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GUA DE PROBLEMAS

QUMICA BIOLGICA
Departamento de Qumica Biolgica Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales - UBA Pabelln II
4to Piso
http://www.qb.fcen.uba.ar

CARRERA

Q
Qumica

2013

B
Biologa

INDICE:
CLULA ............................................................................................................................. ........................2
ESPECTROFOTOMETRA Y CURVAS DE CALIBRACIN............................................................5
PROBLEMA DE ADN: ESPECTROSCOPA Y GELES DE AGAROSA ...........................................8
CINETICA ENZIMATICA .................................................................................................................... .10
PURIFICACIN ENZIMTICA .......................................................................................................... .13
FILTRACIN MOLECULAR .............................................................................................................. .17
INTERCAMBIO INICO...................................................................................................................... .22
ELECTROFORESIS................................................................................................................................24
INTERACCIONES MACROMOLECULA LIGANDOS..................................................................28
Mtodos experimentales para determinaciones in-vitro ....................................................................31
PROBLEMAS INTERACCIONES MACROMOLECULA LIGANDOS .......................................32
RADIACTIVIDAD ............................................................................................................................. ........3
ANEXO: ............................................................................................................................. .........................6
ESTOS PUEDEN CONSULTARLOS EN LAS CLASES DE PROBLEMAS
CORRESPONDIENTES. ESTRUCTURA PROTEICA.....................................................................6
ESTRUCTURA PROTEICA................................................................................................................ .7
CIDOS NUCLEICOS Y BIOSNTESIS DE PROTENAS............................................................25
CICLO DE KREBS ............................................................................................................................. .27
COMPUESTOS NITROGENADOS...................................................................................................29
HORMONAS ............................................................................................................................. ...........31
PARCIAL 1.............................................................................................................................................. .37
PARCIAL 2............................................................................................................................. ..................39
RADIACTIVIDAD ............................................................................................................................. ......41
PARCIAL 3...............................................................................................................................................42
PROBLEMA INTEGRATORIO ........................................................................................................... .47

CLULA
(Nota: estos problemas son para alumnos de Qumica solamente y
para repaso del tema terico. No se resolvern en la clase de
Problemas. Consultas al Dr. Juan Carlos Calvo)
1. En eucariotas, la cicloheximida inhibe la sntesis proteica en el citoplasma y el
cloranfenicol inhibe la sntesis proteica en mitocondrias. Por el contrario, en procariotas,
la sntesis proteica es inhibida por cloranfenicol pero no por cicloheximida. Qu
sugieren estas observaciones acerca del origen de las mitocondrias?
2. El estudio bioqumico de los componentes subcelulares tales como los ribosomas,
retculo endoplsmico, microsomas, etc. se facilit enormemente en los aos 40 con la
disponibilidad de un aparato conocido como ultracentrfuga preparativa. La
ultracentrfuga preparativa permiti el fraccionamiento de partculas subcelulares a
partir de un homogeneizado de tejido centrifugando a diferentes velocidades.
Como uno de los investigadores que trabaja con disponibilidad de equipamiento
moderno, usted decide llevar a cabo experimentos utilizando una ultracentrfuga.
Obtiene un trozo fresco de hgado bovino en un matadero cercano y lo homogeneiza
usando una licuadora de su madre. Luego filtra el homogeneizado para eliminar todos
los grumos de clulas y tejido conectivo que no se rompieron.
a)
Usted toma el homogeneizado y lo somete a una centrifugacin a baja
velocidad (1000 x g durante 10 min). Guarda el sobrenadante en una
heladera y toma el precipitado que se acumul en el fondo del tubo. Usted
disuelve el precipitado en una pequea cantidad de una solucin que contiene
un detergente (Tritn X-100) y desoxicolato de sodio que disuelve las
membranas celulares. Obtiene una solucin densa y viscosa que tiene una
consistencia gelatinosa. Qu estructura subcelular estaba presente en su
precipitado?
b)
Ahora toma el sobrenadante que haba guardado previamente y lo somete a
una centrifugacin a media velocidad (15000 x g durante 5 min). Esta vez,
usted encuentra que el precipitado contiene enzimas que pueden hidrolizar
protenas eficazmente. Usando tcnicas inmunoqumicas (Western blot)
usted demuestra que el precipitado contiene una protena que es utilizada en
la sntesis de ATP. Puede haber otras cosas presentes que usted no pudo
detectar con estos dos ensayos. Suponiendo que el precipitado contiene una
mezcla de estructuras subcelulares, nombre las organelas que espera
encontrar en el mismo. Explique cmo deriv su respuesta de la informacin
provista. Puede pensar en otras formas de detectar ms organelas o probar la
existencia de aquellas que usted piensa que estn en el precipitado?
c)
En el prximo paso, usted toma el sobrenadante del paso anterior y lo somete
a una centrifugacin a alta velocidad (100000 x g durante 60 min). Separa el
precipitado y el sobrenadante en la manera habitual. Esta vez encuentra que
si agrega los factores traduccionales apropiados, usted puede detectar sntesis
proteica. Cules piensa que son los componentes de su precipitado?
d)
Cuando usted examina en detalle la protena sintetizada en el paso anterior,
encuentra que toda su protena est glicosilada. Qu organela adicional cree
que est presente en el precipitado que obtuvo en el paso anterior?
2

3. La protena de reconocimiento para acetilcolina es una protena transmembrana


mayoritaria en neuronas (clulas nerviosas). En su laboratorio usted puede seguir el
camino de la acetilcolina dentro de la clula y ver que primeramente es sintetizada,
luego modificada qumicamente, almacenada por un tiempo y, eventualmente,
transportada a la membrana plasmtica.
a)
Describa el camino que la protena receptora de acetilcolina sigue en
neuronas, mostrando qu organelas estn involucradas en cada etapa. Dnde
se sintetiza? Dnde se la modifica qumicamente? Dnde se almacena?
Cmo va de un lugar a otro? Cmo termina en la membrana plasmtica?
b)
Describa la sntesis de un lisosoma. Dnde se sintetizan sus protenas
transmembrana? Dnde se sintetizan sus protenas internas, digestivas?
Dnde son modificadas? Cmo entran al lisosoma? De dnde provienen
los fosfolpidos de la membrana lisosomal?
4. Las cilias son estructuras celulares importantes que poseen exclusivamente las clulas
eucariotas. Algunos eucariotas como el Paramecio dependen totalmente de las cilias
para moverse y para atrapar partculas de alimentos. Cuando se examina el detalle
ultraestructural, las cilias muestran poseer manojos de microtbulos organizados en una
manera ordenada.
Dentro de una clula, la longitud de los microtbulos puede ajustarse de acuerdo con la
necesidad de la clula agregando o removiendo las protenas monomricas a o de
microtbulos existentes. Su supervisor cree que los monmeros proteicos se agregan,
preferentemente, a un extremo de un microtbulo existente que llama el extremo + del
microtbulo. Para probar que esto es as, usted decide llevar a cabo un experimento.
Purifica algunos microtbulos y monmeros proteicos de una fuente apropiada. Luego
usted marca su protena con un colorante fluorescente rojo. En el prximo paso, usted
incuba sus microtbulos y la protena fluorescente purificada en condiciones que
favorecen el ensamblado de microtbulos. Luego de un perodo de incubacin, examina
los microtbulos con un microscopio fluorescente.
a)
Qu esperara observar en trminos de los nuevos monmeros proteicos
agregados a ambos extremos de los microtbulos, si la idea de su supervisor
fuese verdadera/falsa?
b)
En el experimento anterior, usted agrega GTP a su mezcla de incubacin
para conseguir un ensamblado apropiado. Puede explicar por qu?
c)
La colchicina que se utiliz como droga anticancergena se une a los
monmeros proteicos libres con alta afinidad e impide el ensamblado en
nuevos microtbulos. Aunque la colchicina no posee afinidad para con los
microtbulos ya formados, se observa que al tratar las clulas con colchicina,
todos los microtbulos dentro de la clula se desintegran. Puede pensar en
un mecanismo que explique cmo ocurre esto?
d)
Como investigador que utiliza colchicina, conoce algunos hechos bsicos: la
colchicina inhibe la formacin de microtbulos y las clulas cancerosas
crecen y se replican mucho ms rpidamente que las clulas normales. Qu
puede llevarlo a pensar que la colchicina podra curar el cncer y dejar sano
al paciente?
5. Las clulas germinales haploides de un organismo capaz de reproduccin sexual se
encuentran conteniendo 50 femtogramos de ADN por cada una (1 fg = 1 x 10-15 g). Un
3

ovocito fertilizado contiene 100 fg antes que ocurra la sntesis de ADN. Cunto ADN
espera encontrar en?:
a)
Una clula somtica en G1
b)
Una clula somtica en G2
c)
Una clula germinal en profase I de la meiosis
d)
Una clula germinal en anafase II de la meiosis
e)
Una clula germinal luego de la telofase II de la meiosis
6. Los humanos poseen 22 pares de cromosomas autosmicos y 2 cromosomas sexuales.
Calcule lo siguiente suponiendo que los miembros paternos y maternos de cada
cromosoma son distinguibles genticamente.
a)
Suponiendo que los cromosomas homlogos se segregan al azar durante la
meiosis pero que el crossing over entre pares homlogos no ocurre, cuntas
gametas genticamente nicas puede producir un individuo por meiosis?
b)
Basado en su respuesta anterior, cuntos individuos genticamente
diferentes podra una pareja concebir hipotticamente, una vez ms
considerando segregacin al azar de cromosomas homlogos?
c)
Dado el nmero en (b), explique cmo la reproduccin sexual aumenta la
diversidad gentica de una especia cuando se compara con la reproduccin
asexual.
7. A usted le entregan una suspensin de clulas creciendo en un medio nutritivo.
Existen tantas clulas por ml. Usted agrega un compuesto X al medio y puede
determinar la velocidad a la que el mismo es incorporado por las clulas. Describa,
usando diagramas y palabras, cmo determinara si X ingresa a la clula por difusin
pasiva, transporte facilitado o transporte activo. Suponga que posee todas las tcnicas
experimentales que necesita.
8. Los iones Ca2+ son eliminados eficazmente de muchas clulas vivientes, an cuando
esto involucra movilizar Ca2+ en contra de gradiente. Proponga un mecanismo para
conseguir esto.

ESPECTROFOTOMETRA Y CURVAS DE CALIBRACIN


1. Una solucin de concentracin 3 mg/L de una sustancia que absorbe a una
determinada longitud de onda, transmite el 80% de la luz incidente en una cubeta de 1
cm. Calcule la transmitancia de una sustancia que contenga: a) 5 mg/L; b) 6 mg/L; c)
calcule la absortividad molar (am) cuando el peso molecular del compuesto es 250.
2. Una solucin de protenas (0,3 mL) se diluye con 0,9 mL de agua. A 0,5 mL de la
solucin diluida se le aaden 4,5 mL del reactivo de Biuret y se deja desarrollar el color.
La absorbancia de la mezcla a 540 mm es 0,18. A una solucin estndar (0,5 mL de
solucin que contiene 4 mg de protena/mL) se aaden 4,5 mL del reactivo de Biuret y
se obtiene una absorbancia de 0,12 en cubeta del mismo tamao. Calcule la
concentracin de protenas en la solucin desconocida antes de la dilucin. Considere
que la absorbancia del blanco es despreciable con respecto a la de la muestra.
3. Para la determinacin de un cierto compuesto en orina, se toman 2 mL de orina de 24
h., se diluyen a 4 mL con agua destilada, se realiza una extraccin con ter etlico y se
evapora el extracto etreo en bao de agua. Para el testigo se pesan 500 mg de droga
slida pura, que se disuelven en 100 mL de alcohol. De esa solucin madre se toma 1
mL y se lleva a 50 mL con alcohol; de all se toma una alcuota de 0,5 mL que se
evapora en bao de agua. Sobre el residuo seco se hace la determinacin colorimtrica.
Para la reaccin colorimtrica se disuelve el residuo seco en 2,5 mL de cido actico
glacial y se agregan 2,5 mL de reactivo de color.
El blanco se hace con 2,5 mL de cido actico glacial y 2,5 mL de reactivo de color. Las
lecturas obtenidas son las siguientes:
muestra: 0,100
testigo: 0,200
blanco: 0,030
Calcule la concentracin del compuesto en la orina y la cantidad excretada en 24 h.,
sabiendo que el volumen de orina es de 950 mL.
4. Para determinar la concentracin de glucosa en sangre se extraen 5 mL de sangre, se
desproteiniza y se centrifuga, obtenindose 2 mL de suero. Para realizar la reaccin
colorimtrica se toma 0,5 mL de suero y se agregan 3,5 mL de agua. De esta solucin se
pipetean 0,5 mL; se completa a 1 mL con agua destilada y se agrega 1 mL de la solucin
de Somogyi.
Se calienta a bao Mara durante 15 minutos, se enfra, se aade 1 mL de solucin de
Nelson y se completa a 5 mL con agua destilada. Se lee una absorbancia de 0,25 y de
0,02 para el blanco. Se traza la curva de calibracin correspondiente empleando una
solucin testigo de 2 moles/mL (PM glucosa=181).
Tubos
1
Glucosa (mL)
0,025
0,975
H2O
Somogyi
1
15 100 C
Enfriar a temperatura ambiente
Nelson
1
2
H2O destilada
Absorbancia
0,08

2
0,050
0,950
1

3
0,075
0,925
1

4
0,100
0,900
1

5
0,150
0,850
1

Blanco
--1
1

1
2
0,14

1
2
0,21

1
2
0,27

1
2
0,40

1
2
0,02
5

a) Cul es la concentracin de glucosa en sangre expresada en mg/mL?


b) Si en una muestra de sangre tratada de la misma forma que la anterior se lee una
absorbancia de 0,80, cmo hara para determinar su concentracin? (La Ley de Beer se
cumple en el rango de concentraciones entre 0 y 0,30 moles/mL).
5. El cido pirvico puede determinarse colorimtricamente por conversin de su 2,4dinitrofenilhidrazona seguida de la adicin de lcali. Con el fin de calibrar un
colormetro, la reaccin se llev a cabo en soluciones que contenan diversas cantidades
de cido pirvico, obtenindose los siguientes resultados:
g cido
pirvico/3 mL
lectura

20

40

60

80

100

125

150

175

0,130

0,257

0,390

0,515

0,628

0,750

0,855

0,940

Se analizaron por ste mtodo una serie de soluciones desconocidas de cido pirvico y
una solucin patrn de 50 g/3 mL. Las lecturas fueron: a) 0,280; b) 0,555; c) 0,690; y
d) 0,910 y para la solucin patrn 0,325. Calcule la concentracin de las soluciones
utilizando la curva de calibracin y calcule el error que comete en cada caso si se
emplea el patrn de 50 g/3 mL en lugar de usar curva. Considere que la absorbancia
del blanco es despreciable con respecto a la de las muestras.
6. Se saponifican 10 g de manteca y el insaponificable se extrae con 25 mL de
cloroformo. La solucin clorofrmica diluida al medio da una absorbancia de 0,550 a
328 nm, diluda al tercio una absorbancia de 0,140 a 458 nm. Calcule el caroteno y la
vitamina A contenido en la manteca.
% en cloroformo
328 nm 458 nm
Caroteno
340
2200
Vitamina A
1550
0
7. Supngase que a 1,5 mL de una solucin 2x10-4 M de NADPH se aaden 1,5 mL de
una solucin que contiene una concentracin desconocida de glutatin oxidado (GS-SG)
que previamente haba sido diluda al medio, y una cierta cantidad de la enzima
glutatin-reductasa. La absorbancia final de la solucin medida a 340 nm es 0,250.
Calcular la concentracin de GS-SG en la solucin original.
La reaccin catalizada por la glutatin reductasa es:
GS - SG + NADPH+H+

2GSH + NADP+

y se produce prcticamente transformacin total. M NADPH=6,22x 103


8. El valor normal del colesterol en suero es de 200 mg/100 cm3. Planifique la curva de
calibracin (disponiendo de colesterol puro) para cubrir el rango de 80-400 mg/100 cm3,
de forma tal que con la tcnica descripta a continuacin se obtenga directamente el valor
de colesterol en suero.

Mtodo: En un tubo de centrfuga se ponen 10 mL de una mezcla de alcohol-ter, se


aaden 0,2 mL de suero, se tapa el tubo y se agita vigorosamente. Se centrifuga, el
sobrenadante se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en 5 mL de cloroformo. Se
hace un blanco con 5 mL de cloroformo. A cada tubo se le aaden 2 mL de anhdrido
actico y 0,1 mL de cido sulfrico concentrado. Se lee la absorbancia a 411 nm a los 10
minutos.
9. Planificar la curva de calibracin para un compuesto X, cubriendo un rango de 5 a 30
mg/100mL de suero de manera tal que con la siguiente tcnica se obtenga el valor de X
en suero:
2 mL de suero se diluyen con 4 mL de agua y se agregan 0,5 mL de un reductor, se agita
y extrae el producto X reducido obtenido con 5 mL de ter etlico (la reduccin de X y
posterior extraccin son completas). Se toman 2 mL de extracto, se evapora a sequedad
y se toma con 3 mL de buffer pH 5. Se aaden 1,2 mL del reactivo de color y se lee la
absorbancia a 390 nm. Para realizar la curva de calibracin dispone de una solucin
madre del compuesto X reducido de 10 mg/mL de Buffer pH 5.
10. La cantidad normal excretada en orina de un compuesto P es de 2 9 mg cada 24 hs.
En ciertas patologas la excreta puede sobrepasar los 100 mg/24 hs. no excediendo
nunca los 200 mg/24 hs. Para cuantificar P se toman 0,2 mL de orina, se diluyen a 1 mL
con agua destilada, se agregan 0,5 mL del reactivo A y 0,5 mL del reactivo B, ambos
disueltos en H2SO4 1N y se deja reaccionar 10 min, se aaden 5 ml de cloruro de
metileno, se agita y centrifuga a 2800 rpm durante 10 min. Se toman 3 mL de la fase
inferior y se lee la absorbancia a 540 nm. Paralelamente se realizan las mismas
operaciones utilizando un patrn, del cual se dispone en forma slida y se solubiliza con
agua destilada.
a) Construir la curva de calibracin para la determinacin de P tal que pueda
obtenerse directamente mg P/100 mL de orina para los casos de excretas
normales, donde se cumple la Ley de Beer. Los volmenes de orina
normalmente excretados en 24 hs. caen en el rango de 900-1600 mL Qu
concentracin tiene la solucin patrn que prepara?
b) Indique como procedera para obtener el valor en un paciente con elevada
excreta, si el volumen de orina fue de 1200 mL.

PROBLEMA DE ADN: ESPECTROSCOPA Y GELES DE


AGAROSA
Se realiz un protocolo tpico de mini-prep para extraer ADN pasmdico a partir de un
cultivo bacteriano. El mtodo consiste en romper las clulas de dicho cultivo mediante
un choque alcalino de modo que slo permee selectivamente su ADN plasmdico.
Para ello se sigui el siguiente protocolo:
1-Se centrifugan 1,6 mL de cultivo de E.coli 5 a 4C y 5000 RPM.
Se descarta el sobrenadante.
2- Al pellet bacteriano se lo resuspende en 100 uL de solucin I. Se deja incubar
15.
3- Se le agrega 200 uL de solucin II se mezcla bien y se deja incubar en hielo
5.
4- Se agrega 150 uL de solucin III. Se agita hasta aparicin de un flculo
blancuzco, se coloca en hielo y se deja 30.
5- Se centrifuga 15 a 10000 RPM 4C.
6- En otro Eppendorf rotulado se coloca 1 mL de EtOH absoluto en frio.
7- El sobrenadante de la centrifugacin se mezcla con el alcohol y se deja 2.
8- Se lleva a centrifugar 15 a 10000 RPM 4C.
9- Se descarta el sobrenadante, y se lava el pellet con alcohol 70%.
10- Se deja secar a T. Amb. Se resuspende con 50 uL de agua destilada estril
10 bis- Se deja secar a T. Amb. Se resuspende con 50 uL de agua destilada
estril con agregado de RNAsa. Se incub a 37C por 30 min.
11- Se agrega 14,4 ul de NaCl 2,5 M + 45 ul de PEG800 al 15 % (en agua
destilada) + 5,6 ul de agua destilada estril
12- Incubar en hielo durante 20 min.
13- Centrifugar 15 min a 4C y 12000-14000 RPM.
14- Lavar con etanol al 70% y secar durante 15 min. Resuspender en 50 uL de
agua destilada estril.
Soluciones
Solucion I: 25mM TrisHCl pH:8 + 10mM EDTA pH:8
Solucion II: SDS 1 % + NaOH 0,1 M (450 ul de solucin de SDS 10% +
450 ul de solucin de NaOH 1 M + 3600 ul de agua destilada).
Solucion III: acetato de Potasio pH: 4,8-5,2
Para verificar los resultados y la necesidad o no de realizar los ltimos pasos se trabajo
por cuadriplicado y las diferencias en el procedimiento fueron las siguientes:
Muestras 1 y 2: se termin en el paso 10. En el caso de la muestra 1 se us un cultivo
del doble de volumen.
Muestra 3: se termin en el paso 10 bis
Muestra 4: se realiz el paso 10 bis y se continu hasta el paso 14
Se realiz luego un gel de agarosa con las distintas muestras (figura) y se midi la
absorbancia a 260 y a 280 nm en las soluciones (tabla).

Figura: gel de agarosa revelado con bromuro de etidio al final de la corrida. Las
muestras se sembraron en forma consecutiva en el gel
Tabla
Muestra
1
2
3
4

Abs
(260 nm)
0,238
0,179
0,042
0,035

Abs
(280 nm)
0,146
0,110
0,032
0,017

Discutir los resultados obtenidos, para ello calcular el cociente de A260/280 para todas las
muestras, comparar los resultados del gel y espectroscpicos de a pares: muestras 1 y 2; los
resultados de las muestras 2y 3 y los de las muestras 3 y 4 (en qu difieren?, a qu pueden
deberse las diferencias observadas?)

CINETICA ENZIMATICA
1. Dada una reaccin enzimtica, dibujar las siguientes curvas:
P = f (t)
v = f (E)

v = f (S)

2. Los siguientes datos, obtenidos en condiciones ptimas de pH y temperatura corresponden a


la reaccin:
E
S

S (M)

v (mol/min)

-5

50 x 10

32,5

40 x 10-5

32,5

25 x 10-5

31,5

-5

2,5 x 10

21,0

-5

1 x 10

13,5
-5

0,25 x 10

5,0

a) Estimar los valores de Km y Vmx por observacin de datos.


b) Calcularlos matemticamente.
c) Extraerlos del grfico.
d) Calcular cuntos moles de producto se formarn al cabo de 3 min en los siguientes
casos:
S = 4,5 x 10-4M

S = 1,5 x 10-5 M

e) Si se hubiese usado una cantidad de la misma preparacin enzimtica 4 veces ms


concentrada, qu valores esperara ud para Km, Vmx, el n de unidades enzimticas y la
actividad especfica, respecto a las condiciones iniciales?
3. Sea un extracto enzimtico que contiene una enzima E que cataliza la transformacin:
E
A

R
Se sabe que los valores de sus constantes cinticas son Km = 10-3 M y Vmx = 0,25
moles/30 min, para una concentracin de protenas de 0,10 mg/ml.
1)
Cuntos moles de R se formarn en 15 min?
a)
Si [A] = 10-1 M y [prot] = 0,2 mg/ml
b)
Si [A] = 3 x 10-1 M y [prot] = 0,1 mg/ml
Considerando que se provee constantemente sustrato al medio, cul ser la v de la reaccin
en los siguientes casos?
c)
[A] = 10-3 M y [prot] = 0,3 mg/ml.
d)
[A] = 10-5 M y [prot] = 0,4 mg/ml.
2)
Grafique P = f (t) para los casos a), b), c) y d) en un mismo grfico.
4. La fosfatasa alcalina es una enzima que hidroliza grupos fosfatos de diversos sustratos en
medio alcalino. Puede determinarse utilizando un sustrato artificial como el p-nitrofenil
10
10

fosfato (PNFP), produciendo fosfato inorgnico y p-nitrofenol (PNF), que puede detectarse
espectrofotomtricamente a 405 nm.
PNFP

PNF + Pi

Fosfatasa alcalina, pH 10
Para estudiar los parmetros cinticos de la enzima de un extracto de placenta, se realizaron
las mezclas de reaccin en la cubeta del espectrofotmetro y se hicieron lecturas a distintos
tiempos.

Tubo

1
2
3

PNFP
25 mM
(ml)
0,1
0,2
0,5

H2O
(ml)
0,9
0,8
0,5

Buffer
Carbonato
pH 10 (ml)
3
3
3

Extracto
(ml)
1
1
1

A 405 nm
0
0,02
0,04
0,08

5
0,07
0,12
0,20

10
0,12
0,20
0,33

15
0,17
0,26
0,39

Mediante una curva de calibracin realizada con PNF se obtuvo un factor f = 2,5
moles/unidad de absorbancia, en las mismas condiciones de ensayo.
a) Realizar los grficos convenientes y obtener Km y Vmx.
b) Si el extracto posea 2 mg/ml de protena, cul era la actividad especfica?
c) Si se hubiese hecho una dilucin 1:2 del extracto, qu valor de Km, Vmax y AE se
hubiera obtenido?
5. La velocidad de la reaccin catalizada por una enzima con un Km de 2,4 x 10-4 M se midi
a las siguientes concentraciones de sustrato:
i) 2 x 10-7 M
ii) 6,3 x 10-5 M
iii) 10-4 M
iv) 2 x 10-3 M
v) 0,05 M
La velocidad observada cuando la [S] es 0,05 M fue de 128 mmoles/litro x min.
a) Especificar para cada concentracin de sustrato el orden de reaccin y estimar la
velocidad inicial en cada caso.
b) Cul ser la velocidad observada a [S] = 0,05 M cuando se agrega al sistema el triple
de la concentracin de protenas?
c) Si esta enzima tiene un Km para otro sustrato de 2,4 x 10-5 M, qu concentraciones
de sustrato utilizara para realizar el estudio de velocidades iniciales?
6. Se conoce que el Km de una determinada enzima Michaeliana en diferentes tejidos
animales es de alrededor de 2 mM. Ud quiere determinar el Km de la misma enzima en otro
tejido, nunca analizado y dispone del homogeneizado y reactivos del sistema de incubacin y
cuantificacin del producto formado.
i) Describa en detalle como procede en el laboratorio para determinar la [E] y los rangos
de tiempos utilizados para determinar los parmetros cinticos.

11
11

ii) Arme el protocolo de trabajo indicando las [S] empleadas y las finales alcanzadas,
suponiendo que el volumen de incubacin final es de 1 ml, el volumen de E es 0,2 ml, el
volumen de S es 0,5 ml y el resto se completa con buffer.
iii) Cmo verifica que las [S] ensayadas fueron las correctas?
iv) Si no tiene idea previa del orden del Km, qu determinaciones tendra que efectuar
antes de comenzar los ensayos?
7. Para reacciones enzimticas que obedecen a la ecuacin de Michaelis-Menten, enumerar los
distintos tipos de inhibicin, indicando en cada uno de ellos:
a) Formas enzimticas a las que se unen sustrato S e inhibidor I
b) Grficos de inversas correspondientes
c) Qu ocurre con los parmetros cinticos Km y Vm?
d) Cmo determina Ki? Describa brevemente.

12
12

PURIFICACIN ENZIMTICA
1. a) Con preparaciones crudas de enzimas suele haber considerable formacin de producto sin
que se haya agregado sustrato (Blancos muy altos). Cmo subsanara esta dificultad?
Justificar.
a1) Usando una solucin de enzima ms concentrada.
a2) Usando una solucin de enzima ms diluida.
a3) Midiendo a tiempos ms cortos.
a4) Midiendo a tiempos ms largos.
b) Por qu la extraccin de la enzima debe ser un proceso rpido y debe controlarse
estrictamente la temperatura?
2. a) A qu atribuira un rendimiento mayor que el 100% despus de un paso de
purificacin?
b) Con qu objeto define unidad enzimtica? Cmo se expresa?
c) Una vez que se ha purificado, aislado y caracterizado una enzima, puede afirmarse
que el mecanismo hallado es fiel reflejo de su mecanismo fisiolgico in vivo?
3. Un extracto crudo, libre de clulas, de Neurospora crassa contiene 36 mg de protena/mL.
20 L del extracto catalizan una reaccin a una velocidad de 0,15 moles/min. en condiciones
ptimas del ensayo. 100mL del extracto fueron fraccionados por precipitacin con (NH4)2SO4.
La fraccin que precipita entre 25% y 45% de saturacin fue redisuelta en 10 mL. Esta
solucin contiene 50 mg de protena/mL. 20 L de esta fraccin purificada catalizan la
reaccin a una velocidad de 0,8 moles/min.
a) Calcular el % de recuperacin de la enzima en la fraccin purificada.
b) Calcular el grado de purificacin obtenido.
c) Analizar si el fraccionamiento salino es satisfactorio.
4. Se quiere purificar una enzima de la saliva para luego determinar sus parmetros cinticos.
Se probaron dos esquemas de purificacin y se obtuvieron los siguientes resultados:

a)

Saliva

Dilisis durante 48 hs.


b)
Precipitacin con
(NH4 )2SO4 al 45%
de saturacin
c) ppdo.

sobrenad.

a)

Saliva

Precipitacin con
(NH4)2SO4 al 45%
de saturacin
b) ppdo.

sobrenad.

Pasaje x Sephadex G100


c) Vo de la columna

Pasaje x Sephadex G100


d) Vo de la columna

13
13

Esquema A:
Fraccin
a)
b)
c)
d)

Vol. total
20 ml
20 ml
5 ml
2 ml

(prot.) mg/mL
5
5
6,5
4

unidades/0,5 mL
0,125
8,75
20
45

Fraccin
a)
b)
c)

Vol. total
20 ml
5 ml
2 ml

(prot.) mg/mL
5
6,5
4

unidades/0,25 mL
0,063
0,1
22

Esquema B:

Construya ambas tablas de purificacin y, en base a los resultados, decida qu esquema


utilizara, explicando qu ocurre en cada paso de cada uno de los esquemas de purificacin
propuestos. Justifique todas sus respuestas.
5. Se homogeneizaron 5 g. de hgado de rata con 50 mL de sacarosa 0,25 M. Un pequeo
volumen del homogeneizado se separ para determinar actividad enzimtica. Por
centrifugacin diferencial del homogeneizado se prepararon las fracciones subcelulares y
despus de la purificacin se ajust el volumen de cada fraccin a un valor dado.
Se determin en contenido de protenas en cada una de las fracciones. La actividad de la
enzima glucosa 6-fosfatasa (Glu6P- Glu +Pl) se determin incubando un volumen medido de
la fraccin con glucosa 6-P 10mM y buffer en un volumen final de 5 mL a 37C. A intervalos
de tiempo de 5 minutos se retiraron muestras de 0,5 mL y se determin la cantidad de fsforo
inorgnico presente en estas muestras por un mtodo colorimtrico.
Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

Volumen total (mL)


Protena (mg/mL)
Volumen usado
para el ensayo (mL)
Fosforo
presente
(g)

0 min.
5 min.
10 min.
15 min.
20 min.

Homogeneiz
ado
50
24

Ncleos

0,5

0,5

1
24
47
71
92

1
7,5
13,5
21,0
28,0

10
35

Mitocondrias Microsomas Fraccin


Soluble
10
5
75
49
31
2,2
0,5
2,5
21
40
56
78

0,05
0
18
30
46
64

1,0
2
3
3,5
4,5
4,5

Qu conclusiones puede extraer de estos resultados con respecto a la localizacin de esta


enzima en hgado de rata? Justificar la respuesta mediante el cuadro de purificacin
correspondiente.
La actividad enzimtica se expresa como: mol P liberado
Peso atmico del P = 32
mL. min.
6. Se ha comprobado que un extracto libre de clulas (homogeneizado) de pncreas posee
actividad enzimtica sobre dos sustratos A y B. Se ignora sin embargo, si esa actividad
enzimtica reside en una o varias protenas y cules son sus caractersticas. Con el objeto de
dilucidar esta cuestin se someti al homogeneizado a una serie de pasos de purificacin. Las
14
14

fracciones resultantes de cada una de ellos fueron utilizadas para determinar la actividad
enzimtica con ambos sustratos. Los procedimientos utilizados y los resultados obtenidos se
exponen en la tabla.
1. Homogeneizado
2. Calentamiento del homogeneizado a 50C, 10 minutos.
3. Sobrenadante (2) se pasa por columna DEAE-celulosa, obtenindose una sola fraccin
activa.
4. La fraccin activa se pas por una Sephadex G-50 (rango: 70.000-5.000), obtenindose
dos picos proteicos: Vo y P.
5. La fraccin Vo se pasa por una columna Sephadex G-100 (150.000-5.000), obtenindose
un pico proteico con actividad enzimtica que no coincide con el Vo.
Nro. fraccin
1
2
3
4: Vo
4: P
4: Vo+eluidos<5000
4: P+eluidos<5000
5

Volumen
(mL)
1500
1200
150
50
10
60
20
10

Protenas
(mg)
12000
6000
375
290
85
290
85
40

Actividad
Sustrato A
5,36
5,7
34,2
84,0
0,0
68,3
0,0
323,9

enzimtica(U/mL)
Sustrato B
6,30
7,58
48,8
27,0
0,0
22,5
267,0
106,9

Analizar los resultados obtenidos y extraer toda la informacin que pueda deducir de ellos.
Calcular el rendimiento y el grado de purificacin.
7. Se realiza la purificacin de una enzima por los siguientes pasos:
1) Precipitacin por sulfato de amonio 0-30 %.
2) El sobrenadante es reprecipitado hasta 50 % de saturacin.
3) El precipitado 30-50 % es cromatografiado en una columna de DEAE-celulosa
4) La fraccin activa del paso anterior es cromatografiado en una columna de heparina Sepharosa (afinidad).
La medicin de actividad enzimtica en las distintas fracciones se realiza utilizando 0,2 mL de
cada una de las fracciones, agregando los sustratos y el buffer hasta un volumen final de 2 mL
e incubndose a 37C durante 30 minutos. (Estudios preliminares demostraron que, en las
condiciones de ensayo utilizadas, la velocidad de la reaccin se mantena constante durante
ms de 30 minutos).
Finalizadas las incubaciones, se determina el producto formado sobre 0,1 mL de cada uno de
los incubados llevando a un volumen final de 2 mL con los reactivos de la reaccin
colorimtrica. Se forma un producto coloreado cuya absorbancia se determina a 450 nm. La
determinacin de protenas se realiza sobre 50 L de cada fraccin. Se define 1 unidad
enzimtica (UE) como la cantidad de enzima que forma 1 pmol de producto por minuto. Con
estos datos complete el cuadro de purificacin y comente la eficiencia de cada paso.

15
15

Fraccin

Vol. nmoles UE en vol UE/mL


Total medidos
de
(mL)
incubacin
Homogeneizado 94
0,25
Sobrenadante
de (NH4)2SO4
30-50%
Precipitado
30-50%
Eluido DEAE
Eluido
HeparinaSepharosa

90

UE
Prot.
Prot. AE R% Gr.P
Totales (mg/mL) Totales
(mg)
0,94

325
1,4

2,64
9800

1987
0,21

11

1766

14,9 8,03
1,3

8. Sea una enzima E presente en hgado de rata, capaz de catalizar la conversin A


P.
Nuestro objetivo es extraerla y purificarla. A continuacin se resumen los resultados obtenidos
al aplicar los siguientes tratamientos:
1) Extracto crudo: se resuspende el tejido en buffer de extraccin y se homogeneiza en
licuadora.
2) Sobrenadante de 5000 g, 10 minutos
3) Precipitado de 15.000 g, 20 minutos, se resuspende en buffer y se sonica.
4) Calentamiento a 55C durante 5 minutos
5) Pasaje por DEAE-celulosa equilibrada a pH 7,0. La protena queda retenida en la
columna y eluye en un pico de actividad bien definido al aplicar un gradiente de fuerza
inica.
Fraccin
1
2
3
4
5

UE Totales
8400
8200
7700
6400
5800

mg protenas totales Volumen (mL)


200
120
175
115
55
25
44
24
8
10

Datos: se define unidad enzimtica como la cantidad de enzima capaz de catalizar la


formacin de un mol de producto por hora en las condiciones estndar de incubacin.
El sistema de incubacin para la determinacin de actividad consta de 0,1 mL de buffer, 0,1
mL de sustrato, extracto enzimtico y agua hasta un volumen final de 1 mL. Se incuba 1 hora
en condiciones estndar de incubacin. Con el sistema descrito se pueden cuantificar entre 5 y
40 moles de P por tubo.
a) Completar el cuadro de purificacin calculando grado de purificacin y rendimiento.
b) Armar el protocolo para la medicin de actividad de todas las fracciones. Especificar
claramente los volmenes a utilizar.
c) Suprimira alguna etapa del esquema de purificacin? Justifique brevemente.
d) Qu propiedades de la protena puede inferir con estos resultados? Justifique
brevemente.
e) Si al cromatografiar E por tamices moleculares, eluye con un Kav = 0 por Sephadex G75 y con Kav = 0,4 por Sephadex G-100, acotar el PM de la protena. (Sephadex G-75
resuelve entre 3000-70000 y Sephadex G-100 entre 4000-150000).

16
16

FILTRACIN MOLECULAR
1. Se siembra una muestra que contiene KCl, tres oligopptidos de PM: 1500, 3000 y 6000 y
dos protenas de 5000, en una columna de Sephadex G-25, obtenindose el siguiente grfico
de elucin.
A (280nm)
(
)

(Cl-) (

Ve (mL)
a) Indicar los componentes de cada pico.
b) Con esta columna, se podran aislar los tres oligopptidos? Si su respuesta fue
negativa, indique entonces cmo podra lograrlo.
c) Podra usar este Sephadex para desalar totalmente la muestra? Cmo lo lograra?
2. Se dispone de Sephadex G-25, G-50, G-75 y G-100. Se desea separar los componentes de
una muestra que contiene tres protenas de PM 15.000, 30.000 y 70.000 y dos oligopptidos de
2.000 y 3.000.
Qu gel o conjunto de geles utilizara (el mnimo posible)? Dibujar los perfiles de elucin
Sephadex
G-10
G-25
G-50
G-75
G-100
G-200

Rango fraccin
0-700
1000-5000
1500-30000
3000-70000
4000-150000
5000-250000

3. Se tiene una mezcla de protenas cuya composicin se desconoce. Con el objeto de conocer
el nmero de protenas que la componen y el rango en cual se encuentran sus pesos
moleculares, se ensayan las siguientes operaciones:

G-25
G-75
G-200

Picos proteicos
3
4
5

Rango de separacin
1000-5000
3000-70000
5000-250000

En esta ltima columna ningn pico proteico eluye con Ve=Vo.


Determinar el nmero mnimo de protenas que a su juicio contiene la muestra y en base a esto
justificar los resultados obtenidos en cada una de las columnas. Estimar el peso molecular o
rango dentro del cual se encuentra cada una de las protenas de la muestra.

17
17

4. Se tiene un extracto proteico el cual presenta actividad enzimtica para dos sustratos: A y B.
Por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida se determina la presencia de 2 protenas
en el extracto, estimndose sus pesos moleculares en 40.000 y 100.000.
Para lograr la separacin se emplea una columna de Sephadex de 30 cm de alto y 2 cm de
dimetro, emplendose 6,5 g. de Sephadex G-100 (WR: 10mL/g gel seco).
Una muestra de blue dextrano (PM: 2 x 106) es eludo a 25 mL. A partir de una calibracin se
determin que las protenas de PM 40.000 tienen un Kav de 0,29 y la de 100.000 un Kav de
0,18.
- a) Calcular el volumen mximo de extractos que se pueden sembrar en esta columna y los
volmenes de elucin de ambas protenas.
- b) Al ensayar la actividad enzimtica para sustratos A y B en cada una de las protenas
aisladas se obtuvieron los siguientes resultados:
PM 100.000: activa con A pero no con B
PM 40.000: inactiva para ambos sustratos
Dar una explicacin congruente con estos resultados y de que forma se comprobara.
5. La villina es una protena de PM = 95.000. Estudios de inmunomicroscopa sugieren que
est involucrada en el citoesqueleto celular. Para estudiar esto se us villina purificada,
incubndola con actina, importante componente del citoesqueleto, en diferentes condiciones.
- I) Villina
- II) Villina + actina
- III) Villina + actina + Ca2+
Se corrieron las fracciones incubadas en Bio Gel P-100 (rango: 5000-100000)

A (280nm)
(
)

Vo

Ve1

Vo Ve1

Ve2

Vo

Ve1

Ve2Ve (mL)

Anticuerpo anti-villina
a) Justificar los resultados obtenidos.
b) Qu rango de PM puede indicarse para la actina?
6. Se sabe que la conversin de A a B est catalizada por 2 enzimas presentes en un extracto.
Con el fin de caracterizar estas enzimas, el extracto se pasa por columnas Sephadex G-75 y G100. Midindose la actividad en las distintas fracciones colectadas, se observa un nico pico
de Kav = 0 en la G-75 y 2 picos con Kav = 0 y Kav = 0,1 en G-100.
Por la misma columna de Sephadex G-100 se hacen pasar 3 soluciones con protenas de PM
conocido con el fin de calibrarla, obtenindose los datos de la tabla.

Protena
Citocromo C
Peroxidasa
BSA

PM
12.400
40.000
66.000

Kav
0,543
0,289
0,177
18
18

Fosforilasa b

97.000

Rango de fraccionamiento:
Sephadex G-75
Sephadex G-100

0,095

3.000-70.000
4.000-150.000

- a) Hacer el grfico de los perfiles de elucin obtenidos luego de pasar el extracto por la
columna de G-75 y G-100, indicando el Vo de la columna.
- b) Calcular el PM de las 2 protenas.
- c) Qu consideraciones deben hacerse para asumir que el PM de la protena sea igual al
calculado?.
7. Se obtiene una mezcla de protena y polisacridos y se los analiza por cromatografa en
tamiz molecular, detectndose por absorbancia a 280 nm y antrona sulfrico (exclusivo para
azcares).
Se usaron diferentes combinaciones de geles:
1.500-20.000

20.000-200.000

5.000- 500.000

A (280 nm)
(
)

Vo
Vt Vo
Antrona sulfrico

Vt

Vo

Vt

Indicar y justificar cuntos pptidos y polisacridos hay como mnimo, dando rangos de PM.
8. Se tiene una solucin de una protena pura, con actividad de fosforilasa, cuyo peso
molecular es 240.000. Con el objeto de estudiar la estructura de dicha protena se realizaron
experimentos con columnas de filtracin molecular. Para ello alcuotas de la solucin de
protenas fueron sometidas a distintos tratamientos y sembradas y eludas de distintas
columnas. Los resultados se describen a continuacin:
a) condiciones nativas. Sephadex G-150

19
19

A (280nm)
(
)

Vo

Ve (mL)

b) Dos alcuotas se tratan con urea 7M. Una de ellas se siembra en una columna de Sephadex
G-100 y otra en una de Sephadex G-80. Ambas se eluyen con urea 7M.
A (280nm)
(
)

A (280nm)
(
)

Vo

Vt

Ve (mL)

Vo

Sephadex G-100

Ve (mL)

Sephadex G-80

c) cuatro alcuotas se tratan con beta-mercaptoetanol. Cada una de ellas se siembra en una de
las columnas indicadas y se eluyen con la misma solucin de beta- mercaptoetanol.

G-150

G-100

+
+
+

G-70

G-50

A(280nm)
( )

Vo

Vt

Vo

+

Vt Vo

Vt

Vo

Ve (mL)

Proponga una hiptesis sobre la estructura y actividad enzimtica de la protena en cuestin


que sea congruente con los resultados obtenidos.

20
20

Datos: Las flechas en los grficos indican


los volmenes de elucin del azul
dextrano y del cloruro de cobalto. El signo
(+) indica que el pico proteico presenta
actividad enzimtica, el signo (-) indica
ausencia de actividad enzimtica.

Rangos de separacin:
Sephadex G-150: 200.000-5.000
Sephadex G-100: 150.000-5.000
Sephadex G-80: 100.000-5.000
Sephadex G-70:
50.000-5.000
Sephadex G-50:
30.000-5.000

9. Se tiene un extracto enzimtico a pH 7,5 que contiene 3 protenas A, B, y C, sales y


sacarosa, sabiendo que:
A
B
C
Sacarosa

PM = 37.000 pI = 3,2
PM = 90.000 pI = 3,2
PM = 160.000 pI = 5,5
PM = 340

Disponiendo de:
Sephadex G-10
Sephadex G-75

rango 0 - 700
rango 3000-70000

Resina aninica: DEAE-celulosa


Resina catinica: CM-celulosa
Ambas resinas estn equilibradas con un buffer a pH 7,5
- a) Indique que tamiz molecular usara para separar las protenas del resto de los
componentes.
- b) Si quisiera separar cada uno de los componentes proteicos, describa que operaciones
realizara y bajo qu condiciones. Justifique y dibuje los diagramas de elucin.
- c) Podra determinar los Vo de las columnas de Sephadex G-10 y G- 75 sin utilizar Bluedextrano? Cmo hara?
- d) Cul es la utilidad de desalar una protena? Justifique.

21
21

INTERCAMBIO INICO
1. Una mezcla de 4 protenas se intent separar por intercambio inico en DEAE-Celulosa. En
el panel A se us un gradiente de NaCl de 0,1 a 1,5 M y en el caso B de 0,1 a 0,8 M.
- a) Cul de los dos gradientes usara para separar la mezcla proteica? Justificar.
- b) Podra aumentar la resolucin de separacin entre las 4 protenas empleando un gradiente
an ms suave que el usado en el panel B?
- c) Cmo procedera si quisiera obtener en forma pura slo la protena ms bsica?

A(280nm)
( )

(NaCl)
(---)

Ve (mL)

Ve (mL)

2. Al pasar una mezcla proteica por una columna de intercambio inico de CMC se obtiene el
siguiente perfil cuando se aplica un gradiente de pH creciente. El pico A eluye con el buffer de
siembra cuyo pH es 6.
a) Puede afirmar que cada pico corresponde a un solo componente de mezcla? Por qu?
b) Cul de los tres eludos: B, C o D corresponde a la protena ms cida?
b) Qu hubiera ocurrido si la columna se hubiera equilibrado y sembrado con el buffer pH 8?

A(280nm) ( )

pH (--)
-9

A
B

-8
-7
-6

Ve (mL)

3. Para purificar la enzima piruvato quinasa del hongo Mucor rouxii se parti de micelio del
hongo, homogeneizndolo en un mortero con N2 lquido, en presencia de arena.
Luego de realizar 2 centrifugaciones para eliminar los restos celulares y la arena se realiz un
corte con (NH4)2SO4 30-70%. Se sabe que el paso ms conveniente para continuar la
purificacin es un pasaje por DEAE-celulosa.
a) Cmo procedera si tuviera el precipitado de 70% de (NH4)2SO4 resuspendido en buffer?
Luego de realizar la DEAE se obtiene el siguiente perfil:

22
22

A(280nm) (

(KCl) (---)
-0,2 M
A

-0,08 M

Ve (mL)
(

) Actividad de piruvato quinasa

Por cromatografa de tamiz molecular se obtendra un slo pico con actividad y electroforesis
en condiciones desnaturalizantes, se vio que los picos A y B daban una sola banda del mismo
peso molecular.
b) Qu puede decir acerca de los pIs de las especies de los picos A y B?
4. Se tiene una muestra compuesta por diversas protenas. Se analiza por cromatografa de
intercambio inico. Indicar cuntas protenas hay como mnimo, dando el orden de pIs.
Justificar.
A(280 nm) ( )

(KCl) (--)
-0,2M

-0,2M

-0,1M

-0,1M

20 mL
150 mL
DEAE-celulosa, pH 8,0

A(280 nm) (

20 mL
150 mL
CM-celulosa, pH 6,0

(KCl) (--)
-0,2M

-0,1M

20 mL
DEAE-celulosa, pH 8,0

300 mL Ve (mL)

23
23

ELECTROFORESIS
1. Se tiene una mezcla de cuatro protenas de distinto peso molecular disueltas en un buffer de
pH 8,3:
A) 65.000
B) 63.000
C) 38.000
D) 19.000
Si se siembra esta mezcla de protenas en una columna de intercambio aninico, a pH 8,3, el
orden en que son eludas las protenas con un buffer de fuerza inica creciente es el siguiente:
1 B
2 A
3 C
4 D
Cmo esperara que corrieran estas protenas en un gel de poliacrilamida al 7,5 %? Dibuje las
bandas y justifique.
2. Una mezcla de tres protenas disueltas en un buffer al cual se sabe que las 3 estn cargadas
negativamente se siembran en una columna de Sephadex G-100. El perfil de Absorbancia a
280 nm en funcin del Ve es el siguiente:

A (280nm)
(
)

Ve (mL)
Posteriormente se hace una corrida electrofortica en geles de poliacrilamida de tres
muestras distintas (I, II y III) y se obtienen las siguientes bandas:
I) la mezcla de protenas
II) la fraccin (1) eluda de la columna de Sephadex
III) la fraccin (2) eluda de la columna de Sephadex

(+)

SIEMBRA

X
Y
Z
(-)
mezcla

(+)

SIEMBRA

(+)

SIEMBRA

X
Y
Z
(-)
fraccin 1

(-)
fraccin 2

Comente sobre las propiedades con respecto a carga y peso molecular de las protenas X, Y y
Z. Justifique.
3. Se realizan las curvas de calibracin para determinar pesos moleculares en electroforesis en
geles de poliacrilamida en buffer de pH 8. Se utilizan para ello 3 protenas estndar cuyos

24
24

pesos moleculares son A: 200.000, B: 150.000 y C: 100.000. Se obtuvieron los resultados del
grfico.
log Rf
a) Identificar cada recta con el
estndar correspondiente y estimar
el peso molecular de la protena X
X
(lnea punteada).
b) Ordenar A, B, C y X segn sus pI.
%T
4. La tabla muestra la distancia de corrida de un grupo de protenas de peso molecular
conocido en SDS-PAGE al 10%. En el mismo gel, se corri una enzima purificada, aspartato
aminotranferasa (AAT), de PM desconocido. Disee un grfico apropiado y determine el PM
de AAT.
Protena
Peso Molecular
Distancia (mm)
tranferrina
78.000
13
albmina de suero bovino
66.000
21
ovalbmina
45.000
35
anhidrasa carbnica
30.000
56
tripsingeno
24.000
64
mioglobina
17.800
80
citocomo c
12.400
95
aspartato aminotransferasa (AAT)
?
42
5. Con el objeto de estudiar la sntesis de la catepsina D, se marcaron hepatocitos en cultivo
con Met35S por 15 minutos (pulso. Luego de este tiempo se lavaron las clulas, se agreg
exceso de Met fra y se analiz el procesamiento de las protenas marcadas a lo largo del
tiempo (chase). Para ello, se lisaron las clulas y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo
especfico. Se realiz autorradiografa o revelado por actividad.
Activ. Autor.
Activ. Autor.
Activ. Autor.
Geles nativos
(-)
(-)
(-)
15%

Chase 0 min.

Chase 15 min.

PM*103
Autorradiografa de
geles desnaturalizantes
(SDS, -mercaptoetanol)

Chase 90 min.
PM*103

50 _

50_

30 _

30_

20 _

20_

15 _

15_

Chase 15 min.
Chase 90 min.
Justificar los perfiles electroforticos observados y proponer un modelo para la biosntesis de
la catepsina D.
6. Una enzima purificada hasta homogeneidad se someti a electroforesis en distintas
condiciones y dio los resultados que se muestran en la figura 1. Por otro lado, se corrieron
25
25

alcuotas del preparado en una columna de Sephadex G-100 (5000-150000) con los
tratamientos indicados en la figura 2.
Figura 1: en cada caso se muestra la tincin de protenas y de actividad.
Prot.

Activ.

Prot.

(-)

Activ.

Prot.

(-)

(+)

(-)

(+)
PAGE nativo 7,5%
pH 8,9

Activ.

(+)
PAGE-SDS 7,5%

PAGE-SDS 7,5%
con -mercaptoetanol

Figura 2:
A(280nm)

A(280nm)

5,5

Ve (mL)

6,5

i) Buffer Tris pH: 7,4

7,5

8,3 Ve (mL)

ii) Buffer Tris pH: 7,4 + urea 4M


Actividad
(- - - - - )

A(280nm)

7,5

8,3

Ve (mL)

iii) Buffer Tris pH 7,4 + urea 4M + -mercaptoetanol


a) Justificar los resultados obtenidos en cada figura.
b) Proponer una estructura posible para la enzima.
c) Si se obtuvieran los siguientes resultados, explique a qu podra deberse.

(-)
A(280nm)
(
)

(+)

Actividad
(
)

PAGE nativo
7,5% pH:8

Buffer Tris 100mM pH: 7,4


Sephadex G-100

7. La unin de la insulina a su receptor de membrana estimula la actividad quinasa


del receptor, lo que hace que se fosforile una protena llamada IRS-1 (insulin receptor
substrate). Proponer experimentos electroforticos para mostrar:
a) Fosforilacin del IRS-1 en respuesta al tratamiento con
insulina. b) que se fosforila en mltiples sitios.
c) que IRS-1 se fosforila en Tyr y no en Ser o Thr.
* Si desean profundizar en el tema, consultar paper de Myers et al. (1994), TIBS 19, 289293.

27

INTERACCIONES MACROMOLECULA LIGANDOS

Muchas funciones biolgicas involucran la interaccin de pequeas molculas (metabolitos,


reguladores, cationes, etc.) con superficies especficas de macromolculas como las protenas o la
interaccin entre dos o ms macromolculas. Esta interaccin implica la formacin de enlaces no
covalentes entre la molcula o in que consideraremos el ligando con una regin especfica de la
macromolcula que consideraremos el receptor. Ejemplos importantes en los sistemas biolgicos
involucran la interaccin entre protena-ADN, protena-ARN, protena- ATP (o GTP), protena-metal,
protena-cofactor, antgeno-anticuerpo, hormona-receptor, protena-protena, protena-gas,
protena-inhibidor, etc.
La unin de un ligando a una protena puede ser en algunos casos tan fuerte que parezca irreversible,
pero si no se forman enlaces covalentes, lo podemos considerar como cualquier proceso de
equilibrio.

Dados un receptor, R y un ligando, L en equilibrio:


Kd: constante de equilibrio de disociacin = 1/Ka
Ka: constante de equilibrio de asociacin
[LR]: concentracin del complejo.
[R]: concentracin de protena o receptor libre
[L]: concentracin de ligando libre

1- En el caso de un receptor con un solo sitio de unin para el ligando

R+ L LR

Kd

RL
LR

Balances de masa:
Para el ligando: [LT]= [L] + [LR]
Para el receptor: [RT]= [R] + [LR]

Reordenando puede calcularse [LR] en funcin del ligando total y del receptor total:

LR 0,5LT RT K d LT RT K d 2 4 LT RT
28

Si se tiene el mtodo adecuado para medir la concentracin de complejo formada, se puede realizar
una titulacin, agregando concentraciones crecientes de ligando a una concentracin de receptor fija
o viceversa. Graficando [LR] en funcin de [LT], ajustando la ecuacin anterior se puede determinar
Kd.

Otra forma de hacerlo es definiendo:


: moles de ligando unido por mol de receptor o fraccin de receptor complejado (nmero promedio
de sitios ocupados)

[ L] / K d
[ LR ]
[ LR ]

[ RT ] [ R ] [ LR ] 1 [ L] / K d

[ L]
K d [ L]

En este caso se grafica en funcin de la concentracin de ligando libre, [L] y se calcula Kd.
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0

Kd

[L]

Notar que en este caso a diferencia del anterior es necesario conocer la concentracin de ligando libre
y no alcanza con conocer la concentracin total.

2- En el caso de un receptor con mltiples sitios de unin para el ligando (n)

R+ n L LnR

Kd n

[ L ]n [ R ]
[ Ln R]

En forma anloga al caso anterior se puede definir el parmetro (moles de ligando unido por mol de
receptor total)

i.[ L R] i.[ L R]

[R ]
[ R] i.[ L R]
n

29

2-i Si los sitios de unin son idnticos e independientes (no existe cooperatividad):

Kd1= Kd2= Kd3= Kdn=Kd

Entonces

n.[ L]
K d [ L]

Graficando de en funcin de la concentracin de ligando libre, [L] y ajustando la ecuacin anterior


se calculan n y Kd .

n/2

Kd

[L]

Para linealizar el grfico anterior se puede

i-

hacer un grfico doble recproco y graficar 1/ en funcin de 1/[ [L]

1 1 Kd

n n

.
[ L]

ii-

un grfico de Scatchard y graficar /[L] en funcin de :

30


[ L] K d

1

Kd

. n.K a K a .

2-ii- Los sitios de unin no son equivalentes


En el caso de que los sitios no sean equivalentes se observan desviaciones con los tratamientos
anteriores

-1

-1
[L] -1

[L]

/[L]

1) sitios equivalentes e independientes


2) cooperatividad positiva
3) cooperatividad negativa

En el caso de sitios equivalentes a partir de

n.[ L]
puede re-escribirse
K d [ L]

31



log
en funcin de log [L] es una recta de
log[ L] log K d . Si se grafica log
n
n
pendiente 1.
Si los sitios no son equivalentes este grfico permite visualizar mejor las desviaciones:
pendiente >1, para algn valor de [L]: cooperatividad positiva
pendiente <1, para algn valor de [L]: cooperatividad negativa

Mtodos experimentales para determinaciones in-vitro


A- Mtodos que permiten separar el complejo del ligando libre.
Ejemplos de ello son filtracin por tamiz molecular, geles nativos con distintas tcnicas de
revelado o cuantificacin (fluorescencia, radioactividad, actividad, Western-Blots, etc)
centrifugacin o ultrafiltracin, sedimentacin, etc.
Estos mtodos permiten usar cualquiera de los tratamientos planteados anteriormente para
calcular Kd y n.
B- Mtodos en los que se mide un cambio en una propiedad de la protena o el ligando al
formarse el complejo.
Ejemplos de esto son los mtodos espectroscpicos como absorcin UV-visible, fluorescencia,
dicrosmo circular, etc.
Estos mtodos en general no permiten calcular fcilmente la cantidad de ligando libre en una
titulacin con lo cual son tiles para calcular en forma sencilla constantes de equilibrio para los
complejos 1:1 y la estequiometra de los complejos formados para los casos de receptores con
mltiples sitios de unin.
Para esto ltimo se debe cuantificar el cambio en una propiedad de la protena o el ligando al
formarse el complejo (X) en funcin de [LT]/[RT] trabajando en condiciones saturantes
(Kd/[RT]1) y de la interseccin de las dos rectas cuando se produce el cambio de pendiente se
obtiene n.

Xnormalizada

1,0

0,8
Kd/RT=0,1
Kd/RT=1
Kd/RT=3
Kd/RT=5

0,6

0,4

0,2

0,0

n
[LT]/[RT]

32

PROBLEMAS INTERACCIONES MACROMOLECULA LIGANDOS

Problema 1- La afinidad de la mioglobina por oxgeno varia entre distintas especies. En la siguiente
figura se muestra curvas de saturacin en funcin de la presin de oxigeno para mioglobina de
caballo, goldfish y trucha. Cul de las tres especies presenta mayor afinidad por oxgeno?
Determinar grficamente las constantes de afinidad.

Pedersen C L et al. J Exp Biol 2010;213:2755-2762

Problema 2. Para disear compuestos que compitan con la interaccin protena-ADN de una protena
viral encargada de la replicacin del virus se disearon compuestos 2 peptdicos (pptidos 1 y pptido
2) que contienen el sitio de unin a ADN y se ensayo la afinidad de los mismos con un oligonucletido
de doble cadena que corresponde al sitio de unin en el genoma viral. En la siguiente figura se
ilustran los resultados obtenidos.

1,2

Fraccin complejada

1,0
0,8
0,6

peptido1
peptido salvaje
peptido 2

0,4
0,2
0,0
0

10

20

30

40

50

[peptido]total/[ADN]total

Decidir que pptido diseado podra usar para prevenir la infeccin viral. Justificar.

Problema 3. Para determinar si el tripptido del hipotlamo l-prolil-1-leucil-1-glicinamida (PLG)


aumenta la afinidad de distintos receptores de dopamina por su agonista propilnorapomorfina (NPA).
Para ello se empleo [3H] NPA. Las figuras muestran las curvas de saturacin y los grficos de
Scatchard para dos subtipos de receptores, D2S (arriba) y D2L (abajo), en ausencia (control) y en
presencia de de PLG.

33

JPET 315:12281236, 2005

Discutir los resultados. Qu efectos tienen el PLG en la afinidad de NPA por los receptores?
Afecta el nmero de sitios de unin?

Problema 4. La Isocitrato deshidrogenasa mitocondrial (IDH2) consume NADP+ en lugar de


NAD+ para oxidar isocitrato . Para determinar el nmero de sitios de unin de NADP+ de la
IDH2 (Mr= 90 kDa), se aprovecho que la fluorescencia del NADP+ aumenta al pasar de un
entorno polar a uno menos polar, siguiendo entonces el aumento de la fluorescencia del
NADP+ al estar unido a la enzima. A continuacin se muestran los datos obtenidos al titular
13,5 mg/L de enzima con cantidades crecientes de NADP+:

NADP+/ M

0,07 0,14 0,21 0,28 0,35 0,50 0,75

Aumento de intensidad de fluorescencia 2,3

4,7

7,0

9,3

9,9

10,0 10,0

34

Determinar la estequiometra del complejo formado entre NADP+ y la enzima. Indicar si


realiz alguna aproximacin.

Problema 5. La protena hE2 del papilomavirus humano cumple funciones de replicacin y


regulacin transcripcional del virus, el dominio C-terminal es el dominio de unin a ADN (hE2c)
y posee 4 posiciones de unin en el genoma viral. Para determinar la estequiometra de unin
con uno de los sitios de unin del genoma se realiz un experimento de desplazamiento de
movilidad electrofortica en gel (gel shift assay). Se emple un oligonucletido de doble
cadena de 18 pares de base que contiene el sitio consenso de unin marcado con fluorescena
(concentracin 1 M) y se le agregaron cantidades crecientes de protena hE2c recombinante.
Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente figura:

Biochemistry 2000, 39, 14692-14701

Explicar los resultados observados en el gel, a qu corresponden las bandas observadas?


Cul es la estequiometra de unin observada?
Cmo determinara la constante de afinidad correspondiente al complejo 1:1? Qu
consideracin necesita hacer con respecto al segundo equilibrio?

Problema 6. La enzima fosfohidrolasa necesita unir Manganeso para ser activa. Empleando
una tcnica adecuada se determino la cantidad de Manganeso unido en funcin del
Manganeso total usando una concentracin 100 M de enzima:

[Mn2+] total /M

110 190 290 500 750

[Mn2+] unido /M

75

125 175 250 300

35

Determinar el nmero de sitios de unin a Mn2+ y la constante de afinidad.

Problema 7. Al igual que la mioglobina, la hemoglobina une oxgeno. La siguiente figura


presenta un grfico de saturacin para ambas protenas


en
n

Discutir las diferencias observadas. Cmo esperara que sea un grfico de log
funcin de log [L] en cada caso?

Problema 8. El TNP-ATP es un anlogo fluorescente de ATP, muy usado para caracterizar la


interaccin de protenas que unen ATP. Su fluorescencia depende del entorno, aumentando al
pasar de un entorno polar a uno no polar.

Se quiere estudiar si mutaciones puntuales en una protena que funciona como ATP-asa
modifica sus propiedades de unin a ATP. Se cuenta con la ATP-asa salvaje (wt ) y dos variantes
con una mutacin puntual en un aminocido cada una (MUT1 y MUT2).
Para ello se realiza en primera instancia un experimento en el que se titula la ATP-asa salvaje
(wt) con concentraciones crecientes de TNP-ATP siguiendo los cambios de fluorescencia. En la
siguiente figura se muestran los resultados obtenidos comparndolos con los resultados
obtenidos empleando ATP radiactivo () en lugar de TNP-ATP () (el grfico de la derecha es
una ampliacin del de la izquierda).

36

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
0

20

40

60

80 100 120 140 160 180 200

[ligando] (M)

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
0

10

[ligando libre] (M)

a- Realizar un grfico de Scatchard (/[L] en funcin de ) para los resultados mostrados en la


figura.
b- Indicar qu parmetros que caracterizan la interaccin protena-ATP pueden obtenerse qu
valores toman?Es el TNP-ATP un buen anlogo de ATP para caracterizar la interaccin?
(justificar brevemente)
c- Graficar en el mismo grfico de Scatchard realizado en (a) los resultados que se obtendran, el
caso de la mutante puntual (MUT1), si la mutacin introducida disminuye a la mitad el nmero
de sitios para ATP sin modificar la afinidad de los mismos (el experimento se realiz empleando
TNP-ATP).
d- Al medirse la interaccin de la otra mutante (MUT2), el grfico de en funcin de ligando libre
presenta una forma sigmodea. Qu puede concluir acerca de esta modificacin puntual en la
protena?
Problema 9. En la siguiente figura se muestran los grficos de Scatchard para 4 protenas (A, B, C, D) que
unen magnesio. Todos los experimentos estn hechos a la misma concentracin de protena.

27
27

grficos de Scatchard
7.0
6.5

1
2
3
4

6.0
5.5

-1

/[L] (M )

5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0

Se sabe que B tiene el doble de sitios para Mg++, pero igual afinidad que D, se sabe adems que A es la
que tiene mayor afinidad que todas por el ligando.
a- Asignar cada una de las curvas a los distintos receptores.
b- Cuntos sitios para magnesio tiene cada una de las protenas? Cul es la constante de
afinidad para cada una de las protenas
c- Esquematice en un mismo grfico las curvas en funcin de ligando libre para las 4 protenas.
d- En el mismo grfico realizado en (c) agregue una curva para una protena con 4 sitios y
cooperatividad positiva para la unin de Mg++.

28
28

RADIACTIVIDAD
1. Se disuelve una muestra de 10 mg de bicarbonato de sodio 14C en 10 ml de agua destilada.
Una alcuota de 0,1 ml se seca sobre una plancheta de 2 cm de dimetro. Se coloca la
plancheta en un contador Geiger-Muller y se mide la radiactividad: 7.125 cuentas en 5
minutos. Una plancheta que se usa como blanco contada durante 50 minutos di 1.250
cuentas.
a) Cul es la lectura de fondo del aparato (background)?
b) Cul es la radiactividad total de la muestra y cul su actividad especfica?
2. Una alcuota de 0,5 ml de un estndar de 14C cuya radiactividad es de 10 Ci/ml se diluye a
100 ml. Una alcuota de 0,1 ml de esta solucin se seca sobre una plancheta de 2 cm de
dimetro y se cuenta en el instrumento usado en el problema anterior durante 5 minutos. Se
obtienen 5.675 cuentas. Cul es la eficiencia del contador?

3. Usando la informacin obtenida en los problemas 1 y 2, calcule la actividad especfica del


bicarbonato de sodio14C en trminos de a) dpm/mg, b) Ci/g, c) mCi/mol.
4. El 45Ca tiene un perodo de semidesintegracin (T) de 163 das. Calcular:
a) La constante de desintegracin () en das-1 y seg-1.
b) El porcentaje de la radiactividad inicial que queda en la muestra despus de 90 das.
5. Cuntos moles y cunta radiactividad (en cpm) hay en 100 l de una solucin de 32PdCTP 0,25 mCi/0,025 ml (actividad especfica 3.000 Ci/mmol)?
6. Describir la preparacin de 75 ml de una solucin 10 mM de clorhidrato de L-cistena 35S
en la que el aminocido tiene una actividad especfica de 3,92x104 dpm/mol. Suponer que se
dispone de clorhidrato de cistena slido no marcado (121,15 g/mol) y una solucin madre de
L-cistena35S: 14 mCi/mmol y 1,2 mCi/ml.

7. Para valorar la cantidad de glicina presente en un hidrolizado de protenas se tomaron 152,6


mg de ste y se mezclaron con 6 mg de glicina 14C con una actividad especfica de 120
dpm/mg. Despus de aislar parte de la glicina y purificarla totalmente, se encontr que su
actividad especfica era de 59 dpm/mg. Determinar la proporcin de glicina que haba en el
hidrolizado inicial.
8. Se aaden 20 mg de glucgeno marcado con 14C (6,7x104 cpm/mg) a una solucin que
contiene una cantidad desconocida de glucgeno sin marcar. Se asla de la mezcla una
pequea cantidad de glucgeno y se precipita con etanol hasta lograr una actividad especfica
(2,8x104 cpm/mg). Calcular la cantidad de glucgeno no marcado que haba en la solucin.

2
9

9. Se trat una mezcla de cido esterico con diazometano 14C (actividad especfica
1,93x105 cpm/mol) para esterificar todos los cidos presentes. A la mezcla se agregaron
luego 2 nmoles de estearato de metilo. Una vez homogeneizado, se aisl, mediante un
procedimiento adecuado, una pequea cantidad de estearato de metilo en el cual se contaron
4,87x103 cpm/mol. Calcular la cantidad de cido esterico en la mezcla.

10. Exactamente 1,7 mg de una enzima purificada (PM 55.000) se incubaron con un exceso de
iodoacetamida-14C (actividad especfica 2 Ci/mmol). Luego se precipit la protena
carboximetilada y se lav hasta dejarla libre de iodoacetamida sin reaccionar; se disolvi en
una cantidad de buffer y la muestra ntegra se cont en un contador de centelleo con una
eficiencia del 80%. En una hora la muestra di 13.190 cuentas (corregidas por el blanco).
Calcule el nmero de grupos SH reactivos por la molcula de protena.
11. Se incubaron 2,4x105 cpm de corticosterona-3H con adrenales de rata durante 1 hora.
Finalizada la incubacin se extrajeron los esteroides y se agregaron 40.000 dpm de
aldosterona-14C. Se analizaron separaciones y purificaciones de la aldosterona biosintetizada y
se obtuvieron las medidas de radiactividad que se detallan:
Extracto de incubacin
1 purificacin
2 purificacin
3 purificacin

H
2.400.000
180.000
54.480
40.225

14

C
40.000
32.000
24.000
17.720

H/14C

a) Calcular la relacin 3H/14C para cada etapa.


b) Cul es el criterio de pureza adoptado para la aldosterona aislada?
c) Calcular el % real de aldosterona obtenida durante la incubacin.

12. El ensayo de medicin de quinasa de protenas se realiza en las siguientes condiciones


finales:
20 mM MOPS pH 7,4
10 mM Mg2Cl
3 mg/ml histona
10 mM NaF
50 M ATP
200.000 cpm ATP-- 32P
Teniendo presente que de esta mezcla de reaccin se pipetean 50 l y el volumen final de
reaccin es 100 l, se pide: calcular las cantidades a utilizar de las siguientes soluciones
madres a fin de preparar mezcla de reaccin para 30 ensayos y analizar si la masa de ATP
aportada por el radiactivo es significativa con respecto a la masa fra.
1 M MOPS pH 7,4
1 M MgCL2
100 mg/ml histona
200 mMNaF
1 mM ATP
ATP-- 32P 1,6 Ci/mmol 0,5 Ci/ml
3
0

13. Se desea estudiar la sntesis de protenas en un cultivo de hepatocitos de rata, midiendo la


incorporacin de metionina-35S en las protenas totales de dichas clulas. se utiliza metionina35
S de actividad especfica 100 Ci/mmol en una solucin 1 mCi/ml (estos valores se
determinaron 28 das antes del experimento). Perodo de semidesintegracin 35S T: 87,7 das.
Experimento: se suspenden las clulas en 5 ml de un medio que contiene todos los
aminocidos en una concentracin 0,1 mM y se le agregan 5 l de metionina-35S. Se incuba la
suspensin a 37C durante 90 minutos. Transcurrido ese tiempo, se toman dos alcuotas de 1
ml cada una. En una de ellas se determina la cantidad de protenas por el mtodo de Lowry, lo
que da 5 mg. En la otra se determina la radiactividad incorporada: 1 ml del medio + BSA
como carrier y 1 ml de TCA 10%. Se filtra a travs de papel Whatman GF-A y se lava el
precipitado para eliminar toda absorcin inespecfica de metionina-35S. Se obtienen 60.000
cpm (eficiencia 30%).
a) Calcular los moles de metionina-35S incorporada por hora por mg de protena (las
unidades que crea convenientes).
b) Se saba de experiencias anteriores que 3,5 mg de protena contienen 1 mol de
metionina. Calcular la masa de protena que se ha sintetizado en 1 hora en los 5 ml de
cultivo.

3
1

ANEXO:
LOS SIGUIENTES PROBLEMAS/PREGUNTAS CORRESPONDEN A
LA PARTE TERICA Y SON UNA GUA PARA QUE REPASEN.
EN LAS CLASES CORRESPONDIENTES, CADA PROFESOR
DESARROLLAR LOS PROBLEMAS TIPO QUE SERN TOMADOS
EN LOS PARCIALES.

TAMBIN ENCONTRARN PARCIALES PRCTICOS QUE SE


TOMARON EN AOS ANTERIORES PARA QUE PRACTIQUEN.
ESTOS PUEDEN CONSULTARLOS EN LAS CLASES DE PROBLEMAS
CORRESPONDIENTES.

3
2

ESTRUCTURA PROTEICA
1. Indique el patrn de corte de los siguientes polipptidos con los agentes indicados
a)
b)
c)
d)

Ser-Ala-Phe-Lys-Pro
Leu-Arg-Ile-Phe-Trp-Met-Arg-Glu
Trp-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Glu-Ser
Arg-Leu-Tyr-Glu-Asp-Glu-Thr-Asp

por tripsina
por bromuro de ciangeno
por quimiotripsina
por proteasa Asp-N

2. Se desea averiguar la secuencia de un determinado polipptido. Para ello se realiza una


hidrlisis cida parcial. Luego los oligopptidos obtenidos a partir de la misma son separados
y analizada su composicin aminoacdica. La composicin del polipptido entero es (Ala2,
Asp, Cys, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser2, Trp2). El tratamiento con carboxipeptidasa A da como
resultado Leu.
Se obtuvieron los oligopptidos con la siguiente composicin:
(Ala, Lys) ; (Ala, Lys, Trp) ; (Ala, Pro) ; (Ala, Pro, Ser) ; (Ser2, Trp) ; (Ala, Ser2) ; (Ala, Trp) ;
(Asp, Lys, Phe) ; (Phe, Asp) ; (Cys, Leu) ; (Cys, Leu, Pro) ; (Phe, Ser, Trp) : (Ser, Trp).
Nota: La carboxipeptidasa A libera el aminocido ubicado en el exptremo COOH. Excepto Arg, Lys o Pro.

3. Usted posee un pptido que es un potente inhibidor de la conduccin nerviosa y desea


obtener la estructura primaria. El anlisis de aminocidos revela la siguiente composicin:
Ala(5), Lys, Phe. La reaccin del pptido intacto con FDNB, libera DNP-alanina, luego de
hidrlisis cida y -DNP-lisina (pero no -DNP-lisina) tambin se encuentra. La digestin con
tripsina deja un tripptido (Lys, Ala(2)) y un tetrapptido (Ala(3),Phe). La digestin con
quimotripsina del pptido intacto libera un hexapptido y alanina libre. Escriba la secuencia
del pptido e indique los puntos de corte. Datos: la tripsina corta hacia el extremo COOH de
los aminocidos bsicos y la quimotripsina corta hacia el COOH de Phe, Trp, Tyr.
4. A partir de un hongo raro, usted ha aislado un octapptido que combate la calvicie y desea
determinar la estructura primaria del mismo. La composicin en aminocidos es Lys(2), Asp,
Tyr, Phe, Gly, Ser, Ala. La reaccin del pptido intacto con FDNB da DNP-alanina y 2 moles
de -DNP-lisina, luego de hidrlisis cida. Corte con tripsina da pptidos con una
composicin (Lys, Ala, Ser) y (Gly, Phe, Lys) ms un dipptido. La reaccin con
quimotripsina libera cido asprtico, un tetrapptido con composicin (Lys, Ser, Phe, Ala) y
un tripptido (Gly, Lys, Tyr). Escriba la secuencia del pptido e indique los puntos de corte.
Datos: la tripsina corta hacia el extremo COOH de los aminocidos bsicos y la
quimotripsina corta hacia el COOH de Phe, Trp, Tyr.
5. Indique, brevemente, qu pasos seguira para analizar por completo una protena
determinando, secuencialmente, la estructura primaria, la composicin en estructuras
secundarias y la conformacin terciaria.
6. Describa, brevemente, cmo procedera para secuenciar una protena formada por 4
subunidades idnticas.
7. Qu ventajas tiene el uso del MALDI comparado con mtodos de secuenciacin clsica.
Describa brevemente cada uno de los mtodos.

3
3

8. Qu informacin puede obtenerse a partir del dicrosmo circular?


9. Cules son los pasos a seguir para obtener la estructura de una protena utilizando?:
a) Cristalografa de rayos-X
b) RMN
10. Indique los posibles efectos de las siguientes mutaciones en la estructura de una protena:
a)
b)
c)
d)
e)

Leu
Lys
Val
Gly
Met

a
a
a
a
a

Phe
Glu
Thr
Ala
Pro

11. Dibuje los puentes de hidrgeno presentes en las siguientes estructuras secundarias:

12. Dibuje las estructuras de resonancia que justifican que el enlace peptdico es plano.
13. Por qu se dice que las hlices alfa son estructuras locales y las hojas beta no? Qu
opina de los loops?
14. Indique el tipo de interaccin presente en las siguientes estructuras, ordnelas por su
magnitud en vaco y diga de que aminocidos se trata.

15. Relacione los dominios de plegamiento con los grficos de Ramachandran, justifique la
asignacin. Nombre si puede los dominios de plegamiento

3
4

16. Para las siguientes secuencias indique si la probabilidad de formar hlices hojas o loops es
alta, media o baja. Justifique
a) EALMQRLMRAAL
b) VICYFWYF
c) AAGPGSAA
17. Sabiendo que la protena que usted esta estudiando posee un dominio de plegamiento de
tipo Manojo de 4 hlices (o 4-helix bundle), usted ha olvidado la secuencia que posee la
tercera hlice (residuos 40 a 50), indique cul de las siguientes es la ms probable de
corresponder a este segmento. Justifique
a) KEDAKAKSEEE b) LSIAAAMNILA c) INELFDLLRSG
Sabiendo que de las restantes secuencias una pertenece a una hlice transmembrana, puede
sugerir cul es? Justifique
18. Indique para cada uno de los siguientes casos que metodologa utilizar para determinar la
estructura, justifquelo en trminos de posibilidad de xito, esfuerzo, costo y garanta de xito.
a) Protena de membrana
b) Hormona protica de 25 resduos
c) Estructura cuaternaria de la hemoglobina de un pez del rtico
d) Protena nativamente desestructurada
e) Triple Mutante del sitio activo, de una protena de estructura conocida
19. Calcule el G de desplegamiento en agua (o sea para el proceso N => U) a partir de los
siguientes datos experimentales:
Protena A
Gu (kcal/mol)
0
-3
-5

[Urea] Molar
1
2
3

Protena B
Gu (kcal/mol)
-5
-11
-14

[Urea] Molar
1
2
3
3
5

a) Cul protena es ms estable en agua?


b) Qu protena es ms estable en urea 2M?
c) Qu protena es ms sensible a la desnaturalizacin por alta Temperatura?
20. En relacin con la ley del embudo responda brevemente (3 renglones)
a) Qu es un contacto nativo?
b) Cmo se interpretan los grficos tridimensionales de Energa vs. conformacin,
dnde se encuentra la entropa en el mismo?
c) Cul es la diferencia entre un embudo ideal y uno casi real?
d) Puede un embudo ideal presentar intermediario de plegamiento? y una estructura de
tipo glbulo fundido?
e) En esta teora, cmo se origina la barrera en el perfil de energa libre para el proceso
de plegado?
f) Comparando dos embudos de igual dimetro inicial, pero siendo el primero
significativamente ms profundo que el segundo, qu diferencias espera en cuanto a
la termodinmica y cintica de plegamiento?
g) De una interpretacin estructural para el caso anterior
h) Dibuje en una hoja cuadriculada un embudo ideal en dos dimensiones (cmo si fuera
un corte transversal de un embudo 3D con simetra rotacional), ahora asuma que una
cuadrado en el eje vertical equivale a un 1kcal/mol de energa, y que un cuadradito en
el eje horizontal equivale a una perdida de entropa conformacional de 1 kcal/mol a
300K. Dibuje entonces el perfil de energa libre para el proceso de plegado.
21. En base al anlisis de los valores de elija uno de los mecanismos de plegamiento
propuesto y racionalice los resultados
Nt
Mut

10
E5G
0.8

20
F15A
0.1

Y25A
0

30
A35G
1

40
P30G
-1

F45A
0.1

50
F55A
0.1

Mecanismo 1. Se forman primero las hojas 1 y 2 y en el estado de transicin se asocian con


las hojas 3 y 4, lo que luego colapsa a la estructura final.
Mecanismo 2. Se forman primero las hlices 1 y 2 x separado y en el ET se asocian. Luego la
estructura colapsa al estado final al formarse las hojas beta.
21. Sean las siguientes hlices, ordnelas de acuerdo a la magnitud de su dipolo
a) DAEEIIALAIKR
b) LILAFVMAI
c) KIKLVALVDE
22. Indique dos maneras en cmo las cristalografa de rayos-X muestra la dinmica proteica

10
10

ACLARACIONES PARA LOS PROXIMOS PROBLEMAS:


La N-glicosilacin es una de las modificaciones postraduccionales ms comunes. Ocurre
sobre las protenas que son sintetizadas en la va secretoria (en el retculo endoplsmico). Esta
modificacin puede tener consecuencias muy marcadas sobre las propiedades de las protenas.
Los oligosacridos pueden tener varios kilodalton de peso molecular y su naturaleza
hidroflica puede aumenta dramticamente la solubilidad y estabilidad de las glicoprotenas.
Los N-glicanos se clasifican en tres familias: alta manosa, complejos y mixtos.
La agregacin proteica puede medirse mediante dispersin de luz. Tpicamente se usa
radiacin de 360 nm.
23. La protena Xhil-P est glicosilada en dos sitios. Uno del los N-glicanos es de alta manosa,
mientras el otro es una azucar complejo biantenario. Para estudiar el efecto de la Nglicosilacin en la estabilidad conformacional de Xhil-P se decidi desglicosilarla mediante
tratamiento con ENDO-H (corta N-glicanos de alta manosa) con PNGase F. En paralelo se
trat la protena con un procedimiento qumico que elimina TODOS los N-glicanos. Las
muestras se analizaron por un gel de SDS PAGE:
MWM

Xhil-P

ENDO-H PNGase F Trat. Quimico

66
55
40

A continuacin se midi la estabilidad trmica de Xhil-P y de sus variantes desglicosiladas


enzimticamente siguiendo la seal de dicrosmo circular a 280 nm (reporta estructura
terciaria):
1
Xhil-P
Fraccin
nativa

ENDO-H
PNGase F

Temperatura

a) En base al primer gel, Qu puede decir de la especificidad del corte por PNGase F?
b) Cul es el efecto de los N-glicanos en la estabilidad de Xhil-P? A qu se debe la
diferencia de estabilidad entre la protena tratada con ENDO-H y la tratada con
PNGase F?

11
11

24. La protena Luc-G se encuentra modificada con un N-glicano de alta manosa. Para
estudiar el efecto de la N-glicosilacin en el comportamiento biofsico de Luc-P, la protena
fue desglicosilada con ENDO-H y se estudi desnaturalizacin trmica de ambas formas
mediante dicroismo circular en el UV cercano (reporta estructura terciaria) y lejano (reporta
estructura secundaria):
UV lejano

UV cercano

Luc-P

65C
Temperatura
UV lejano

UV cercano

Luc-P +
ENDO-H
45 C 55C
Temperatura

Para medir la tendencia a formar agregados de ambas protenas se las incub a 70C y se
midi la dispersin de luz a 360 nm a lo largo del tiempo:

1
OD 360 nm
2

Tiempo

a) En base a los experimentos de dicrosmo circular Cul fue el efecto de las


desglicosilacin en el camino de desplegamiento trmico de la protena?
b) Las curvas 1 y 2 corresponden a Luc-G y a su variante tratada con ENDO-H
Podra asignar cada curva a la protena correspondiente? En base a qu decidi su
eleccin?

12
12

25. La protena Kal2 est glicosilada por un N-glicano de alta manosa. Para estudiar el efecto
de la N-glicosilacin en la estabilidad conformacional de Kal2 se purificaron sus variantes
glicosiladas y no glicosiladas, denominadas Kal2 y Kal2-NG, respectivamente. La variante
Kal2 fue expresada en levaduras, mientras que la variante Kal2-NG en Escherichia coli (esta
bacteria no N-glicosila protenas). Para verificar el estado de glicosilacin las protenas se
analizaron por un gel de SDS PAGE luego de ser tratadas o no con ENDO-H (enzima que
cliva N-glicanos de alta manosa):
ENDO H
MWM

Kal2

+
Kal2

+
Kal2-NG Kal2-NG

55
30
15

A continuacin se midi la estabilidad trmica de Kal2 y Kal2-NG siguiendo la seal de


dicrosmo circular a 280 nm (reporta estructura terciaria) y a 220 nm (reporta estructura
secundaria):
1
Kal2 (220 y 280 nm)
Seal CD
normalizada

Kal2-NG (220)
Kal2-NG (280 nm)
0

Temperatura

a) Explique las diferencias de tamao observadas en la electroforesis.


b) Cul es el efecto de los N-glicanos en la estabilidad de Kal2?
c) Qu indica que las seales a 220 y 280 nm para Kal2 cambien en paralelo? Cual
podra ser el motivo del corrimiento observado entre 280 y 220 nm para Kal2-NG?
El grado de oligomerizacin de Kal2 y Kal2-NG fue estudiado mediante dispersin de luz
dinmica. Segn su secuencia primaria Kal2 presenta un PM de 32 kDa. El PM de las
protenas en solucin medido fue:
Kal2:
68 kDa
Kal2-NG: 32 kDa

13
13

A continuacin se determin la unin de ANS (cido anilinonaftalen sulfnico) a ambas


protenas. El ANS es un compuesto cuya fluorescencia se incrementa unas 100 veces cuando
se une a un parche hidrofbico expuesto de una protena:
Kal2-NG
Fluorescencia

Kal2
Long. onda

Para medir la tendencia a formar agregados de ambas protenas se las incub a 70C y se
midi la dispersin de luz a 360 nm a lo largo del tiempo:

1
OD 360 nm
2

Tiempo

d) Cul es el efecto de la N-glicosilacin de Kal2 sobre su estado de oligomerizacin?


Cul podra ser la causa del incremento en la unin de ANS a Kal2-NG?
e) En el experimento de agregacin a 360 nm, a cul de las protenas corresponderan
las curvas 1 y 2? Justifique.
26. Usted est tratando de expresar en E. coli el inhibidor de tripsina 2 silvestre (CT2) y una
versin mutante en la cual introdujo por mutagnesis dirigida un puente disulfuro
intracatenario (CT2-mut). La masa molecular de ambas protenas es de 8.5 kDa y se
encuentran clonadas en el vector pBAD, inducible por arabinosa. Luego de inducir dos cepas
cada uno expresando una de las protenas, cosecha las clulas, las lisa con lisozima y tritn X100 (un detergente no inico) y centrifuga el lisado, separando el sobrenedante (sn) del
precipitado (pp). Al analizar ambas fracciones mediante un gel de SDS-Page observ lo
siguiente:

14
14

1 2 3 4
Arabinosa - + + +
T T PP SN

5 6 7 8
- + + +
T T PP SN

180 kDa
100
66 kDa
29 kDa
10 kDa

T: total (SN + PP)


PP: precipitado.
SN: sobrenadante

CT2-mut

CT2

Luego de purificar las protenas de la fraccin soluble estudi su estabilidad conformacional


ante la urea, midiendo en paralelo la fluorescencia de TRP (sensible a la estructura terciaria,
lnea continua) y la seal de dicrosmo circular a 222 nm (sensible a la estructura secundaria,
lnea punteada):
CD 222 nm

Max. Fluor.
CT2
320 nm

0 mdeg

340 nm

-5 mdeg
2M

3.5 M

Max. Fluor.

[Urea]
CD 222 nm

CT2-mut
320 nm

0 mdeg

340 nm

-5 mdeg
5M

[Urea]

15
15

Preguntas:
a) Cul fue el efecto de la mutacin en la estabilidad de la protena? Explique de qu
forma la introduccin del puente disulfuro afect la estabilidad y cual podra ser su
efecto a nivel molecular.
b) Existe algn intermediario durante el desplegamiento de alguna de las protenas? En
caso afirmativo, qu caractersticas estructurales presenta?
c) A qu podra deberse la diferencia en la distribucin entre sobrenadante y precipitado
entre ambas protenas? Proponga algn mtodo que le permita recuperar a CT2 del
precipitado en forma cuantitativa y con actividad biolgica.

27. La protena HAL2 est formada por dos subunidades idnticas de 24 kDa cada una. La
superficie de contacto entre las subunidades est formada por una hlice alfa (llamada hlice
"C") que presenta la secuencia:
Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala

Por otra parte, HAL2 presenta una segunda hlice alfa (helice "B"), de la cual NO se sabe si
participa en la superficie de contacto entre las subunidades.
A continuacin se realizan las siguientes mutaciones:
Mutante 1: (llamada MUT1) sobre la hlice C que forma la superficie de contacto se cambian
dos residuos de Leu por Ala, la nueva hlice presenta la secuencia:
Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala

Mutante 2: (llamada MUT2) se cambia una Tyr de la hlice "B" por Gly
Para ver el efecto de las mutaciones sobre la estructura y estabilidad de HAL2 se realizaron
curvas de desnaturalizacin inducidas por UREA seguidas mediante las siguientes tcnicas:
a) Dispersin de luz: permite medir el tamao de las molculas en solucin
(DATO: si una protena tiene estructura cuaternaria por dispersin de luz se obtiene el
tamao del oligmeros. Los cambios de estructura terciaria no se detectan)
Tamao
48 kDa

Curvas para HAL2 y


MUT2

MUT1
24 kDa
2 2.5 M

UREA (M)

16
16

b) Dicrosmo circular en el UV cercano (estructura terciaria)


1

Fraccin
desplegada

Curvas para HAL2 y


MUT1

MUT2

0
2.5 M

3.5 M

UREA (M)

c) Dicrosmo circular en el UV lejano (estructura secundaria)

Fraccin
desplegada

Curvas para
HAL2 y MUT1
MUT2

0
2.5 M

5M

UREA (M)

Preguntas:
a) Cmo es el camino de desplegado de HAL2? Describa como es la prdida de los
diferentes niveles de estructura en base a las curvas.
b) Cul fue el efecto de las mutaciones introducidas en MUT1 sobre el camino de
desplegado? Describa como es la prdida de los diferentes niveles de estructura en
base a las curvas.
c) Qu tipo de motivo estructural mantiene a HAL2 en forma dimrica?
d) Cul fue el efecto de la mutacin introducida en MUT2 sobre el camino de
desplegado? Describa como es la prdida de los diferentes niveles de estructura en
base a las curvas.
e) Cmo es la dependencia mutua de los diversos niveles de estructura para MUT2?
(dicho de otra forma: Como depende la estructura terciaria y secundaria de la
estructura cuaternaria?)
f) Cual podra ser el motivo molecular de cambiar TYR por GLY en la estabilidad de
MUT2?

17
17

28. El gen que codifica para la protena Sma fue aislado de hgado de rata y clonado en un
vector de expresin en la bacteria Escherichia coli. Sma est formada por dos dominios: el
dominio A tiene un PM de 11 kDa y el B un PM de 15 kDa. Cada una de los dominios
presenta un triptofano en el core hidrofbico, el cual sirve para medir la estabilidad de la
protena mediante fluorescencia.
Para determinar si la protena Sma expresada en E. coli es soluble o se fue a cuerpos de
inclusin, luego de crecer las bacterias a 37 C, se rompieron mediante sonicacin y
detergente, se centrifug el material resultante y se separ el sobrenadante (SN) del
precipitado (PP). Las fracciones aisladas se analizaron por SDS-Page:
Gen de Sma
fraccin

+
total total

+
SN

+
PP

Marcadores PM
180 kDa
100 kDa

50 kDa

27 kDa
10 kDa

A continuacin se expresaron los dominios por separado y se realiz un anlisis similar:


Expresin del dominio A
Plsmido con A
fraccin

total

+
total

+
SN

+
PP

Marcadores PM
180 kDa
100 kDa

50 kDa

27 kDa
10 kDa

18
18

Expresin del dominio B


Plsmido con B
fraccin

+
total total

+
SN

+
PP

Marcadores PM
180 kDa
100 kDa

50 kDa

27 kDa
10 kDa

Luego de purificar las protenas (Sma completa, y los dominios por separado) se les midi la
estabilidad trmica siguiendo la intensidad de fluorescencia del triptofano en funcin de la
temperatura:
65C
Fluorescencia 350 nm

Sma

Fluorescencia 350 nm

28C

28C

65C

B
Fluorescencia 350 nm

Temperatura
Preguntas:
a) Explique la curva de desplegado de Sma (Porqu presenta dos transiciones?)
b) Cul es el grado de cooperacin del plegamiento de los dominios de Sma en la
protena completa? (Se ve afectada la estabilidad de un dominio por la presencia del
otro?)
c) Explique la distribucin intracelular de cada una de las protenas (SN o PP) en base a
su estabilidad trmica

19
19

29. La protena RepM cuando se une a secuencias especficas de DNA reprime la


transcripcin de las enzimas involucradas en la biosntesis de metionina. La unin al DNA es
precedida por la unin a RepM de una molcula pequea llamada S-adenosil metionina
(SAM). Si SAM no est unida a la protena, sta no se une al DNA. Segn su estructura
primaria RepM tiene una masa molecular de 32 kDa. La estructura terciaria de RepM puede
esquematizarse de la siguiente forma:
Sitio de unin a SAM

Hlice A

K
D

Superficie de unin al
ADN

K: lisina (residuo positivo)


D: cido asprtico
Los residuos de K y D marcados en la figura estn a tres aminocidos de distancia en la
secuencia de RepM.
RepM posee varios residuos de triptofano que permiten estudiar cambios conformacionales
mediante fluorescencia.
Se estudi el efecto de la urea sobre RepM mediante dicrosmo circular en el UV lejano (farUV, sigue cambios de estructura secundaria) y por fluorescencia de triptofano (sigue cambios
en la estructura terciaria, y si la hubiere, de estructura cuaternaria). Las curvas se realizaron en
ausencia y en presencia de SAM:
Sin SAM:
Fluorescencia

CD far UV

MAX
350

-5000

339
nm
4.5 M

4.5 M
[UREA]

[UREA]

20
20

Con SAM:
Fluorescencia

CD far UV

MAX

350
nm

2M

-5000
339
nm
330
nm

4.5 M

4.5 M
[UREA]

[UREA]

A continuacin se determin el tamao de la protena por cromatografa de exclusin


molecular (cuanto ms grande es una protena su volumen de elusin es menor). El tamao de
las protenas fue medido a la salida de la columna mediante un detector de dispersin de luz:

Abs 280 nm

+SAM
64.2 kDa

-SAM
32 kDa

Volumen

Finalmente se estudi el efecto del la hlice A sobre la estructura de RepM. Para ello se mut
el residuo de lisina que est marcado en la figura por un cido asprtico y se midi el efecto de
la urea en presencia de SAM:
RepM mutada en presencia de SAM:
Fluorescencia

CD far UV

MAX

350
nm

2M

-5000

339
nm
330
nm

3M
3M
[UREA]

[UREA]
21
21

PREGUNTAS:
a) En base a los experimentos dibuje un modelo que describa el camino de desplegado de
RepM en presencia y en ausencia de SAM.
b) Cul es la estructura cuaternaria de RepM cuando se encuentra unido al DNA?
c) Cul fue el efecto de la mutacin de K por D sobre la estabilidad de RepM? Cul
podra ser la causa de dicho efecto?
d) Por qu podra ser que la primera transicin (la de urea 2 M) de la protena mutada
sucede en la misma concentracin de urea que con la protena silvestre?
Nota: si bien este es un ejemplo inventado, en la realidad el comportamiento de RepM es bastante cercano.
SAM es un metabolito secundario de la metionina, la necesidad de RepM por SAM para unirse al DNA
constituye un elegante mecanismo de autorregulacin en la biosntesis de este aminocido. Medtelo por unos
segundos.

30. La protena IivA presenta un peso molecular predicho a partir de su secuencia de 12 kDa.
En su secuencia presenta un nico residuo de cistena.
Cuando se realiza un gel de SDS-page en condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR) de
IivA se observa:
Marcadores de peso
molecular

NR

50 kDa
30 kDa

15 kDa
6 kDa

La estabilidad de la protena fue medida mediante curvas de desnaturalizacin trmica. Las


mismas fueron seguidas mediante dicrosmo circular en el UV-lejano (estructura secundaria),
dicrosmo circular en el UV cercano (estructura terciaria) y por dispersin de luz (tamao
molecular, estructura cuaternaria). Los experimentos fueron hechos en condiciones
reductoras (lnea punteada) y no reductoras (lnea continua):

22
22

CD UV lejano
Fraccin
desplegada

55 C

70 C

Temperatura

55 C

70 C

Temperatura

CD UV cercano

Fraccin
desplegada

Dispersin de luz

Peso
molecular
24 kDa

12 kDa

55 C

Temperatura

23
23

Preguntas:
a) En base e los experimentos realizados describa el camino de desplegado trmico que
siguen ambas protenas. Cmo dependen los diversos niveles de estructura
(cuaternaria, terciaria y secundaria) entre s?
b) Cul es el efecto del puente disulfuro sobre la estructura y estabilidad de IivA?
c) Qu particularidades estructurales presenta el aminocido prolina?
d) Por qu la mutacin de un residuo por glicina por lo comn disminuye la estabilidad
de una protena?
e) Explique brevemente el origen del efecto hidrofbico.

24
24

CIDOS NUCLEICOS Y BIOSNTESIS DE PROTENAS


1. Una de las maneras por las cuales las protenas pueden reconocer determinadas secuencias
del DNA, sin necesidad de desarmar la doble hlice, es a travs de la formacin de puentes de
hidrgeno entre la protena y tomos de las bases heterocclicas del DNA que quedan
expuestos en los surcos mayores o menores.
Se tiene una secuencia trinucleotdica de DNA doble cadena: 5 - AGT - 3. Supongamos
que una protena interacciona con dicha secuencia a travs del surco mayor formando
puentes de H con las bases del DNA. Se pide detallar cuales seran, en trminos de donores o
aceptores, los elementos que tendra que tener la protena para formar puentes de H con dicho
trinucletido. Escribir la secuencia de donores o aceptores de la protena tomando como
referencia la direccin 5 - 3del DNA.
Se adjuntan las estructuras de las bases, indicando los puentes de H en el apareamiento de
Watson y Crick y las uniones glicosdicas para poder deducir la ubicacin de los surcos
mayores y menores. Presten atencin a como se encuentran las bases en la secuencia y
direccin indicadas.

Deoxiribosa
Deoxiribosa

Deoxiribosa

Deoxiribosa

2. Las protenas, utilizando las cadenas laterales de los aminocidos, pueden interaccionar con
el DNA a travs de la formacin de puentes de H con las bases.
a) De acuerdo a la estructura y cargas del DNA, hipotetize y justifique su hiptesis acerca
de que cadenas laterales, entre las siguientes, podrn formar, con facilidad o dificultad,
uniones puentes de H con el DNA.
cadenas laterales de aminocidos neutros
cadenas laterales de aminocidos polares (contienen un grupo hidroxilo)
cadenas laterales de aminocidos cidos (contienen un grupo carboxilo cargado
o sea una carga negativa)

25
25

cadenas laterales de aminocidos bsicos (contienen un grupo amino cargado o


sea una carga positiva)
b) Adems de las interacciones con las bases, las protenas tambin pueden formar
uniones puentes de H con la cadena fosfato-azcar del DNA.
Ofrezca una hiptesis razonable y justificada acerca de si las uniones puentes de H
otorgan estabilidad o especificidad a la unin de la protena con el DNA, segn sean
hechas con las bases o con la cadena fosfato-azcar.
3. Dibuje la horquilla de replicacin del DNA bacteriano con las cadenas parentales y las
filiales en proceso de sntesis indicando la direccionalidad de dichas cadenas. Mencionar tres
actividades enzimticas relacionadas con el proceso de replicacin del DNA, describiendo su
funcin y sealando en el dibujo su lugar de accin.
4. En que sentido y porqu vara la estabilidad de la doble hlice del DNA en los siguientes
casos:
f) aumento de pH por sobre el fisiolgico
g) aumento de la fuerza inica por sobre la fisiolgica
h) aumento de la temperatura por sobre la fisiolgica
5.
a)

Realice un esquema de un gen que codifica para una protena, indicando zonas
regulatorias, gnicas y direccionalidad de las cadenas.
b) Suponga la transcripcin del gen indicando los elementos mnimos necesarios para la
obtencin del producto e indique las hebras molde y codificante y direccionalidad del
producto obtenido.
c) Indique los elementos y eventos mnimos necesarios para que a partir del producto de
la transcripcin se obtenga una protena.
6. La aseveracin un gen codifica para una protena ha quedado demostrada de ser errnea
o al menos incompleta. Describa los mecanismos por los cuales a partir de un gen puede
obtenerse ms de una protena y en que casos puede no dar ninguna.

26
26

CICLO DE KREBS
1. Describa el efecto sobre el ciclo de Krebs (no considere a la piruvato deshidrogenasa) de:
a) aumento de NAD+
b) disminucin de ATP
c) aumento de la concentracin de isocitrato.
En cada caso indique si el ciclo se activa o inhibe, en qu puntos y qu intermediarios se vern
aumentados o disminuidos en cada caso
2. En qu paso del ciclo de Krebs se forma FADH2? Cul es la enzima involucrada?
Dnde esta localizada?
3. Mencione las enzimas que catalizan pasos irreversibles en el ciclo de Krebs. Indique
sustratos, productos y cofactores asociados.
4. Indique en qu paso del ciclo de Krebs se producen los siguientes compuestos. Mencione
segn corresponda: sustratos, productos, enzima que cataliza la reaccin y cofactores
involucrados.
a) FADH2
b) GTP
c) Citrato
d) Qu enzima cataliza la conversin de piruvato a acetil-CoA? Qu combinacin de
cofactores est involucrada? Qu relacin tiene esta reaccin con el ciclo de Krebs?
5. Las deshidrogenasas son enzimas que cumplen un papel importante en el ciclo de Krebs. a)
Mencione todas las deshidrogenasas que participan en el ciclo de Krebs, seale que reaccin
catalizan y los cofactores asociados. b) Qu compuestos energticamente importantes para la
clula se producen en dichas reacciones? c) Cul sera el rendimiento energtico que aporta
los compuestos derivados de estas reacciones a travs de la fosforilacin oxidativa partiendo
de una molcula de glucosa?
6. Verdadero o Falso
a) Como consecuencia de la oxidacin de un mol de hexosa a travs de la gliclisis se
producen 3 moles de piruvato, 4 moles de ATP y la reduccin de 2 moles de NAD+.
b) En condiciones aerbicas las plantas oxidan el piruvato a CO2 a travs del Ciclo de
Krebs.
c) El piruvato es oxidado completamente a CO2 en el citosol, al igual que la sacarosa y el
almidn.
d) Todas las enzimas que participan en la oxidacin de piruvato a CO2, se localizan en la
matriz mitocondrial.

27
27

e) La descarboxilacin oxidativa de piruvato no forma parte del Ciclo de Krebs, pero


ocurre dentro de la mitocondria.
f)

El CO2 que se libera en la reaccin que cataliza el complejo enzimtico piruvato


descarboxilasa corresponde al carbono del grupo carboxilo de la molcula de piruvato.

g) En la descarboxilacin oxidativa de isocitrato en 2-oxoglutarato catalizada por la


isocitrato deshidrogenasa, se requiere de Mg2+o Mn2+.
h) El succinato es deshidrogenado a fumarato por la succinato deshidrogenasa, enzima
que est fuertemente unida a la membrana mitocondrial externa.
i)

Como resultado de la oxidacin mitocondrial de un mol de piruvato por el complejo


piruvato deshidrogenasa y Ciclo de Krebs, se liberan 3 moles de CO2 y se forman 2
moles de ATP y 3 moles de NADH.

j)

Es posible regular la actividad del Ciclo de Krebs, a travs de la regulacin de la


actividad de las enzimas que catalizan reacciones reversibles.

k) Los complejos enzimticos Piruvato deshidrogenasa e Isocitrato deshidrogenasa,


presentan mecanismos de reaccin similares y presentan inhibicin alostrica por
niveles elevados de NADH.

28
28

COMPUESTOS NITROGENADOS
1. La desnitrificacin que ocurre en microorganismos del suelo, puede ser estudiada a travs
de la determinacin de oxido nitroso para evitar tener que determinar Nitrgeno gaseoso
componente presente en alta concentracin en la atmosfera.
La adicin de acetileno (H-CC-H) permite esta determinacin cuando a una muestra de suelo
se le agrega junto con nitrato. Cul es el efecto del acetileno?
NO3 NO2N2O N2

2. Marque la o las respuesta correcta. Por qu la vida media de muchas protenas es corta?
a) El nitrgeno no se almacena en los mamferos
b) Se ingieren cantidades insuficientes de un aminocido en la dieta
c) Depende de la identidad del extremo amino terminal de la protena
d) Deficiencia en la ubiquitinacin
3. Escriba dos reacciones completas que involucren al glutamato en catabolismo de
aminocidos.
4. Qu paso en la sntesis de los nucletidos sirve de balance de NADPH, relacionando el
camino de las pentosas con esta sntesis? Cmo es regulado?
5. A su juicio qu evidencias del metabolismo de nitrogenados podran apoyar la hiptesis del
ARN como cido nucleico original?
6. Describa para Purinas y Pirimidinas, sustratos de partida para la sntesis de cada tomo de
los anillos Cules son las diferencias ms notables de las dos vas?

29
29

7. Por qu se dice que las protenas son cetognicas? En que condicin ocurre? Cules son
los aminocidos puramente cetognicos
8. Considera posible obtener energa celular desde los cidos nucleicos?
9. Dado que dUTP no es un componente normal del ADN, para qu sirve que la
Ribonucletido Reductasa convierta UDP a dUDP?
10. Cul es el aminocido que participa en todos los procesos que se detallan a continuacin:
Sntesis de purinas, Sntesis de pirimidinas, Ciclo de Nucletidos de Purinas, Sntesis de
protenas y Ciclo de la Urea.
11. Complete en la Tabla los casilleros vacos con la informacin sobre los pasos del ciclo de
la Urea
Localizacin
celular

Enzima

Sustratos

Productos

CARBAMILFOSFATO
SINTETASA I
MITOCONDRIA

Incorpora
NH4+ a la
Urea?

SI
ORNITINA +
CARBAMILFOSFATO
ARGININOSUCCINATO
+ AMP + Pi

ARGININOSUCCINATO
LIASA
CITOPLASMA

Hay
gasto
de
ATP?

SI

NO
UREA +
ORNITINA

30
30

HORMONAS
1. La expresin del gen de la tirosina aminotransferasa (TAT) se encuentra bajo un complejo
control hormonal. El anlisis de la secuencia que codifica para la regin promotora del gen
mostr la presencia de dos regiones que presentan elementos que unen, respectivamente, al
receptor de glucocorticoides y a la protena CREB.
Por otro lado, se sabe que el receptor de glucocorticoides es activado por ligando y puede
adems ser fosforilado en determinados residuos de tirosina y/o serina, modificndose as su
actividad transcripcional.
La Tabla siguiente muestra los ensayos realizados para establecer un modelo de transduccin
de seales que conduzca a la regulacin de la expresin de la TAT, en una lnea celular de
hepatocitos de rata.
Tratamiento
Control
Glucocorticoides
Forskolina (Activador de Adenilato ciclasa)
DiBu-cAMP
Glucocorticoides + DiBu-cAMP
EGF
Glucocorticoides + EGF
Glucocorticoides + EGF + Inhibidor general de tirosinquinasas
Glucocorticoides + Esteres de forbol
Esteres de forbol
Glucocorticoides + activadores de canales de Ca++

TAT
(tratado/control)
1
45 3
20 2
25 4
70 2
1 0,1
10 1
43 2
65 2
1 0,1
45 2

a) Explique los resultados obtenidos, mencionando los caminos de transduccin de


seales involucrados en el control de la expresin de ese gen.
b) Como afectara el grado y tipo de fosforilacin a la actividad del receptor de
glucocorticoides?
2. Se realizaron los experimentos que se detallan a continuacin utilizando un cultivo de clulas
que expresa la protena de membrana GHSR conocida como Receptor de Grelina. La Grelina es
una hormona que estimula la secrecin de hormona de crecimiento o GH.

%de Grelina radiactiva


unida

Experimento 1: Se pre-incubaron clulas con Grelina marcada radiactivamente. Luego


de 2 h, se removi la Grelina del medio y se continu la incubacin durante distintos
tiempos al cabo de los cuales se determin la radioactividad en la superficie y en el
interior celular. Los resultados se
Internalizado
120
Superficial
muestran en la siguiente figura.
100
80
60
40
20
0
0

50

100

150

200

minutos

31
31

Experimento 2: Se repiti el experimento anterior pero agregando durante la


preincubacin (2 h) y la incubacin (de 30 min.) las sustancias que figuran en la siguiente
Tabla. Luego se determin la radioactividad en la superficie y en el interior celular. Los
resultados se detallan a continuacin:
Grelina +
------Bloqueante de Ca++
Inhibidor de quinasas
Inhibidor especfico de PKA
PMA (tratamiento prolongado)
Inhibidor especfico CAMK II

% radioactividad
superficial
23%
85%
83%
25%
28%
87%

% radioactividad
internalizada
64%
13%
15%
72%
68%
12%

a) Interprete los resultados.


b) Proponga un modelo coherente con los resultados obtenidos.

3. Como es bien sabido, la Insulina es responsable de la regulacin de los niveles plasmticos


de glucosa, entre otras cosas, estimulando la incorporacin de glucosa a sus tejidos blanco. La
Insulina ejerce su accin a partir de la interaccin con un receptor especfico, el IR.
a) Cul es la ubicacin subcelular de IR, a qu clase de receptores pertenece y cmo se
activa?
Por otro lado tambin se demostr que el factor de crecimiento IGF-II puede interactuar con
IR y estimular la proliferacin celular. A fin de estudiar el mecanismo de transduccin de
seales involucrado en este efecto se realiz el siguiente experimento:
Clulas hIRcB (que responden a IGF-II va IR, proliferando) se incubaron con distintos
estmulos dando los siguientes resultados:
Tratamiento
Control
IGF-II
IGF-II + U73122 (inhibidor de PLC)
OAG (anlogo de DAG)
IGF-II + U73122 + OAG

Proliferacin
(veces de aumento)
1,0
5,4
1,6
4,5
6,1

b) Qu efector est siendo activado por IGF-II, a travs de qu mecanismo?

4. La Histamina ejerce su accin a travs de la interaccin con cuatro tipos de receptores,


llamados HR1; HR2; HR3 y HR4 que se localizan en la membrana plasmtica de las clulas
blanco. A fin de estudiar a qu vas de transduccin de seales se acoplan los distintos
receptores de histamina, se llevaron a cabo los siguientes experimentos.

32
32

Nota: Los valores que se muestran en ambas Tablas corresponden al cociente tratado/control

Experimento 1: Un cultivo celular que expresa cantidades equimolares de los receptores


H1; H2 y H3 fue incubado en presencia de histamina y se analizaron los niveles de las
siguientes molculas:

Histamina

cAMP
1,1

cGMP
1,1

IP3
6,0

DAG
5,5

Experimento 2: Sabiendo que existen drogas farmacolgicas que actan como antagonistas
especficos de cada uno de los distintos tipos de receptores de Histamina, se incubaron las
mismas clulas con Histamina en presencia y ausencia de los distintos antagonistas: ANT1;
ANT2 y ANT3 para H1; H2 y H3, respectivamente. Los resultados se muestran en la
siguiente Tabla

Hist. + ANT1
Hist. + ANT2
Hist. + ANT3

cAMP
1,1
0,4
2,4

cGMP
1
1,1
0,9

IP3
1,2
5,9
5,8

DAG
1,1
5,6
5,7

a) A qu tipo de receptores pertenecen los distintos HR.


b) Haga un esquema del mecanismo de transduccin de seales acoplado a cada
subtipo de receptor.
c) Como explica los resultados obtenidos en las distintas determinaciones de los
niveles de cAMP.
5. La hormona ACTH es un pptido de 39 aa, tiene la funcin de estimular la sntesis de
............................ en la glndula......................
Es sabido que la interaccin de ACTH con receptores especficos presentes en las clulas
blanco puede activar dos caminos de transduccin de seales.
A fin de establecer un modelo del mecanismo transduccin de seales involucrado en el
efecto de ACTH, se llevaron a cabo los siguientes experimentos en un cultivo de clulas que
responden a dicha hormona.
Tratamiento
Control
ACTH
Forskolina
Toxina del clera
DAG + activador de canales de Ca++
ACTH + Inhibidor general de tirosina-quinasas
ACTH + PMA (tratamiento prolongado = 4 hs.)
ACTH + Activador de la fosfodiesterasa de cAMP
Fragmento ACTH1-10
Fragmento ACTH11-24
Fragmento ACTH1-10 + Activador de la fosfodiesterasa de cAMP
Fragmento ACTH11-24 + Activador de la fosfodiesterasa de cAMP
Fragmento ACTH1-10 + Inhibidor especfico de PKC
Fragmento ACTH11-24 + Inhibidor especfico de PKC

Respuesta Biolgica
(tratado/control)
1
48 3
20 2
25 4
33 2
50 3
18 3
21 2
17 2
19 2
32
24 4
23 2
2 1
33
33

a) Explique los resultados obtenidos, mencionando los caminos de transduccin de


seales involucrados en el control de la respuesta a ACTH.
b) Proponga un modelo de interaccin de la hormona ACTH con sus receptores
especficos.

6. El factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) tiene, entre otras funciones, inducir la


actividad mitognica y angiognica. En un trabajo reciente se demostr que la actividad
mitognica del FGF, poda ser bloqueada por la presencia de inhibidores de tirosina-quinasas
y tambin por tratamiento prolongado con steres de forbol.
a) Describa un posible mecanismo de transduccin de seales involucrado en la accin
mitognica del FGF.
b) Disee una estrategia experimental que le permita confirmar el mecanismo propuesto.

7. La Hormona liberadora de corticotrofina (CRH) y otros pptidos anlogos a la misma


ejercen su accin a travs de la interaccin con un receptor de siete pasos de membrana.
A fin de estudiar las vas de sealizacin involucradas luego de la activacin de ese receptor
(llamado CRH-R) y los mecanismos que llevan a su desensibilizacin, se llevaron a cabo los
siguientes experimentos.
Nota: Los valores que se muestran en las Tablas corresponden al cociente tratado/control

Experimento 1: Un cultivo celular que expresa CRH-R fue incubado en presencia de la


hormona CRH o del pptido UCN. Finalizada la incubacin se analizaron los niveles
citoplasmticos de las siguientes molculas:

Control
CRH (100 nM)
UCN (100 nM)

cAMP
0,9
6,7
1,1

IP3
1,0
0,9
8,1

DAG
0,9
1,0
7,8

a) Haga un esquema del mecanismo de transduccin de seales acoplado al receptor


luego de la interaccin con cada uno de esos ligandos, que especifique, qu tipo de
protea G y que quinasa estn involucradas.
Experimento 2: Para estudiar los mecanismos de desensibilizacin del receptor el mismo
cultivo celular es previamente incubado con CRH (100 nM) o con UCN (100 nM) y luego
incubado con CRH (100 nM) o con UNC (100 nM). Se determinan luego los niveles de
las siguientes molculas.
cAMP
DAG
Control
1,0
1,1
CRH (100nM)
6,8
1,1
UCN (100nM)
0,9
7,8
CRH (100 nM) preincubado con CRH
2,4
1,0
CRH (100 nM) preincubado con UCN
6,8
1,2
UCN (100nM) preincubado con CRH
1,1
3,2
UCN (100nM) preincubado con UCN
1,0
7,7

34
34

b) Interprete los resultados obtenidos y construya un grfico de barras que muestre el


porcentaje de receptor en la superficie de la celular para cada uno de los tratamientos.
c) Determine qu va de transduccin de seales estara involucrada en la
desensibilizacin del receptor.
8. IGF-1 es un polipptido con funcin de factor de crecimiento, que interacta con un
receptor localizado en la membrana plasmtica. Recientemente se realiz un estudio
incubando un cultivo de clulas PC12 con cantidades crecientes de IGF-1 y se determinaron
los niveles de protena Akt-fosforilada (Figura 1).

Figura 1: Anlisis de los niveles de Akt fosforilada en el residuo Ser473. Luego de la incubacin se
extrajeron protenas, se realiz una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, se transfiri a
una membrana de nitrocelulosa y se analiz por western blot con un anticuerpo anti-fosfoAkt.

a) A que tipo de receptor se une IGF-1 y como se activa?


b) Interprete los resultados y explique brevemente el mecanismo involucrado en la
fosforilacin de Akt mediada por IGF-1.
Se sabe que cuando se activa Akt, sta fosforila a la protena BAD, involucrada en el control
de la muerte celular. A su vez, BAD puede ser fosforilada por la protena quinasa PKA.
c) Describa los resultados que espera obtener respecto de la fosforilacin de Akt y de
BAD, cuando incuban clulas PC12 con IGF-1 en presencia de las sustancias que se
mencionan a continuacin, aclarando en qu vas de transduccin de seales
participaran cada una de ellas:
I) Exceso de ster de forbol (PMA).
II) Un inhibidor general de serina/treonina-quinasas.
III) Un bloqueante de canales de Ca++.
IV) Toxina de clera.
V) Un inhibidor general de tirosina-quinasas.
VI) Un activador de fosfodiesterasas.
9. La hormona liberadora de corticotrofina (CRH) y otros pptidos anlogos a la misma
ejercen su accin a travs de la interaccin con un receptor de siete pasos de membrana.
A fin de estudiar las vas de sealizacin involucradas luego de la activacin de ese receptor
(llamado CRH-R) se llevaron a cabo los siguientes experimentos.
Se incubaron pituicitos de rata con distintos estmulos y se determinaron los parmetros que
se enumeran en la siguiente Tabla:

35
35

Nota: los valores corresponden a veces de induccin respecto del control

Tratamiento
CRH
FK
activador de canales de Ca++
PMA (trat. corto)
TC
CRH+ PMA (trat. largo)
CRH + inhibidor de tirosinaquinasa
CRH + activador de fosfodiesterasa
CRH + inhibidor de serinaquinasa
OAG
CRH+EDTA

cAMP
7,5
10
1,8
1,5

DAG
6,4
1,1
0,9
1,1

[Ca++] citopl.
8,1
0,9
10,2
0,9

ACTH
14
8
6,4
6,1

Abreviaturas: CRH: Factor liberador de corticotrofinas; FK, forskolina; PMA, ster de forbol; TC, toxina de
clera; OAG, octanoil-acil-glicerol; EDTA, quelante de calcio.

a) Interprete los resultados.


b) Complete el cuadro con los resultados que espera obtener.
c) Haga un esquema de los caminos de sealizacin involucrados en la sntesis de
ACTH.

36
36

PARCIAL 1
Problema 1
Plantear el protocolo de la curva de calibracin de la reaccin:
200 l de la sustancia Z (disuelta en agua) a la cual se le agregan 2 ml del reactivo X y se
mide a los 5 minutos el producto coloreado formado, que absorbe a 550 nm. El rango de
trabajo donde se cumple la ley de Beer para Z es entre 100 y 500 g.
Adems del mtodo de medicin indicado antes, Z se puede cuantificar
espectrofotomtricamente por absorcin a 340 nm, donde su coeficiente de extincin molar es
= 500 M-1 cm-1. La solucin patrn de Z que hay en el laboratorio tiene la etiqueta borrada y
decide cuantificarla para utilizarla como solucin madre en la curva. Una dilucin 1/300 de
una alcuota de este patrn da una A = 0,359 a 340 nm.
Planee la curva de calibracin indicando cantidad de tubos, concentracin de estndar que
utiliza, como lo prepara a partir de la solucin patrn y que parmetros grafica. PM de Z =
581.
Problema 2
Se quiere purificar una enzima E con actividad de quinasa de protenas a partir de un extracto
de corazn bovino (buffer de extraccin: 25 mM Tris HCl, pH 7,2). Se disea el siguiente
protocolo de purificacin.
1) Homogeneizado, 120 ml
2) Centrifugacin a 100.000xg durante 1 hora. Sobrenadante (SN). Vol: 100 ml
3) Calentamiento durante 3 minutos a 70C. Luego de esto se centrifuga, y se descarta el
pellet. Vol: 35 ml
4) Precipitacin con SO4(NH4)2 (35-60%). El precipitado se resuspende en 5 ml
5) Cromatografa de exclusin molecular (Sephacryl S 200: 5.000-200.000). El pico de la
fraccin activa eluy a 53 ml. El volumen del pico recogido fue de 10 ml.
Se calibr la columna con los siguientes marcadores de PM:
Mx
Anhidrasa carbnica
Peroxidasa
BSA
Fosforilasa b
B-amilasa
Cl2Co
Enzima E

PM (daltons)
29.000
40.000
66.000
97.000
200.000
sal

Vol de elucin (ml)


90
80
60
50
40
120
53

Se determinaron protenas a todas las fracciones de la purificacin. Se obtuvieron los


siguientes datos:
Homogeneizado: 22 mg/ml
SN: 18 mg/ml
Calentamiento: 10 mg/ml
SO4(NH4)2: 35 mg/ml
S200: 2,5 mg/ml.
En la tabla se indican los volmenes de cada fraccin (E) utilizados para la determinacin de
actividad, el cual se realiza incubando durante 10 min a 37C, y los pmoles obtenidos en el
ensayo en el volumen total de incubacin.
37
37

Fraccin
Homogeneizado
SN
Calentamiento
SO4(NH4)2
S200

Volumen usado (ml)


0,05
0,05
0,025
0,02
0,015

pmoles medidos
70
60
70
200
300

Se define 1UE como la cantidad de enzima capaz de formar 1 pmol de producto/min.


a) Arme la tabla de purificacin. Analice los resultados.
b) Dibuje el perfil de elucin del S200. Indique Vt y Vo. Calcule el PM de la protena nativa
usando el Kav.
c) Que datos le aportara acerca de E si un investigador de confianza le comentara que usando
una columna DEAE-celulosa, E puede ser eluido con 25 mM Tris HCl, pH 7,2 + 0,25M
NaCl?
Problema 3
Para determinar actividad enzimtica del problema anterior se us un ensayo radioactivo. La
mezcla de reaccin por tubo lleva: 25 mM Tris-H Cl pH 7,2
10 mM MgCl2
0,1 mg/ml Histona
50M ATP
1000000 cpm/ensayo ATP32P
El ensayo enzimtico se realiza en un volumen final de 0,1 ml de los cuales 0,05 ml
corresponden a la mezcla de reaccin. Prepare la mezcla radioactiva para 20 tubos. Dispone
de las siguientes soluciones madres:
1M Tris-HCl pH 7,2 - 1M MgCl2 - 10 mg/ml Histona - 10 mM ATP - ATP 32P 3000Ci/mol,
1 Ci/l. Eficiencia del contador para 32P: 95%.
Considere que el ATP 32P acaba de llegar.
Calcule la actividad especfica de la mezcla radioactiva obtenida. Calcule si la masa que
aporta el radioactivo es significativa respecto del frio.
Dato: 1 Ci = 2,22 x 106 cpm
Problema 4:
Describir los geles que esperara obtener si la protena que se muestra se somete a
electroforesis en distintas condiciones, todas a pH 9.
1) electroforesis nativa
2) con agregado de urea y -mercaptoetanol
3) electroforesis con SDS
4) con SDS y -mercaptoetanol

Indique lugar de siembra y sentido de la corrida.


Identifique cada banda

38
38

PARCIAL 2
CURVA DE CALIBRACIN
Para determinar la velocidad de reaccin que cataliza la enzima E se mide la aparicin de
producto P. Para la cuantificacin de P se dispone de una reaccin colorimtrica en la cual se
toma un volumen mximo de 1 ml de muestra y se le agregan 1 ml de reactivo A y 1 ml de
reactivo B. Se deja a temperatura ambiente por 15 minutos y se lee la absorbancia a 540 nm.
1) Disee el protocolo para realizar la curva de calibracin de tal forma de cubrir el rango de
10 a 50 nmoles de P. Para ello cuenta con un patrn de P de concentracin 50 mM, disuelto
en buffer fosfato de sodio pH 7,5.
2) El sistema de incubacin para la determinacin de la actividad de E consta de 0,1 ml de
sustrato, x ml de extracto enzimtico y buffer fosfato de sodio pH 7,5 hasta un volumen
final de 1,8 ml. Se incuba 1 hora a 30 C y la reaccin se detiene por el agregado de 0,2 ml
de acetato de zinc. Finalmente se centrifuga a 3000 rpm por 10 minutos y se cuantifica P en
y ml del sobrenadante. Sabiendo que un extracto enzimtico presenta una actividad de 100
nmoles de P/h x ml, indique el volumen x a pipetear de extracto enzimtico para realizar la
incubacin a 30C y el volumen y del sobrenadante para realizar la colorimetra.

PURIFICACION
Una proteasa heptica fue recientemente identificada y purificada. Se ensayaron diferentes
operaciones obteniendo los siguientes resultados:
Vol (ml)

UE/ml

mg Prot/ml

1) Extracto crudo en buffer de extraccin

75

20,9

24

2) Sobrenadante de 10.000xg, 15 minutos.

70

21,2

6,9

10

35

11,8

10

105

10,4

65,7

3,9

60,8

1,67

3) Fraccionamiento con sulfato de amonio (p/v) en 2 etapas:


a) Se precipita entre 0-35%, se redisuelve en buffer
b) El sobrenadante de a) se lleva a 70% y el precipitado
se redisuelve en buffer

4) La fraccin 3b) se dializa, y se realiza una cromatografa en


columna de Intercambio Catinica a pH 6 y se obtiene el perfil
de fig 1.
Pico I
7,5
Pico II

39
39

Fig 1
A280nm
0,16

Actividad

I
II

0,2

NaCl
(M)
- 0,5

0,1

0,08

- 0,25

0
0

20

40

60

volum en (m l)

80

A280nm
Actividad

5) Tanto el pico I como el pico II, al sembrarse por separado en una columna de Sephadex G100 (Rango: 4.000-150.000) dan perfiles con varios picos y con un solo pico activo que se
corresponde en ambos casos a un Kav = 0,3. Se obtuvo:
Vol ml

UE/ml

mgProt/ml

Pico I

112

1,6

Pico II

109

1,55

6) Se siembran los picos activos de la columna G-100 en geles de electroforesis en diferentes


condiciones, revelando con Coomasie blue se obtuvieron los siguientes resultados:
120.000
98.000

66.000
40.000

13.000

+
Pico I Pico II
Nativo, pH 9,10%

Pico I

Pico II

SDS-PAGE pH 7

Pico I Pico II
MeOH +

Marcadores
de PM

SDS-PAGE pH 7

a) Calcule AE, R% y grado de purificacin. Analice los resultados obtenidos en cada paso y si
la purificacin fue satisfactoria. Proponga un esquema que aplicara en el prximo trabajo
para mejorar los resultados aplicando una metodologa similar.
b) Explique el perfil de elucin obtenido con la columna de intercambio. Puede acotar el pI
de la enzima sabiendo que una alcuota de los picos 1 y 2 sembradas en una columna de
intercambio aninico a pH 8,5 fueron retenidas? Justifique.
c) Puede acotar el PM de la enzima? Indique sucintamente como calibra la columna de tamiz
molecular para informar a qu peso molecular corresponde un Kav = 0,3.
40
40

d) Explique los resultados obtenidos con las diferentes electroforesis y sugiera la estructura de
la protena.

RADIACTIVIDAD
Describir la preparacin de 30 ml de una solucin 10 mM de L-metionina 35S en la que el
aminocido tenga una actividad especfica de 3,5x104 dpm/mol. Se dispone de metionina
slida sin marcar (PM 149,2) y una solucin de metionina

35

S 100 Ci/mmol y 1 mCi/ml,

valores determinados 30 das antes del experimento. El perodo de semidesintegracin del

35

es de 87,7 das.
1 Ci = 2,22x1012 dpm
A = Ao e-t
T = 0,693/

41
41

PARCIAL 3
CURVA DE CALIBRACIN
Se obtuvieron extractos de hojas y races de plantas de papa crecidas en presencia o ausencia
de nitrato.
Fueron calculadas las protenas de cada extracto por el mtodo de Bradford en estas
condiciones: 10 l de solucin de BSA + 200 l de reactivo de Bradford.
Se hizo una curva de calibracin usando BSA como patrn, obtenindose los siguientes
resultados:
BSA (g)
Abs 595 nm

0
0,05

1
0,12

2
0,19

3
0,26

4
0,32

5
0,34

Para determinar protenas a los extractos de hojas y races se diluy una alcuota de cada
extracto (1:10) y se usaron 10 l de cada dilucin en el ensayo. Los datos de Absorbancia a
595 nm fueron los siguientes. El valor del blanco obtenido es el mismo que para la curva de
calibracin.

Extractos
Hojas
Races

Plantas crecidas en Nitrato


0,30
0,24

Plantas crecidas sin Nitrato


0,23
0,21

1) Grafique la curva. Calcule el factor.


2) Calcule la concentracin de protenas en (mg/ml) de cada extracto crudo.
En paralelo se hizo una curva de Nitritos (entre 10 y 50 nmoles) en un volumen final de 1,5
ml.
Se dispone de una solucin stock de KNO2 50 M. Se detectaron los nitritos usando
Sulfanilamida y Naftilendiamida (1 ml de cada una) y se midi la absorbancia a 540nm.
Arme el protocolo de esta curva de calibracin.
Se determin actividad de Nitrato Reductasa (NR) incubando los diferentes extractos (sin
diluir) durante 30 min a 30C en un volumen final de 2 ml. Los volmenes de extracto usados
como fuente de enzima (E) estn indicados en la tabla. La mezcla de reaccin contiene: 20
mM Buffer Fosfato, 10 mM KNO3 y 0,2 mM NADH. Se obtuvieron los siguientes resultados
ya restado el blanco.
Ensayos
Extracto (E)
Abs 540nm

Plantas crecidas con NO3K


Hojas (50 l)
0,45

Races (100 l)
0,15

Plantas crecidas sin NO3K


Hojas (200 l)
0,06

Races(200 l)
0,03

El factor de la curva de Nitritos fue 130 nmoles. La actividad de NR se expresa en UE siendo:


1UE = 1 nmol de NO2/hora.
1) Calcule las UE por ml de enzima en cada caso.
2) Calcule la actividad especfica (UE/mg) en cada caso.
42
42

PURIFICACIN
Se necesita purificar la enzima X con el fin de desarrollar una droga contra el mal de Chagas.
La fuente enzimtica es corazn de cerdo y se siguen las siguientes etapas
1)
2)

3)

4)

5)

Homogeneizado en buffer Tris-HCl 50 mM pH 7,4 adicionado de KCl 0,1 M


(volumen 105 ml, UE/ml: 65; protena: 8,1 mg/ml)
El homogeneizado se somete a una centrifugacin diferencial: 10 minutos a 600xg, el
sobrenadante resultante se centrifuga a 15.000xg durante 20 minutos a 15.000xg
durante 20 minutos y el precipitado resultante se resuspende en 27 ml del mismo
buffer adicionado de Tween 0,1% (UE/ml: 240; protena: 14 mg/ml)
Fraccionamiento con sulfato de amonio
0-30% (volumen 5 ml, UE/ml: 3; protena: 16,5 mg/ml)
30-45% (volumen 5 ml, UE/ml: 550; protena: 24 mg/ml)
45-65% (volumen 5 ml, UE/ml: 750; protena: 27 mg/ml)
Los precipitados se resuspendieron en el volumen indicado en Tris-HCl 50 mM pH 7,4
Filtracin en gel en Sephacryl S-200 (5000-250000) del precipitado 45-65%, se
recogen fracciones de 2 ml y se obtuvieron 3 picos:
Pico A: Kav 0,3 (protena: 22 mg/ml)
Pico B: Kav 0,6 (protena: 4 mg/ml; UE/ml: 490 en 4 tubos)
Pico C: Kav 0 (protena: 40 mg/ml)
El pico con actividad se siembra en una columna de DEAE celulosa equilibrada con
buffer Tris-HCl 50 mM pH 7,4 y se eluye con gradiente salino entre 100 y 600 mM) y
se obtiene el siguiente perfil de elucin (pico: volumen 5 ml; UE/ml: 760 ; protena:
2,5 mg/ml)

A 280 nm

NaCl (mM) (.)

600

100
Ve (ml)
a) Confeccione el cuadro de purificacin, indicando como calcula los parmetros.
b) Analice los pasos de purificacin, indicando si son adecuados. Justifique en todos los casos
c) Cambiara el paso 4 por una dilisis?. Justifique brevemente
d) Que caractersticas posee la enzima en cuanto a ubicacin subcelular, pI y PM
e) Dibuje el perfil de elucin obtenido en la filtracin en gel indicando todos los parmetros

43
43

ELECTROFORESIS
La inmunoglobulina G (IgG) tiene un peso molecular de 150.000. Est formada por la unin
de 2 cadenas pesadas H (peso molecular 50.000) y 2 livianas L (peso molecular 25.000)
unidas por puentes disulfuro.

puentes
disulfuro

L
H

Se tiene una muestra de IgG pura la cual es analizada mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida.
1) Represente mediante un esquema los geles obtenidos luego de la tincin con Coomassie
blue (el esquema debe incluir: polos; sentido de corrida y bandas identificadas):

muestra tratada con SDS

muestra tratada con SDS + -mercaptoetanol.

2) Cuando la muestra es tratada con -mercaptoetanol y sometida luego a electroforesis en


condiciones nativas se observa el siguiente patrn de bandas:
pH: 6.5

pH: 8.5

H
L
L

DATO: Una muestra de IgG pura tratada


con iodoacetamida para la reduccin
irreversible de los puentes disulfuro fue
sometida a una cromatografa CMcelulosa a pH: 6,5. Se observ un solo
pico proteico eludo al aumentar la
fuerza inica.

+
gel 15% T

gel 6% T

a. Qu puede decir acerca de los pI de las cadenas H y L?


b. Justifique el patrn de bandas obtenido en ambos geles.

44
44

RADIACTIVIDAD
Para determinar el efecto del Mg2+ sobre la actividad de la enzima CAT (Cloranfenicol Acetil
Transferasa), se incuban 10 L (0,5mg/mL) de la enzima durante 60 minutos a 37C en 100
L de solucin de reaccin. La actividad CAT se determina midiendo 125I-Cloranfenicol-Ac
producido.
Solucin final de reaccin (100 L):
Buffer Tris-HCl pH 7,8, 0,25 M
MgCl2 5 mM
AcCoA 1 mM
Cloranfenicol, 50 M
125
I-Cloranfenicol, 1.325.000 cpm
Fuente de enzima: 10L (0,5 mg/mL)

Soluciones Stock:
Buffer Tris-HCl pH 7,8 0,50 M
MgCl2 100 mM
AcCoA 40 mM,
Cloranfenicol, 1 mM
125
I-Cloranfenicol, 6,4 Ci/mol, 0,5 Ci/mL
(valores al 1/08/2007)

Fecha del experimento: 20/08/2007


2,22 .1012 dpm = 1 Ci
T1/2 125Iodo= 60 das (T1/2 = ln2/)
Eficiencia= 60%
PARA QUE LAS RESPUESTAS SEAN CONSIDERADAS, SE DEBEN INDICAR LOS
CALCULOS REALIZADOS
A) i-Calcule los volmenes necesarios para preparar las dos Soluciones Madre para 5 tubos
con MgCl2 y 5 tubos sin MgCl2. Complete la tabla (en su hoja de examen, NO EN EL
ENUNCIADO) con los volmenes que se deben pipetear de las Soluciones Stock
considerando que la reaccin en cada tubo se iniciar con el agregado de 10L de fuente
de enzima. Se dispone de pipetas que cubren los rangos de 2L hasta 1000L.
ii-Indique si la masa que aporta el 125I-Cloranfenicol es significativa respecto a la masa de
Cloranfenicol.
SOLUCIONES

SOLUCIN MADRE
con Mg2+

SOLUCIN MADRE
sin Mg2+

Buffer Tris-HCl pH 7,8, 0,25M


MgCl2 5 mM
AcCoA 1 mM
Cloranfenicol, 50 M
125

I-Cloranfenicol, 1.325.000 cpm

H2O
Volumen TOTAL

45
45

B) Luego de las incubaciones, se obtuvo un promedio de 11.000 cpm de 125I-CloranfenicolAc (con MgCl2) mientras que en ausencia de MgCl2, se obtuvieron 500 cpm. Calcule la
actividad de CAT inducida por Mg++ expresndola en dpm/g.prot x min.

Actividad de CAT =

dpm/ug.prot x min

46
46

PROBLEMA INTEGRATORIO
La catalasa es una de las enzimas antioxidantes y esta relacionada con muchos procesos
patofisiolgicos y enfermedades humanas. En este estudio se trata de purificar la catalasa
recombinante humana secretada al medio de cultivo por las levaduras (Pichia pastoris). La
catalasa secretada fue purificada por fraccionamiento en sulfato de amonio, cromatografa de
intercambio aninico y columna de hidroxiapatita. Con este estudio se logr una expresin y
purificacin de la protena recombinante a gran escala.
La purificacin de la protena se muestra en la tabla 2 del trabajo publicado por X.L. Shi et al.
en Protein expression and purification 54 (2007) 24-29.
La purificacin con sulfato de amonio es un paso fcil, y es seguido por dos pasos ms,
consiguiendo una buena purificacin con slo tres simples etapas de purificacin.
Se muestran a continuacin la tabla y el anlisis por SDS-PAGE de la purificacin enzimtica.

Determinacin de catalasa
recombinante en SDS PAGE, anlisis
del producto crudo precipitado con
Sulfato de amonio (calle 2),
purificado con Q-Sepharosa FF (calle
3) y macro prep Ceramie
Hidroxiapatita (calle 4). La calle 1 se
sembraron los marcadores de peso
molecular.

a) Complete el cuadro de purificacin. Comente cada paso realizado

47
47

b) Si considera que existe algn paso importante que fue omitido en la purificacin
enzimtica, comntelo.
c) Qu opinin le merece la electroforesis realizada, puede decir que la protena est
purificada? Puede estimar el peso molecular por simple observacin del gel?
d) Qu puede inferir acerca del punto isoelctrico de la misma si el pH al que se trabajo
en la columna de Q-Sepharosa fue de 7,0?
e) Dibuje el perfil de elusin correspondiente a la columna de intercambio aninico.
f)

Podra haber trabajado con una columna de intercambio catinico, que condiciones
cambiara y por que?

g) En que paso se le ocurrira usar una columna de filtracin por gel, que condiciones
pondra y dibuje el perfil que esperara obtener para cada fraccin y para los
marcadores de PM
Sephadex
G-10
G-25
G-50
G-75
G-100
G-200

Rango fraccin
0-700
1000-5000
1500-30000
3000-70000
4000-150000
5000-250000

48
48

N de
rden

Apellido y Nombre

II

III

IV

Final

Parcial de Qumica Biolgica 2012-09


Curva de calibracin
Ud. tiene como misin, la medicin de las protenas totales (PT) en plasma, orina, saliva y lquido
cefalorraqudeo (LCR) por el mtodo de Marion Bradford. Ud. no encuentra la gua de laboratorio de QB y
busca en Internet un procedimiento analtico para determinar protenas utilizando el mismo reactivo de color.
Ud. decide entonces, utilizar el procedimiento encontrado en la web, para lo cual deber leer atentamente el
nuevo procedimiento de trabajo y seguir las indicaciones especificadas.

1). Tratamiento de la muestra:


Plasma: 2 o 5 L, aforar a 50 L con agua bidestilada
Orina, saliva o LCR: 10 o 20 L aforar a 50 L con agua bidestilada
2). Curva de calibracin: Albmina bovina srica (BSA), 1 mg / mL.: 0, 2, 4, 8, 10, 15, y 20 L
3). Buffer o Agua bidestilada (milli Q): 50, 48, 46, 42, 40, 35, y 30 L
4). Reactivo de Bradford: 200 L
5). Agitar suevamente (en agitador orbital)
6). Incubar a 22 C durante 5 min.
7). Leer la microplaca en un lector de microplacas a 595 nm.
I.
II.

III.

(3 puntos) Disee el protocolo de trabajo, especificando adems en una fila la masa de


protenas que est colocando en cada pocillo.
(4 puntos)La concentracin normal de protenas en las muestras a determinar estn tabuladas
en el siguiente cuadro. Decida si esta curva y las condiciones de disolucin de la muestra
son adecuadas para obtener un buen valor de protenas totales en la muestra. Justifique.
Muestra

Concentraciones normales

Plasma

6,5-8 g/100mL

Orina

10 mg/100mL u 80 mg/da (calculando un


volumen diario entre (900-1200) mL

Saliva

300 mg/100 mL

LCR

15-30 mg/100 mL

(2 puntos) Si la medicin de PT en LCR le da un valor de absorbancia muy alto el cual no


entra en la curva validada, qu decisin tomara? Justifique muy brevemente cada decisin
tomada (por si o por no.)

a) No dudara de este dato, sabe que Ud. no se equivoca nunca, as que tratara que el dato
entre en curva, para ello realizara una nueva curva con ms puntos, con valores de masa
ms altos.
b) Buscara en internet si es posible un aumento de PT en LCR y si as fuese qu estara
indicando este incremento.

IV.

(1 punto) En el trabajo de la Revista Odontolgica Mexicana Determinacin de pH y


protenas totales en saliva en pacientes con y sin aparatologa ortodncica fija (estudio
piloto) de Arith Nallel y Zrate Daza, Elba Rosa Leyva Huerta y Fernado Franco Martnez,
publicado en 2004, aparece la siguiente curva de calibracin de protenas,

Siendo Ud. un experto en medicin de protenas totales, explique al menos tres puntos que
considere, segn su criterio, han omitido o est incorrectamente graficado o disientan con la
forma de graficar. Enumrelos y enncielo, sea breve. Utilice la tabla a continuacin
1
2
3
4
5