Manual

JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de

Protenas
Cat. No.

Cantidad

CS-401ES

1 Kit

Slo para usos in vitro

Garanta vlida para 12 meses
Conservar a 4C

Introduccin y Teora de la Cristalizacin

Hoy en da hay dos mtodos fundamentales para
determinar la estructura tridimensional de una
protena. Por un lado est la resonancia magntica
nuclear (NMR) y, por el otro, la cristalografa de
rayos X. Con el mtodo NMR slo se pueden estudiar
molculas con un peso molecular aproximado de
hasta 25.000 Da (25 kDa, o aproximadamente 220
aminocidos); la cristalografa de rayos X es ms
apropiada para determinar la estructura de protenas
ms grandes o complejos macromoleculares. Las
primeras estructuras analizadas con este mtodo
fueron la mioglobina (1950) y la hemoglobina
(1955), estudios que fueron premiados en 1962 con
el premio Nobel de qumica.
El primer paso para determinar una estructura por
medio de la cristalografa y, al mismo tiempo, el ms
complicado- radica en la obtencin de cristales de
suficiente tamao. Un cristal es una estructura
tridimensional formada por bloques bsicos (en este
caso, molculas proteicas) dispuestos de manera
regular. Cmo podemos lograr cristales partiendo de
una molcula tan compleja como es la protena?
Para pasar del estado lquido al cristalino, hay que
reducir primero la solubilidad de la molcula. Por
regla general, esto entraa la formacin de una
precipitacin amorfa. Sin embargo, si las condiciones
se han elegido de tal manera que en la superficie de
la molcula se hallan reas complementarias entre s,
se pueden dar variaciones especficas entre las
molculas proteicas. Si la geometra de estas
variaciones es favorable, se formarn cristales.

Fig. 1: Diagrama esquemtico de fases de una

mezcla de protena y precipitante
En la cristalizacin se distinguen principalmente dos
pasos: (1) la nucleacin y (2) el crecimiento del
cristal. Ambos pasos tienen lugar, si las condiciones
son favorables, en la zona sobresaturada del
diagrama de fases (ver Figura 1).
Desafortunadamente, para la nucleacin se requiere
ms sobresaturacin que para el crecimiento. El rea
de formacin nuclear donde se da la sobresaturacin
tambin se denomina zona inestable o labil, mientras
que el rea de crecimiento se conoce como zona
metaestable. Para la nucleacin es necesario que la
solucin llegue a la zona labil. Sin embargo, una vez
all los ncleos crecern demasiado rpido y los
cristales resultantes sern muchos y muy pequeos.
Como nos interesa formar cristales lo ms grandes
posibles (ca. 0,5 mm de largo) es necesario limitar la
cantidad de ncleos en formacin. En el experimento,
por tanto, hay que aproximarse a la fase de
nucleacin muy lentamente, para garantizar que los
ncleos tengan tiempo suficiente para crecer.
El paso de una solucin estable a una sobresaturada
se puede realizar fcilmente variando la proporcin
de la mezcla de protena y precipitante guindose
por el diagrama de fases. Para ello, se puede
aumentar la concentracin de la protena o la del
precipitado. Los procesos fsicos que se prestan para
lograr un cambio de concentracin son la dilisis y la
difusin. Ambos se caracterizan por el transporte de
materia. El mtodo de difusin por vapor, ilustrado en
la Figura 2, ha demostrado ser especialmente idneo
para la cristalizacin.

Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 80 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100
Page 1 of 7

www.jenabioscience.com

Last update: December 04, 2012

Manual
JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de
Protenas
Este mtodo tambin se conoce como gota colgante
(hanging drop). La solucin proteica se encuentra
en una gota suspendida de la parte inferior de una
lmina de microscopio. El tamao de la gota oscila
normalmente entre los 0,5 l y los 20 l. La solucin
del pocillo (ca. 1 ml), que se encuentra en un
reservorio por debajo de la gota, posee una elevada
concentracin de precipitante y dispone, por tanto,
de una presin de vapor inferior a la de la solucin
proteica. Durante el experimento, el agua de la gota
se evapora sobre la solucin del recipiente. De esta
manera, la concentracin proteica de la gota
aumenta, junto con la concentracin de otros
materiales.
En
condiciones
favorables,
la
cristalizacin tendr lugar al cabo de unos das o
semanas. En otras palabras, estamos usando un
sistema (gota colgante sobre un pocillo) que se halla
en desequilibrio termodinmico. Es primordial que el
equilibrio se vaya alcanzando poco a poco.

como (NH4)2SO4, NaCl, LiCl, KH2PO4, etc., cambian

la carga inica de la solucin. La Figura 3 demuestra
cmo vara la solubilidad de las protenas en funcin
de la carga inica.

Fig. 3: Dependencia de la solubilidad S en funcin

de la carga inica I
El rea a la izquierda del mximo de solubilidad
proteica tambin se denomina area de salado
(salting-in); el rea a la derecha, de desalado
(salting-out). En la zona de salting-in la
solubilidad aumenta debido a la elevada constante
dielctrica de la solucin. Gracias a este aumento, las
cargas de la superficie de la protena pueden
interactuar mejor con su entorno. En la zona de
salting-out la solubilidad vuelve a descender, ya
que las cargas de precipitante entran en competencia
por las molculas de agua con las cargas de la
superficie de la protena.

Fig. 2: El
drop

mtodo de gota colgante o hanging

Qu Materiales
Precipitante?

se

Pueden

Usar

Como

En principio, se puede usar cualquier material que

pueda influir sobre la solubilidad de la protena,
siempre que no la desnaturalice en elevadas
concentraciones.
Los distintos precipitantes usados comnmente en la
cristalizacin de protenas se pueden catalogar segn
sus efectos sobre la solucin. Por ejemplo, las sales

Los precipitados orgnicos como el ethanol, el

methanol, el propanol, el MPD (metilopentanediol) o
el acetonitrilo, entre otros, disminuyen la solubilidad
proteica ya que bajan la constante dielctrica de la
solucin. El mismo efecto provocan los polmeros
orgnicos
como,
por
ejemplo,
los
PEGs
(polietilenglicoles), que se pueden encontrar con
diversos pesos moleculares (de 400 a 20.000 Da).
Otro parmetro importante que influye en la
solubilidad de las protenas es el factor de pH. La
solubilidad es ms baja, por lo general, en el punto
isoelctrico de la protena (IEP), puesto que all es
donde la protena contiene una carga neta de cero.

Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 80 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100
Page 2 of 7

www.jenabioscience.com

Last update: December 04, 2012

Manual
JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de
Protenas
Existen muchos factores que pueden influir en la
cristalizacin, y normalmente disponemos de una
cantidad reducida de protena; como consecuencia,
resulta prcticamente imposible probar todos y cada
uno de los parmetros existentes en el espectro. Es
importante, por tanto, desarrollar una estrategia que
nos permita obtener resultados rpidos sin gastar
demasiado material.
Las Propiedades de los Cristales Proteicos
En principio, los cristales proteicos estn formados de
igual manera que los cristales de molculas pequeas
o cristales salinos, y su empaquetamiento molecular y
su simetra se rigen por las mismas reglas. Sin
embargo, hay algunas diferencias fundamentales que
afectan tanto a las propiedades mecnicas y pticas
de los cristales como a su composicin. Los cristales
proteicos son muy blandos y contienen normalmente
entre un 30% y un 70% de agua, la mayor parte de
forma relativamente desordenada dentro del cristal.
La integridad del cristal est dictada por la
interaccin entre las molculas proteicas; sin
embargo, entre las protenas se encuentran espacios
vacos de un tamao considerable, que estn llenos
de agua y/o molculas amortiguadoras. Por
consiguiente, las molculas proteicas se encuentran
en un medio casi natural, es decir, acuoso. Su
estructura original (los pliegues de la protena,
fundamentales para permitir la actividad proteica) se
mantiene, algo que se puede comprobar por medio
de tests de actividad enzimtica realizadas en
proteinas cristalizadas. En algunos casos, la forma
cristalina es una forma natural de reserva, como
ocurre por ejemplo con la insulina.

El JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin

Proteica
Jena Bioscience ha desarrollado este Kit de Iniciacin
a la Cristalizacin Proteica, que contiene todo el
material necesario para averiguar, partiendo de una
protena ejemplo (lisozima de clara de huevo) cmo
se va desarrollando la cristalizacin en funcin del
pH, con NaCl como precipitante. Para ello, el pH se
modifica poco a poco, mientras se va variando por
fases la concentracin del precipitante. El Kit,
adems, incluye todos los materiales para cristalizar

lisozima por medio del mtodo batch. Para ello, la

solucin de cristalizacin y la solucin proteica se
mezclan al mismo tiempo, logrando cristales sin
difusin por vapor y sin equilibrar la concentracin de
proteina y precipitante.
El Kit Incluye:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

7.
8.

2 placas 24-well SuperClearTM para la

cristalizacin segn el mtodo de gota colgante
1 jeringa con 5 ml de grasa de silicona para
sellar los pocillos
100 lminas para la cristalizacin por gota
colgante
1 porta objeto
20 ml de NaCl, 20% (m/v)
4 dosis de 3 ml de 250 mM de acetato de sodio
como tampn, con un pH de 4,0; 4,4; 4,8 y 5,2
cada una
200 l de solucin de lisozima en agua (20
mg/ml)
1 ml de solucin de cristalizacin para la
cristalizacin por mtodo batch (30% (m/v) de
PEG 5000-MME, 1 M de NaCl, 50 mM de
acetato de sodio con un pH de 4,4)

Otros Materiales Necesarios no Incluidos en

este Kit:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Pipetas Eppendorf o similares, con capacidad

para abarcar de 1 a 500 l
Puntas de pipeta del tamao correspondiente
Agua destilada o desionizada
Una pinza
Una habitacin con una temperatura constante
(2022 C)
Un microscopio con un poder de amplificacin
de 50-100 para examinar los cristales

Realizacin del Experimento Segn el

Mtodo de Gota Colgante
En el experimento por gota colgante o hanging
drop (Figura 2), la lisozima se cristaliza equilibrando
la gota de protena diluida en la solucin de
cristalizacin con la solucin de cristalizacin
contenida en el pocillo, por medio de una placa de
cristalizacin sellada. Para ello se utiliza un sistema

Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 80 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100
Page 3 of 7

www.jenabioscience.com

Last update: December 04, 2012

Manual
JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de
Protenas
de acetato de sodio/NaCl, teniendo en cuenta que la
cristalizacin depende en gran parte del valor de pH
del tampn y la concentracin de NaCl. El test se
realiza con un pH de entre 4,0 y 5,2 en combinacin
con una concentracin de NaCl de entre 4% y 9%.
Desarrollo del Experimento:
1. Aplicar grasa de silicona en los pocillos de
cristalizacin: usando la jeringa incluida en el kit,
esparcir uniformemente la grasa de silicona sobre
los bordes circulares del pocillos de cristalizacin.
No deben aparecer irregularidades en el filo
engrasado ni hilos sobre la cavidad del
recipiente.
2. Pipetar la solucin en el pocillo siguiendo el
esquema de la Figura 4: el volumen total por
pocillo debe ser 1ml, y la concentracin de
tampn tras ser mezclado con el precipitante y
con agua debe ser 50 mM. Atencin: antes de
empezar a pipetar, asegurarse de que el placa
est colocado correctamente, sirvindose como
orientacin de las lneas (A-D) y las columnas (16).
3. Pipetar la gota para la cristalizacin: pipetar 1 l
de solucin proteica y 1 l de solucin del pocillo
en una lmina circular. Pipetar cada lnea (A-D)
por separado. Primero se coloca una gota de la
solucin proteica en una lmina. Despus, se
aplica con cuidado la solucin del pocillo sobre
cada gota. Para ello, colocar la punta de la
pipeta con precaucin sobre la superficie de la
gota de protena y liberar 1 l de solucin del
pocillo sin que aparezcan burbujas sobre la gota.
Antes de pipetar una gota nueva hay que
cambiar la punta de la pipeta.
4. Tapar los recipientes: con ayuda de una pinza,
coger
las
lminas,
darles
la
vuelta
cuidadosamente con la gota hacia abajo y
colocarlas sobre los pocillos. A continuacin,
presionar ligeramente para que la grasa de
silicona cierre hermticamente el pocillo.
Conservar las placas preparadas en una habitacin
con una temperatura constante (20-22C). Para
examinar la gota bajo el microscopio es
recomendable quitarles la tapa a la placa. Se deben

tomar precauciones para no ensuciar el objetivo del

microscopio con la grasa. Asegrese de observar
toda la profundidad de la gota de protena en el
microscopio. La luz polarizada se puede aplicar
tambin a fin de distinguir entre precipitado amorfo y
material cristalino, ya que los cristales son capaces de
polarizar la luz transmitida.
La Figura 5 muestra el aspecto de la gota de
cristalizacin a travs del microscopio (factor de
amplificacin de 40) al cabo de 20 horas. Las
coordinadas (A-D, 1-6) son las mismas que figuran
sobre la placa de cristalizacin.
Se puede observar claramente que el nmero de
cristales aumenta cuanto ms elevada sea la
concentracin de NaCl. La calidad ptima de
cristales se alcanza cuando la saturacin salina es
ligeramente inferior a la mxima, como indica el
diagrama de fases de la Figura 1 (para ms
informacin, vanse los procesos de nucleacin y
crecimiento de cristales en la introduccin de este
manual). Por contraste, la formacin de ncleos
decrece conforme aumenta el pH del tampn, dando
como resultado menos cristales cuanto ms alto es el
pH.

Desarrollo del Experimento Segn el

Mtodo Batch
Para un experimento tipo batch hay que pipetar, de
manera similar al mtodo hanging drop, una gota
de la solucin de cristalizacin junto con una gota de
solucin proteica en una lmina. En este caso, sin
embargo, la composicin de la solucin de
cristalizacin ha sido optimizada de tal manera que
la
cristalizacin
de
la
protena
ocurre
inmediatamente.
Despus de unos 20 minutos, se pueden apreciar con
el microscopio los primeros cristales, que en el
transcurso de pocos minutos irn creciendo con
rapidez. De este modo, se pueden obtener cristales
de lisozima ms rpido que con el mtodo de gota
colgante.

Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 80 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100
Page 4 of 7

www.jenabioscience.com

Last update: December 04, 2012

Manual
JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de
Protenas
Desarrollo del Experimento:
1. Pipetar la solucin precipitante: pipetar 4 l de la
solucin de cristalizacin en la lmina del
microscopio.
2. Pipetar la solucin proteica: pipetar 2 l de
solucin proteica sobre la gota de buffer.
Observe la gota en el microscopio. Se pueden variar
las proporciones de buffer y protena, lo que afectar
la velocidad de crecimiento de los cristales y el
nmero total de cristales formados.

Agradecimientos
Damos gracias a Dr. Manfred Weiss como autor de
la idea original y por su asistencia en la organizacin
de este kit. Gran parte de este manual est basado en
las instrucciones para experimentos proporcionadas
por Dr. Weiss.

Derechos de Autor
Todas las figuras incluidas en este manual son
propiedad registrada de Dr. Manfred S. Weiss.
Todos los derechos de las ilustraciones pertenecen a
su autor.
Se prohibe la reproduccin total o parcial de este
manual sin la autorizacin expresa y por escrito de
Jena Bioscience GmbH.

Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 80 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100
Page 5 of 7

www.jenabioscience.com

Last update: December 04, 2012

Manual
JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de Protenas

250 mM Acetato de Sodio

20 % NaCl
Concentracin
final

4%

50 mM
pH 4,0

5%

6%

7%

8%

9%

200 l
600 l
200l

250 l
550 l
200l

300 l
500 l
200l

350 l
450 l
200l

400 l
400 l
200l

450 l
350 l
200l

50 mM
pH 4,4

200 l
600 l
200l

250 l
550 l
200l

300 l
500 l
200l

350 l
450 l
200l

400 l
400 l
200l

450 l
350 l
200l

50 mM
pH 4,8

200 l
600 l
200l

250 l
550 l
200l

300 l
500 l
200l

350 l
450 l
200l

400 l
400 l
200l

450 l
350 l
200l

50 mM
pH 5,2

200 l
600 l
200l

250 l
550 l
200l

300 l
500 l
200l

350 l
450 l
200l

400 l
400 l
200l

450 l
350 l
200l

20 % de NaCl
250 mM de Acetato de Sodio
Agua Destilada

Fig. 4: Esquema para pipetar segn el mtodo de gota colgante

Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 80 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100
Page 6 of 7

www.jenabioscience.com

Last update: December 04, 2012

Manual
JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de Protenas

Fig. 5: Aspecto del experimento segn el mtodo de goteo despus de 20 horas (ampliacin de 40x)

Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 80 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100
Page 7 of 7

www.jenabioscience.com

Last update: December 04, 2012