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Determinacin de valor hematocrito mediante micromtodo

Fundamento
Cuando se centrifuga la sangre la fraccin forme, por accin de la fuerza centrifuga, se separa de la fraccin
liquida. Los hemates, leucocitos y plaquetas quedan en el fondo del tubo y el plasma de sobrenadante. El
valor hematocrito o HTC es la relacin existente entre el volumen ocupado por los hemates y el ocupado
por la sangre total, expresado como porcentaje. Este valor no es igual en todas las zonas vasculares del
organismo, siendo algo mayor este porcentaje en la sangre capilar.

o
o

1.
2.
3.
4.

Metdica
El HCT puede calcularse por medios manuales o automticos. Los manuales consisten en la centrifugacin de
la sangre a 2000 o 2500 g en macrometodo y a 12000 o 15000 g en micrometodo.
Los mtodos automticos pueden basarse en dos maneras:
El clculo automtico de los valores del HTC basndose en los valores del RBC y del VCM, obtenidos
electrnicamente con anterioridad.
El anlisis de la sombre que produce la poblacin eritrocitaria al reflejarse sobre un campo oscuro.
Con los mtodos manuales tambin se cuentan, junto con el volumen de los hemates, el de los leucocitos, el
de las plaquetas y el del plasma que queda atrapado entre los hemates. Por ello el valor del HCT es ms
exacto con los mtodos automticos y suele ser una o dos unidades ms bajo que el logrado con mtodos
manuales.
Material necesario
Tubos capilares de vidrio, heparinizados si la sangre es capilar. Si es venosa y esta anticoagulada con EDTA
no es necesario, pero tambin se pueden usar. Los tubos heparinizados tienen un anillo rojo en un extremo,
los que no uno azul; no estn graduados y son desechables.
Plastilina
Algodn o gasa
Una centrfuga de microhematocrito.
Una regla milimetrada o un medidor de microhematocrito
Como reactivos podramos usar heparina o EDTA, si la sangre no est ya anticoagulada.
Tcnica
La determinacin debe hacerse dos veces para sacar el valor medio de ambos tubos. Esto sera lo ideal, pero
nosotros por falta de tiempo no siempre lo hacemos. Homogeneizamos la sangre si fuera necesario. Una vez
integradas la fraccin o forme y liquida, inclinamos el tubo hasta una posicin casi horizontal. Introducimos
el tubo capilar en una posicin similar hasta que entre en la sangre y esperamos a que, por fenmenos de
capilaridad, se llene hasta tres cuartas partes de su longitud. Una vez cargado, retiramos el tubo procurando
colocarlo ligeramente por encima de la horizontal, pero sin levantarlo demasiado pues la sangre se movera
hacia el final del tubo y se nos podra crear una burbuja en el interior. Tampoco debemos inclinarlo por
debajo de la horizontal o la sangre se saldra. Insertamos el tubo en la plastilina por su extremo abierto y la
atravesamos completamente, hasta que el tubo sale por el otro lado. Limpiamos los posibles restos de sangre
con gasa, algodn o papel. Ya cargado y cerrado el tubo, lo colocamos en la centrifuga. Esta consta de un
plato circular con surcos; en esos surcos debemos colocar el tubo, con el extremo de la plastilina hacia el
exterior.
Es imprescindible que el plato este en equilibrio: para ello, colocaremos otro tubo en la posicin opuesta al
primero. Si solo tuviramos una muestra, llenaramos un tubo con agua para equilibrar el peso. Tambin es
importante que la plastilina haya creado un tapn lo suficientemente grueso, de unos milmetros de grosos,
y pegarlo ligeramente a la pared de la centrifuga para evitar que el tubo se pueda agitar en ella y se salga la
sangre o no se separe bien. Una vez cargada la centrifuga, cerramos la tapa, seleccionamos 12000 g
aproximadamente, durante 5 minutos.
Lectura de resultados
Con regla: medir la fraccin forme del final del tapn hasta donde empieza la fraccin liquida. Media
la fraccin liquida desde donde termina esta hasta donde termina la forme. Medir las dos partes juntas (o
sumar). Hacer una regla de tres segn la siguiente frmula:
Si T (total) es el 100%, fraccin forme igual a HCT. Despejar el HCT.
Con lector de microhematocrito: colocar el tubo en la muesca del lector, con la plastilina mirando
hacia el punto rojo. Colocar sobre la raya horizontal del medidor la separacin entre las dos fracciones.
Mover el medidor hasta que la diagonal de la derecha coincide, por la parte superior, con la separacin entre
la plastilina y la fraccin forme. Situar la otra diagonal del mismo modo con la fraccin liquida. El nmero
de la escala es el porcentaje de HCT.

Entre los valores de los dos tubos no debe hacer una diferencia superior al 2% del mayor de ellos. Si la
diferencia es superior la determinacin no es vlida y se tiene que repetir; si es inferior se da como valor
del HCT la media de los dos valores. Si el valor de da mayor del 50%, se centrifuga 5 minutos ms y se hace la
media, dando esa media como valor final.
Interpretacin clnica de los resultados
El valor normal de HCT est comprendido entre el 42 y el 47 en mujeres y el 45 y 52% en hombres. Un valor
bajo suele ser signo de anemia pero tambin puede darse un falso valor bajo en situaciones de hemodilucin,
como por ejemplo la hidremia del embarazo. En las fases tempranas de las hemorragias agudas los valores
son normales ya que se pierde plasma y clulas en una misma proporcin. Un valor alto del HCT suele ser
signo de una poliglobulia como la policitemia vera, aunque en este caso tambin puede haber ascensos
engaosos debido a una hemoconcentracin.
Contaje de reticulocitos
Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen en su interior restos de un retculo formado por
restos de ARN, mitocondrias y otros rganos celulares. Permanecen en medula sea de dos a cuatro das y
despus salen a sangre perifrica, donde terminan el proceso de maduracin en unas 24 horas. Su cantidad
en sangre perifrica es un reflejo de la actividad eritropoytica medular. Podemos observar los reticulocitos
al microscopio ptico mediante la tincin con colorantes vitales como azul de metileno nuevo o azul de
cresil brillante, colorantes acidfilos. Segn el grado de maduracin del reticulocito presentara mayor o
menor cantidad de retculo.
Material necesario
1. Microscopio
2. Tubos de cristal (porque hay que calentar)
3. Pipetas Pasteur
4. Portas
5. Bao de agua
6. Sistema de filtracin
Reactivos
1. Azul de cresil brillante
2. Aceite de inmersin
Tcnica
Teimos los reticulocitos: es una tincin supravital pues las clulas aun estn vivas cuando se tien. En un
tubo de hemolisis echamos tres gotas de sangre homogeneizada y tres gotas de colorante. Mezclamos
suavemente y tapamos con parafilm. Introducimos en el bao de agua a 37 durante 5 minutos. Tras ello
volvemos a homogeneizar y realizamos una extensin con una gota de la suspensin. Tras ello dejamos
secar al aire.
Lectura de resultados
Se deben contar 2000 hemates en total para calcular el porcentaje de reticulocitos. Para ello, contamos los
hemates de un campo y lo dividimos entre el total, 2000: as sabremos en cuantos campos tendremos que
buscar reticulocitos. Lo correcto es hacer dos extensiones y sacar el porcentaje de reticulocitos de la media
de las dos.
%reticulocitos = (numero de reticulocitos contados/numero de hemates contados) x100
Interpretacin clnica de los resultados
En adultos y nios los valores normales estn entre 0.5 y 1.5%. Se produce reticulocitopenia o disminucin
de la cifre de reticulocitos, en casos de aplasia medular, anemia ferropnica, megaloblstica y anemias que
cursan con dificultad en la eritropoyesis.
Por el contrario, se da reticulocitosis en las anemias hemolticas y post-hemorrgicas, donde aumenta el
nivel de produccin de hemates para compensar la prdida.
La cantidad de reticulocitos expresada en tanto por cierto es un valor relativo referido a una cifra normal de
hemates. Por ello, cuando existe una disminucin del a cantidad de hemates se compensa con un aumentos
en el numero de reticulocitos y debemos corregir su valor en tanto por ciento para poder considerarlo real.
%reticulocitos corregido = %reticulocitos x (HCT paciente/ HCT normal)
Si existe una anemia muy intensa la medula sea no solo produce una mayor cantidad de clulas sanguneas
sino que adems acorta su periodo de maduracin envindolas antes a sangre perifrica, donde terminaran
de madurar. Esto se conoce como desviacin reticulocitaria y se observa en el frotis por la aparicin de
hemates grandes de color azulado (macrocitos policromatfilos). Para descartar esta posibilidad se debe
hacer una segunda correccin al porcentaje de reticulocitos en funcin de los das que tarda en madurar un
reticulocito en sangre perifrica y que se le llama ndice de produccin reticulocitaria.
IPR = % reticulocitos corregido/das de maduracin en sangre perifrica

Los das de maduracin son valores obtenidos experimentalmente en funcin del hematocrito (te lo dan).
Los valores por encima de 3 indican aumento de la actividad eritropoytica y menor que 2 escasa actividad
Determinacin de hemoglobina en sangre
La determinacin de hemoglobina en sangre es un paso fundamental en el diagnostico de anemias. El Comit
internacional por la estandarizacin de la Hematologa recomienda el mtodo colorimtrico de la
cianmetahemoglobina por su exactitud y precisin, y por la posibilidad de utilizar un patrn de referencia
internacional muy estable que sirve para verificar los resultados obtenidos en laboratorio, y elaborar curvas
de calibracin.
Fundamento
Se basa en la transformacin de la hemoglobina en cianmetahemoglobina mediante los siguientes pasos: en
primer lugar el Fe2+ de la hemoglobina, en presencia de ferricianuro potsico, se oxida a Fe3+, dando lugar a
metahemoglobina. Despus, y en presencia de cianuro potsico, la metahemoglobina pasa a
cianmetahemoglobina. Este es un compuesto estable, de color rojo, con un pico de absorcin mximo a 540
nm y cuya concentracin puede ser determinada por mtodos colorimtricos empleando un patrn de
concentracin conocida.
Material necesario
1. Tubos de ensayo
2. Pipetas
3. Cubetas para colorimetra (cubetillas)
4. Reactivo de Drabkin
5. Patrn estndar equivalente a 15 g/dl de hemoglobina
Tcnica
Utilizamos la mitad de las cantidades indicadas en la tcnica ya que nuestras cubetas son de semimicro.
Preparamos dos tubos rotulados como B (blanco) y M (muestra). Los llenamos con 2.5 mililitros de reactivo
y a M aadimos 10 microlitros de sangre. Agitamos el tubo M, sellado previamente con parafilm, y lo
dejamos incubar a temperatura ambiente. Preparamos un tercer tubo P (patrn) con 2.5 mililitros de
Drabkin y 10 microlitros de patrn. Agitamos.
El tubo B es el blanco de la tcnica, porque de Drabkin es de color amarillo y, aunque en condiciones
normales la absorbancia debe ser cero, nos aseguramos de no incluir errores en la tcnica. As, hacemos la
lectura del problema frente a l. Nuestro patrn contiene un patrn y Drabkin, para simular la absorbancia
que tendra una sangre normal.
Lectura de resultados
Se echa el contenido de los tubos en las cubetas y se hace la lectura a 540 nm. Realizamos clculos segn la
frmula:
(Absorbancia muestra/Absorbancia patrn) x 15 = gramos de hemoglobina/decilitro de sangre.
Interpretacin clnica de los resultados obtenidos
Los valores normales son: Hombres: 14-18 g/dl Mujeres: 11-16 g/dl Nios: 10-14 g/dl Estos son ms
bien valores de referencia, ya que existen diferencias notables entre zonas geogrficas y grupos tnicos.
Determinacin de la sideremia (PLASMA)
El hierro se disocia del complejo hierro-transferrina en medio cido-dbil (cido ascrbico) y el hierro libre
se reduce a ferroso mediante la accin del acido ascrbico. Los iones ferrosos en presencia de la ferrocina
forman un compuesto coloreado. Cuanta ms concentracin del compuesto haya, mayor absorbancia tendr
la muestra.
Reactivos
Reactivo 1: tampn Reactivo 2: reductor (cido ascrbico) Reactivos 3: ferrocina Reactivo 4: patrn
Preparacin del reactivo de trabajo
Disolver el contenido de un tubo R2 en un frasco de R1, mezclar suavemente (este ser nuestro RT). Es estable
hasta tres meses en nevera.
Material
1. Tubos de hemolisis
2. Cubetillas
3. Pipetas
Muestra
Suero o plasma heparinizado o anticoagualdo con EDTA y libre de hemolisis, ya que la rotura de los
hemates y consecuente liberacin de la hemoglobina podra dar falsos resultados altos.

Procedimiento
Pipeteamos segn la tabla, agitamos y dejamos incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
Blanco
Patrn
Muestra
RT (ml)
1
1
1
R3 (gotas)
1
1
1
Agua destilada (microlitros)
200
Patrn (ml)
200
Plasma (microlitros)
200
Medimos a 562 nanmetros y realizamos una regla de tres para averiguar la concentracin de nuestra
muestra.
Concentracin del patrn (viene en la caja)/ concentracin muestra = Absorbancia patrn/absorbancia
muestra
Interpretacin clnica de los resultados
Con esta tcnica analtica los valores normales de la sideremia son
Mujeres: 55-140 microgramos/dl Hombres: 70-155 microgramos/dl
Se observa hiposideremia en la anemia ferropnica y en la anemia de las afecciones crnicas. Se encuentra
aumentada en todas las situaciones de sobrecarga de hierro, como la hemocromatosis idioptica y las
anemias sideroblsticas.
Determinacin de hemoglobina A2
La fase estacionaria de una cromatografa lquido-slido puede ser empaquetada en forma de columna,
en este caso se dice que la cromatografa es en columna. Mediante el empleo de una microcolumna
preparada a base de una resina apropiada y mediante un mecanismo de intercambio de aniones, la Hb
A2 puede ser separada de otras hemoglobinas y del resto de sustancias presentes en la sangre, para,
posteriormente, ser cuantificada espectrofotomtricamente. En esta determinacin, despus de
preparar el hemolizado, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio aninico,
cargada positivamente. Tras ello, la hemoglobina A2 se eluye de forma especfica usando un tampn,
bajo estrictas condiciones de pH y fuerza inica. Finalmente, la Hb A2 se cuantifica mediante lectura
espectrofotomtrica a 415 nm.
Material
1.
Soporte universal con pinza
2.
Vaso de precipitados
3.
Tubo de ensayo
4.
Pipeta Pasteur de vidrio
5.
Agitador
6.
Pipeta de vidrio graduada de 12 ml y micropipeta de hasta 200 microlitros
7.
Cubetillas
Procedimiento
Quitamos los dos tapones de la columna para que caiga el hemolizado y lo recogemos en un vaso de
precipitados. Empujamos el tapn interior con la parte plana de una pipeta de vidrio hasta que est en
contacto con la resina, sin comprimirla.
Preparamos el hemolizado: 50 microlitros de sangre + 200 microlitros de agua destilada. Agitamos.
Cuando no queda liquido en la microcolumna, aadimos 50 microlitros de ste. Esperamos a que
empape el tapn al completo. Entonces, aadimos 200 microlitros de tampn. Cuando ha arrastrado el
hemolizado y no cae mas liquido, aadimos 3 militros de tampn y recogemos el eluido en un tubo de
ensayo. Preparamos la dilucin del hemolizado con 12 mililitros de agua destilada y 50 microlitros de
hemolizado; esta ser nuestra Hb total, que mediremos en el espectro. Cuando todo el tampn haya
pasado llenamos una cubeta con l. Esta es la Hb A2. Llenamos otras dos cubetas, una con agua para
hacer de blanco y otra con Hb total. Medimos a 415 nm. Para averiguar el porcentaje de Hb A2 en la
sangre haremos una regla de tres:
Hb total/Hb A2 = 100/X
Interpretacin de los valores obtenidos
Los valores normales en sangre perifrica se sitan entre el 1.3 y el 3.7% del total de Hb. Un aumento de
entre el 4-10% indica una beta talasemia. Cuando el porcentaje es mayor del 10% lo ms probable es que
haya hemoglobina anmalas (Hb E, C, Koln) que tienen un punto isoelctrico similar al de la A2 y que,
por ello, con eluidas junto con esta.