en este caso, pK2 = 6.8)
Las experiencias a realizar en la primera parte de la prctica intentan familiarizar al alumno con el
uso del pH-metro y constatar el poder tamponante de alguno de estos sistemas. En la segunda parte se utiliza
una medida indirecta del pH para poder seguir la accin de una enzima digestiva, y detectar la liberacin de
cidos grasos.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
MATERIAL
pHmetro con electrodo de vidrio combinado
Papel "cientfico"
1 vaso de 50 y 1 de 100-250 ml
2 Gradillas con 6 tubos de ensayo transparentes
2 Pipetas de 5 o 10 ml
Micropipeta P100 o P200 y puntas desechables.
Propipeta de 10 ml
1 Varilla de agitacin
Pipeta Pasteur de plstico
Pinza de madera
1 Bao termosttico o termobloque para 37 C
7 viales de 20 ml de capacidad y boca ancha para introducir electrodo
REACTIVOS
Disolucin patrn de pH 7
Tampn fosfato 0,1 M pH 7
KCl Saturado
Fenolftalena 1% en etanol
Carbonato sdico 0.1 M
Leche entera

HCl 1N
NaOH 1N
Agua destilada
Pancreatina bovina al 2%
Bilis 2% (o desoxicolato 2%)

Parte A: UTILIZACION DEL ELECTRODO. MEDIDA DEL pH EN AGUA Y EN


DISOLUCIONES TAMPONADAS.
IMPORTANTE: PRECAUCIONES PARA EL USO DEL ELECTRODO
Un electrodo convencional, como el utilizado en la prctica, tiene la membrana porosa en la pared
lateral, pero en algunos casos se encuentra expuesta, en la zona inferior. Llevar cuidado de no daarla.
a) Antes de efectuar las medidas, asegurarse de que el electrodo est limpio lavndolo con agua destilada y
pasndole suavemente papel cientfico.

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b) Para realizar la medida, es esencial que la membrana porosa situada en el lateral de electrodo est
totalmente sumergida en la disolucin. Es el rea por donde se produce el intercambio inico entre la
disolucin exterior y la interior del electrodo.
c) En casos donde se necesite agitacin magntica, no agitar a gran velocidad ni con movimientos excntricos
de la barra magntica para evitar que sta pueda golpear y romper el electrodo.
1. Uso del electrodo.
Extraer el electrodo de la capucha con solucin de KCl saturado donde debe mantenerse al finalizar las
medidas. Lavar con agua destilada y secar pasando suavemente un trozo de papel por el electrodo.
Preguntar al profesor encargado de la prctica si el electrodo ha sido calibrado recientemente. Si es
as, pasar directamente al punto 2. De lo contrario, debe calibrarse segn los siguientes pasos:

Aadir unos 5 ml de disolucin patrn pH 7 en un tubo de ensayo.


Sumergir el electrodo en esa disolucin.
Conectar el pH-metro y esperar unos segundos hasta estabilizacin de la lectura.
Si sta es distinta de pH 7, ajustar con el mando correspondiente.
Desconectar el botn de lectura de pH.
Sacar el electrodo de la disolucin patrn, quedando listo para medidas.

2. Medidas de pH. Poder tamponante.


Utilizar las 2 series de 3 tubos marcados con 1A, 2A 3A y 1B, 2B, 3B. A la serie A aadir 10 ml de agua
destilada a cada tubo y a la serie B 10 ml de tampn fosfato pH=7. Utilizar los tubos 1A y 1B para medir el pH
inicial del agua o del tampn fosfato, que deber ser prximo a 7. Despus, adicionar con la micropipeta 100
l de HCl 1N a los tubos 2A-2B y 100 l de NaOH a los tubos 3A-3B o alternativamente con la pipeta pasteur
2 gotas del cido o la base respectivamente. Tener siempre la precaucin de cambiar las puntas de la
micropipeta o cambiar la pipeta Pasteur si se va a utilizar para ms de un reactivo antagnico (por ejemplo no
utilizar la misma punta o pipeta para aadir cido y base).
Medir los pH de todos los tubos y rellenar la tabla de abajo. Calcular los cambios de pH producidos por la
adicin de un cido o una base fuertes sobre el agua o el tampn fosfato (columna 3) y comparar con los
resultados tericos.
Tubo

pH inicial
(1 medida)

1A (agua)

pH final
(tras
adicin)

Id a 1A

Variacin
respecto a 1A
o 1B

Valor terico del pH


final (pK2= 6,8).
Opcional

2A (agua+ HCl)

Id a 1A

3A (agua+ NaOH)

Id a 1A

12

1B (fosfato)

Id a 1B

2B (fosfato+ HCl)

Id a 1B

6.82

3B(fosfato+ NaOH)

Id a 1B

7.19

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Parte B: APLICACIN DEL CAMBIO DE pH A MEDIDAS ENZIMTICAS: HIDRLISIS


DE TRIACILGLICRIDOS.
Algunas reacciones metablicas producen sustancias que modificaran considerablemente el pH celular
si no estuvieran suficientemente tamponados. Un ejemplo es la hidrlisis de los triacilglicridos (TAG),
principales componentes de los lpidos de la dieta, durante la digestin en el lumen intestinal, gracias a la
actuacin de la lipasa pancretica.

Acido graso
CH2-OOC-R
CH-OOC-R

lipasa CH2-OH
CH-OH
H2O

R-COOH

CH2-OH

CH2-OOC-R

Glicerol

TAG

RCOO- +

H+

La reaccin se denomina saponificacin. Una vez que acta la lipasa y saponifica el TAG, los cidos
grasos liberan H+, produciendo un descenso del pH medible en un medio no tamponado. Dicho descenso se
podra seguir utilizando un pHmetro, pero en este caso, vamos a utilizar un indicador que cambia de color
como consecuencia del paso de pH de cido a base y que cualitativamente puede reemplazar al electrodo.
Se utiliza pancreatina bovina, que contiene una mezcla de enzimas con lipasa. Como fuente de TAG se
utiliza leche entera de vaca. Mediante fenolftalena, un indicador cido/base, es posible visualizar el descenso
de pH ya que este indicador a pH>7 presenta coloracin rosa, mientras que a pH<7 es incoloro. Puesto que la
leche entera natural tiene un pH inicial inferior a 7, y para acercar el pH al ptimo de actuacin de la lipasa,
prximo a 8, previamente a la accin de la lipasa la leche con la fenolftalena debe basificarse con carbonato
sdico para poder visualizar el descenso de pH.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Aadir unos 25 ml de leche entera al vaso de precipitados y adicionar agitando 5 gotas de fenolftalena.
Ir adicionando disolucin de carbonato sdico con agitacin continua hasta que adquiera un color rosa
homogneo y permanente, con una intensidad semejante a un batido de fresa. A continuacin se numeran 4
tubos de ensayo y se les aaden los reactivos reflejados en la Tabla (cantidades expresadas en ml). Las
adiciones se deben realizar en el orden expresado, y con agitacin cada vez que se aade un nuevo reactivo.
REACTIVOS

Leche basificada

Agua destilada

1.5

0.5

Sales biliares

0.5

0.5

Pancreatina (con lipasa)

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Apuntar tiempo, agitar todos los tubos con rapidez y hasta homogenizacin total y situarlos a 37 C en un bao
termosttico o termobloque, observando atentamente lo que sucede con los tubos a lo largo del tiempo.
Anotar donde se producen decoloraciones y el tiempo transcurrido. Interpretar resultados.

CUESTIONES (Ser breves y utilizar solo el espacio disponible)


A1) Cul es la relacin entre el pH y el pOH? Por qu?

A2) Hay alguna relacin entre el pKa de un grupo y su eficacia tamponante en un rango de pH
determinado? Explique por qu.

A3) Segn lo anterior, explique brevemente por qu los grupos imidazol es un buen agente tamponante en
la sangre.

B1) A qu pH fisiolgico actan las lipasas? Qu producto de la accin de las lipasas es el responsable
directo del cambio de color de la fenolftalena?

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B2) Cul es el efecto de las sales biliares sobre la digestin de triacilglicridos? Afecta a otras clases de
lpidos como los esteres del colesterol?

B3) En el experimento de la digestin de los TAG de la leche En qu orden se produce el cambio de


coloracin?Observa diferencias entre los tubos 1 y 2 a tiempo final? Y entre el 3 y 4? Por qu? Tiene
alguna explicacin para los hechos observados?

Problema (de mayor Dificultad).


Asumiendo que ha adicionado a los 10 ml de agua o de tampn fosfato 0.1M, pH=7 exactamente 100 l de
HCl o NaOH 1N, Podra calcular de forma terica el pH de las disoluciones resultantes en los tubos 2A, 3A,
2B y 3B? Comprelas con las medidas experimentales.

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PRCTICA 2.
PROPIEDADES DE AMINOCIDOS Y PROTEINAS.
INTRODUCCION
A. AMINOACIDOS. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.
Los -aminocidos son las unidades estructurales de las protenas. Se caracterizan por la presencia
sobre el mismo carbono (C) de un grupo bsico (amino, NH2 o NH3+) y un grupo cido (carboxilo, COOH
o COO-), adems de una cadena lateral de naturaleza qumica diversa.
La cromatografa se define como la separacin de una mezcla de dos o ms compuestos por distribucin
entre dos fases inmiscibles: una fase mvil, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en
relacin con la otra, denominada fase estacionaria. La fase mvil puede ser un lquido o un gas y la estacionaria
puede ser un slido o un lquido. Estas tcnicas tambin permiten identificar un compuesto comparando su
comportamiento cromatogrfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrn.
En la cromatografa en capa fina (TLC, por Thin Layer Chromatography), la fase estacionaria es una
fina capa de material poroso e hidroflico (gel de slice, almina, etc.) extendida sobre un soporte plano inerte
(vidrio o aluminio), y la fase mvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que migra por la
fase estacionaria por capilaridad. La fase mvil, en su movimiento, arrastra en mayor o menor medida a los
componentes de la mezcla.
Durante la cromatografa, un determinado soluto interacta con las dos fases y experimenta una serie de
procesos (solubilizacin en cada fase, adsorcin en fase slida, arrastre por la fase mvil, etc.) que condicionan
su reparto entre ellas. En el equilibrio, la relacin entre las concentraciones del soluto de ambas fases es
constante. Este parmetro se denomina coeficiente de reparto y depende de la naturaleza del compuesto y la de
las fases, as como de las condiciones en las cuales se corre la muestra (temperatura, vapor de saturacin, etc).
La separacin de los componentes de una mezcla es buena si todos presentan coeficientes de reparto diferentes.
El coeficiente de reparto es poco empleado en la prctica. En su
lugar, e ntimamente relacionado con l, se emplea el denominado Rf,
caracterstico de cada sustancia y definido como la relacin entre la
distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase mvil. Los
componentes de la mezcla ms insolubles en el disolvente empleado
tendrn un Rf prximo a cero, mientras que el de los ms solubles se
acercar a uno.
La cromatografa en capa fina se puede emplear para separar distintos grupos de biomolculas, tales
como aminocidos, fosfolpidos, azcares, etc, y en cada caso cambiara la fase mvil empleada y los reactivos
reveladores. En esta prctica, separaremos aminocidos y revelaremos la placa con ninhidrina, que al

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reaccionar con el grupo amino de los aminocidos produce un color prpura (en algunos casos puede ser rosa o
rojizo), y con el grupo imino o amino secundario (iminocidos) da un color amarillo/ocre.
B. PROTENAS
Las protenas son las biomolculas ms abundantes de la materia viva. Estn formadas por aminocidos unidos por enlaces peptdicos, lo que origina cadenas lineales. Las protenas conjugadas contienen
otros componentes de distinta naturaleza (no peptdica), que se denominan grupos prostticos. Las propiedades
fisico-qumicas de las protenas pueden ser muy diferentes: as, protenas estructurales como la queratina del pelo
se parecen poco a la hemoglobina o a la hormona insulina.
Para que las protenas cumplan su funcin biolgica tienen que adoptar una estructura espacial
determinada, denominada nativa. La mayora de las protenas globulares son solubles en disoluciones acuosas y a
pH prximos a la neutralidad mantienen su estructura nativa intacta. La alteracin de esta estructura tridimensional
conlleva la prdida de su actividad biolgica, proceso que se denomina desnaturalizacin: las propiedades fisicoqumicas cambian drsticamente y, en el caso de las protenas globulares solubles, generalmente se produce una
insolubilizacin o precipitacin. Agentes desnaturalizantes tpicos son el calor, valores extremos de pH,
disolventes orgnicos, metales pesados (Pb+2, Hg+2, Ag+), agentes caotrpicos y detergentes inicos.
La presencia protenas en una disolucin puede ponerse de manifiesto por gran nmero de ensayos,
basados en la formacin de un compuesto coloreado entre la protena y un reactivo especfico. Dentro de un rango
de concentraciones adecuado, la intensidad del color desarrollado es proporcional a la concentracin de protena,
por lo que se puede cuantificar y correlacionar con la cantidad de protena presente en la muestra. Los distintos
mtodos colorimtricos presentan diferencias de sensibilidad, especificidad y variables como la dificultad o el
precio del ensayo que es importante valorar a la hora de elegir el ms idneo para cada caso. Entre los mtodos
ms utilizados para protenas destacan:
a) Ensayo de Biuret: Compuestos con enlaces peptdicos producen un cambio de color del azul al prpura cuando
reaccionan con Cu (II) en medio alcalino. El ensayo es bastante especfico para protenas (pocos interferentes) y
barato, pero poco sensible: se requieren de 1 a 10 mg de protena.
b) Ensayo de Lowry: Es hasta 10 veces ms sensible que el de Biuret, pero ms tedioso de realizar. El principio de
la reaccin es similar a aqul: se basa en la reaccin de protenas con el Cu (II) en medio alcalino y en la reaccin
de grupos fenlicos (mayoritariamente de tirosina) con un reactivo, denominado de Folin-Ciocalteau, que contiene
fosfomolibdato y fosfowolframato. Como inconvenientes destacan su dependencia del contenido en Tyr y Trp de
la protena y las interferencias debidas a la eventual presencia de compuestos fenlicos en el medio.
c) Ensayo de Bradford: Es un ensayo rpido y muy sensible para cuantificar protenas (1-20 g), aunque la
presencia de detergentes en la muestra puede producir interferencias. El mtodo se basa en el cambio de color que
experimenta el colorante azul coomassie en medio cido en presencia de protenas. Las protenas producen el
cambio de la coloracin parda del reactivo a una tonalidad azulada.
En esta prctica se utilizarn y compararn los ensayos de Biuret y de Bradford.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A. AMINOACIDOS. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.
MATERIAL.
Placa fina (TL) de Slice o celulosa
Micropipeta 1-10 l y puntas adecuadas (blancas)
Cubeta cromatogrfica para TLC
Batea plana para el revelado
Pinza de madera
Lpiz n 2 con punta fina y regla de 10-20 cm
Secador de aire y Horno de incubacin a 95C
REACTIVOS.
Muestras de aminocidos al 1%
Ninhidrina (1mg/ml en acetona)
Fase mvil: n-butanol/acetona/actico/agua (35/35/20/10)
Importante: Tocar la placa solo por los bordes, sin tocar la superficie, para evitar contaminarla.
1.
Colocar aprox. 20 ml de fase mvil en la cubeta y cerrarla, para saturar su atmsfera. La cromatografa
se efectuar en esa cubeta cerrada.
2.
Trazar con un lpiz, sin apretar demasiado para no daar la placa, una lnea horizontal a 1,5 cm del
borde inferior de la placa. Marcar sobre ella 5 puntos con igual separacin entre s, y aplicar en cada uno de
esos puntos 1 l de cada aminocido con la micropipeta anotando las posiciones en que se han colocado los
diferentes aminocidos y el problema. Es importante que las gotas se extiendan lo menos posible, por lo que se
debe secar la primera antes de aplicar la segunda, si es necesario utilizando el secador.
3.
Colocar la placa en la cubeta, cuidando de que el nivel de disolvente quede por debajo de la lnea de
aplicacin de las muestras. Cerrar y esperar unos 35-45 minutos. La fase mvil no debe llegar al extremo
superior de la placa. En ese tiempo, realizar los otros apartados de la prctica.
4.
Sacar la placa, marcar en un borde el nivel alcanzado por la fase mvil, medir y anotar la distancia
recorrida por la fase mvil en mm (en la Tabla de la seccin de cuestiones, A2) y secarla con aire caliente
del secador. Sumergirla en revelador (20-30 ml de ninhidrina). Introducir la placa en la estufa unos 3-5 min, a
105C, o hasta la aparicin de manchas.
5.
Observar las manchas aparecidas, su forma e intensidad. Calcule en Rf de cada muestra y determine
cul(es) es (son) el (los) desconocido(s) de la muestra problema. Para ello, tener en cuenta que Rf = Distancia
corrida por la muestra / Distancia recorrida por la fase mvil. Anotar los datos de distancias y Rf y rellenar
con ellos la Tabla de la cuestin A2.

45 min

B. PROTENAS
MATERIAL ADICIONAL
Tubos de ensayo (vidrio y plstico seco para Bradford)
Micropipetas de 200l y 1000 l y puntas apropiadas
Pipetas de 1-2, 5 y 10 ml y propipetas adecuadas (azul y verde respectivamente)
REACTIVOS.
Disolucin de albmina (10 mg/ml)
Tampn fosfato pH 7, 10 mM
NaOH 2.5 N
cido tricloroactico (TCA) 10%
Acetona
Acetato de plomo 0.2 M
Reactivo de Biuret
Reactivo de Bradford

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1. Precipitacin de protenas.
Rotular 5 tubos de ensayo, y aadir a cada tubo 1 ml de la disolucin de albmina de 10 mg/ml. A continuacin
agitar bien el contenido en cada tubo y observar los efectos de cada agente sobre la solubilidad de la protena:
Tubo

Condicin

Calor

Medio cido

Medio bsico

Disolv. orgnico

Catin pesado

Tratamiento

Observaciones a apuntar
(precipitado, turbidez)

Calentar a 100 C unos minutos


Aadir 1 ml de cido tricloroactico
Aadir 1 ml de hidrxido sdico
Aadir 2 ml de acetona
Aadir 1 ml de acetato de plomo

2. Ensayo del Biuret.


Preparar, a partir de la disolucin de albmina original, 10 ml de disolucin 2 mg/ml en albmina. Rotular 4
tubos de vidrio y aadir, en el orden indicado, cada uno de los reactivos que se especifican (en ml). Agitar y
esperar 10 min y observar resultados apuntado en la Tabla si el color permite dar el ensayo como positivo.
1(Control)

H2O destilada

1.8

Albmina 2 mg/ml

0.2

Reactivo de Biuret

Comentarios respecto a la diferencia de


color observable entre el control y tubos
2, 3 y 4

3. Ensayo de Bradford.
Preparar para este ensayo una disolucin de albmina an mas diluida, de 0,2 mg/ml a partir de la de 2 mg/ml.
Rotular dos tubos de plstico y aadir los reactivos en el orden que se indica. Agitar y observar el color de los 2
tubos y sus posibles diferencias.
1

800 l

700 l

Albmina 0.2 mg/ml

--

100 l

Reactivo de Bradford

200 l

200 l

H2O destilada

CUESTIONES (Ser breves y utilizar solo el espacio disponible)

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A1) Qu naturaleza tienen las fases estacionaria y mvil empleadas? Con una fase mvil ms polar, la
separacin sera mejor o peor? Razonar como afectara al Rf de los distintos aminocidos.

A2) Anote distancias y calcule el Rf de los Aminocidos patrones y el problema. Identificar ste.
Tubo

Aa patrn

Color de la mancha

Distancia
recorrida

Rf

1
2
3
4
5

PROBLEMA

A3) Qu aminocido de cada una de las siguientes parejas tendr mayor Rf en el sistema cromatogrfico
empleado? Por qu?
a) Ala y Lys;
b) His y Phe;
c) Gly y Ser.
A4) La deteccin precoz de algunas enfermedades congnitas relacionadas con el metabolismo de
aminocidos se realiza por esta tcnica, empleando una muestra de sangre. El caso ms importante es la
fenilcetonuria. Consultar el problema metablico que origina la enfermedad y describir qu observaramos
en la cromatografa de un suero fenilcetonrico con respecto a uno sano.

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A5) Buscar en textos o fuentes informticas la estructura qumica de la ninhidrina y dibujar su reaccin con
los aminocidos y la estructura del compuesto formado en calor, el denominado prpura de Ruhemann.

B1) Cmo operara para transformar 15 ml de la disolucin de albmina 10 mg/ml en otra de concentracin
0.4 mg/ml?Cual es el volumen final obtenido? Cunto disolvente ha de aadirse?

B2) En el ensayo del Biuret, qu color presenta la disolucin del tubo 1? Por qu?

B3) Calcular los mg de albmina presentes en los tubos n 2 de los ensayos de Biuret y de Bradford, y justificar,
en funcin de los resultados, cul de los dos mtodos es ms sensible para detectar protenas.

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PRCTICA 3.
DISOLUCIONES Y DETERMINACIONES ANALITICAS. APLICACIN A LA
HIDRLISIS DEL ALMIDON
INTRODUCCIN.
Una disolucin es una mezcla homognea de dos o ms sustancias, cuyos componentes son un medio
generalmente lquido denominado disolvente, y sustancias disgregadas en su seno, denominadas solutos. En los
seres vivos el disolvente fundamental, el agua, sirve para disolver la mayora de las biomolculas y sales,
aunque en el caso de las biomolculas de gran tamao como las protenas, ms que disoluciones verdaderas son
sistemas coloidales. La composicin de una disolucin se puede expresar de diferentes maneras:

Peso del soluto por volumen de disolucin (por ejemplo g/L o mg/ml).
Porcentaje en peso (% peso): peso de soluto en 100 g de disolucin.
Molaridad (M): moles de soluto por litro de disolucin.
Molalidad (m): moles de soluto por Kg de disolvente.
Mientras que las concentraciones de los diferentes metabolitos en extractos celulares o de los sustratos y

productos en las reacciones enzimticas se suelen expresar en M o mM, en los anlisis de la sangre la
concentracin de diferentes componentes como glucosa o triglicridos se expresa generalmente como mg/dL.
En la determinacin de metabolitos y de muchas actividades enzimticas se utilizan mtodos basados en la
generacin de compuestos coloreados, y el color generado sirve para cuantificar la concentracin y la actividad.
Una de las caractersticas de las disoluciones coloreadas es la de absorber radiaciones del espectro de
luz visible. La ley de Lambert-Beer relaciona la absorcin con las propiedades de la disolucin atravesada por
el haz luminoso. En esta prctica se medirn las absorciones correspondientes a diferentes concentraciones de
una disolucin coloreada, utilizando una cubeta de 1 cm de paso de luz. En el esquema 1 se representa el paso
de luz monocromtica de longitud de onda a travs de una cubeta de anchura l que contiene una disolucin de
concentracin c, y en donde I0 e It son las intensidades de luz antes y despus de atravesar la disolucin.
La ley de Lamber-Beer determina que existe una relacin exponencial entre la transmisin de la luz a
travs de una sustancia (transmitancia) y la concentracin de la sustancia y longitud del cuerpo que atraviesa la
luz. Dicha ley queda reflejada en la expresin
Transmitancia (T) = It/I0 = 10- l c
Si al valor logT se denomina absorbancia (A), la ecuacin anterior queda como
Absorbancia (A) = l c
que nos dice que la absorbancia de una disolucin es funcin directa de la concentracin de dicha disolucin y
de la longitud que atraviesa la luz. Para una cubeta de l = 1 cm la ecuacin se transforma en:
A=c
donde es el coeficiente de absorcin molar o absorbancia molar de la sustancia, y cuyas dimensiones
-1

son M cm-1.

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haz de luz

Io

c,

It

l
A=lc

T = (It/Io) = 10-

A es la absorbancia
T es transmitancia
Io es la intensidad de la luz incidente
It es la intensidad de la luz transmitida

lc

A = -log T

c es la concentracin de la muestra
es el coeficiente de absorcin
l es la distancia que la luz atraviesa
por la disolucin

Esquema 1.

En la primera parte de la prctica se van a preparar disoluciones de concentraciones diferentes a partir


de una disolucin patrn de concentracin conocida, midindose a continuacin la absorbancia de cada una de
las disoluciones con la ayuda de un espectrofotmetro. A continuacin, se representaran en un diagrama x/y los
valores de absorbancia frente a las concentraciones, obtenindose la recta correspondiente y a partir de la misma
determinar el coeficiente de absorcin molar ( de la sustancia analizada.
En la segunda parte, se llevar a cabo la medida de la aparicin o desaparicin de un color para detectar
la presencia de una biomolcula como el almidn, y la degradacin del mismo por la amilasa salivar. Para ello
se har uso de la propiedad que tienen las cadenas de amilosa del almidn para generar un color azulado/violeta
cuando interaccionan con el yodo, y de la capacidad de amilasa salivar para degradar el almidn, hidrolizando
los enlaces glicosdicos (1 4) de dicho polmero.
PARTE A. LEY DE LAMBERT-BEER. CALCULO DEL Y DE LA CONCENTRACION DE UNA
DISOLUCIN PROBLEMA.
MATERIALES
Espectrofotmetro.
Gradilla tubos
Juego y puntas de micropipetas.
Tubos de plstico de 10 ml.
Frasco lavador
Cubetas de espectrofotmetro.
Disolucin patrn de azul de metileno de 300 M y Disolucin problema (P).

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
a) Rotular 6 tubos de plstico y aadir a cada uno de ellos los volmenes de agua destilada y de disolucin
patrn que se indican en la siguiente tabla
1

Agua destilada (ml)

2.97 2.94 2.85 2.70 2.40

Disolucin patrn (ml)

0.03 0.06 0.15 0.30 0.60

Agitar los tubos y mediar la absorbancia a =550 nm de cada uno. Para ello se debe de ajustar en primer lugar
los valores de 0 y 100% de transmitancia, utilizando una cubeta de espectrofotmetro llena con la disolucin del
tubo 1. A continuacin medir y anotar los valores de absorbancia de todos los tubos, calculando a continuacin
la concentracin de la sustancia medida en cada uno de los tubos. Medir la absorbancia del problema (P)
Tubo

Absorbancia
Concentracin
A partir de los valores anotados, obtener la representacin grfica de los mismos, utilizando el papel
milimetrado y calcular el coeficiente de absorcin y la concentracin de la disolucin problema:

Coeficiente de absorcin:

Concentracin problema:

NOTA: Es muy importante saber expresar las unidades del coeficiente de absorcin y la concentracin.

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PARTE B. ACTIVIDAD AMILASA SALIVAR. REACCIN DEL ALMIDON CON EL YODO.


Materiales
Gradilla
Tubos de vidrio de 10 ml.
Micropipetas. P100 y P1000
Puntas de micropipetas.
Termobloque

Vaso pequeo desechable para recolectar saliva.


Disolucin de almidn 1%
Disolucin de yodo 1 mM
Agua destilada
Saliva

Procedimiento experimental
a) Recolectar saliva utilizando el vaso de plstico, y diluir dicha saliva con un volumen
aproximadamente igual de agua destilada.
Numerar seis tubos. Adicionar a los tubos 1 y 2 los siguientes componentes:

Tubo

Almidn 1% (ml)

Agua destilada (ml)

Saliva (ml)

Agitar los tubos y dejar incubar hasta realizar el apartado b.


b) Aadir los siguientes reactivos a los otros cuatro tubos

Tubo

Almidn 1%

Agua destilada

Disolucin de yodo 1 mM

Agitar y anotar los cambios observados.


Introducir el tubo 5 en el calefactor puesto a una temperatura de 90C. Ir observando los cambios producidos en
relacin con el tubo 6 mantenido a la temperatura ambiente. A continuacin enfriar el tubo 5 usando el agua del
grifo. Anotar los cambios.
c) Una vez terminado el apartado b, aadir 1ml de disolucin de yodo a cada uno de los tubos 1 y 2 y
agitar. Comparar la coloracin de ambos tubos.

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CUESTIONES (Ser breves y utilizar solo el espacio disponible)


A1)? Qu sustancia patrn ha utilizado para verificar la Ley de Lambert-Beer? Qu absorbancia
tendra una disolucin 50 M de dicho patrn?

A2) Qu cantidad de soluto existe en 3 ml de disolucin 60 M?

A3) Cul ser la concentracin mM de glucosa en sangre si el valor de la glucemia es 90 mg/dL ?


(El peso molecular de la glucosa es 180).

B1) A que se debe la coloracin observada en los tubos 5 y 6?

B2) Cmo explicara los cambios observados al calentar y enfriar el tubo 5?

B3) A que se deben los cambios observados entre los tubos 1 y 2?

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PRCTICA 4.
DETERMINACIN DE CREATININA EN ORINA Y DE OTROS
PARMETROS EN SANGRE.
A. DETERMINACIN DE CREATININA EN ORINA.
El fosfato de creatina es un compuesto que acta como almacn de alta energa fcilmente convertible
en ATP, en msculo y otros tejidos de mamferos. La creatina se sintetiza en hgado y pncreas. Desde estos
rganos se transporta a travs de la sangre a tejidos, donde puede fosforilarse. El contenido muscular de
creatina+fosfocreatina oscila sobre 400 mg/100g. Ambos se convierten espontneamente en creatinina, que
llega por la sangre al rin y es eliminada en la orina.
Cada da, y de forma casi constante, un 2% del contenido muscular se convierte en creatinina. As, sus
niveles plasmticos y en orina dependen de la masa muscular, por lo que su produccin vara segn el sexo y
edad del individuo. Los valores normales de creatinina en plasma son 0.5-1.3 mg/ml para hombres y 0.4-1.0
mg/ml para mujeres. Las determinaciones de creatinina en orina y en plasma sirven para calcular el
aclaramiento (clearance) de creatinina, una prueba utilizada para estimar el filtrado glomerular y valorar la
funcin renal. Existen distintas frmulas empricas para el clculo del aclaramiento, como la de CockcroftGault o la de Jelliffe (buscar esas frmulas en libros de Bioqumica Clnica).
Aunque se han descrito otros procedimientos ms especficos para determinar creatinina en orina, el
mtodo ms rpido es el basado en la reaccin de Jaff, que consiste en la formacin de un complejo con
coloracin amarillo-naranja por reaccin con el picrato en medio alcalino que se cuantifica por la medida de la
absorbancia en el colormetro. Finalmente, se debe calcular la concentracin de la creatinina en la orina
problema utilizando una recta de calibrado obtenida previamente.
MATERIAL Y REACTIVOS
Micropipeta de 1000 l
Tubos de ensayo y gradilla
cido pcrico 14 mM

Colormetro
NaOH 1,4 M
ClH 25 mM
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Rotule 4 tubos y adicione los siguientes reactivos (ml) en el orden establecido en la Tabla (orden horizontal).
AGITE todos los tubos tras la adicin de cido pcrico y espere 15 minutos. Mida la absorbancia en el
colormetro a una longitud de onda de 500 nm. Utilice el tubo n 1, exento de creatinina, para ajustar el cero de
absorbancia. A continuacin, y haciendo uso de la recta de calibrado siguiente:
Absorbancia500 = 0,824 x (miligramos de creatinina)
calcule la cantidad de creatinina en cada tubo, su concentraciones y finalmente en la orina problema.

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REACTIVO / n tubo

HCl 25 mM

1,6

0,8

0,4

--

--

0,8

1,2

1,6

cido Pcrico 14 mM

2,6

2,6

2,6

2,6

NaOH 1,4 M

0,8

0,8

0,8

0,8

Orina problema

(AGITAR)

Anotar valores de A500


Cantidades o concentraciones

de creatinina

CUESTIONES (utilizar solo el espacio disponible)


A1. Cul es la concentracin de creatinina estimada en la orina problema?Utiliza los datos de los tubos 2,
3 y 4? Cmo?

B. DETERMINACIN DEL VOLUMEN DE HEMATOCRITO.


El hematocrito representa la proporcin de glbulos rojos a sangre entera, y se expresa en volmenes
por ciento. Su medida se realiza por centrifugacin de la sangre heparinizada o tratada con algn otro inhibidor
de la coagulacin, calculando el % que alcanza la masa globular.
Normalmente, en el adulto oscila del 36-50 %, con un valor medio de 46 para varones y 40 para
mujeres. En neonatos, los valores normales son ms altos, sobre el 56%, pero la cifra decrece progresivamente
en el primer mes hasta alcanzar un mnimo prximo al 35% y ascender de nuevo lentamente.
Aproximadamente, el hematocrito multiplicado por 100.000 nos indica el nmero de eritrocitos por
milmetro cbico. Ello es debido a la poca contribucin que los glbulos blancos y plaquetas tienen sobre el
volumen celular de la sangre.
MATERIAL Y REACTIVOS
Centrfuga de hematocrito
Sangre entera
Capilares heparinizados de 1.8 mm de dimetro mximo y longitud no superior a 75 mm.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
Todas las personas que manejen sangre deben conocer las denominadas PRECAUCIONES
UNIVERSALES EN EL MANEJO DE SANGRE Y FLUIDOS CORPORALES, que establecen que toda
muestra de sangre o fluido corporal debe ser considerada como potencialmente infecciosa. Por ello, se
deben adoptar las medidas adecuadas para evitar cualquier posible contagio. El alumno de Ciencias de la
Salud est obligado a conocerlas (consltense en las normativas, manuales o sitios pertinentes) y a
ponerlas en prctica de manera inexcusable. Entre ellas, es fundamental la utilizacin obligatoria de
guantes y evitar el contacto de la sangre o fluidos con heridas, ojos y mucosas.
1. Introducir la sangre en el tubo capilar por capilaridad, sumergiendo ste, con un cierto ngulo
respecto a la vertical, en una gota de sangre por uno de sus extremos. Mantener el otro extremo abierto. No
llenar el capilar menos de 40 mm ni ms de 70 mm.
2. Tapar el extremo del tubo capilar con plastilina u otro tipo de cera. Para ello, tapone con el dedo el
extremo superior del capilar y apritelo en forma vertical sobre dicha lmina, con cuidado de no romperlo.
3. Site el capilar en una hendidura del rotor de la centrifuga de hematocrito, con el extremo tapado
con plastilina hacia la parte exterior.
4. Centrifugue durante 3 minutos y lea el volumen de hematocrito mediante el empleo de la plantilla
excntrica, ajustando el cero en el inicio de la sangre y el 100 en el menisco superior del plasma.

CUESTIONES
B1) Exprese el resultado obtenido para el volumen de hematocrito, e indique si se trata de un valor normal o,
por el contrario, es indicativo de anemia o de poliglobulia.

B2) Explique la diferencia existente entre los trminos sangre entera, plasma y suero.

B3) Qu puede significar la obtencin de un plasma de color rojizo? si se observa, el valor de hematocrito
que se mide es incorrecto?porqu?

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C. DETERMINACIN AUTOMATIZADA DE PARMETROS CLNICOS.


DETERMINACIN DE CIDO RICO EN SANGRE.
El cido rico es el producto final del catabolismo humano de las purinas (adenina y guanina). La
produccin diaria de cido rico procedente del catabolismo de productos endgenos es, aproximadamente, 400
mg por da; el procedente de la dieta supone unos 300 mg diarios. El cido rico es un cido dbil cuyo pKa es
5,75. Por tanto, en el medio fisiolgico se encuentra en forma de urato. Los valores normales de referencia
oscilan entre 3-7 mg/dl en hombres y 2-6 mg/dl en mujeres.
La causa ms comn de hiperuricemia es la disminucin de la excrecin de urato, fundamentalmente de
origen renal. Puede aparecer hiperuricemia temporal en enfermedades neoplsicas de la sangre (leucemias), en
el alcoholismo, tras un ejercicio fsico intenso, en el caso de deshidratacin o tras tratamiento con diurticos. de
pacientes con esa enfermedad.
Pero el sndrome que mejor caracteriza la hiperuricemia es la gota, acompaada de artritis aguda y
depsitos tisulares de urato sdico. La crisis aguda de gota se inicia por la respuesta inflamatoria a los cristales
de urato monosdico.
La determinacin analtica de cido rico se lleva a cabo habitualmente utilizando dos enzimas
acopladas: uricasa (urato oxidasa) y peroxidasa, segn la secuencia de reacciones expresada a continuacin:
cido rico + O2 + 2H2O

uricasa
---------

H2O2 + indicador reducido

peroxidasa
----------

alantona + H2O2 + CO2


indicador oxidado + H2 O

En esta prctica se utiliza un sistema de qumica seca, til para la medida de cido rico y otros
parmetros, tales como hemoglobina, glucosa, colesterol, glucosa, creatinina, urea, triglicridos, GPT, GOT, etc.
El aparato de medida consiste en un fotmetro de reflexin. El fundamento de la medida se basa en la reflexin
de luz sobre una tira portarreactivos que contiene un sustrato cromgeno. Dicha tira dispone de una banda
magntica que contiene todas las informaciones del mtodo necesarias para la ejecucin y calibracin del
aparato de forma automatizada. Slo se necesitan 32 l de sangre y el tiempo de medida es de 3 minutos.
MATERIAL Y REACTIVOS
-Tiras portarreactivos
-Papel cientfico

-Instrumento medidor Reflotrn


-Pipeta Reflotrn de 32 l

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL (Este apartado de la prctica se realiza como demostracin)


1. Conecte el aparato y ponga el interruptor en la posicin I (parte trasera).
2. Djelo que se caliente hasta que en la pantalla aparezca el mensaje LISTO. Si no va a ser utilizado durante
algn tiempo, puede pulsar la tecla Stand-by, situada en la parte inferior derecha de la pantalla.
(Al mismo tiempo que sigue este protocolo, la lectura de las hojas informativas para cada test, que se incluyen
en este cuadernillo como apndice, pueden facilitarle el proceso).
3. Tome una tira portarreactivos correspondiente al parmetro que pretende determinar. Cierre inmediatamente
el tubo. No toque la zona gris.
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4. Retire la hoja protectora de la tira portarreactiva, evitando doblar la tira.


5. Introduzca la tira cuidadosamente en la ranura para los portarreactivos.
6. Utilice la pipeta de volumen fijo para aspirar sangre (bien de la muestra proporcionada o bien por puncin en
el dedo de algn voluntario -en este caso consulte con el profesor)
7. Coloque la muestra como gota en el centro del campo de aplicacin (rojo) provisto de una malla, evitando
tocar ste con la punta de la pipeta.
8. Introduzca la tira horizontalmente en la ranura de la cmara de medicin. Cierre la tapa.
9. En la pantalla aparece la confirmacin de la medida que estamos realizando (UA), Asimismo aparece el
tiempo necesario hasta que disponible el resultado. Tome nota de la lectura.
10. Abra la cmara de medicin y retire la tira. Observe que el color debe haberse desarrollado en toda la zona
del test, presente en la tira. Descarte la tira.

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CUESTIONES
C1) Cul es la enzima responsable de la ltima etapa en la va de formacin del cido rico?sabe de
alguna propiedad de esta enzima?

C2) Busque los valores normales de cido rico en sangre. Porque se produce la enfermedad de la gota? El
alopurinol suele ser utilizado para su tratamiento Cmo acta?

D. DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SANGRE.


La determinacin de la glucemia es una prueba frecuentemente utilizada en Bioqumica Clnica. La
concentracin normal de glucosa en sangre para un individuo en ayunas oscila entre 80 y 120 mg/100ml.
Despus de una comida que contenga carbohidratos, esta cifra se incrementa para volver en unas dos horas a los
niveles basales. Si el ayuno es prolongado el nivel de glucosa desciende, pero nunca por debajo de 50 mg/100
ml; la razn fundamental es que el sistema nervioso requiere un aporte continuo de glucosa.
Aunque el nmero de mtodos utilizados histricamente para la determinacin de glucosa es abundante,
la mayora no son ya utilizados en los laboratorios de bioqumica clnica de forma manual. En cualquier caso, si
los agrupamos segn el tipo de reaccin qumica que se lleva a cabo, podemos distinguir tres grandes grupos:
1. Mtodos basados en el poder reductor de la glucosa sobre un agente oxidante, generalmente una
sal de cobre o hierro. Entre ellos estn los mtodos de Folin-Wu, Hagedorn y Jensen, hoy da en desuso.
2. Mtodos de determinacin de furfural. Ms especficos que los de reduccin, se basan en el
comportamiento de las hexosas y pentosas en medio muy cido, donde forman furfural. A partir de glucosa se
obtiene hidroxi-metil furfural, que puede detectarse colorimtricamente, mediante la o-toluidina.
3. Mtodos enzimticos. Son los ms utilizados en la actualidad. Entre ellos destacan:
a) Mtodo de la glucosa-oxidasa y peroxidasa acopladas. Se mide colorimtricamente la formacin de
un aceptor de oxgeno cromognico como el ABTS.
b) Mtodo de la glucosa deshidrogenasa, en el que se sigue colorimtricamente la formacin de NADH.
c) Mtodo de la hexoquinasa. Utiliza esta enzima acoplada a la deshidrogenasa de la glucosa -6-P, con
la formacin concomitante de NADH y su medida colorimtrica a 340 nm.
La determinacin de glucosa en esta prctica se lleva a cabo por el mtodo enzimtico de la
glucosa oxidasa y peroxidasa acopladas (ver documento adjunto).

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Glucosa oxidasa
----------------
-D-gluconolactona + H2O2
Peroxidasa
H2O2 + Ind.. reducido (ABTS) ----------
Indicador oxidado + H2O
Glucosa + O2

CUESTIONES
D1) Qu problema tienen los mtodos qumicos basados en la medida del poder reductor de la glucosa?
Cul es la ventaja de los mtodos enzimticos para medir la glucemia?

D2) En qu consiste la prueba de tolerancia oral a la glucosa?para que sirve?

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COMENTARIOS
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Gracias por su contribucin.

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