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BIOTEC2004

Biotratamientos no destructivos
para la revalorizacin de suero
lcteo
Laca, A., Moure, F. , Garca, L.A. y Daz, M.
Tecnologa de Bioprocesos y Reactores
(www.uniovi.es/TBR)
Dpto. de Ing. Qumica y Tecnol. Medio Ambiente

UNIVERSIDAD DE OVIEDO
TBR

El suero lcteo
El suero lcteo es el subproducto que
proviene de la separacin de la cuajada de
la leche durante la fabricacin de queso

ip
c
e
Pr

n
i
c
a
t
i

Suero cido
TBR

da
i
c

Pr
ec
ipi
ta
ci
n

en
zim

t
ic

Suero dulce

El suero lcteo
Composicin

(% en peso)

SUERO DULCE SUERO CIDO


Agua
93-94
94-95
Protenas
0.8-1.0
0.8-1.0
Lactosa
4.5-5.0
3.8-4.2
Minerales
0.5-0.7
0.7-0.8
cido lctico y otros
0.1-0.5
0.1-0.8
pH
6.0-7.0
4.0-5.0

TBR

SUERO DULCE
3.0 g/L
-Lactoglobulina
0.7 g/L
-Lactoalbmina
Inmunoglobulinas
0.6 g/L
Seroalbmina bovina
0.3 g/L

El suero lcteo
Produccin de suero lcteo en Asturias

9 Kg de Suero
DBO5 (30000-60000 mg/L)

TBR

50.0

1999
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0

1998
450 000 t/ao
Enero
Febrero
Marzo
Abril
Mayo
Junio
Julio
Agosto
Septiembre
Octubre
Noviembre
Diciembre

1 kg
de queso

Suero lcteo (103 t/mes)

60.0

Biotratamientos del suero lcteo

Industria Suero
Lctea

Recuperacin
(Suero en polvo, concentrados
de protenas, lactosa...)

BIOTRATAMIENTOS

TBR

(Obtencin de productos
valiosos por fermentacin).

Tratamiento
de aguas

Biotratamientos de suero lcteo


El suero lcteo es un buen sustrato que posee un pH adecuado y
los nutrientes necesarios para el desarrollo microbiano
Fuentes de carbono: lactosa y/o protenas
La lactosa es un azcar complejo
microorganismos son capaces de utilizar

no

todos

Suero

UF

Hidrlisis lactosa

Permeado

FERMENTACIN
TBR

que

Productos

los

Protenas

Biotratamientos de suero lcteo


Tratamientos destructivos: Aerobio / Anaerobio (biogas)
Tratamientos no destructivos:
Alcoholes y cetonas: etanol, glicerol, butanol, acetona...
cidos orgnicos: actico, butrico, lctico, ctrico.....
Aminocidos: cido glutmico, lisina, triptfano...
Vitaminas: cianocobalamina, riboflavina...
Enzimas: amilasas, glucoamilasas, proteasas, lipasas...
Biomasa
Fermentos lcticos

TBR

Otros: grasas y aceites, polisacridos, antibiticos...

Biotratamientos de suero lcteo


Tecnologa de Bioprocesos y Reactores:

Bebida alcohlica
Vinagre
cido lctico
Proteasas
TBR

1. Bebida alcohlica
Mediante una fermentacin alcohlica la lactosa del
suero se puede transformar en etanol
A escala industrial la fermentacin alcohlica se
realiza casi exclusivamente empleando levaduras
1 Hidrlisis de la lactosa
Lactasa
Glucosa

Lactosa
Isomerasa
Galactosa

TBR

Glucosa

Galactosa

1. Bebida alcohlica
2 La glucosa entra en la ruta de Embden-Meyerhof
O
C H
H

HO

OH

O
C O-

OH
4 H2O

CH3

OH
4 ADP +2 Pi 4 ATP 4 NAD+

CH2OH

4 NADH + 4H+

Piruvato

Glucosa
O
C H

4 NAD+

CH3

Acetaldehdo

TBR

4 H+

4 CO2

O
C H

CH3

Acetaldehdo

OH

O
C
CH2OH

4 NADH + H+

CH3

Etanol

Una posibilidad atractiva es la elaboracin de una


bebida alcohlica a partir del suero lcteo

1. Bebida alcohlica
Temas clave:
Tipo de sustratos
(suero / suero + suplementos)
Cultivos de alta produccin en continuo
Metabolismo secundario
Valoracin global
TBR

1. Bebida alcohlica
Operacin:

Kluyveromyces fragilis: .
Metaboliza lactosa sin producir toxinas
Ha sido autorizado su uso en alimentos

Medio de cultivo: Permeado de UF

Fermentaciones
Discontinuo
Continuo

Mtodos analticos
Lactosa: HPLC
Etanol y otros voltiles: GC

TBR

Componentes

% p/v

Lactosa

4.5

Protenas totales

0.45

Materia grasa

Trazas

Extracto Seco Total

5.5-6

1. Bebida alcohlica
Cultivo discontinuo: Metabolismo primario
Inculo

5
5%
10%
15%
20%

20

18 C

21 C

Peso seco, g/l

15
10
5

3
2
1

0
20

0
0

15

34 C

10

12

18

Agitacin

25 g/l etanol

12

24

36

12

24

36

Tiempo, h

TBR

30

24

Tiempo, h

37 C

Sin agitacin
100 rpm
200 rpm

Peso seco, g/l

Concentracin de etanol, g/l

Temperatura

21 g/l etanol

5
4
3

11 g/l etanol

Temperatura: 30-34C.
Inculo: 10 %.
Tiempo, h
Variaciones del pH inicial entre 3.4 y 6.7 no afectan al sistema
La agitacin incrementa la produccin de etanol respecto a la falta de agitacin.
2
1
0

12

18

24

30

1. Bebida alcohlica
Cultivo discontinuo: Metabolismo secundario
Temperatura
37 C
34 C
21 C
18 C

20

10

0
0

12

24

36

48

Tiempo, h

1-propanol, 2-metil-1-propanol
2-metil-1-butanol, 3-metil-1-butanol

TBR

Alcoholes secundarios, mg/l

1 -p rop anol, mg/l

30

250
200
150
100
50
0
120

Agitacin
Total

100
80

2-metil-1-propanol
2-metil-1-butanol
3-metil-1-butanol
1-propanol

60
40
20
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Agitacin, rpm

A mayor temperatura menor concentracin final de alcoholes secundarios

La agitacin incrementa la formacin de alcoholes secundarios

Los niveles alcanzados de alcoholes secundarios son del mismo orden de magnitud
que los registrados en otras bebidas alcohlicas de baja graduacin

1. Bebida alcohlica

J
Q

Etanol,g/l
g/l
Etanol,

20

Productividad etanol
Productividad biomasa x 10

15

10

0
0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25
-1

Velocidaddededilucin,
dilucin, hh-1
Velocidad

0.3

12
10
8
6
4
2
0

Alcoholes secundarios

4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20

2-metil-1-propanol
2-metil-1-butanol
3-metil-1-butanol
1-propanol

Velocidad de dilucin, h-1

D, h-1
0.05
0.09
0.11
0.15

Acetaldehido
mg/l
YP/X, x 103
38
31
29
24

10.2
10.3
11.2
13.4

Acetato de etilo
mg/l
YP/X, x 103
8
5
4
3

2.2
1.6
1.5
1.6

El proceso es viable

Productividad mxima etanol, biomasa y


alcoholes secundarios: D = 0.11 h-1 ( 15 g/l. etanol)
Los valores de acetaldehdo y acetato de etilo son inferiores a otros registrados
en la bibliografa en otras bebidas alcohlicas de baja graduacin

TBR

Productividad,g/L
g/lhh
Productividad,

Etanol

25

Productividad, mg/L h

Cultivo continuo

2. Vinagre
El cido actico es el principal componente del vinagre,
empleado en aderezos y como conservante de alimentos
En la UE la produccin est entre 4.5 y 5 millones de
hL, de los cuales 1/3 es de vino
Para producir cido actico con fines alimentarios se
realizan dos fermentaciones sucesivas:
1. AZCAR ETANOL
2. ETANOL

CIDO ACTICO

Se plantea la posibilidad de obtener vinagre a partir de


suero lcteo

TBR

2. Vinagre
Temas clave:
Mtodo de produccin de actico vlido
para su uso en alimentacin
Seleccin de una bacteria cido actica
Caractersticas del producto
Valoracin global
TBR

2. Vinagre
Operacin:

Medio de cultivo: 78 g/L de suero lcteo en polvo + 100 g/L de lactosa


Fermentacin alcohlica: Kluyveromyces fragilis
Eliminacin de las
levaduras por filtracin

TBR

Fermentacion cido actica:


Bacteria cido actica aislada de vinagre de sidra e identificada
como Acetobacter pasterianus
Condiciones de cultivo: Fuertemente aerbicas: matraces
Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 33 ml de medio; 250 rpm; 30C
Mtodos analticos
Etanol y otros voltiles: GC

Concentraciones de etanol y actico, %v/v

2. Vinagre

TBR

Concentracin de voltiles

cido actico

4
3
2

Etanol
1
0
0

12

24

36

48

60

72

84

96

108

Acetato de
etilo

13 mg/L

2-metil-1propanol

34 mg/L

2-metil-1butanol

9 mg/L

3-metil-141 mg/L
butanol
*Acetaldehdo no detectado

Tiempo, h

La bacteria aislada realiza perfectamente la fermentacin actica en la bebida


alcohlica producida por fermentacin del suero lcteo (84% eficiencia)

El vinagre obtenido, apto para consumo humano, tiene un contenido de 5.3


grados acticos (concentracin comercial 5-6 grados acticos)

El proceso empleado cumple los requerimientos de la FAO

3. cido lctico
bacterias cido lcticas

Lactosa
OH

CH2OH

cido lctico
COOH

O
OH
OH
CH2OH

OH
OH
OH

OH

CH3

(suero lcteo / permeado de UF)

Aplicaciones industriales: en el sector alimentario


como estabilizador (aguas minerales, zumos,
cerveza, vinos, industria lctea...)
TBR

cido lctico grado alimentario: pureza 80%, color, olor, textura

3. cido lctico

cido lctico (g/l)

Condiciones de Fermentacin

L. casei
L. plantarum

L. helvticus

t (h)

TBR

T = 37-42C
pH inicial = 5-7
Anaerobio/microaerfilo

Evolucin de la concentracin de cido lctico obtenido


por fermentacin de suero lcteo

Suero lcteo
(7% de suero
deshidratado)
pH inicial = 6
T = 37C

3. cido lctico
Desalinizacin del fermentado de lactosuero por II
El cido lctico con calidad alimentaria requiere desalinizacin
Se realizaron ensayos con resinas catinicas y aninicas

Resultados obtenidos con la resina catinica


Eliminacin prcticamente total de cationes (Na+, Ca2+ y K+)
Capacidad til = 1.67 eq/L
(0.4 m3 de resina por cada m3 de suero)
Mejor regeneracin con HCl que con H2SO4
(0.69 L de HCl 2M por cada L de suero)
Prdida de lctico < 0.1%

TBR

Resina aninica: Buena eliminacin de aniones (Cl- y SO4 2) y


prdidas de lctico< 0.5%

4. Proteasas
Las proteasas son enzimas que catalizan la ruptura
de los enlaces peptdicos de las protenas
Cuentan con una gran aplicabilidad a nivel industrial
constituyendo aproximadamente el 60% del total de
enzimas comercializadas (detergentes, alimentacin,
tratamiento de pieles, industria farmactica...),
La bacteria Serratia marcescens es una gran
productora de proteasas cuando se cultiva en
medios proteicos como es el lactosuero
TBR

4. Proteasas
Temas clave:
Cultivos de alta produccin
Tipo de sustratos
(suero / suero + suplementos)
Posibilidad de trabajar en continuo
Grado de eliminacin de la carga contaminante
Valoracin global
TBR

4. Proteasas
Operacin:

TBR

Medio de cultivo: lactosuero dulce fresco


Serratia marcescens:
Baja capacidad para degradar lactosa
Las protenas del suero constituyen su fundamental fuente de C y N
Fermentaciones
Discontinuo
Continuo
Mtodos analticos
Biomasa: peso seco celular / recuento en placa
Actividad enzimtica: mtodo de la azocasena
Protena: Lowry /Bradford
Lactosa: Mtodo del cido dinitrosaliclico

4. Proteasas
Optimizacin de parmetros
8000

6000
2
4000
1

Proteasa (UE/ml)

10000
a) 5%

2000

0
10

15

20

25

8000

6000
2
4000
1

2000
0
0

30

10

8000

6000
2
4000
1

2000

0
5

10

15

20

tiempo (h)

TBR

25

30

Proteasa (UE/ml)

10000
c) 30%

Biomasa, Protena (g/l)

Biomasa,Protenas (g/l)

15

20

25

30

tiempo (h)

tiempo (h)

10000
d) 50%

8000

6000
2
4000
1

Proteasa (UE/ml)

10000
b) 10%

0
0

Proteasa (UE/ml)

Biomasa,Protena (g/l)

Biomasa,Protenas (g/l)

Oxgeno disuelto
Parmetros ensayados:
Temperatura: 26-37C.
pH: 7-8
Concentracin inicial de
protenas: 4-8 g/L
Oxgeno disuelto: 5-50%
S proteasa
z biomasa
prote
protena

2000

0
0

10

15

20

25

30

tiempo (h)

Condiciones ptimas para mxima produccin: 30C; pH 7.6; OD 30%

TBR

6000

5000

4000
3

3000

2000

1000

b) Pasteurisation

7000
6000

5000

4000
3

3000

2000

1000

Protease (EU/mL)
Proteasas
(UE/mL)

Pasteurizacin (75C, 60 min)


min) 8000
7

Doble pasteurizacin (a las 12 h)


8000

c) Tindalisation

7000
6000

5000

4000
3

3000

2000

1000

0
0

10

15

20

time (h)
Tiempo
(h)

25

30

35

Optimizacin del pretratamiento


Los niveles ms altos de actividad enzimtica se
alcanzaron empleando suero pasteurizado o
doblemente pasteurizado
Se seleccion como ms adecuada la doble
pasteurizacin porque consigue una mayor
reduccin en la carga microbiana
Condiciones ptimas + Doble pasteurizacin
12

14000

10

12000
10000

8000

6000

4000

2000

Protease (EU/ml)
Proteasas
(UE/mL)

7000

Protease(EU/mL)
Proteasas
(UE/mL)

8000

a) Microfiltration

Biomass/Protein (g/l)
Biomasa/Protenas
(g/L)

Microfiltracin (33 m)

Protease (EU/mL)
Proteasas
(UE/mL)

Biomasa/Protenas
(g/L)
Biomass/Proteins (g/l)

Biomass/Proteins (g/l)

Biomasa/Protenas (g/L)

Biomass/Proteins (g/L)

Biomasa/Protenas (g/L)

4. Proteasas

0
0

10

20

30

40

50

time (h) (h)


Tiempo

*Se realizaron experimentos en continuo probando la


viabilidad del proceso

4. Proteasas
Fermentaciones con clulas inmovilizadas en alginato
Se ha empleado el sistema S. marcescens-suero lcteo como
modelo para realizar un anlisis del comportamiento de
sistemas con clulas inmovilizadas

Microscopa ptica

t=0h

t=7h

t = 25 h

TBR Crecimiento de S. marcescens en zonas prximas a la superficie del soporte

4. Proteasas
Fermentaciones con clulas inmovilizadas en alginato
MO

TEM

SEM
Crecimiento preferencial en la superficie
debido a limitaciones difusionales
Escape celular por rotura de los soportes

TBR

4. Proteasas
Fermentaciones con clulas inmovilizadas en alginato
Theoretical Results
Resultados
tericos

exterior

r/R

Ci
1 2 Ci
=
r
+

r Di
i
Dentro del soporte: t
r
r 2 r

Modelo homogneo

TBR

En el reactor:

UTSIDE

t (h)t (h)

0.99

25
19
19
13
70

0.97

OUTSIDE

0.99

0.97

0.95

0.93

r/R

0.91

0.8

0.6

0.4

0.2

20

0.95

20

40

0.93

40

60

0.91

60

80

0.8

80

100

0.6

100

120

0.4

120

140

0.2

140

160

BIOMASS
(mg/ml)
Biomasa
(g/l)

160

BIOMASS
Biomasa(mg/ml)
(g/l)

Experimental
Results
Resultados
experimentales

25
19
19
13
70

t (h)t (h)

exterior

d Cbi
3 (1 L ) Ci
=
Di
+ r
r r=R i
dt
R L

4. Proteasas
Mdulo de Thiele para el
sustrato y la biomasa:
2
< rs >
R

2
s = 3 D < C >
s
s

2
< rx >
R

2
x = 3 D < C >
x
x

TBR

4. Proteasas
Cultivos combinados
El principal responsable de la alta DQO
del suero es su alto contenido en lactosa
S. marcescens presenta escasa capacidad
para degradar la lactosa

Opcin:
TBR

S. marcescens
+

K. fragilis

DQO en el
caldo final

4. Proteasas

1000

0
7

0
6000

K.
fragilis
b) K.fragilis

3000

2000

5
4
3
2
1

1000

0
7

0
6000

0
7

5000

c)S.marcescens
S.
marcescens-K.fragilis
+ K. fragilis

6
5

4000

3000

2000

2
1

1000

0
0

10

20

30

40

tiempo (h)

50

60

70

K.K.fragilis
fragilis

6
Protenas (g/l)

2
0
7

5000
4000

S. marcescens
+ K.- K.fragilis
fragilis
S.marcescens

5
4
3
2
1
0

10

20

30

40

tiempo (h)

50

60

70

Lactosa (g/l)

80
70
60
50
40
30
20
10
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Lactosa (g/l)

2000

Protena (g/l)

S. marcescens
S.marcescens

Protenas (g/l)

Biomasa (g/l)

3000

Biomasa (g/l)

5000
4000

TBR

Proteasa (UE/ml)

Biomasa (g/l)

6000

Proteasas (UE/ml)

a) S.
marcescens
S.
marcescens

Proteasas (UE/ml)

Lactosa (g/l)

Cultivos combinados
La presencia
de la levadura
no afecta a la
produccin
enzimtica
La mayor
reduccin en
la DQO se
consigui
empleando
cultivos
combinados
(76% de
eliminacin)

Consideraciones finales
Los biotratamientos no destructivos presentan un atractivo
indudable frente a los destructivos existiendo distintas
propuestas y posibilidades disponibles en la bibliografa
Resulta clave la bsqueda de nuevos productos y mercados
para materias primas residuales disponibles en altas
cantidades (evitar saturaciones de mercado)
Los nuevos procesos y en particular en el caso alimentario,
compiten en un mercado econmico complejo, cambiante y de
mucha competencia

TBR

El esfuerzo por desarrollar tcnicas de aprovechamiento vs.


tcnicas destructivas ejerce un efecto positivo y pedaggico
en la sociedad (abre camino hacia la sostenibilidad)

www.uniovi.es/TBR