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Universidad de Antofagasta

Facultad Cs. De la Salud


Departamento Biomdico
Bioqumica

Lisis
Alcalina

Introduccin
Nicole Huacte - Patricia Jara Daniela
Rojo

El inters de realizar extracciones de DNA viene desde hace muchos aos


atrs, el primero en lograr esto fue el Doctor Friedrich Miescher que
esperaba solucionar los principios fundamentales de la vida, para
determinar la composicin qumica de las clulas, para esto utilizo
leucocitos obtenidos de la pus, recogidos en vendajes quirrgicos y obtuvo,
mediante sus pruebas, precipitado de ADN.
Hoy en da, la extraccin de DNA es un mtodo altamente utilizado a travs
de kit preparados, o el seguir los pasos ya estructurados y muy bien
probados.
Una de las herramientas ms utilizadas en Biologa Molecular para realizar
estudios o para la docencia, son las bacterias.
Las bacterias son organismos procariontes, que poseen su DNA cromosomal,
y adems contienen un tipo de DNA circular, al que se le denomina,
plsmido, son de muy pocos pares de bases y son utilizados como vectores
de clonaje. Al igual que el DNA cromosomal el plsmidico puede presentar
las siguientes caractersticas, tiene una doble hlice, estabilizada por
puentes de hidrgeno, en la clula generalmente se encuentra
superenrollada.

Figura 1.- esquema de una bacteria solamente recalcando el DNA bacteriano y el


DNA plasmidial.

Figura 2.- Esquema de un plsmido, que demuestra las regiones ms importantes,


ORI, es el sitio de origen de replicacin, luego se encuentra la regin de
resistencia a los antibiticos, y por ltimo el denominado Polylinker que es la
seccin donde se puede insertar el DNA.

Figura 3.- Diferentes formas de enrollamiento del plsmido.

Para poder obtener el DNA plasmidial, se utiliza un mtodo llamado lisis


alcalina, el cual ser mencionado con mayor profundidad en la seccin de
mtodos.
Mtodo
Para la obtencin de un plsmido se utiliza la tcnica de lisis alcalina, la cual
se produce una desnaturalizacin alcalina en presencia del detergente
dodecil sulfato de sodio (SDS)

Figura 4.- Estructura molecular del SDS (dodecil sulfato de sodio.

Se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo de


desnaturalizacin y renaturalizacin del DNA de plsmido versus el DNA
cromosomal. Hay que tener en claro que el DNA se puede desnaturalizar,
gracias a el calor, pH, la concentracin de iones, ya que influyen en la
estabilidad de la doble hlice. Lo que ocurre es que deshace su estructura
nativa, es decir se eliminan sus puentes de hidrgeno, pero hay que tener
en claro que estas se pueden volver a unir.

Figura 5.- Proceso de desnaturalizacin y renaturalizacin

Los pasos de la lisis alcalina son:


1. Resuspensin:
Se utiliza un Buffer que contiene EDTA Tris-Cl, adems de utilizar
RNAsa que es una enzima que degrada el RNA que se liberar en
pasos posteriores.
2. Lisis:
Se utiliza una alta concentracin de SDS e hidrxido de sodio, la
funcin del detergente SDS es lisar la membrana celular y la del
NaOH es desnaturalizar el DNA. El DNA cromosomal se desnaturaliza
ms rpidamente que el DNA del plsmido (cerrado).

Figura 6.- El NaOH desnaturaliza el DNA del plsmido y cromosomal.

3. Neutralizacin:
El lisado es neutralizado adicionando acetato de potasio acidificado,
as se provoca la renaturacin del DNA del plsmido. Lo que ocurre es
que hace regresar a un pH menos drstico y se vuelven a formar los
puentes de hidrgeno. Sin embargo, el DNA cromosomal es muy largo
y por tanto no logra establecer bien sus puentes de hidrgeno y
forma un agregado junto con el SDS y las protenas bacterianas, el
cual precipita. Al centrifugar, en el sobrenadante queda el DNA del
plsmido y en el fondo el cromosomal.
4. Aclaracin del lisado:
Aqu se obtiene el DNA del plsmido a travs del sobrenadante, que
luego se precipita con etanol al 70% y para asegurar se adiciona
luego etanol absoluto.

Figura 7.- Esquema de la tcnica Lisis Alcalina

Materiales
1. Bacterias E.coli, se entregaron dos tubos con bacterias que contienen
plsmidos diferentes el cual se selecciono el denominado P, que es
el que contiene el conocido pGLO. Este fue el que posteriormente se
cargaron en el gel para realizar la electroforesis.
2. Buffer P1, que contiene EDTA Tris-Cl
3. RNAsa A
4. Buffer P2, que contiene SDS y NaOH
5. Buffer P3, que contiene Acetato de Potasio y cido Actico
6. Etanol 70%
7. Etanol Absoluto
8. Micropipetas
9. Tubos Ependorff
10.Centrifuga
11.Estufa
12.Cubeta con hielo
13.Agua libre de nucleasa

Resultados
Para poder cuantificar y observar los resultados obtenidos se realiza una
electroforesis en gel de agarosa, esta consiste en una separacin de tamao
molecular al ser expuesto por una carga elctrica, adems se utiliza en el
mismo gel un colorante que es intercalante a los cidos nuclicos, que es el
bromuro de etidio.
La muestra utilizada fue la denomida P, y que fue cargada en el posillo
nmero dos del gel.

Al da siguiente se fue a ver los resultados, que se muestran en la figura


nmero 8, donde claramente se ve la banda del DNA del plsmido.

Figura 8.- Gel de agarosa obtenido en la parte experimental.

Conclusin
En la experiencia de extraccin de lisis alcalina, se deben tomar ciertas
precauciones para obtener un resultado esperado que es la obtencin de
DNA del plsmido.
Es muy fcil que la muestra se contamine, ya sea por una mala
manipulacin o por los reactivos que no funcionan bien.
Es por ello que cada paso se debe tomar con cuidado y adems se debe
mantener en la muestra una temperatura baja.