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I.

INMUNOGENICIDAD DEL ANTIGENO SECRETOR/EXCRETOR Y


ANTIGENOS TOTALES DE Toxoplasma gondii Y SU UTILIDAD EN
EL DIAGNOSTICO DE TOXOPLASMOSIS

II.

AUTOR: Br. Edith Vernica Arocutipa Chino

III.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Toxoplasma gondii es un parasito intracelular obligado que causa formas


crnicas y agudas de la toxoplasmosis. Los estudios epidemiolgicos indican
que infecta de manera crnica entre 20 y 50% de la poblacin mundial. En el
paciente inmunocompetente es un proceso autolimitado, de breve duracin y
persiste de por vida en estado de infeccin latente habitualmente subclnico. La
infeccin por este parasito es una causa importante de morbilidad y mortalidad
en nios infectados y pacientes inmunocomprometidos incluyendo pacientes
con SIDA, por eso es necesario hacer un diagnstico oportuno, que permita
detectar la infeccin a tiempo (Dubey, 2002).
Estudios sobre protenas de taquizoito de Toxoplasma gondii mencionan que,
uno de los antgenos presentes en la superficie de taquizoito, es la protena
SAG1 o P30; sta es inmunogenica e induce a la produccin de anticuerpos
de; tipo IgG e IgM, por lo tanto es reconocida por el suero humano (Meireles,
2001); sin embargo no existen estudios sobre la inmunogenicidad de otras
protenas del parasito que son secretados y excretados por ste, as como las
protenas totales que ste posee y que al inducir anticuerpos para una o ms
protenas especificas detectadas por Western blot podrn ser utilizadas en el
diagnstico de la enfermedad. Los taquizotos en las clulas secretan o
excretan hasta el 90% de los tipos de antgenos de toxoplasma que circulan en
el hospedero, stos antgenos son liberados por los organelos localizados en el
complejo apical (micronemas, roptrias y grnulos densos) asumiendo estos un
papel importante en la estimulacin del sistema inmune (Wong y Remington,
1993).

La inmunidad humoral es el principal indicador para el diagnstico de la


toxoplasmosis. Es considerada de gran valor en la deteccin de la enfermedad;
1

sin embargo, no proporciona informacin sobre las diferencias que estos


observan en inducir anticuerpos que dependera de naturaleza inmunogenica
de cada uno de ellos. Existen estudios en diversos parsitos que sealan que
la respuesta inmune en el hospedero es dirigida hacia epitopes especficos
encontrados en algunas protenas del parasito.
En general, el diagnstico de toxoplasmosis se basa en mtodos serolgicos
por la demostracin de anticuerpos contra los antgenos del parasito, poco
confiables porque en algunos casos emplea antgeno poco sensible; no
detectan infecciones recientes; son de baja sensibilidad y especificidad; tienen
reacciones cruzadas con Neospora caninum y Eimeria spp, ya que comparten
eptopes comunes con Toxoplasma gondii. Razn por la cual es preponderante
investigar la inmunogenicidad de otras proteinas de Toxoplasma gondii,
ubicadas en el antgeno secretor/excretor y antgenos totales, para evaluar su
naturaleza inmunognica, stas sern de utilidad para diagnosticar la
enfermedad, sin que presenten reacciones cruzadas los resultados. En este
contexto se aportara la utilidad diagnstica de las protenas de los taquizoitos
de Toxoplasma gondii.
Enunciado del problema:
Cul

ser

la

inmunogenicidad

utilidad

de

los

antgenos

secretor/excretor y antgenos totales de Toxoplasma gondii para el


diagnstico de la enfermedad de la toxoplasmosis?
Enunciados especficos
Se

obtendrn

antgenos

secretor/excretor

de

taquizoitos

de

Toxoplasma gondii a partir de cultivos in vitro en la lnea celular LLC-MK 2


-Rhesus Monkey Kidney epithelial cells?
Se extraern los antgenos totales de de taquizoitos de Toxoplasma
gondii aplicando el mtodo de Sonicacion?

Cules sern los pesos moleculares de los antgenos secretor/excretor


y antgenos totales de taquizoitos de Toxoplasma gondii

mediante

electrotransferencia SDS-PAGE?
Cul ser la inmunogenicidad de los antgenos de secresion/excresion
y antgenos totales de taquizoitos de Toxoplasma gondii por la tcnica de
Inmunoblot?

IV.

REVISIN BIBLIOGRFICA

IV.1.

ANTECEDENTES

Partanem et al. (1984), investigaron el anlisis de antgenos de Toxoplasma


gondii en humanos. Las inmunoglobulinas G, M y A anticuerpos en
diferentes etapas de la infeccin. Los componentes antignicos de T. gondii
que inducen las inmunoglobulina G (IgG), IgM, IgA, anticuerpos IgG
reaccionan con mltiples componentes sobre una amplia gama de peso
molecular de 6 a 150 kDa, por el contrario, anticuerpos IgM Toxoplasma
reaccionan con polipptidos de 6, 25 y 35 kDa, que podran ser tiles en
nuevos instrumentos de diagnstico. El patrn general de los componentes
antignicos de la respuesta de anticuerpos IgA, Toxoplasma estrechamente
se pareca en la respuesta IgM, a pesar de que algunos rasgos
caractersticos eran constantemente observados.
Decoster et al. (1988), realizaron un

estudio de reconocimiento de

antgenos excretados y secretados por Toxoplasma gondii en humanos


con toxoplasmosis adquirida y congnita: identificacin de marcadores de
infeccin aguda y crnica. Este estudio serolgico se centra en la respuesta
inmune hacia

antgenos excretor/secretor que fueron liberados por los

parsitos en medio de cultivo libre de clulas. En toxoplasmosis crnica,


IgG fueron reconocidas las protenas de 108, 97, 86, 60, 57, 42, 39 y 28
kDa. En la infeccin aguda, los anticuerpos IgM contra el antgeno 97 kD, la
primera en aparecer, parece un buen marcador de infeccin aguda
temprana. El estudio comparativo de la respuesta de anticuerpos a
antgenos de la membrana que mostr, en toxoplasmosis crnica, humano
fueron reconocidos cuatro antgenos de 43, 35, 30 y 22 kD y que, en la
toxoplasmosis aguda, reconocieron por primera vez los antgenos de 43 y
30 kD. Este estudio demuestra en la toxoplasmosis humana una solucin
pronta, intenso y respuesta de anticuerpos contra la caracterstica ESA, lo
que sugiere que el uso de estos antgenos podra conducir en el futuro para
las pruebas de diagnstico mejoradas.

Galvan et al. (1998), realizaron el estudio de anlisis de antgenos de


Toxoplasma gondii en sueros de pacientes con toxoplasmosis. Demostraron
que algunas protenas de Toxoplasma gondii son reconocidas por los
anticuerpos IgM,

IgG e IgA en pacientes con toxoplasmosis aguda y

crnica. Los sueros fueron de individuos inmunocompetentes, sometidos a


la investigacin de anticuerpos por la tcnica de Western blot. El anlisis de
protenas reveladas por los anticuerpos IgG e IgM fueron hechos por el
mtodo de Inmunoblot con la finalidad de conocer la frecuencia de
reconocimiento. En la fase aguda los anticuerpos IgM presentaron una
frecuencia de reconocimiento para la protena 60 kDa y en la fase crnica,
los anticuerpos IgG presentaron para la protena 12 kDa. Los pacientes
seronegativos no revelaron ninguna informacin.
Prigione et al. (2000), investigaron sobre clones de clulas T elevados de
infeccin crnica en humanos saludables por estimulacin con antgenos
excretor-secretor de Toxoplasma gondii reaccionan de forma cruzada con
taquizotos vivos. Para identificar los antgenos del parsito que participan
en el mantenimiento de las inmunidad mediada por clulas T a largo plazo,
se usaron 40 clones de clulas T-ESA especfico se derivados de tres
sujetos sanos con infeccin crnica. Todos los clones eran CD41 y
reconocidos tanto los ESA y taquizotos. Clones de clulas T Por el
contrario, CD41-de taquizoitos especfica de los mismos temas proliferado
en respuesta a la ESA, sealando Ags inmunodominantes compartidas
entre la ESA y taquizoitos de Toxoplasma gondii. Los extractos parasitarios
se analizaron por transferencia de clulas T utilizando SDS-PAGE
fraccionada, los

patrones de reactividad detectados fueron: De los 25

clones, 6 fracciones de Toxoplasma. gondii fueron reconocidos en el rango


de 24 a 28 kDa y 5 reaccionaron con fracciones de Toxoplasma gondii en el
rango de 30 a 33 kDa; y 4 de ellos result ser especfico para SAg1. Aunque
superficie de Ag (SAG1) no es un miembro de la ESA, pequeas cantidades
de esta protena estaban presentes en la preparacin de la ESA por
Western blot. De los 25 clones, 8 respondieron a las fracciones de
Toxoplasma gondii en el rango de 50 a 60 kDa.

Susanto y Muljono, (2001), realizaron un estudio sobre la preparacin de


antgenos de Toxoplasma gondii cepa RH, anlisis de antgeno y deteccin
de anticuerpo en sueros. El anlisis del antgeno se realiz mediante
Western blot, utilizando sueros recogidos de 30 casos clnicamente
sospechosos de toxoplasmosis que contenan slo IgG; de 9 persona sana
asintomtica. Se ha demostrado que los componentes antignicos de 90,
87, 82, 72, 41, 26 y 6 kDa reaccionado a todos los sueros que contienen
IgG excepto sueros que contienen IgM. Especialmente bandas de 41 y 26
kDa mostraron una fuerte reaccin con todos los sueros que contienen IgG.
Songul et al. (2006), investigaron sobre la evaluacin de las variaciones
antignicas entre dos cepas virulentas de Toxoplasma. Los autores
compararon la respuesta de cepas RH y RH Ankara (HRT) de Toxoplasma
los sometieron a pruebas serolgicas y evaluaron los perfiles antignicos de
ambas cepas con Western blot. Usaron antgenos excretor/secretor, el
nmero debandas con pesos moleculares que varan entre 17 y 105 kDa
fueron detectados en WB. Obtuvieron catorce diferentes bandas con el
ensayo realizado con los antgenos de cepa RH, y se observaron cuatro
bandas con antgeno cepa RHT. La banda de 80 kDa se ti ms oscura en
la transferencia con antgenos de cepa RHT, mientras que con antgeno de
la

cepa RH 30 y 38 kDa fueron ms oscuros. El polimorfismo de los

antgenos de taquizoitos de diferentes cepas de Toxoplasma gondii, es


importante

evaluar por WB pero

no por serologa convencional como

ELISA e IFA.
Costa, (2008), investigo sobre el anlisis del potencial antignico de
protenas excretadas por taquizoitos de Toxoplasma gondii. Se evalu
aspectos

de

respuesta

excretadas/secretadas

inmune

(ESAs),

una

desencadenada
vez

que

los

por

protenas

taquizoitos

son

responsables de la estimulacin de respuesta inmune celular y humoral en


los hospederos intermediarios. Grupos de 5 ratones fueron inmunizados con
4 dosis quincenales de ESAs. La colecta de sangre fue realizada 15 das
despus de cada inmunizacin y el anlisis de anticuerpos fue hecha por
ELISA, IFI y Inmunotransferencia. Las reacciones de inmunoblot revelaron
6

que el suero anti-ESAs fue capaz de reconocer el lisado bruto de taquizoitos


y las protenas excretadas/secretadas. Los

ESAs fueron reactivas con

sueros de ratones inmunizados reaccionando con protenas de mayor peso


molecular y las protenas del lisado bruto de taquizoitos reaccionaron con
protenas de menor peso molecular.
Ahmad et al. (2014), realizaron un estudio sobre patrones electroforticos
de antgenos excretor/secretor de Toxoplasma gondii y su papel en la
induccin de la respuesta inmune humoral. Para la comparacin de los
pesos moleculares de los antgenos excretor/secretor y antgenos lisado de
Toxoplasma gondii cepa RH usaron la tcnica de SDS-PAGE. Las muestras
de

suero

de

ratones

inmunizados

se

midieron

por

tcnica

de

inmunotransferencia para la deteccin de antgenos inmunognicos. En los


antgenos excretor/secretor se obtuvieron 13 bandas y en antgenos lisado
de Toxoplasma mostr 8 bandas, respectivamente. El anlisis de suero por
inmunotransferencia tambin revel una banda de 65 kDa en suero de
ambos grupos.
A nivel nacional
Gomez, (2011), en el estudio sobre la determinacin de seroprevalencia de
Toxoplasma gondii en alpacas y llamas de la Estacin Experimental del INIA
(Quimsachata) Puno, se colectaron sueros sanguneos de 200 alpacas y
136 llamas entre hembras y machos, para la deteccin de anticuerpos
mediante el mtodo de Hemaglutinacin Indirecta (HAI). El 44,506,89%
(89/200) de las muestras de alpacas presentaron anticuerpos con ttulos
que variaron desde 1/16 hasta 1/512.La seroprevalencia hallada en
hembras 569,73% (30,88/100) fue mayor que en machos 339,22%
(25/100). El 27,947,54% (38/136) de las muestras de llamas presentaron
anticuerpos con ttulos que variaron desde 1/16 hasta 1/256. La
seroprevalencia hallada en hembras 30,8810,98% (56/100) fue similar que
en machos 2510,29% (33/100).

Los resultados de este estudio

demostraron una seroprevalencia relativamente ms alta en alpacas que en


llamas en la Estacin del INIA-Puno. Se encontr que el sexo representa un

factor de riesgo de contraer toxoplasmosis en alpaca, sin embargo no


ocurre lo mismo en llamas.
Manrique y Vildoso, (2012), realizaron un estudio

sobre la toxoplasmosis

congenita en el Hospital Regional Honorio Delgado Espinoza de Arequipa,


1996 a 2011. El estudio retrospectivo, descriptivo de recin nacidos vivos
con diagnstico de egreso de toxoplasmosis congnita confirmados por
serologa, con IgM (+) en el recin nacido e IgG (+) en la madre. La tasa de
prevalencia fue de 1,7 por 10,000 nacidos vivos, oscilando entre 1,5 a 5,1,
con tendencia descendente. De 16 casos, 68,8% fueron de sexo femenino,
nacidos en la provincia de Arequipa, 87,5% fueron a trmino y en 25% se
registr antecedente de crianza de gatos. Los signos y sntomas ms
frecuentes fueron: 50% de debilidad y 43,8% de bajo peso e ictericia
respectivamente y 25% de microcefalia. El diagnstico se realiz en el
56,3% entre los 7 y 28 das de vida, el tratamiento fue recibido por 76,3% de
los casos. La toxoplasmosis congnita en el Hospital Regional de Arequipa
fue 1,7 por 10,000 nacidos vivos, predominando los de sexo femenino,
nacidos en Arequipa y con manifestaciones clnicas de tipo neurolgico.
Retegui y Vela, (2013), determinaron la relacin entre los factores
socioeconmicos-epidemiolgicos y la seroprevalencia de toxoplasmosis en
gestantes atendidas en los Hospitales Felipe Arriola y Csar Garayar de
la ciudad de Iquitos. El estudio fue descriptivo y transversal en 355
gestantes de 15 a 45 aos de edad que asistieron a su control pre-natal,
seleccionadas intencionalmente. Se determinaron los anticuerpos

IgG e

IgM anti Toxoplasma gondii utilizando un kit comercial de ELISA. La


seroprevalencia general de toxoplasmosis fue de 97.6 % en las gestantes
del Hospital Felipe Arriola y 97,4 % en las del Hospital Cesar Garayar. La
frecuencia de anticuerpos IgG fue 94,5 % y 86,8 % en gestantes de los
hospitales Felipe Arriola y Csar Garayar, respectivamente. Se
registraron bajas frecuencias de anticuerpos IgG e IgM, 3,1% en el Hospital
Felipe Arriola y 10,5% en Hospital Csar Garayar.

IV.2.

MARCO TEORICO

IV.2.1. Toxoplasma gondii

Nombre Toxoplasma (toxon = forma de plasma de arco) se refiere a


forma morfolgica de una media luna que se encuentra en etapa de
taquizoitos. (Hill et al. 2005). Este parsito intracelular obligado, es
capaz de infectar una amplia variedad de animales de sangre
caliente (Dubey et al., 1998).

IV.2.1.1.

Clasificacin taxonmica segn Smith, 1991.

Reino:

Protozoa

Phylum:

Apicomplexa

Clase:

Sporozoea

Sub clase:

Coccidia

Orden:

Eucoccidiida

Suborden:

Eimeriina

Familia:

Sarcocystidae

Gnero:

Toxoplasma

Especie: Toxoplasma gondii


Fuente: Smith, 1991
IV.2.1.2. Morfoestructura del parasito
En el ciclo biolgico de Toxoplasma gondii se ha identificado tres
estadios diferentes: los taquizoitos, los quistes tisulares con bradizoitos
en su interior y los ooquistes. Presentan una morfologa y una estructura
tpicas de las fases infectantes de los Apicomplexa, habindose descrito
las

siguientes

estructuras:

presenta

un

anillo

polar,

conoide,

microtbulos, micronemas, microporo, grnulos densos, roptrias y una


membrana

triple

(una

externa

dos

internas

discontinuas)

caractersticas propias que lo difiere de otros protozoarios. Cada una de


9

estas estructuras es formada por protenas relacionadas con la invasin,


formacin de la vacuola parasitfora y mantenimiento del parsito en el
interior de la clula hospedera (Black y Boothroyd, 2000).
IV.2.1.2.1. Taquizoitos
Los taquizotos tienen una forma de media luna con 2 a 6 m de
longitud, tal como una clula de sangre (Hill et al., 2005). Muestran
diversos orgnulos apicales como anillos de poste, conoide, roptrias,
micronemes,

microporos,

mitocondrias,

microtbulos

subpellicular,

aparato de Golgi, ribosomas, liso y rugoso retculo endoplasmtico,


ncleo, perlas, grnulos densos de amilopectina (puede estar presente o
no) y apicoplasto. Como miembros del phylum Apicomplexa, tambin
tienen una de triple capa de la membrana formado

ntimamente

asociado con el plasmalema complejo de la membrana interior. El


complejo apical consiste en elementos del citoesqueleto y por los
roptrias secretoras llamadas organelos especializados y micronemas
grnulos densos (Baum et al., 2006), El anillo polar sirve como un centro
organizador de microtbulos por los microtbulos subpellicular con una
forma de cesta, dndole la forma de media luna del parsito (Soldati y
Meissner, 2004).
Los taquizotos se multiplican asexualmente por repetidas endodiogenias
dentro de las clulas. La endodiogenia es un tipo especializado de
divisin en el cual un taquizoto da lugar a dos clulas hijas dentro de la
clula madre, crecen y rompen la membrana materna. El proceso de
multiplicacin contina hasta ocupar la clula. El taquizoto juega un
papel importante en la transmisin vertical del T.gondii y es, muy
sensible a condiciones medioambientales, deshidratacin y variaciones
osmticas. Por lo que son rpidamente eliminados fuera del hospedero
(Tenter et al., 2000).

10

Fig. 1: Dibujo esquemtico de un taquizoto de Toxoplasma gondii.


Fuente: Dubey et al., 1998.
IV.2.1.2.2. Bradisoito y quiste tisular
Los quistes tisulares miden 5 a 100 m, y tienen pocos o miles de
bradizotos en el interior, los cuales miden aproximadamente de 7 m x
1,5 m. Difieren morfolgicamente de taquizotos al ser ms delgados, la
ubicacin de la parte posterior del ncleo del parsito y el alto ndice y
micronemas grnulos amilopectina (Hill et al., 2005). Se encuentran
sobre todo en el cerebro, el corazn y el msculo esqueltico.
Representar a una etapa de reposo del parsito dentro del anfitrin
(Dubey y Beattie, 1988).
Los bradizotos se dividen como los taquizotos por endodiogenia (Dubey
et al., 1998) Permanecen dentro de los quistes por toda la vida del
husped y son ms resistentes a la tripsina o pepsina que los taquizotos
(Montoya y Liesenfeld, 2004).Estn presentes durante la fase crnica de
la infeccin. Esta forma infectante es responsable de la transmisin de
esta zoonosis a travs del carnivorismo e ingestin de carne cruda o mal
cocida. Los quistes pueden encontrarse en cualquier rgano, pero
predominan en el SNC y en el tejido muscular (corazn, y msculo
esqueltico estriado), donde pueden persistir en fase de latencia durante
toda la vida, siendo capaces de reactivarse (Meireles, 2001).
11

IV.2.1.2.3. Ooquistes
Durante la infeccin aguda de los felinos, unos pocos millones de
ooquistes (10x12 ) se encuentran en las heces de los gatos de 7-21
das (Montoya y Liesenfeld, 2004). Los ooquistes se vuelven infecciosos
dentro de 1-5 das dependiendo de la temperatura ambiental y la
aireacin. Un quiste esporulado contiene dos esporocistos elipsoidales y
cada esporozoito tiene cuatro esporozoitos (2 m x 8 m) en el interior
(Hill et al., 2005).
IV.2.2.

IV.2.2.1.

Biologia de Toxoplasma gondii

Protenas de superficie de Toxoplasma gondii

La superficie externa del taquizoto est recubierta, por protenas, con


peso molecular que vara entre los 22 a 43 kDa, estas molculas
contienen glicosilfosfatidilinositol sirviendo como puente de anclaje para
estas protenas (Scout, 2004).

Las protenas que forman parte de la

superficie celular son imprescindibles en la supervivencia del parsito, ya


que estn implicadas en los procesos previos de adhesin e invasin
celular, siendo las responsables de iniciar las interacciones entre el
patgeno y las molculas de la superficie de la clula y de estimular la
respuesta inmune desarrollada por el hospedador. (Hemphill et al.,
1996). Muchos cientficos han enfocado sus esfuerzos para mejorar las
pruebas de diagnstico para la toxoplasmosis y desarrollar una vacuna
la cual pueda prevenir o atenuar la enfermedad. Muchos de estos
trabajos se han centrado en la SAG1 o P30, la protena de superficie
ms abundante del taquizoto que representa hasta un 5% del total de
protenas del taquizoto y no es expresada en bradizotos y esporozoitos
(Lekutis et al., 2000).
Colectivamente estos antgenos son conocidos como superfamilia de
protenas SRS (secuencias relacionadas a SAG1) (Jung et al., 2004).
Este grupo de antgenos promueve la interaccin entre la membrana el
parasito y una clula hospedera a travs de molculas aglutinantes o
12

receptores celulares que ayudan al parasito en la entrada de la clula


(Grimwood y Smith, 1995).
Es importante resaltar que la expresin de protenas se rigen de acuerdo
a la fase de desarrollo biolgico del parasito. Las protenas SAG1 y
SAG3 (P43) son exclusivamente producidas por taquizoitos (Gross et al.,
1996), bien como la SAG2A. En contraste, SAG2 (P22) son expresadas
tanto por taquizoitos y por bradizoitos, SAG2C/D, BSR4 y SRS9 son
encontradas apenas en bradizoitos (Lekutis et al., 2000).
Las protenas SAG4 y BSR4/p36 son protenas de superficie ligadas a
protenas de citosol BAG1, expresa especficamente en bradizoitos
(Bohne et al., 1995). Estudios realizados como las cepas RH (virulenta) y
76K (avirulenta) mostraron que todos los miembros de la familia SAG5
son transcritos en taquizoitos y bradizoitos de Toxoplasma gondii (Spano
et al., 2002).
La P30 es uno de los antgenos reconocidos en el suero humano y, por
ser muy inmunognica, induce a la produccin de anticuerpos IgG, IgM e
IgA, pudiendo ser utilizada en el diagnstico de la infeccin aguda en
adultos o en la forma congnita. La P22, otra protena de superficie de
los taquizotos, ya fue clonada, expresada y usada para estimular la
produccin de anticuerpos IgG. Su menor capacidad de estimular la
sntesis de IgA e IgM sugiere que esta molcula puede ser usada como
marcador de infeccin tarda (Meireles, 2001).
IV.2.2.2.

Protenas secretadas y excretadas por Toxoplasma gondii

Los antgenos excretados secretados (ESAs) son liberados por los


organelos localizados en complejo apical (micronemas, roptrias y
grnulos densos) y estos son un papel importante en la estimulacin del
sistema inmune. Son expresados tanto en taquizoitos y por bradizoitos
(Priogione et al., 2000). En la literatura son presentados en su mayora
por la abreviacin de las tres primeras letras del organelo de origen. Los
taquizotos en las clulas secretan o excretan hasta el 90% de los tipos
de antgenos de toxoplasma que circulan en el hospedero, ms all de
13

eso, son altamente inmunognicos, desencadenando una respuesta


tanto celular como humoral (Meireles, 2001).
IV.2.2.2.1. Organelos secretorios y protenas

IV.2.2.2.1.1.

Micronemas

Los micronemas tienen funciones relacionadas con la invasin y


adhesin celular. Para llevar a cabo estas funciones, el contenido de
los micronemas es secretado por la zona apical de los zotos,
posiblemente en el momento del contacto inicial con la clula
hospedadora, distribuyndose sobre la superficie del parsito. Una
vez en la superficie del parsito, las protenas de los micronemas
intervienen en la interaccin con las molculas de la clula
hospedadora establecindose una fuerte unin entre el parsito y la
clula para, de esta forma, iniciar el proceso de invasin activa
(Rabenau et al., 2001).
Las protena M2AP facilita el transporte de MIC2 y, que parsitos
mutantes que no expresan M2AP tienen una ineficiencia en la
invasin, presumiblemente por el transporte insuficiente de MIC2
(Huynh et al., 2003). Una actividad adhesiva de protenas de
micronema incluye MIC2 (Carruthers y Sibley, 2004) expresa en todos
los estadios invasivos el parsito bien como MIC1, MIC3, MIC4
(Harper et al., 2004), MIC6, MIC6, MIC7, MIC8, MIC9 y MIC12
(Meissner et al., 2002). Algunas protenas de los micronemas
conocidas como MIC5, MIC10, M2AP y SUB1 no contienen una
secuencia adhesiva obvia, sugeriendo que estas tengas una funcin
alternativa o accesoria (Rabenau et al., 2001).
IV.2.2.2.1.2. Roptrias
Las roptrias son organelas secretorias en forma de botella
electrodensa, delimitada por membranas (Perkins, 1992) y que liberan
sus protenas durante la invasin celular. Producen las protenas
14

secretadas/excretadas, de

tamao

variado

de 42-68

kDa, y

codificadas por los genes de la familia de Roptria: ROP 1, 2, 3, 4, 5, 6,


7, 8 (Beckers et al., 1996) y ROP 9 (Park y Nam, 1999, citado por
Costa, 2008). El papel de estas protenas permanece desconocido,
sin embargo su funcin esta probablemente relacionada con la
invasin, biognesis, mantencin de la vacuola parasitofora y
replicacin (Nakkar et al., 2003; citado por Costa, 2008). Se cree que
las roptrias secretan productos lticos o factores realsadores de la
penetracin (PEF) para facilitar la invasin de T. gondii en la clula
hospedera (Soldati et al., 1995, citado por Costa, 2008).
Mostraron que ROP2 se inserta en la membrana de la vacuola
parasitofora promoviendo la asociacin de estas con las mitocondrias
de la clula hospedera (Sinai y Joiner, 2001). En otro estudio
realizado donde fue disminuida la expresin el gen ROP2 obtuvieron
como resultado: 1) desorganizacin de la biognesis de la roptria y
perjuicio de la accin de la citocinesis, 2) reduccin en la asociacin
de la mitocondria de la clula hospedera como la vacuola parasitofora
y reduccin en la asimilacin de clula husped esteroles, 3)
reduccin de la capacidad del parasito de invadir y replicar en las
clulas fibroblasticas humanas, y atenuacin de la virulencia en el
ratn, confirmando que la liberacin de ROP2 es esencial para la
invasin, replicacin e interaccin husped-parasito (Nakaar et al.,
2003; citado por Costa, 2008).
IV.2.2.2.1.3.

Grnulos densos

Los grnulos densos liberan sus protenas despus de la invasin,


donde la liberacin contina

dentro del hospedero (Carruthers y

Sibley, 1997; citado por Costa, 2008). Esas protenas son fundadas
dentro de la vacuola parasitofora (Dubremetz, 1998; citado por Costa,
2008) y una funcin est relacionada con la sobrevivencia dentro de
la clula

y replicacin (Carey et al., 2000). A diferencia de la

secrecin de las micronemas y las roptrias que ocurre por la regin

15

apical, la secrecin de los grnulos densos ocurre en las regiones


laterales del protozoario (Souza, 2006).
Fueron identificados 9 protenas especficas liberadas por los
grnulos densos (GRA). Una GRA1-8 (Jacobs et al., 1998), una GRA9
(Adjogble et al., 2004). La funcin de las protenas de los grnulos
densos todava no estan bien definidas, posiblemente estas protenas
actuan como una especie de extensor de superficie, pudiendo estar
implicado

en

el

reclutamiento

de

nutrientes,

permitiendo

la

sobrevivencia intracelular y multiplicacin del parsito (Adjogble et al.,


2004). Adems GRA2 contribuye para la virulencia de T. gondii contra
ratones,

lo que fue evidenciado en experimentos con parsitos

mutantes deficientes en GRA2 (Mercier et al., 1998).


Inmunolgicamente, las protenas del grnulo denso son potentes
antgenos para la respuesta de clulas T y B. Esta propiedad fue
explorada en experimentos de vacunacin de roedores, usando el
total de protenas libres de la clula hospedera, protenas purificadas
o DNA (Vercammen et al., 2000). Las protenas del grnulo denso
son producidas en todos los estadios de T. gondii. En el husped
intermediario son producidas por taquizoitos y bradizoitos, en un
grupo, por esporozoitos (Tilley et al., 1997).
La P23, presente en los grnulos densos de los taquizotos y
bradizotos, es secretada por el parsito en la red reticular de las
vacuolas parasitarias y fcilmente detectadas en el suero de los
pacientes con infeccin crnica, lo que no sucede en la infeccin
aguda. La P28 es un antgeno intracelular sintetizado por los
taquizotos, y est presente en los grnulos densos siendo el menor
componente de la red reticular secretada en la vacuola parasitaria
(Wong y Remington, 1993).

16

IV.2.3.

Mecanismo de invasin de Toxoplasma gondii

Los mecanismos por los que Toxoplasma gondii invade las clulas del
husped y forma un nicho intracelular han sido ampliamente estudiado,
pero varios aspectos de este proceso est directamente relacionado con
la inmunidad y patognesis. Durante la invasin, las protenas son
secretadas por orgnulos del parsito, llamado los micronemas, grnulos
densos, y roptrias, en la clula husped. Estas protenas pueden alterar la
funcin de la clula husped e inhibir la respuesta inmune dirigida hacia el
parsito. Tambin sirven para modificar la membrana lipdica que rodea el
parsito, formando un orgnulo intracelular especializado llamado la
vacuola parasitfora (VP). La VP permite el transporte de nutrientes
esenciales de la clula husped para el parsito, al tiempo que evita la
fusin lisosomal, lo que llevara a la muerte del parsito. (Dupont et al.,
2012).
La invasin de clulas de Toxoplasma gondii implica la accin concertada
de la secrecin de la protena junto con la movilidad basada en la actina.
Se requiere una ola inicial de la secrecin de micronemas para la fijacin
de la motilidad y la clula husped. Durante la invasin, el parsito se
invagina la membrana plasmtica de la clula husped para crear un
compartimiento modificado de forma nica llamada la vacuola parasitfora
(VP). Formacin de VP se inicia por la secrecin de un parsito orgnulo
en forma de bulbo llamado el roptria, que contiene un conjunto diverso de
protenas que se liberan directamente en la clula husped y en la
vacuola formanda. Las protenas en el cuello roptria (RON) se secretan
inicialmente en la membrana de la clula husped, donde ayudan a
mediar en la formacin de una unin en movimiento compuesta de RON2,
RON4 y RON5 junto con el AMA1 protena micronemal (Hunter y Sibley,
2012).
Las protenas en el bulbo de la roptria (ROP) son liberados en el citosol
de la clula husped, donde se dirigen al ncleo de la clula husped
(ROP16 y protena fosfatasa 2C (PP2C) o a la superficie de la VP (ROP2,
17

ROP18 y ROP5). La VP se resiste a la acidificacin y la fusin con los


endosomas y lisosomas, mitocondrias y tambin recluta anfitriones y RE
anfitrin, ambos pueden ayudar al parasito en la adquisicin de nutrientes.
La amplia modificacin del VP durante la invasin sugiere que el parsito
modula muchas funciones de la clula husped como parte de su estilo
de vida intracelular. Despus de varias divisiones mitticas, el parasito
hija activa la salida de la clula husped e invade las clulas vecinas
(Hunter y Sibley, 2012).
IV.2.4.

Patogenia por infeccin de Toxoplasma gondii

La penetracin del T. gondii a travs de cualquier va, ya sea oral,


intraperitoneal, etc. sta produce rpidamente una infeccin generalizada.
Sin embargo, en la mayor parte de las infecciones agudas, la va de
infeccin es el intestino (Soulsby, 1987).
As luego de la ingestin de la forma infectiva, los parsitos son liberados
de los quistes tisulares (bradizotos) o de los ooquistes (esporozotos) por
el proceso digestivo en el tracto gastrointestinal del hospedero
(Hernndez e Izquierdo, 2003), siendo liberados a la luz del intestino,
penetrando en el interior de diferentes tipos de clula de la mucosa y
submucosa intestinal, formndose taquizoitos, tanto por invasin activa
como por fagocitosis (Atias y Thiermann, 1994).
Los organismos se transportan por los ganglios linfticos y el sistema
portal con la posterior invasin de varios rganos y tejidos. En infecciones
importantes, la multiplicacin de los taquizotos puede producir reas de
necrosis en rganos vitales tales como miocardio, pulmn, hgado y
cerebro; durante esta fase el hospedador puede desarrollar pirexia y
linfadenopata.

Cuando

la

enfermedad

progresa,

se

forman

los

bradizotos, correspondiendo sta a la fase crnica o de curso


asintomtica (Urquhart et al., 2001)

18

IV.2.5. Respuesta inmunolgica

IV.2.5.1. Respuesta inmune innata por infeccin de Toxoplasma gondii


La respuesta inmunolgica del hospedero inmunocompetente contra T.
gondii, en el curso de la infeccin aguda adquirida es responsable por el
enquistamiento del parsito en la musculatura esqueltica, cerebro y otros
rganos. En este aspecto, los taquizotos asumen la forma bradizotica, la
cual puede permanecer latente por toda la vida del individuo sin causar
dao o muerte. Sin embargo en pacientes inmunosuprimidos, la
toxoplasmosis es una infeccin mucho ms severa, siendo considerada
entre las enfermedades oportunistas de mayor frecuencia, presentndose
en casos de SIDA, enfermedad de Hodgkin y leucemia. En estos
pacientes, la toxoplasmosis activa se puede desarrollar por la reactivacin
de una infeccin toxoplsmica latente previa o bien por una primo
infeccin adquirida naturalmente o en forma iatrognica (transplantes de
rganos o transfusin sangunea) (Atias y Thiermann, 1994).
La inmunidad humoral representada por la produccin de anticuerpos
especficos y el principal indicador para el diagnstico de la toxoplasmosis
en la poblacin. Posee gran validez para la deteccin de los individuos
infectados. Sin embargo, no son fuente de informacin sobre el estado
inmune o la resistencia del hospedero (Mayumi, 2004). Se han descrito
varias clases de anticuerpos que ejercen accin sobre diversos antgenos;
todos ellos se forman a los pocos das de la infeccin y actan sobre las
formas libres en la sangre y en los lquidos extracelulares. Algunos de
estos anticuerpos originan lisis del protozoario, actuando exclusivamente
sobre el parsito extracelular, cuya membrana celular perforan con ayuda
del complemento, lo cual produce escape del citosol (Frenkel, 1986).
Durante la respuesta humoral, el parsito induce rpidamente niveles
detectables de anticuerpos de tipo IgM e IgG en el suero. La evolucin
ms frecuente (> 90% de los casos), sea o no la infeccin sintomtica,
ocurre con nivel elevado de IgM que desaparece despus de varios
meses, siendo el ttulo de IgG ascendente durante dos o tres meses o
19

persistente durante 6 a 12 meses, para despus ir disminuyendo


lentamente. (Hernndez e Izquierdo, 2003).
Los macrfagos son activados siguiendo la fagocitosis de parsitos
opsonizados por anticuerpos. Sin embargo, cuando los taquizotos del
Toxoplasma gondii penetran activamente en los macrfago, evaden los
mecanismos de destruccin, debido que inhiben la fusin de los
lisosomas con el fagosoma, continuando con su multiplicacin intracelular,
la clula infectada, al contener un excesivo nmero de microorganismos
intracelulares, se rompe, liberando taquizotos que invadirn otras clulas
(Tizard, 1995).
Despus de la exposicin con T. gondii, los monocitos, neutrfilos y
clulas dendrticas (DC) son reclutados al sitio de la infeccin, y todos
estos tipos de clulas han sido implicados en la resistencia a este
organismo. Sin embargo, sigue habiendo dudas sobre sus funciones
especficas en el control de la infeccin. Una de las funciones ms crticas
de la respuesta inmune innata a Toxoplasma gondii es la capacidad de
detectar el patgeno y producir la citoquina IL-12, que estimula asesinas
naturales (NK) y clulas T para producir la citocina interfern-gamma (IFN
-). IFN- es el principal mediador de la resistencia a T. gondii y promueve
mltiples mecanismos intracelulares para matar el parsito e inhibir su
replicacin. Esta respuesta inmune Th1, que se define por la produccin
de IL-12 e IFN-, es caracterstico de la infeccin por muchos patgenos
intracelulares, y como es el caso para la infeccin con otros patgenos
intracelulares, ratones deficientes en IL-12 o IFN- que estn infectados
con T. gondii sucumben a la enfermedad aguda y demostrar la
incapacidad para controlar la carga de parsitos (Dupont et al., 2012).
Las clulas asesinas naturales (NK) son otra poblacin innata implicados
en la inmunidad a Toxoplasma gondii, y en ratones que carecen de
clulas T que proporcionan un mecanismo limitado de resistencia a travs
de su capacidad para producir IFN-. Actividad de las clulas NK picos
temprano durante la infeccin, y aunque su actividad es elevada durante
la toxoplasmosis crnica, que no parecen ser importantes contribuyentes
a la inmunidad durante la fase crnica de la infeccin. En consecuencia,
20

la mayora de los estudios se han centrado en los primeros eventos que


controlan la actividad de las clulas NK, lo que lleva a un modelo en el
que IL-12 producidas por otras clulas innatas (por ejemplo, neutrfilos,
monocitos y DCS) promueve la produccin mediada por clulas NK de
IFN-. Adems de IFN-, las clulas NK producen la citocina IL-10, la
importancia de que se discutir ms adelante en esta revisin. Las clulas
NK humanas y murinas tambin pueden ser citotxicos para las clulas
infectadas con Toxoplasma gondii, pero se ha propuesto que las clulas
NK se infectan con el parsito tras la lisis de las clulas infectadas, lo que
puede promover la difusin del parsito (Dupont et al., 2012).
IV.2.5.2. La inmunidad humoral es esencial para la resistencia a la
toxoplasmosis
Durante mucho tiempo se ha reconocido que la infeccin con T. gondii
promueve respuestas de anticuerpos, y que estos anticuerpos puede
matar el parsito. De hecho, IgM, IgA, IgE de anticuerpos especficos del
parsito han sido aislados de pacientes humanos, y la deteccin de
anticuerpos especficos del parsito es una herramienta de diagnstico
eficaz para distinguir individuos recin infectados de aquellos en la fase
crnica de la infeccin. El papel crtico de anticuerpos en la inmunidad a T.
gondii se demuestra por el fenotipo de los ratones MT, que son
deficientes en clulas B. Estos ratones desarrollan respuestas de
apariencia normal, IFN-, pero sucumben a la infeccin dentro de 3-4
semanas despus del desafo, asociados a las altas cargas parasitarias
en el SNC. Este aumento en la susceptibilidad es probablemente debido a
la falta de anticuerpos, como la transferencia pasiva de anticuerpos
confiere proteccin a los ratones deficientes en clulas B. Los anticuerpos
pueden mediar sus efectos protectores a travs de una variedad de
mecanismos. En estudios in vitro han encontrado que pueden opsonizar
parsitos para la fagocitosis, bloquear la invasin, y tambin activar la va
clsica del complemento. La relevancia in vivo de la activacin del
complemento se ilustra por estudios en los que el tratamiento de ratones
con un anticuerpo que se une a los resultados protena C3 del
complemento en la susceptibilidad a la toxoplasmosis aguda. Se
21

requieren estudios adicionales para definir la contribucin de otras


funciones mediadas por anticuerpos (Dupont et al., 2012).

IV.2.6. Mtodos inmunolgicos para diagnstico de Toxoplasmosis

IV.2.6.1.

Sabin-Feldman (RSF)
La reaccin de Sabin y Feldman, que mide preferentemente
anticuerpos de tipo IgG, es una prueba serolgica altamente especfica
y sensible. La tcnica de RSF tiene una sensibilidad de 99% y una
especificidad de 100% (Ovalle et al., 2000).
Es una reaccin de lisis y se fundamenta en el hecho de que los
toxoplasmas vivos no se colorean con una solucin fuertemente
alcalina de azul de metileno (ph:11), al ser sometidos previamente a la
accin de los anticuerpos del suero positivo; debido que stos y el
complemento

ocasionan

lisis

destruccin

de

la

membrana

citoplasmtica; por otra parte en la reaccin negativa, los taquizotos


vivos se tien intensamente de azul con el colorante vital (Cordero del
Campillo et al., 1999).
Para tal efecto se utiliza toxoplasma virulento como antgeno el cual es
expuesto a diluciones de suero y un factor accesorio obtenido de suero
humano libre de toxoplasma. El inconveniente de la tcnica es el costo
del suero humano y la exigencia de trabajar con parsitos vivos (Ovalle
et al., 2000).
IV.2.6.2.

Fijacin de complemento

Es una prueba difcil, no est estandarizada, razones por la cual, cada


vez se utiliza menos. Se basa en la determinacin de la cantidad de
complemento consumido cuando se produce la unin de AntgenoAnticuerpo (Acha y Szyfres, 2003).
El valor diagnstico depende de la calidad del antgeno utilizado. Para
el uso clnico, se recomienda emplear un antgeno poco sensible, que
22

slo de resultados positivos durante las etapas activas de la infeccin.


As aplicado, este mtodo no detecta la totalidad de las infecciones y,
por

consiguiente,

completa,

pero

no

sustituye

pruebas

como

hemaglutinacion indirecta, inmunofluorescencia indirecta, reaccin


Sabin Feldman o reaccin de aglutinacin directa (Atas y Thiermann,
1994).
IV.2.6.3.

Hemaglutinacin indirecta

Esta tcnica detecta IgG y emplea como soporte del antgeno, glbulos
rojos tratados con glutaraldehdo y se basa en la propiedad que tienen
los anticuerpos anti- T. gondii de producir aglutinacin en presencia de
glbulos rojos sensibilizados con antgenos citoplasmticos y de
membrana del parsito. Su principal limitacin es no detectar
infecciones recientes, pues se alcanzan ttulos diagnsticos a los 30
das, mientras que Sabin y Feldman o Dye Test e Inmunoflourescencia
Indirecta pueden detectar IgG e IgM a los 10-14 das (Rojas,1990).
IV.2.6.4.

Mtodo Aglutinacin directa (MAD)

Detecta principalmente anticuerpos IgM e IgG, dirigidos contra


antgenos de superficie, por lo que permite la deteccin temprana; sin
embargo se recomienda su empleo como prueba tamiz en combinacin
con alguna otra tcnica. Tiene buena sensibilidad y correlacin con el
Dye test y ELISA. Al igual que IFI, emplea taquizotos enteros como
antgenos, tratados con formol y se basa en la interaccin del antgeno
anticuerpo (Venturini et al., 2001).
A pesar de ser simple, no cuenta con una aceptacin universal, puesto
que el valor de los resultados depende de la calidad de los antgenos
incluidos en los kits. Algunos antgenos no presentan una sensibilidad
adecuada, y adems, los resultados carecen de especificidad. El valor
de esta prueba como mtodo de diagnstico aumenta con el empleo de
antgenos ms sofisticados (Atas y Thiermann, 1994).).
IV.2.6.5.

Inmunofluorescencia indireta

23

La tcnica de inmunofluorescencia tiene una alta sensibilidad (99%) y


especificidad (100%) y utiliza antgenos muertos estables; es por eso
que viene reemplazando a la tcnica de Sabin-Feldman que a pesar de
obtener resultados equivalente a IFI, sta requiere manipulacin de
parsitos vivos y crianza de ratones (Acha y Szyfres, 2003; Ovalle,
2000).
En esta prueba, se utiliza como antgeno los taquizotos del T. gondii
previamente

formalizados

fijados

en

portaobjetos

de

inmunoflourescencia que posteriormente se enfrentan a diluciones


crecientes del suero problema. La prueba se basa en que ciertas
sustancias

denominadas

fluorocromos,

se

conjugan

con

los

anticuerpos, y al ser expuestos a una luz ultravioleta, emiten un haz de


luz de mayor longitud de onda, que se visualiza con un microscopio de
fluorescencia, permitiendo detectar la presencia de anticuerpos
especficos en una muestra problema (Venturini et al., 2001).
IV.2.6.6.

Inmunoensayo enzimtico o ELISA

La prueba de ELISA es un mtodo de gran sensibilidad y especificidad,


adems puede diferenciar IgM, IgG, IgA e IgE. Elisa para anticuerpos
especficos IgM tiene una sensibilidad de 97% y una especificidad de
100%. El principio de la prueba de Elisa es semejante al de la prueba
de inmunofluorescencia indirecta. No obstante, en lugar de sustancias
fluorescentes se utiliza una enzima unida de manera estable a una
antiglobulina

de

la

especie

investigada.

Las

tcnicas

inmunoenzimticas permiten la deteccin de anticuerpos en un medio


complejo y normalmente se utilizan tres principios tcnicos para la
deteccin de estos anticuerpos: la inmunocompetencia, el mtodo
indirecto y la inmunocaptura (Martn-Hernndez y Garca-Izquierdo,
2003).
IV.2.6.7.

Western blot

Esta prueba se puede utilizar como una ayuda para las pruebas
serolgicas convencionales descritos anteriormente. En esta prueba,
sueros se hacen reaccionar con antgenos de Toxoplasma gondii en
24

una membrana transferido de un gel de poliacrilamida y los patrones de


bandas resultantes se comparan con los controles conocidos de peso
molecular. Esta prueba tiene ha utilizado para distinguir los anticuerpos
IgG presentes en lactantes frente a sueros madre (Dubey, 2010).
La electrotransferencia o western blot se desarrolla en dos pasos: 1)
electroforesis, con lo que se logra la migracin y separacin de los
antgenos debido sus diferentes pesos moleculares en un campo
electrofortico y geles de poliacrilamida. 2) inmunotransferencia,
proceso para que las protenas sean accesibles a la deteccin de los
anticuerpos

se transfiere las protenas del gel

a la membrana de

nitrocelulosa.
IV.2.6.7.1.

Electroforesis
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia
de un campo elctrico; Estas partculas migran hacia el ctodo o
nodo (electrodos y +), en dependencia de una combinacin de su
carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es de destacar que
a escala analtica, los mtodos electroforticos son de alta
sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como mtodo
de separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y
otras biomolculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se
pueden conocer tambin mediante estas tcnicas, las caractersticas
cido-bsicas de las protenas presentes en un extracto crudo, lo que
da la informacin necesaria si se pretende realizar una separacin
cromatogrfica basada en diferencias de carga. Es til adems para
determinar otros parmetros como peso molecular, punto isoelctrico
y nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas (Towbin et al.;
1979).
4.2.7.1.1. Electroforesis SDS-PAGE
La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en
electroforesis en gel, es qumicamente inerte, de propiedades
25

uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible.


Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica,
insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena
visualizacin de las bandas durante tiempo prolongado. Adems tiene
la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede
modificar de manera controlada el tamao del poro (Towbin et al.;
1979).
La electroforesis con SDS es un excelente mtodo para identificar y
monitorear las protenas durante un proceso de purificacin; tambin
se emplea para la determinacin del peso molecular de las
subunidades de protenas. La estructura del detergente SDS
empleado en esta variacin de la electroforesis en gel de
poliacrilamida es CH3 (CH2)10 CH2 = SO3 Na+. El anin se une a las
protenas por absorcin no especfica (aproximadamente una
molcula de SDS por cada dos residuos de aminocidos, con una
relacin SDS/protena mximo de 1,4 g/g). El SDS desnaturaliza por
completo las protenas y rompe las interacciones no covalentes que
determinan la estructura terciaria y cuaternaria. Los grupos alifticos
dodecil se colocan en el interior, mientras que los grupos sulfato en la
superficie y todos los complejos SDS-protena toman carga neta
negativa (que excede la carga intrnseca de las cadenas de
aminocidos). Las protenas reaccionan con SDS a relativamente alta
concentracin, pero se ha demostrado que 0,4 % de SDS es el nivel
mnimo necesario para saturar los sitios de unin de la protena, sin
embargo, se emplea 1 % para lograr un margen de seguridad (Renart
y Reiser, 1979).
4.2.7.2.

Inmunotrotransferencia

Finalizada la electroforesis SDS- PAGE, se puede obtener informacin


acerca de las protenas si stas se transfieren desde el gel a una
membrana. El proceso de transferencia se denomina blotting. Una vez
en la membrana, las protenas estn accesibles (cosa que no ocurre en
26

el gel) para interaccionar con otras molculas que permitan su


identificacin; en la mayora de los casos, estas molculas son
anticuerpos (el proceso se conoce como inmunoblotting), pero tambin
pueden ser lecitinas, cidos nucleicos, receptores o cualquier otro
ligando (Reiser, 1979).

La tcnica de inmunoblot o

inmunotransferencia, proporciona

informacin acerca de la presencia, el peso molecular relativo, y / o


cantidad de un antgeno mediante la combinacin de separacin de
protenas mediante electroforesis en gel con el reconocimiento
especfico de antgenos por anticuerpos. Immunoblotting es til
cuando el antgeno de inters es insoluble o degradado fcilmente.
Dado que la mayora procedimientos de electroforesis en gel dan
como resultado la desnaturalizacin

del antgeno, slo los

anticuerpos policlonales como monoclonales que reconocen la


forma desnaturalizada de un antgeno puede ser utilizado en
inmunotransferencia. (Reiser, 1979).
4.2.7.2.1. Bloqueo
Las membranas con el material transferido se bloquean para impedir
uniones inespecficas del anticuerpo que se utiliza en la tcnica. Este
proceso se realiza mediante la incubacin de la membrana en una
solucin de bloque, compuesta, por lo general, por protenas que no
reaccionan despus con el anticuerpo. Para el bloqueo se puede usar
BSA, que en teora es la ms adecuada para el bloqueo de protenas
fosforiladas, pero la membrana no sale muy limpia, por eso se usa
leche desnatada deshidratada al 5%, que tambin sirve para el
bloqueo de dichas protenas (Fuente et al., 2007).
4.2.7.2.2. Anticuerpo
Las protenas inmovilizadas en la membrana se incuban con
anticuerpos primarios especficos que permiten identificar y cuantificar
protenas concretas de una mezcla compleja de protenas. En la
actualidad se usan fundamentalmente dos tipos de preparaciones de
27

anticuerpos para Western blot

anticuerpos policlonales, cuyas

preparaciones incluyen mltiples molculas de anticuerpo que se


unen a un antgeno concreto, y anticuerpos monoclonales, que
poseen la ventaja de que son especficos en sus interacciones porque
nicamente se unen a un eptopo en particular, es decir a una nica
regin del antgeno protenas (Fuente et al., 2007).
4.2.7.2.3. Deteccin
Existen mtodos de deteccin, como el marcado radiactivo, que se
basan en unin del anticuerpo secundario con I 125, cuya radiactividad
impresiona

una

pelcula

autorradiogrfica.

Las

actividades

enzimticas que se suelen utilizar conjugadas con anticuerpos


secundarios son la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa horseadish
(HRPO), ya que permiten la deteccin de la unin antgenoanticuerpo mediante sustratos luminiscentes. Tambin se pueden
usar sustratos cromognicos, pero la deteccin de los sustratos
luminiscentes es mucho ms rpida y ms sensible (Fuente et al.,
2007).

Fig 2: Deteccin colorimtrica de las bandas de protenas (Advansta, 2011)

28

4.3.

MARCO CONCEPTUAL

Anticuerpo. Protena sangunea que se sintetiza como respuesta frente


a un antgeno.
Antgeno.- Sustancia extraa al organismo y frente a la cual se produce
un anticuerpo.
Cepa.-Variante fenotpica de una especie, usualmente propagado
clonalmente, para mantener sus caractersticas definitorias.
Clulas de tipo fibroblstica: Morfologia irregular o fusiforme,
Crecimiento en monocapa: Las clulas se adhieren al sustrato,
creciendo y dividindose en una nica capa celular (monocapa).
Cultivo celular: Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de
las clulas in vitro, conservando al mximo sus propiedades fisiolgicas,
bioqumicas y genticas.
Cultivo de clulas: Actualmente se entiende por cultivo celular al
conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de las clulas 'in
vitro', manteniendo al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas
y genticas.
Dioxido de carbono: Influye en la cantidad de CO2 disuelto, mantiene el
pH y la cantidad de iones bicarbonato.
Eptopo:

Un eptopo o determinante

antignico es

la

porcin

de

una macromolcula que es reconocida por el sistema inmunitario,


especficamente la secuencia a la que se unen los anticuerpos
Excrecin: Proceso fisiolgico, que le permite al organismo eliminar
sustancias de desecho y txicas.
Inmunidad. Capacidad de nuestro organismo para resistir a la infeccin.

29

Inmunizacin.- Proceso de induccin de inmunidad artificial frente a un


preparado antignico
Inmunodiagnstico.- Tcnica usada en estudios epidemiolgicos que
detecta y/o emplea anticuerpos especficos para un patgeno.
Inmunogenicidad: Capacidad que tiene el sistema inmunitario de
reaccionar frente a un estmulo qumico de naturaleza generalmente
proteica.
Invasin.- proceso que se da como resultad de los factores de virulencia
(componentes de un organismo que le permite colonizar, invadir,
proliferar).
Lnea celular: Cultivo celular que tiene alta capacidad de multiplicarse
in vitro, establecido a partir del primer subcultivo de un cultivo primario y
que tiene las mismas caractersticas que el tejido de origen.
Parsito. Cualquier ente vivo que vive en o sobre otro organismo vivo.
Patgeno. Organismo capaz de causar una enfermedad infecciosa.
Patogenicidad.- Capacidad de un agente infeccioso de producir una
enfermedad en un husped susceptible.
Protena. Sustancia del grupo de compuestos orgnicos (C-H-O-N).
Pasaje o subcultivo: Transplante de clulas de un envase de cultivo a
otro u otros.
RPMI.- El medio Roswell Park Memorial Institute , medio de cultivo rico
en protenas, glucosa y aminocidos esenciales, ms conocido por su
siglas, RPMI, es usado para cultivos celulares.
Secrecin: Proceso por el que una clula o parasito vierten al exterior
sustancias de cualquier clase.
Sonicacin.- Aplicacin de ultrasonidos (vibraciones de alta intensidad
que generan ondas de ultrasonido) para agitar las partculas de una
muestra, con fines cientficos.

30

Suero fetal bovino (SFB).- Subproducto del faenamiento de vacas


preadas, nico y enriquecedor universal de medios de cultivo.
SDS-PAGE:

sodium

dodecyl

sulfate

polyacrylamide

gel

electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato


sdico).
Virulencia.- Grado en que un patgeno puede causar enfermedad.
Western Blot.- Tcnica analtica usada para detectar protenas
especficas.

V.

JUSTIFICACIN

En la inmunologa del husped frente a Toxoplasma gondii, muchos factores


podran afectar para que este parasito pueda ser reconocido por el sistema
de defensa humoral, una de las explicaciones podra ser que las protenas
que expresa este parasito, especficamente en el estadio de taquizoitos,
lleguen a

evadir completamente los anticuerpos dirigidos a una o ms

protenas del parasito.

31

Estudiar la inmunogenicidad de las protenas secretor/excretor y proteinas


totales de Toxoplasma gondii, es necesario para comprender mejor los
mecanismos fisiopatolgicos involucrados en el desarrollo de la infeccin
tanto como en la respuesta del husped y comprender la enfermedad de
toxoplasmosis.
Su estudio permitir evaluar que tan inmungenos son los antgenos
secretados/excretados y antgenos totales de taquizoitos de T. gondii para
ser considerados en el diagnstico de toxoplasmosis, esto podra contribuir
en el desarrollo de nuevas formas de diagnstico, desarrollo de nuevas
terapias para la prevencin, tratamiento de la infeccin.

VI.

OBJETIVOS DE ESTUDIO

Objetivo general
Evaluar la inmunogenicidad del antgeno secretor/excretor y antgenos
totales de Toxoplasma

gondii y su utilidad para diagnstico de

toxoplasmosis.
Objetivos especficos
32

Obtener antgenos secretor/excretor y de taquizoitos de Toxoplasma gondii


a partir de cultivos in vitro en la lnea celular LLC-MK 2 -Rhesus Monkey
Kidney epithelial cells.
Extraer antgenos totales de taquizoitos de Toxoplasma gondii mediante la
aplicacin del mtodo de sonicacin.
Determinar el peso molecular de los antgenos
antgenos

totales

de

taquizoitos

Toxoplasma

secretor/excretor y
gondii

mediante

electrotransferencia SDS-PAGE.
Evaluar la inmunogenicidad de los antgenos secretor/excretor y antgenos
totales de los taquizoitos de Toxoplasma gondii por la tcnica de
Inmunoelectrotransferencia.

VII.

HIPOTESIS

Hipotesis general
Las protenas obtenidas del antgeno secretor/excretor y antgenos
totales de Toxoplasma gondii son inmunogenicas y sern tiles para el
diagnstico de la toxoplasmosis.
Hipotesis especificas
A partir de cultivos in vitro en la lnea celular celular LLC-MK 2 -Rhesus
Monkey Kidney epithelial cells se obtienen antgenos secretor/excretor
de taquizoitos de Toxoplasma gondii.

33

Aplicando el mtodo de sonicacin, se obtendr por extraccin de


antgenos totales de taquizoitos de Toxoplasma gondii.
Los antigenos de secretor/excretor y antigenos totales migrarn por
corrida electrofortica de acuerdo a su peso molecular.
La tcnica de inmunoblot permitir evaluar la inmunogenicidad los
antigenos de secrecin/excrecin yantigenos totales de taquizoitos de
Toxoplasma gondii

VIII.

UTILIDAD DE LOS RESULTADOS DE ESTUDIO


De evaluar la inmunogenicidad de los antgenos secretor/excretor y
antgenos totales de taquizoitos de Toxoplasma gondii contribuir en la
bsqueda de nuevas protenas inmunognicas candidatas para mejorar
el diagnstico de la toxoplasmosis; tambin contribuir a enriquecer el
conocimiento cientfico y ayudara a resolver algunas interrogantes como
que protenas de secrecin /excrecin y protenas totales de taquizoitos
de Toxoplasma gondii

son reconocidas por el sistema inmune del

hospedero, as tambin permitir contar con una nueva herramienta para


el diagnstico y la investigacin en toxoplasmosis, y servir como

34

diagnstico de respaldo de tcnicas serolgicas convencionales como el


ELISA e IFI.
IX.

METODOLOGIA
IX.1.

Tipo de investigacin

El tipo de investigacin ser descriptivo y analtico.


IX.2.

Poblacin y muestra de la investigacin

IX.2.1. Poblacin
Sern los taquizoitos de Toxoplasma gondii cepa RH, altamente virulenta,
no cistogenica y de multiplicacin rpida (Howe y Sibley, 1995).
IX.2.2. Muestra
Sern las protenas de secrecin/excrecin

producidos en cultivo y los

antgenos totales de taquizoitos de Toxoplasma gondii los cuales son


mantenidos en el laboratorio de enfermedades infecciosas Inmunologia
del laboratorio de investigacin y desarrollo

de la Universidad Peruana

Cayetano Heredia-Lima.

IX.3.

Operacionalizacion de variables

IX.3.1. Variables
- Variable independiente: Antgenos secretor/excreto y total de T. gondii.
- Variable
depedientes:
Inmunogenicidad
de
los
antgenos
secretor/excretor y antgenos totales.
IX.3.2. Operacionalizacin de variables, dimensiones, indicadores e
ndices.
Variables
Variable

Dimensin

Indicadores

ndices

independiente
Concentracin de .
35

Antgenos

Cultivo

secretor/excret

axenico

protenas
de travs

or y antgenos taquizoitos
totales

de

a Presencia de
del proteinas por

mtodo Bradford

T. de T. gondii

gondii.

cepa RH.

electrotrofore
sis

Sonicacion

SDS-

de PAGE.

taquizoitos de T.
gondii.

Variable
dependiente
Presencia de
Inmunogenicid
ad

de

Presencia de Ensayo

de bandas

protenas por tcnica

de inmunigenica

las electrotransfe

protenas

rencia

obtenidas.

PAGE

Inmunoblot.

s.

SDSAusencia de
bandas
inmunogenic
as.

36

IX.4.

Tcnicas y procedimientos de recoleccin de datos

IX.4.1. Obtencin de antgenos secretor/excretor y antgenos totales de


taquizoitos de Toxoplasma gondii mediante cultivos in vitro en
lnea celular LLC-MK2 -Rhesus Monkey Kidney.
IX.4.1.1.

Cultivo de lnea celular LLC-MK2

En la investigacin se utilizara la lnea celular LLC-MK 2Rhesus Monkey


Kidney epithelial cell, procedente de fibroblasto de rin de mono. La
lnea celular se empleara para el mantenimiento y produccin de
taquizoitos de Toxoplasma gondii.
Fundamento:

Las

lneas

celulares

son

clulas

provenientes

generalmente de carcinomas lo cual le da la facultad de

tener una

replicacin constante, pero no finita, para ello necesitan de modificacin


genticas con lo que se da lugar a clulas de crecimiento indefinido y
as facilitan su cultivo y mantencin in vitro.
Procedimiento:
-

Sembrar

las

clulas

LLC-MK

los

sern

mantenidas

indefinidamente en cultivos en monocapa por pases sucesivo en


frascos de cultivo con medio RPMI 1640 suplementado con 2% de
37

suero fetal bovino (SFB)y antibiticos como 50ug/ml de penicilina


y estreptomicina e incubadas a 37C, 5% de CO2 y 95% de
-

humedad relativa;
Cambiar de medio nuevo cada 2-3 das por medio fresco.
- Cada 7-8 das se proceder a realizar subcultivos por ello se
empler una solucin de Trypsin- EDTA 1X (Sigma Aldrich) para
despegar las clulas, dejndola en contacto con ellas durante 10
minutos con el fin de que, al actuar sobre el calcio de las
-

membranas, el EDTA las haga desprenderse.


Posteriormente sern conservadas mediante crio-preservacin en

nitrgeno lquido.
La congelacin se llevar cabo en crio-viales (crio tubos con una
capacidad de 1ml) en los que se aaden el pellet de clulas re

suspendidas en medio DMSO freezer (Sigma).


Se har descender la temperatura de forma gradual: -20C por 1
hora, -70C por una noche, luego sern transferidas a un tanque
de nitrgeno lquido.

IX.4.1.2.

Cultivo in vitro de taquizoitos de Toxoplasma gondii cepa RH

Fundamento: Toxoplasma gondii no ha sido cultivado en medios libres


de clulas, a pesar de que contiene los citocromos, glicoltica, hidroltica,
lpidos, y respiratorio. Toxoplasma gondii puede ser cultivada en los
animales de laboratorio, en los embriones de pollo y cultivos celulares.
Los taquizoitos de T. gondii se multiplican en casi todas las lneas de
clulas de mamfero en cultivo de tejidos. La propagacin en clulas a
cabo tal como fibroblastos se utiliza comnmente. El rendimiento de
taquizotos variar con la lnea celular y la cepa de Toxoplasma gondii El
tiempo medio de generacin de taquizoitos de la cepa RH es de 5 horas.
A diferencia de pasaje en ratones, el paso de taquizotos en cultivo
celular no se conoce para alterar la virulencia del organismo (Dubey,
2010).
Procedimiento:
-

Para la produccin continua del parasito se infectara una


monocapa de clulas LLC-MK2 con taquizoitos de T. gondii cepa

38

RH segn los procedimientos propuestos por Nakazawa et al.;


-

2001, con algunas modificaciones.


La infeccin se realizara con

aproximadamente 5 x 10 6

taquizoitos, con medio RPMI 1640 suplementado con 2mM de Lglutamina, 1mM de piruvato de sodio, 1mmM aminocidos no
-

esenciales y con 2% de SFB.


Sern incubadas en 5% de CO2, 95% de humedad a 37C por 48
horas.

IX.4.1.3.

Obtencin de antgenos secretor/excretor de taquizoitos de

Toxoplasma gondii
Fundamento: En el cultivo celular en el despus de la infeccin se
desarrolla Toxoplasma gondii intracelulares, se liberan los taquizoitos,
as sucesivamente, durante este proceso de produce la liberacin de
protenas de secrecin

y excrecin en el sobrenadante (medio de

cultivo) por parte del parasito. Este sobrenadante es el antgeno secretor


y excretor (Dubey, 2010).
Procedimiento:

- Los antgenos secretor/ excretor de taquizoitos de T. gondii


cepa RH se obtendrn siguiendo el mtodo de Umezawa et al.

2001/2006.
Brevemente,

el

sobrenadante

de

las clulas

LLC-MK2

infectadas con 5x106 taquizoitos de T. gondii, se cosechar el


sobrenadante del cultivo.
- Luego ser centrifugado a 1000 rpm x 2 min esto con el fin de
que precipiten las clulas, se recuperara el sobrenadante,
luego se centrifugar a 3500 rpm por 10 min.
- El sobrenadante ser filtrado en una membrana de acetato de

celulosa de poro (0.20 m) (Millipore Laboratories).


Se agregara inhibidores de proteasa, luego almacenado a -70
o

C hasta su uso.
- Los niveles de protenas se determinarn por el mtodo de
Bradford segn Nakazawa et al. 2001.

39

IX.4.1.4.

Obtencin del Antgeno total (LISIS) de taaquizoitos de T.

gondii cepa RH
Fundamento: Se basa en la aplicacin de ultrasonidos (vibraciones de
alta intensidad que generan ondas de ultrasonido), donde el parasito es
re suspendido en una solucin que con el ultrasonido se logra millones
de burbujas microscpicas de esta manera logrando el rompimiento de
la clula parasitaria , logrando la liberacin de protenas solubles (Dubey,
2010).
Procedimiento:
-

Los taquizoitos en el sobrenadante

de los cultivos celulares

infectados, sern cosechados.


Luego centrifugados a 3500rpm X 10 min. A 4 C), lavados por

tres veces con solucin tamponada fosfato salino (PBS).


El precipitado obtenido (taquizoitos) ser sonicado por 30

min.a 3 Hertz.
Los parsitos lisados sern centrifugados por 30 minutos a 10

000rpm.
El sobrenadante ser filtrado y luego almacenado a -70 oC

hasta su uso.
Los niveles de protenas se determinarn por el mtodo de
Bradford segn Nakazawa et al., 2001

IX.4.2. Determinacin del peso molecular de


secrecin/excrecin

antgenos

los antgenos

totales

de

de

taquizoitos

Toxoplasma gondii mediante electrotransferencia SDS-PAGE.


IX.4.2.1.

Electrotransferencia SDS-PAGE

Fundamento:

Es

una

tcnica

analtica

usada

para

detectar protenas especficas en una muestra determinada, mediante


una electroforesis en geles
atendiendo

al

SDS- PAGE, se separan las protenas

criterio

molecular, estructura, hidrofobicidad.


una membrana

que
Luego

se
son

desee: peso
transferidas

de nitrocelulosa, para poder buscar la protena de

inters con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se detecta


la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica, de esta forma se
40

puede estudiar la presencia de la protena en el extracto (Towbin et al,


1979, Renart et al. 1979).
Procedimiento:
-

El antgeno secretor/excretor y antgenos totales de taquizoitos

se identificaran en corrida de geles SDS-PAGE.


Los antgenos de taquizoitos se separaran en SDS-PAGE 15%

tal como se describe por Laemmli,1970.


Brevemente, las muestras antgenos secretor/excretor a partir
de cultivo celular,

las protenas de lisado

de T. gondii se

prepararan por ebullicin.


La muestra se someter a un bao de agua 95-100C durante

cinco minutos.
Se cargara en la parte superior del gel (staking gel) con 5% de
acrilamida y 15% de acrilamida en gel de apilamiento (resolvin
gel). SDS-PAGE se llevara a cabo en tampn Tris-glicina (pH =

8,3).
Se usara una corriente constante de 100 V durante 1 hora.
Despus de la electroforesis se teir el gel con azul de

Coomassie.
Se decolorara el gel y se visualizara las bandas de protenas

de color azul en el gel.


La masa molecular relativa de cada banda reconocida se
determinara

por comparacin con

marcadores

moleculares (Laemmli,1970).
Las protenas separadas por electroforesis sern transferidas a
una membrana de nitrocelulosa

estndar

a 100 V con tampn de

transferencia por 1h y media.


Despus de la transferencia la membrana de nitrocelulosa ser
bloqueada con 5% de leche descremada y 0.05 Twen 20

durante 30 minutos a temperatura ambiente.


Luego la membrana de nitrocelulosa se guardara a -20C hasta
su uso.

41

Fig 3 : Concentracin de bandas de protenas por el flujo inico en


el sistema discontinuo de Laemmli. (Advansta, 2011)

IX.4.3. Evaluacin de la inmunogenicidad de los antgenos obtenidos


de productos de secrecin/excrecin y total de taquizoitos de
Toxoplasma gondii
9.4.3.1. Inmunoblot de antgenos secretor/excreto y antgenos
totales
Fundamento: Es un tipo de inmunodiagnstico que permite

ver un

patrn de bandas, donde los anticuerpos de animales incluido el hombre


con toxoplasmosis deben de reconocer. El inmunoblot se desarrolla para
la deteccin de anticuerpos especficos presentes en el hospedero u
organismo que haya generado anticuerpos contra Toxoplasma gondii ,se
incuba con el suero del paciente el cual si es positivo reaccionar
mostrndose una mancha marrn,

Finalmente, se detecta la unin

antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica, de esta forma se puede


estudiar la presencia de la protena en el extracto (Towbin et al, 1979,
Renart et al. 1979).
Procedimiento:
-

La membrana de nitrocelulosa se lavara tres veces con PBS


(buffer fosfato salino).

42

Luego se incubaran con muestras de sueros de ratas con


toxoplasmosis a temperatura ambiente durante 16 horas con

PBS twen 0.3% con 1% de leche descremada en agitacin,


Al da siguiente se lavara tres veces con PBS para eliminar

los anticuerpos no unidos.


A continuacin, se incubaran con conjugado de cabra antiratn IGM e IgG diluido en PBS-Twen 0.03% durante 2 horas

en agitacin.
Luego lavar 3 veces con PBS-Twen 0.03% y 2 veces con PBS

solo.
Para revelar se sumergen las tiras en solucin de sustrato que
consta de 0,5 mg / mL diaminobenzidina (DAB) y 0,1% de

perxido de hidrgeno en PBS.


Para visualizar el patrn de bandas inmunogenicas, se
observaran las bandas de color marrn.

IX.5.

Diseo y anlisis estadstico

43

X.

AMBITO DE ESTUDIO

El estudio se realizar en Laboratorio de Investigacin de


Infecciosas, rea: Inmunologa-Toxoplasma,

Enfermedades

de la Facultad de Ciencias y

Filosofa de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH). Distrito de San


Martn de Porres, LimaPer. El laboratorio en cual se realizar el estudio
cuenta con un nivel de bioseguridad de tipo II. Adems tiene los equipos y
ambientes apropiados para el adecuado manipuleo y
44

ejecucin de los

experimentos

para

este estudio como para diferentes trabajos de

investigacin.
XI.

RECURSOS

XI.1.

Recursos humanos
-

1 persona (tesista) para que realice el cultivo de los taquizoitos de


y obtenga los diferentes antgenos

de Toxoplasma gondii

evalu la inmunogenicidad de estos antgenos.

XI.2.

Recursos materiales

Material biolgico
- Lnea celular: Se utilizar la lnea celular LLC-MK2 (Rhesus
monkey kidney epithelial cells) fibroblastos de mono, sern
obtenidos de

American Type Culture Collection (Rockville,

MD). Se usar como soporte celular para la obtencin de


-

taquizoitos.
Parsitos: Taquizoitos de T.

gondii cepa RH, altamente

virulenta, no cistogenica y de multiplicacin rpida (Howe y


-

Sibley, 1995).
Sueros de ratas con toxoplasmosis.

Material de laboratorio
- Pipetas Pasteur
- Pipeta serolgicas de 10 ml.
- Puntas (tips) 1000l y 200 l.
- Tubos cnicos de plstico de 15 y 50 ml
- Tubos de plastico Ependorffs siliconados de 1.5 ml
- Crioviales
- Papel toalla
- Frascos de cultivo celular
- Jeringas
- Filtros estriles de 0.22 um
45

- Termmetro
- Filtros para esterilizar
- Gradillas
Equipos:
- Cabina de flujo laminar
- Incubadora con CO2 y humedad
- Microscopio de luz
- Microscopio invertido
- pH metro
- Suministro de CO2
- Sonicador
- Autoclave
- Bomba de vaco
- Refrigerador
- Congeladoras 20C y -70C
- Baln de nitrgeno lquido
- Pipeteador
- Vortex
- Stir
- Rocker
- Cmara digital
- Cmaras de corridas electroforticas
- Cmara de transferencia

Reactivos qumicos:
- Hepes
- Bicarbonato de sodio (NaHCO3)
- L- Glutamina
- Suero Fetal Bovino
- Piruvato de Sodio
- Aminoacidos no esenciales
46

- Inhibidores de proteasas
- Agua Milli Q (tridestilada)
- Buffer fosfato salino (PBS)
- Tripsina-EDTA
- Medio de crio preservacin (Frezer medium DMSO)
- Reactivo de Bradford
- BSA (albumina serica bovina)
- Azul Tripan (colorante vital)
- Calibradores de pH
Antibiticos:
- Penicilina
- Gentamicina
Para Western blot
- Geles de poliacrilamida
- Solucion upper
- Solucion lower
- Solucion de transferencia
- Buffer de muestra (SDS, Trackin dye, DTT, glicerol)
Bioseguridad

XI.3.

Guardapolvo

Guantes de nitrilo

Barbijo

Gorro

Presupuesto

Rubros

Presenta
cin

47

Can
t.

Precio
unitario
($)

Precio
total ($)

Material Biolgico:
Clulas LLC-MK2

Vial

256

256

Unidad

411

411

Unidad

452

452

Pack de
1000

16.60

18.80

37

347

347

240

240

20

40

250 ml

30

30

10 L

124

124

Bicarbonato de sodio

250 g

26

26

Hepes

250 g

142

142

Suero Fetal Bovino

500 ml

680

680

Goat anti-IgG rabbit


-HPR

0.5 ml

93

93

1 mg.

151

151

100 ml

30

30

100 ml

32

32

Materiales de
laboratorio:
Micropipeta de 2-200 l
Micropipeta de 2001000 l
Puntas amarillas 2-200
l
Puntas azules 200-1000
l
Frascos de cultivo
celular
Filtros para geringa 2
m

Pack de
1000
Pack de
200

33

100 unid
Pack x 25

Pipetas serolgicas de
10 ml
Reactivos:
Alcohol Isopropilico
Medio RPMI 1640

Glucosa
Piruvato de Sodio
Aminoacidos no
esenciales

TOTAL

48

3124

Total (en dlares)

$ 3124.00

Total en soles (cambio S/.3.00)

S/. 9.384

Subvencin otorgada por la institucin a realizarse el proyecto


Todos los materiales, reactivos y equipos que se utilizaran en este
estudio sern financiados

por el

Laboratorio de Investigacin en

Enfermedades Infecciosas (LIEI) del LID de la

Universidad Peruana

Cayetano Heredia-Lima.
XII.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

El trabajo se realizar ntegramente en el Laboratorio de enfermedades


infecciosas: Inmunologia de Laboratorios de investigacin y desarrollo de la
Universidad Peruana Cayetano Heredia- Lima.
ACTIVIDAD
Elaboracin
del proyecto
Presentacin
de proyecto
Aprobacin
de proyecto
Periodo

oct-14
X

nov14

dic-14

ene15

feb-15

mar15

abr-15 may-15 jun-15

X
X
X
X

experimental
Anlisis de

X
X

datos
Seminario de

avance
Redaccin

de tesis
Correccin

de tesis
Revisin

X
X
X
X
X
X
bibliogrfica
- La defensa de la tesis ser en Julio del 2015.

49

XIII.

REVISION BIBLIOGRAFICA

Acha, P.y B. Szyfres. Zoonosis y Enfermedades Transmisibles Comunes al


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