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Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal

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Carlos ngel Gallardo C., Edgar Cano E., Gabriel Eduardo Lpez G., Vanessa Blas V., Roxana Olvera R.,
Margarita Franco C., Roco Ortiz B.
Las ficobiliprotenas de Spirulina maxima y Pseudanabaena tenuis protegen contra el dao heptico y el estrs
oxidativo ocasionado por el Hg2+
Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, vol. 41, nm. 2, abril-junio, 2010, pp. 30-35,
Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C.
Mxico
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57914151005

Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas,


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Volumen 41 Nmero 2 Abril - Junio 2010

Trabajo Cientfico

Las ficobiliprotenas de Spirulina maxima y


Pseudanabaena tenuis protegen contra el dao
heptico y el estrs oxidativo ocasionado por el Hg2+
Phycobiliproteins from Spirulina maxima and Pseudanabaena tenuis protect
against hepatic damage and oxidative stress caused by Hg2+
Carlos ngel Gallardo C.1,2, Edgar Cano E.1, Gabriel Eduardo Lpez G.1,
Vanessa Blas V.1, Roxana Olvera R.4, Margarita Franco C.3, Roco Ortiz B.1
1Lab.

de Neurobiologa. Departamento de Fisiologa Mauricio Russek Berman,


Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, IPN
2Academia de Biologa. CECyT No. 6 Miguel Othn de Mendizabal, IPN
3Lab. de Metabolismo I. Departamento de Fisiologa Mauricio Russek Berman, ENCB, IPN
4Departamento de Botnica, ENCB, IPN
Resumen
El objetivo fue evaluar si las ficobiliprotenas de P. tenuis y S. maxima, protegen contra el dao heptico y estrs oxidativo que
ocasiona el Hg2+. Se emplearon 42 ratones macho adultos, divididos en: 1) control; 2) amortiguador de fosfatos (AF) + 5 mg/Kg
de HgCl2 (ip); 3) AF + extracto proteico (EP) con 100 mg/kg de ficobiliprotenas de Spirulina maxima (ig); 4) AF + extracto proteico
con 100 mg/kg de ficobiliprotenas de Pseudanabena tenuis (ig). Los ratones se sacrificaron y se obtuvo el hgado. Se cuantific la
LP, EROS, la catalasa y la glutatin peroxidasa y se realiz el anlisis histolgico. Se encontr que las ficobiliprotenas de ambas
cianobacterias evitan el incremento de EROS y LP, y aumenta la actividad de la CAT y protegen el tejido heptico.
Abstract
The aim of this work was to evaluate if phycobiliproteins of P. tenuis y S. maxima protect from the hepatic damage and oxidative
stress caused by Hg2+. There were used 42 adult male mice, divided in: 1) control; 2) buffer phosphates (BP) + 5 mg/Kg of HgCl2 (ip);
3) BP + protean extract (PE) with 100 mg/kg of Spirulina maxima phycobiliproteins (ig); 4) BP + protean extract with 100 mg/kg of
Pseudanabena tenuis phycobiliproteins (ig). The mice were sacrificed and the liver was obtained. LP, ROS, catalase and glutathione
peroxidase were quantified, and histological analysis was made. It was found that phycobiliproteins from two cyanobacterias
avoid the increase of LP and ROS, and they induced a rise of catalase that protects hepatic tissue damage caused by Hg2+.
Palabras clave: ficobiliprotenas, proteccin heptica,
mercurio y estrs oxidativo.
Correspondencia
Roco Ortiz Butrn
Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, IPN
Carpio y Plan de Ayala, Mxico D.F., C.P. 11340, Mxico
Tel. (525) 729 6300 / 62348
Fax: (525) 729 6206
e-mail: rocipn@yahoo.com.mx

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Keywords: phycobiliproteins, liver protection, mercuric ion


and oxidative stress.
Fecha de recepcin: 21 de enero de 2010
Fecha de recepcin de modificaciones: 23 de marzo de 2010
Fecha de aceptacin: 11 de mayo de 2010

Introduccin
En la actualidad debido a la industrializacin, los seres vivos
estn expuestos a la intoxicacin por diferentes formas qumicas
de mercurio, este metal causa diferentes efectos txicos en un
gran nmero de tejidos y rganos, ya que es de difcil eliminacin
y se bioacumula. El grado de toxicidad depende del tiempo de
exposicin, de la concentracin del metal y de la forma qumica1.
Particularmente, la forma inorgnica de este metal con valencia
2+ participa en la reaccin de Fenton donde el in mercrico
(Hg2+) reacciona con el perxido de hidrgeno produciendo
radical hidroxilo, in hidrxido y la especie metlica se reduce,
lo que provoca estrs oxidativo y dao celular2.
Los estudios de toxicidad en roedores han demostrado que
el Hg2+ daa al hgado , ya que se presenta un aumento de
la produccin de especies reactivas del oxgeno (EROS) y
peroxidacin de lpidos (LP)3.
Por otro lado, se ha demostrado que la ingesta de cianobacterias
del gnero Spirulina protege contra la citotoxidad inducida por
Hg2+, CCl4, doxorrubicina, 4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina,
entre otros 4,5. El mecanismo protector de la ingesta de
cianobacterias se debe a que contienen vitaminas, cidos
grasos polinsaturados, y otros fitoqumicos como las clorofilas
y sus pigmentos accesorios llamados f icobiliprotenas 6 .
Particularmente en Spirulina se encontr que produce tres
ficobiliprotenas, aloficocianina, la ficoeritrina y en particular
ms del 50% de sus ficobiliprotenas las constituyen el pigmento
azul ficocianina.
De hecho, se ha demostrado que los extractos proteicos ricos
en ficobiliprotenas de Spirulina tienen un poder antioxidante
y citoprotector7, y estudios recientes han demostrado que el
extracto proteico de Pseudanabena tenuis la cual es altamente
productora de ficoeritrina, protege contra el dao renal que
provoca el Hg2+8. Por lo mencionado anteriormente, fu de
nuestro inters evaluar y comparar las diferentes proporciones de
ficobiliprotenas de Spirulina maxima y de Pseudanabena tenuis
ante el dao heptico provocado por el Hg2+.

Material y mtodos
Obtencin del extracto de ficobiliprotenas
Se parti de la cepas Spirulina maxima y Pseudanabena tenuis,
que fueron proporcionadas por el laboratorio de Fisiologa
Vegetal del Departamento de Botnica de la ENCB. Dichas
cepas fueron identificadas por la Dra. Roxana Olvera Ramrez,
del departamento de Botnica de la ENCB.
Los cultivos se escalaron hasta tener cultivos de lote continuo
de 20 L mantenidos en medio mineral a temperatura de 24

2 C, con flujo de aire continuo proporcionado por bombas de


aire MAXIMA (Hagen) para 113.6 L, iluminacin constante
(180 E / m 2s) de lmparas de halgeno (luz blanca) con ciclo
de luz-oscuridad 10:14 h, la luz encienda a las 7:00 a.m.
Para obtener el extracto de ficobiliprotenas se recuperaron 10
gramos de biomasa por filtrado al alto vaco, posteriormente
se coloc en regulador de fosfatos 100 mM pH 7.4 (RF), para
darle 5 ciclos de congelacin y descongelacin. El extracto
se centrifug a 3000 rpm por 30 minutos y se colect el
sobrenadante para caracterizarlo por espectrofotometra9. El
extracto proteico rico en ficobiliprotenas de Spirulina maxima,
contenan 47 % de ficocianina, 37 % de aloficocianina y 16 % de
ficoeritrina mientras que el de Pseudanabena tenuis contena 2%
de ficocianina, 9% de aloficocianina y 89% de ficoeritrina.

Tratamiento de los animales


Se emplearon 42 ratones macho de la cepa NIH que se
encontraban en un peso de entre 25 y 30 gramos, los cuales
se separaron aleatoriamente en cuatro grupos: 1) control que
recibi una solucin 100 mM de amortiguador de fosfatos (AF)
(ig) + solucin salina 0.9% (ip); 2) AF + 5 mg/Kg de HgCl 2
(ip); 3) AF + extracto proteico (EP) que contena 100 mg/kg
de ficobiliproteinas de Spirulina maxima (ig); 4) AF + extracto
proteico (EP) que contena 100 mg/kg de ficobiliproteinas de
Pseudanabena tenuis (ig).
La administracin del EP o AF se realiz 30 min. antes de
la administracin de solucin salina o HgCl 2 y diariamente
durante 5 das.
Los ratones se mantuvieron en cmaras de temperatura y
humedad controlada, en cajas de acrlico de 40x40 con acceso
libre a agua y alimento, despus de 5 das de la administracin
del HgCl 2 y/o solucin salina, se sacrificaron por dislocacin
cervical. Inmediatamente despus de haber realizado el
sacrificio, se obtuvo el hgado, de cada animal. La mitad del
hgado se emple para cuantificar la peroxidacin de lpidos,
la formacin de EROS, as como la actividad de enzimas
antioxidantes (catalasa y glutatin peroxidasa). Mientras que
la otra mitad del hgado se emple para realizar el anlisis
histolgico por la tcnica de hematoxilina-eosina. Todos los
procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo a la
normativa mexicana para la produccin, cuidado y tratamiento
de animales de laboratorio NOM-082-ZOO-1999.

Anlisis bioqumico
Todos los hgados utilizados en las pruebas bioqumicas fueron
homogenizados en 3 mL de regulador de fosfatos 10 mM pH 7.4.
Evaluacin de la peroxidacin de lpidos
Cada muestra fue homogeneizada en 2.2 mL de solucin
salina 0.9 % para realizar la tcnica descrita por Triss y

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Wilmore de 198410, la cual consiste en la determinacin de los
productos lipdicos de peroxidacin que son capaces de generar
fluorescencia. Para lo cual, se tomaron alcuotas de 1 mL de
los homogeneizados de cada muestra y se les adicion 4 mL
de una mezcla de cloroformo-metanol (2:1 vol/vol), despus se
agitaron durante 30 segundos. Posteriormente, para permitir la
separacin de las fases acuosa y la orgnica, dichas muestras se
mantuvieron a 4 C durante 30 minutos siempre protegidas de
la luz. Transcurrido dicho tiempo, la fase acuosa (fase superior)
fue aspirada y desechada con una bomba de vaco.
La fluorescencia de cada muestra se determin con ayuda de
un espectrofotmetro de f luorescencia Perkin-Elmer LS5,
a longitudes de onda de 370 nm de excitacin y 430 nm de
emisin. La sensibilidad del aparato se ajust a 140 unidades de
fluorescencia con una solucin de quinina a una concentracin
de 0.001 mg/mL. Los resultados se expresan como unidades
relativas de fluorescencia (URF)/mg de protena.

Cuantificacin de las especies reactivas del oxgeno


Las EROS se determinaron usando el diacetato de 2,7diclorof luorescina (DCFH-DA), el cual es desesterificado
por la presencia de perxido de hidrgeno produciendo una
molcula ms oxidada (2,7-diclorofluorescena o DCF), la cual
es capaz de fluorescer11. El DCF posee como propiedades una
longitud de excitacin a 488 nm y una longitud de emisin de
fluorescencia mxima a los 525 nm. Para ello, se tomaron 10 L
del homogeneizado utilizado para la tcnica de peroxidacin de
lpidos y se colocaron en 1950 L de regulador TRIS:HEPES
(18:1). La fraccin diluida se incub con 50 L de DCFH-DA
por 1 hora a 37 C en agitacin constante. La reaccin se detuvo
colocando las muestras en hielo. Inmediatamente se comenz la
lectura de la fluorescencia en un espectrofotmetro Perkin-Elmer
LS5, a longitudes de onda de 488 nm de excitacin y 525 nm
de emisin, los resultados se expresan como DCF formada/h/
mg de protenas totales.
Actividad de la Glutatin peroxidasa (GPX)
La actividad de la GPX fue determinada por el mtodo de
Hafeman de 197412 modificado por Cano-Europa 200813 el
cual se basa en medir en Glutatin reducido remanente que
utiliza la enzima como cofactor. Se agregaron diecisis mL del
homogeneizado a 2 mL de regulador de fosfatos 100 mM que
contena EDTA 0.4 mM, Azida de sodio (NaN3) y 2 mM de
GSH. La reaccin se incub a 37C y posteriormente se agreg
1 mL de H 2O2 1.25 mM. Se tom una muestra a los 5 min y
otra a los 10 min y se les agreg 1.2 mL de cido metafosfrico
al 1.6%. A la ltima mezcla se le realiz una dilucin 1:2 con
regulador de fosfatos 400 mM. Finalmente, se revel la reaccin
agregando 250 L de cido 5.5-dinitrobis-2-nitrobenzoico y se
ley la absorbancia a 412 nm. Los resultados se muestran en g
de GSH consumido/mg de protena/min.

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Actividad de la Catalasa
La actividad de la catalasa fue medida por medio de la tcnica
de Aebi de 198414 la cual se basa en la desaparicin del H 2O2 a
240 nm. Se colocaron 5 L de del homogenizado en 3 mL de
regulador de fosfatos 100 mM pH 7.4 que contena H 2O2 30
mM. Se midi la absorbancia a los 15 y 30 segundos. Los datos
se presentan como k/mg de protenas.
Estudio histolgico
Los hgados fueron fijados durante 12 horas, para posteriormente
incluirlos en parafina. Se obtuvieron 8 cortes coronales de 7m
de cada rgano y posteriormente fueron teidos por la tcnica
de hematoxilina-eosina. El estudio microscpico se realiz a
doble ciego, analizndose 20 secciones de tejido para cada uno
de los rganos evaluados15.
Nota: Todos los reactivos empleados para las determinaciones
de fluorescencia son marca SIGMA calidad grado HPLC.
Mientras que aquellos utilizados en la determinacin enzimtica
e histologa son SIGMA calidad analtica.

Anlisis estadstico
En las grficas de peroxidacin de lpidos, las EROS y las
actividades de la catalasa y la GPX se muestran como valores
de la media el error estndar EE. Estas variables se analizaron
utilizando un anlisis de ANOVA de una va, seguida de la
prueba de Dunnett post hoc contra el control. Los valores de P<
0.05 se consideraron estadsticamente significativos.

Resultados y discusin
El mercurio es un contaminante industrial, que produce una
serie de alteraciones en tejidos tanto de plantas como animales.
Uno de los rganos blanco de este metal es el hgado, donde
induce dao tisular, principalmente cuando se encuentra en
su forma catinica de valencia 2+, en la que es absorbido y
acumulado16. El objetivo de nuestra investigacin fue demostrar,
que los pigmentos accesorios llamados ficobiliprotenas de las
cianobacterias Spirulina maxima y Pseudanabena tenuis previenen
el estrs oxidativo causado por mercurio, as como el dao
celular. Nuestros resultados demostraron que las ficobiliprotenas
independientemente de la cianobacteria que se trate mantienen
la citoarquitectura normal del parnquima heptico (Figura 1) y
evita que se eleven los marcadores de estrs oxidativo LP y EROS
(Figura 2) por lo que se sugiere que todas las ficobiliprotenas
tienen las mismas propiedades antioxidantes y citoprotectoras.
El mercurio en su forma Hg2+ causa estrs oxidativo porque
tiene gran afinidad por las protenas intracelulares que contienen
grupos sulfidrilo16.

Figura 1. Fotomicrografas del tejido heptico. a Grupo control. b Grupo tratado con Hg2+. c Ficobiliproteinas de S maxima 100mg/kg + s.s.
d Ficobiliproteinas de P tenuis 100mg/kg + ss. e Ficobiliproteinas de S maxima 100mg/kg + Hg2+. f Ficobiliproteinas de P tenuis 100 mg/kg
+ Hg2+ . El tratamiento con Hg2+ ocasion atrofia, prdida de los cordones de hepatocitos, vasocongestin y prdida de los ncleos. (Flechas
en b). Las alteraciones histolgicas no se presentaron en los grupos tratados con ficobiliprotenas de ambas cianobacterias (e y f).

Los conjugados de mercurio cambian el ambiente REDOX


provocando que sea ms oxidante. El ambiente oxidante promueve
reacciones oxidativas entre las EROS y las biomolculas, como
los lpidos, los carbohidratos o los cidos nucleicos17.
En este trabajo se demostr que el mercurio incrementa las
concentraciones de lipoperxidos y de EROS. El estado oxidado es
incrementado porque el Hg2+ interfiere con la cadena respiratoria
mitocondrial aumentando la produccin de H2O218.
Por otra parte, se sabe que las cianobacterias del gnero Spirulina
tienen potencial nutracutico y farmacolgico debido a sus
componentes; entre ellos se encuentran algunos antioxidantes
que previenen el dao celular en diferentes modelos toxicolgicos
sin embargo, estos estudios solo involucran este gnero, por lo
tanto es importante explorar nuevas cianobacterias con diferente
potencial farmacolgico.
Figura 2. Cuantificacin de la peroxidacin de lpidos (a), especies
reactivas del oxgeno (b), y la actividades de las peroxidasas:
catalasa (c) y GPX (d). Se representa la media EE. *P< vs.
Control.

Hemos mostrado con este trabajo que las ficobiliprotenas de


Spirulina maxima y las ficobiliprotenas, ricas en ficoeritrina
de Pseudanabaena tenuis, son un potente antioxidante contra el
estrs oxidativo causado por mercurio as como contra el dao
celular en el hgado. En trabajos previos se encontr que la

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dosis que mantiene un ambiente REDOX es la de 100mg/Kg
de ficobiliprotenas y mantiene la citoarquietectura del rin8,
la cual tambin protege totalmente al hgado.
Se proponen tres mecanismos por los cuales las ficobiliproteinas
ejercen un efecto protector, el primero involucra la reduccin de
marcadores oxidativos debido a su propia estructura qumica
de tetrapirroles lineales ya que pueden actuar como potentes
nuclefilos pudiendo neutralizar a las especias reactivas derivadas
del oxgeno y nitrgeno evitando dao oxidativo. Esta hiptesis
fue demostrada tanto in vitro19 como in vivo20.
El segundo mecanismo protector de las ficobiliprotenas pudiera
deberse a sus propiedades quelantes, ya que se sabe que estos
pigmentos son usados para concentrar metales pesados21. El
tercer mecanismo involucra el incremento del sistema enzimtico
antioxidante. Este ltimo puede observarse por el aumento
de la actividad destoxificadora de la catalasa (Figura 2) que
produce una disminucin de la cantidad de H 2O2. Es posible
que los tetrapirroles lineales de las ficobiliprotenas mimeticen
los efectos de dicha enzima8.

Conclusiones
Podemos concluir que las ficobiliprotenas de las cianobacterias
son potentes sustancias antioxidantes y hepatoprotectoras
independientemente de la cianobacteria de la que provengan.

Agradecimientos
Este estudio fue parcialmente financiado por el proyecto
20090485 SIP-IPN. O-B, R. es becaria EDI, COFFA y SNI.
G-C, C.A. y L-G, G. E; B-V, V. son becarios CONACyT.

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