ComposiciÃ N Esteroidal de Ofiuroideo

UNIVERSIDAD DEL MAR
CAMPUS PUERTO NGEL, OAXACA
ESTUDIO PRELIMINAR DE LA COMPOSICIN

ESTEROIDAL DEL OFIUROIDEO Ophiocoma aethiops
(Ltken, 1859)
TESIS PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE
BILOGO MARINO
PRESENTA
MARA ZULEMA JUREZ CORTS
DIRIGIDA POR
M. EN C. MA NIEVES TRUJILLO TAPIA
Puerto ngel, Oaxaca Febrero del 2011
Puerto ngel, Oaxaca, Febrero del 2011
HIDROBIL. GABRIELA GONZLEZ MEDINA

JEFA DE LA CARRERA DE BIOLOGA MARINA
DE LA UNIVERSIDAD DEL MAR
PRESENTE
Despus de haber analizado y evaluado la tesis
Estudio preliminar de la
composicin esteroidal del ofiuroideo Ophiocoma aethiops (Ltken,1859) que

presenta la C. Mara Zulema Jurez Corts, le comunicamos que cumple con los
requisitos acadmicos para que la citada tesista presente el correspondiente examen
profesional.
ATENTAMENTE
COMISION REVISORA
M. en C. Ma Nieves Trujillo Tapia
Dra. Angelina Flores Parra
Dra. Ma. del Socorro Garca Madrigal
Dr. J. Marco Vinicio Ramrez Mares
M. en C. Julia Patricia Daz Martnez
ii
RESUMEN
En la actualidad, se ha demostrado que el estudio de la composicin esteroidal de

especies de equinodermos con diferentes hbitats da una idea de cmo, factores
poblacionales, estacionales y geogrficos influyen a lo largo de la ruta biogentica de
estos metabolitos. Por ello en este trabajo se realiz un estudio preliminar sobre la
composicin esteroidal de estos organismos, para lo cual se llevaron a cabo dos
muestreos en la playa La Tijera, Oaxaca, en Abril del 2009 y en Marzo del 2010. La
biomasa total obtenida fue sometida a dos tratamientos, los cuales consistieron en
una extraccin fraccionada de mayor a menor polaridad
y una extraccin por
disolvente individual respectivamente, utilizando los disolventes metanol, butanol,

acetato de etilo, cloroformo y hexano en el tratamiento 1 y hexano, cloroformo y
acetato de etilo en el tratamiento 2; se evaluaron tres tiempos de extraccin 6, 12 y
24 horas; siendo 24 horas el que mejor rendimiento di, posteriomente se determin
y cuantific la presencia de esteroides mediante la prueba Liebermann-Burchard, los
extractos positivos fueron analizados por cromatografa en capa fina probando 6
fases mviles benceno-acetato de etilo (50:10); butanol-acetato de etilo-agua
(40:50:10), (120:30:10); etil ter-ter de petrleo (1:99), (4:96) y (8:92), siendo esta
ltima proporcin la ms adecuada para la separacin de los compuestos. La
separacin de los mismos fue realizada por cromatografa en fase slida y columna
abierta, obteniendo las fracciones finales 3H, Z3 y A, las cuales se estudiaron por
Resonancia Magntica Nuclear (RMN), espectroscopa de masas y espectroscopa
infrarroja (IR), encontrndose en la fraccin 3H un compuesto con el anillo esteroidal,
el cual no pudo ser identificado completamente. En Z3 se identificaron dos
compuestos esteroidales y en A no pudo identificarse ninguno de los dos compuestos
presentes.
iii
El amor, el ejemplo y las lecciones que los padres brindan a sus hijos, as como las
distintas experiencias que ofrece la vida, y las decisiones que tomamos de manera
individual, nos ayudan a formar el carcter y ser mejores cada da. Por esta razn
quiero dedicar este trabajo a mis padres Benito Jurez Gutirrez y Mara Corts
Hernndez, quienes son para mi, grandes ejemplos de lucha y superacin.
INDIVISA MANENT
(Permanezcamos siempre unidos)
iv
AGRADECIMIENTOS
El trabajo en equipo permite la realizacin de un objetivo o meta, por ello deseo

agradecer a todas esas personas que colaboraron para que este trabajo de tesis se
hiciera realidad.
En primer lugar agradezco a mis padres quienes a pesar de todas las dificultades
que han vivido, siempre me han apoyado y motivado para cumplir mis objetivos. Los
amo, como ustedes nadie.
A mis hermanas, Viviana Ins Jurez Corts y Rosario Jurez Corts quienes a
pesar de la distancia siempre han estado conmigo en las buenas y las malas.
A Jorge Alberto Snchez Burgos persona especial para m y adems pilar de este
trabajo, que sin la gua, la paciencia y el conocimiento que me ha brindado, no s si
esto se hubiera hecho realidad. Gracias por la motivacin y el apoyo.
A mis amigas y amigo: Aurora Villa Esparragoza, Hermelinda Santiago Gutirrez,

Perla Elizabeth Carrasco Bautista, Esmeralda Morales Domnguez, Cristina
Hernndez Tlapale, Rosa Estela Cerqueda y Miguel Matus (oito) gracias por los
bellos momentos, por los disgustos, por el apoyo, por las ricas comidas y cenas, por
las tardes y noches de tertulia y pelculas, por los tecitos para mi tos, por las risas y
por toda la compresin brindada a este ser humano imperfecto. Las quiero mucho y a
ti tambin oito.
A Ins Cruz Salinas y Bricio de Nova por abrirme la puerta de su hogar y

considerarme como un miembro ms de su familia, y en especial a ti Ine porque
nunca me dejaste sola, gracias por todo tu apoyo en los malos momentos
emocionales y econmicos, eres una gran amiga y mam postiza.
A Samantha Flores Morales quien me brind su amistad cuando cre que me haba
quedado sola.
Al Dr. Rolando Cardea, Cristina Hernndez, Ma. Trinidad Domnguez, H. Hiram

Ortiz, Jorge Snchez, Lorena Contreras, Elizabeth Franco y Leonides Aquino quienes
colaboraron con su tiempo y esfuerzo para que los muestreos se pudieran llevar a
cabo.
A mi directora de tesis Ma Nieves Trujillo Tapia, por aceptar el reto de este trabajo, y
por la motivacin que me brind en mis malos momentos.
A la Dra. Angelina Flores Parra, Profesora en el Departamento de Qumica del Centro

de Investigacin y de Estudios Avanzados (Cinvestav), por su ayuda en la
identificacin de los compuestos aislados.
Al Dr. Marco Vinicio Ramrez Mares jefe del Laboratorio de Investigacin de Biologa
y Qumica por todas las facilidades brindadas, as como por sus observaciones a este
trabajo.
vi
INDICE GENERAL
Pgina
RESUMEN................................................................................................................... iii
DEDICATORIA ........................................................................................................... iv
AGRADECIMIENTOS................................................................................................v
INDICE GENERAL ................................................................................................... vii
INDICE DE FIGURAS................................................................................................x
INDICE DE CUADROS .......................................................................................... xiii
INDICE DE ECUACIONES.................................................................................... xiv
1. INTRODUCCIN .................................................................................................. 1
1. 1 Phylum equinodermata ........................................................................................ 2
1.1.1 Clase ophiuroidea ....................................................................................... 2
1.1.1.1 Ophiocoma aethiops (Ltken, 1859) ............................................. 4
1.2 Los lpidos: Clasificacin y funcionalidad en los organismos vivos ..................... 5
1.2.1 Esteroides: clasificacin, estructura molecular y funciones que
desempean en los organismos................................................................ 6
1.2.2 Biosntesis de esteroles en organismos marinos ....................................... 8
1.2.3 Esteroides presentes en invertebrados marinos ....................................... 9
1.3 Mtodos de extraccin de lpidos ....................................................................... 11
1.4 Determinacin de colesterol y derivados ............................................................ 12
1.5 Tcnica de cuantificacin por curva de calibracin ............................................ 13
1.6 Mtodos de separacin de lpidos ...................................................................... 13
1.6.1 Mtodos cromatogrficos ......................................................................... 13
1.6.1.1 Cromatografa en capa fina (TLC) ................................................. 14
1.6.1.2 Separacin en columna abierta .................................................... 15
1.6.1.3 Extraccin en fase slida .............................................................. 15
1.7 Tcnicas de dilucidacin..................................................................................... 16
1.8 Estudios realizados a nivel bioqumico y tecnolgico en equinodermos ............ 17
1.8.1 Estudios bioqumicos y biotecnolgicos realizados en la clase
Ophiuroidea ........................................................................................... 17
2. HIPTESIS........................................................................................................... 19
3. OBJETIVOS ......................................................................................................... 19
3.1 General ............................................................................................................... 19
3.2 Particulares......................................................................................................... 19
4. MATERIAL Y MTODOS .................................................................................. 20
4.1 Zona de recolecta ............................................................................................... 20
4.2 Recolecta e identificacin ................................................................................... 21
4.3 Trabajo de laboratorio......................................................................................... 21
4.3.1 Extraccin de los compuestos esteroidales .............................................. 21
vii
Pgina
4.3.2 Determinacin colorimtrica de esteroides por la reaccin de
Liebermann-Burchard (modificado de Parekh y Chanda, 2006) .............. 23
4.3.3 Cuantificacin de compuestos esteroidales .............................................. 23
4.3.3.1 Curva de calibracin .................................................................... 23
4.3.3.2 Determinacin de la concentracin de compuestos
esteroidales en los extractos crudos de O. aethiops .................. 24
4.3.3.3 Anlisis estadstico ........................................................................ 24
4.3.4 Separacin de los compuestos esteroidales mediante tcnicas
cromatogrficas ....................................................................................... 24
4.3.4.1 Cromatografa en capa fina ........................................................... 24
4.3.4.2 Cromatografa en fase slida y columna abierta (Pea et
al., 2003) ....................................................................................... 25
4.3.4.3 Evidencia y limpieza de los compuestos esteroidales de
las fracciones obtenidas de los extractos crudos de O.
aethiops ........................................................................................ 26
4.3.4.4 Identificacin de los compuestos obtenidos del extracto en
hexano de O. aethiops .................................................................. 27
5. RESULTADOS Y DISCUSIN ........................................................................ 28
5.1 Obtencin de los extractos crudos del tejido corporal de O. aethiops ................ 28
5.1.2 Anlisis estadstico .................................................................................... 29
5.1.2.1 ANDEVA de una va para determinar el efecto de los
tratamientos en la masa obtenida por extracto crudo de O.
aethiops ........................................................................................ 29
5.1.2.2 MANOVA para determinar el efecto del tiempo en la masa
obtenida por extracto crudo de O. aethiops .................................. 30
5.2 Determinacin colorimtrica de compuestos esteroidales en los
extractos crudos de O. aethiops ...................................................................... 31
5.3 Cuantificacin de compuestos esteroidales por curva de calibracin ................. 32
5.3.1 Longitud de onda de mxima absorcin en la reaccin L-B con
colesterol ............................................................................................... 32
5.3.2 Curva de calibracin del colesterol y ecuacin lineal obtenida
para la cuantificacin de compuestos esteroidales en extractos
crudos de O. aethiops ........................................................................... 33
5.3.3 Concentracin de compuestos esteroidales en los extractos
crudos de O. aethiops ........................................................................... 35
5.4 Tcnicas cromatogrficas ................................................................................... 40
5.4.1 Cromatografa en capa fina de los extractos crudos de O.
aethiops obtenidos con el T1 ................................................................ 40
viii
Pgina
5.4.2 Cromatografa en fase slida del extracto crudo en hexano de O.
aethiops obtenido en el t3 ...................................................................... 42
5.4.3 Cromatografa en capa fina de los extractos crudos de O.
aethiops obtenidos en el T2 .................................................................. 44
5.4.4 Cromatografa en columna abierta del extracto crudo de O.
aethiops obtenido en 21 das con hexano ............................................. 45
5.5 Identificacin de compuestos por RMN y EM ..................................................... 47
5.5.1 Fraccin 3H .............................................................................................. 48
5.5.2 Subfraccin Z3 ......................................................................................... 49
5.5.3 Fraccin A ................................................................................................ 52
6. CONCLUSIONES ............................................................................................... 54
7. PERSPECTIVAS ................................................................................................. 56
8. REFERENCIAS ................................................................................................... 57
9. ANEXOS ............................................................................................................... 70
ix
NDICE DE FIGURAS
Figura
Pgina
1 Ophiocoma aethiops (Ltken, 1859). ......................................................................... 4

2 Distribucin de Ophiocoma aethiops en el pacfico sur ............................................. 5
3 Molcula de colesterol con los tomos de carbono enumerados; los anillos
A, B y C de seis tomos de carbono (amarillo) y el anillo D con cinco
tomos
de
carbono
(verde)
conforman
el
anillo
ciclopentanoperhidrofenantreno. Grupo OH (color rosa) y cadena lateral de

ocho tomos de carbono (color rojo) caractersticos de los esteroles ....................... 7
4 Compuestos de invertebrados marinos que poseen en su estructura el
nucleo esteroide ...................................................................................................... 10
5 Mecanismo de la reaccin Liebermann-Burchard ejemplificado para el
colesterol (modificado de Burke et al., 1974) ........................................................... 12
6 Procedimiento para la extraccin en fase slida (tomado de MachereyNegel, 2003) ............................................................................................................. 15
7 Zona de recolecta de los ofiuroideos en playa la tijera, Pochutla, Oaxaca ........... 20
8
Tubo eppendorf con la solucin verde-azul que forma el anillo en la

reaccin colorimtrica de Liebermann-Burchard con el colesterol ......................... 23
9 ANDEVA de una va de los tratamientos 1 y 2 realizados a los extractos

crudos de O. aethiops respecto a la cantidad de masa obtenida ........................... 30
10 MANOVA de los tiempos de extraccin utilizados en los tratamientos 1 y 2 .......... 31
11 Espectro de absorcin de la solucin que forma el anillo en la reaccin en
la reaccin Liebermann-Burchard con el colesterol desde una de 2001100 nm, pico de mxima absorcin a 295 nm ...................................................... 33
12 Curva de calibracin y ecuacin lineal (y= 0.634x 0.0635) obtenidas a
partir de los datos de absorbencia de la solucin que forma el anillo en la
reaccin L-B en las distintas concentraciones del colesterol. ................................ 34
13 ANDEVA de una va de los extractos crudos de O. aethiops en los
tratamientos 1 y 2 respecto al porcentaje obtenido de compuestos
esteroidales. .......................................................................................................... 37
Figura
Pgina
14 Porcentajes promedio de compuestos esteroidales presentes en los

extractos crudos de O. aethiops ............................................................................ 40
15 Cromatofolios con aplicaciones en cada carril, de los extractos en acetato
de etilo por tiempo de extraccin (t1, t2 y t3) del T1, con las fases: A)
benceno-acetato de etilo (50:10); B) butanol-acetato de etilo-agua
(40:50:10) y C) butanol-acetato de etilo-agua (120:30:10); en la parte
superior en un crculo compuestos separados y en la parte inferior los
retenidos.. ............................................................................................................... 40
16 Cromatofolios con aplicaciones en cada carril, del extracto en cloroformo
por tiempo de extraccin (t1, t2 y t3). A) Separacin de los compuestos con
la fase butanol-acetato de etilo-agua (40:50:10); y B) cromatofolio revelado
con luz UV a una =254 nm.................................................................................... 41
17 Cromatofolios bajo luz UV (366 nm). En cada carril separacin de las
aplicaciones de los extractos en hexano por tiempo de extraccin (t1, t2 y
t3) con las fases: A) etil ter-ter de petrleo 1:99, B) etil ter-ter de
petrleo 4:96 y C) etil ter-ter de petrleo 8:92. En crculos superiores
compuesto mayoritario separado, en el crculo inferior compuestos
retenidos ................................................................................................................. 41
18 Cromatofolio revelado bajo la luz UV (=366 nm) en cada carril separacin
de las aplicaciones de los extractos crudos en acetato de etilo, hexano,
cloroformo y butanol obtenidos en el t3, utilizando la fase etil ter-ter de
petrleo 8:92. En el crculo compuesto nico separado con un Rf= 0.611. ............ 42
19 Espectros de absorcin del
colesterol y la fraccin 3H, separada del
extracto crudo en hexano de O. aethiops (obtenido del T1 en el t3). En el

espectro de absorcin de la fraccin 3H dos picos de mxima absorcin
3.53 (= 227 nm) y 0.419 (= 410 nm). .................................................................. 43
20 Procedimiento realizado para separar compuestos esteroidales a partir del
extracto en hexano obtenido en 21 das utilizando cromatografia en
columna abierta y fase slida................................................................................ 46
xi
Figura
Pgina
21 Cromatofolio con muestras en cada carril de las fracciones obtenidas de la

separacin del extracto en hexano de 21 das (E1, E2, E3, E4 y E5). En la
fraccin E4 el compuesto 3H, separado utilizando la fase etil ter-ter de
petrleo (8:92). ....................................................................................................... 47
22 Estructura molecular obtenida a partir de los espectros de Resonancia
Magntica Nuclear para el compuesto de la fraccin 3H. ................................... 49
23 Estructura molecular obtenida de los espectros de Resonancia Magntica
Nuclear para el compuesto de la fraccin Z3 ....................................................... 51
xii
NDICE DE CUADROS
Cuadro
1
Pgina
Matriz del T2 para determinar el mejor disolvente y tiempo de extraccin

de compuestos esteroidales contenidos en el tejido corporal de
Ophiocoma aethiops .............................................................................................. 22
2 Sistemas de disolventes propuestos por diferentes autores para separar

compuestos esteroidales ....................................................................................... 25
3
Masa total (seca) obtenida por extracto crudo de O. aethiops .............................. 27
Resultados de la prueba Liebermann-Burchard en los extractos crudos de

O. aethiops obtenidos en el T1 .............................................................................. 32
Absorbencias de la solucin que forma el anillo en la reaccin L-B a

distintas concentraciones de colesterol y su desviacin estandar ......................... 34
Clculos para obtener la concentracin de compuestos esteroidales en 2

mg del extracto en acetato de etilo del tiempo 1 y tratamiento 1 ........................... 35
Concentracin y porcentaje de compuestos esteroidales en extractos

crudos de O. aethiops obtenidos con los tratamientos 1 y 2 .................................. 37
Factor de retencin (Rf) calculado para cada uno de los compuestos

separados de los extractos crudos de O. aethiops en el T2................................... 44
Datos del espectro de RMN 13C del compuesto 3H ............................................. 49
10 Datos del espectro de RMN 13C del compuesto Z3 .............................................. 51
xiii
NDICE DE ECUACIONES
Ecuacin
Pgina
1 Frmula para calcular el factor de retencin............................................................ 14

2 Ecuacin para calcular el contenido de compuestos esteroidales........................... 35
3 Ecuacin de proporcionalidad directa para estimar el contenido de
compuestos esteroidales .......................................................................................... 36
4 Cantidad de compuestos esteroidales contenidos en la masa total del
extracto .................................................................................................................... 36
xiv
2011
Estudio preliminar de la composicin esteroidal del ofiuroideo Ophiocoma aethiops (Ltken, 1859)
1. INTRODUCCION
La clase Ophiuroidea est compuesta por un grupo de organismos marinos de vida
libre, tambin conocidos como estrellas serpientes, los cuales habitan aguas costeras y
profundas, anatmicamente estn constituidos por un disco, del cual sobresalen cinco
brazos que aparentan ser serpientes. Los ofiuroideos, tienen un papel ecolgico
importante dentro del medio marino, por su abundancia y por ser recicladores de
materia orgnica (Jangoux y Lawrence, 1982; Menge, 1982; Hyman, 1993). Por la
abundancia que presenta este grupo, la mayora de los estudios en Mxico estn
enfocados al conocimiento de su biodiversidad mediante la identificacin taxonmica
(Caso, 1951, 1976; Hendler y Turner, 1987; Sols-Marn et al., 1997, 2005; HernndezHerrejn et al., 2007). Adems, recientemente se ha demostrado que el estudio de la
composicin esteroidal de especies de equinodermos (incluyendo ofiuroideos) con
diferentes hbitats da una idea de cmo, los factores poblacionales, estacionales y
geogrficos influyen a lo largo de la ruta biogentica de estos metabolitos (Levina et al.,
2002). Algunos grupos de metabolitos secundarios incluyendo compuestos esteroidales,
pueden ser utilizados como marcadores quimiotaxonmicos para diferentes clases de
equinodermos (Stonik y Elyakov, 2002). Por otro lado, la actividad biolgica que poseen
estos compuestos ha sido evaluada exitosamente en patgenos de humanos,
adquiriendo de esta forma importancia farmacolgica. Actualmente, los estudios
biotecnolgicos en estos organismos han adquirido gran importancia a nivel mundial;
an as, hasta la fecha no hay muchos estudios sobre el rol fisiolgico y biolgico que
tienen los compuestos esteroidales en los ofiuroideos. En Mxico, ningn trabajo se ha
realizado en este mbito, por lo que, con este trabajo se propone iniciar con el estudio
de la composicin esteroidal en ofiruoideos y establecer un mtodo de extraccin de
esteroides que facilite la obtencin de los mismos.
Mara Zulema Jurez Corts
2011
1.1 Phylum Echinodermata

En la actualidad el phylum Echinodermata se divide en cinco clases, Crinoidea,
Asteroidea,
Ophiuroidea,
Echinoidea
Holothuroidea
(Pawson,
2007),
aproximadamente tiene 7,000 especies vivientes y 13, 000 fsiles. Estos organismos
poseen un endoesqueleto calcreo, formado por pequeas placas llamadas osculos y
el arreglo corporal que presentan los adultos es simtrico pentmeral (Hendler et al.,
1995).
1.1.1 Clase Ophiuroidea

El nombre Ophiuroidea deriva del latn ophis, serpiente; y ura, cola, en referencia a que
los brazos se parecen a la parte terminal de la cola de una serpiente; los cuales utilizan
para desplazarse por las rocas, la arena, el coral, algas y otros sustratos (BejaranoChavarro et al., 2004). Los ofiuroideos poseen una gran variedad de formas, tienen un
disco pequeo y aplanado, que puede ser redondo, pentagonal o petaloide; del disco;
se separan simtricamente cinco (en ocasiones pueden ser seis o siete) brazos largos,
delgados, lisos o con espinas (Hyman, 1993).
La clase Ophiuroidea est conformada por organismos de vida libre y existen
aproximadamente 2,000 especies, sobrepasando a otras clases de equinodermos, en
nmero de especies vivientes (Laguarda-Figueras, 2000). Los ofiuroideos son
considerados el grupo ms exitoso de los equinodermos, esto debido a las tallas
pequeas de los organismos y a la gran agilidad de sus miembros, permitindoles
moverse y habitar desde las aguas costeras, hasta las grandes profundidades del
ocano (Hyman, 1993); por esto; es comn encontrar a los ofiuros en todos los tipos de
hbitats marinos, siendo ms abundantes sobre fondos blandos-arenosos. Algunas
especies son selectivas con el tipo de sustrato, y esta seleccin se relaciona con los
hbitos alimenticios de las especies (Boolootian, 1995), ya que algunas especies
pueden ser depredadoras, filtradoras de materia orgnica, carroeras o suspensvoras,
incluso, hay especies que son capaces de alimentarse con ms de una estrategia
alimenticia (Brusca y Brusca, 1990). En general, los ofiuroideos combinan la ingestin
de materia orgnica y de tejido animal, incluyendo detritus, diatomeas, foraminferos,
dinoflagelados, tintnidos, y otras presas animales como poliquetos y pequeos
crustceos, raramente se alimentan de equinodermos jvenes, bivalvos y otros
moluscos (Hyman, 1993). La seleccin del sustrato tambin se debe a que estos
organismos presentan fototactismo negativo, por esto, buscan proteccin debajo de
2011
diferentes objetos, como rocas, conchas o entre algas, sin embargo se consideran los
ms activos de todas las especies de equinodermos (Boolotian, 1995; Hyman, 1993).
Al igual que en la alimentacin de estos organismos, las estrategias de reproduccin
son variadas. La mayora de los ofiuroideos son dioicos, es decir, hay individuos
machos y hembras, sin embargo; los sexos usualmente no pueden ser distinguidos
externamente, a menos que, el color de la gnada madura afecte la coloracin propia
del organismo, o cuando presentan dimorfismo sexual, en los cuales se ha observado
que el macho es ms pequeo y se aferra a la hembra que es de talla ms grande
(Mortensen, 1930 y 1936). Por otro lado, un considerable nmero de ofiuroideos son
hermafroditas, es decir que en un individuo se encuentran presentes los dos sexos, de
estos la cuarta parte es protndrica, funcionando las gnadas del individuo primero
como macho y despus como hembra (Brusca y Brusca, 1990). Otras especies son
partenognicas, formndose un nuevo organismo a partir de clulas sexuales
femeninas, sin haber sido fecundadas por clulas sexuales masculinas (Hyman, 1993;
Brusca y Brusca, 1990). Comnmente, los ofiuros desovan directamente en el agua
marina, este fenmeno se realiza principalmente durante las noches de primavera y
verano, relacionndose con el aumento de la temperatura del agua en estas estaciones
(Mortensen, 1938; Olsen, 1942).
La reproduccin asexual por fisin es comn en algunas especies de ofiuroideos, los
cuales, son de talla pequea y llegan a tener seis o siete brazos, estos organismos
dividen simtricamente el disco en dos partes, con tres extremidades cada uno, y a
partir de estas se forman 2 nuevos individuos. Este tipo de reproduccin ha sido
considerada importante, debido a que permite altas densidades en las poblaciones de
estos organismos (Hyman, 1993).
La importancia ecolgica de los ofiuros es reconocida, ya que al ser organismos con
diferentes estrategias de alimentacin, se les considera recicladores. Al alimentarse de
sedimento transforman la materia orgnica, hacindola accesible a otros organismos y a
la vez permiten la oxigenacin del sedimento (Jangoux y Lawrence, 1982; Menge, 1982;
Lawrence, 1987; Brusca y Brusca 2003). La abundancia de las especies, tambin es un
factor importante a nivel ecolgico, y sta es consecuencia de las diversas estrategias
reproductivas, las cuales a su vez permiten la presencia de estos organismos en
diferentes zonas del medio marino (Brusca y Brusca 2003).
2011
1.1.1.1 Ophiocoma aethiops (Ltken, 1859)

El ofiuroideo Ophiocoma aethiops (Figura 1) pertenece a la familia Ophiocomidae; el
cuerpo est compuesto de un disco que sostiene cinco brazos largos de hasta 19 cm de
longitud, y el disco llega a medir 3.4 cm de dimetro en organismos adultos (Hickman,
1999). La principal caracterstica de la especie, es que el disco se encuentra
completamente cubierto de pequeas espinas granuliformes y finas, las cuales cubren
dorsalmente la superficie de las bases de los brazos. Por su parte, los brazos slo
tienen espinas en la parte lateral. Las placas dorsales de los brazos son ovaladas,
alargadas, irregulares y ms anchas que largas. Las placas inferiores de los brazos
presentan forma cuadrangular. Las espinas son robustas, de formas diversas, por lo
general cilndricas y dispuestas en tres, cuatro o cinco hileras en la parte lateral de los
brazos. La superficie dorsal del disco es oscura, y los brazos presentan una coloracin
parda oscura (Hickman, 1999).
4 cm
Figura 1: Ophiocoma aethiops (Ltken, 1859). Foto: Jurez-Corts 2010 (Indita).
La especie se distribuye (Figura 2) desde Baja California hasta el Ecuador (Hickman,

1999; Caso, 1978), y ha sido colectada principalmente en Nicaragua, Honduras,
Panam y las Islas Galpagos; en Mxico en la costa oeste, Mazatln, y Acapulco
(Caso, 1978). En el estado de Oaxaca se tienen registros de sta especie en las zonas
coralinas y rocosas del sistema arrecifal Puerto Escondido-Bahas de Huatulco
(Bentez-Villalobos, 2000; Zamorano de Haro, 2004). Esta especie forma parte de la
epifauna y la forma de alimentacin que presenta es del tipo suspensvoro micrfago
(Caso et al., 1993). Los juveniles de O. aethiops como estrategia de sobrevivencia,
2011
aseguran proteccin y alimento, viviendo en las bursas de los adultos de la misma

especie, marcando de esta forma una asociacin interespecfica entre juveniles y
adultos, la cual es nica dentro de la clase Ophiuroidea (Hendler et al., 1999).
120
110
100
90
30
30
20
20
Ocano
Pacfico
0
200
400 km
200
120
400 m
110
100
90
Figura 2: Distribucin de Ophiocoma aethiops en Mxico.
1.2 Los lpidos: clasificacin y funcionalidad en los organismos vivos

Los lpidos son un grupo amplio y heterogneo de compuestos insolubles en agua, pero
miscibles en disolventes orgnicos no polares como el hexano, cloroformo o acetato de
etilo. Una caracterstica bsica y de la cual derivan sus principales propiedades
biolgicas es su hidrofobicidad; esto se debe a que su estructura qumica es
fundamentalmente hidrocarbonada (aliftica, alicclica o aromtica), con gran cantidad
de enlaces carbono-hidrgeno y carbono-carbono (Garcs de Granada et al., 2009). En
trminos de energa y estructura son compuestos importantes, ya que constituyen una
considerable fraccin de material celular (Klimov y Nikul cheva, 1999). Los lpidos
generalmente se clasifican en tres grandes grupos (Garcs de Granada et al., 2009):
a) Lpidos simples: En su molcula solamente poseen carbono, hidrgeno y
oxgeno, En este grupo se incluyen los glicridos (steres de glicerol ms cidos
grasos) y cidos grasos.
2011
b) Lpidos complejos: De estructura similar a los lpidos simples, pero adems

contienen fsforo y nitrgeno. Ejemplo de este tipo de lpidos estn los
esfingsidos (steres de esfingosina con cidos grasos), fosfolpidos y los
glicolpidos.
c) Lpidos derivados: Presentan semejanza estructural con los terpenos o
isoprenos. Dentro de este grupo se encuentran los esteroides, carotenoides,
prostaglandinas y las vitaminas liposolubles.
Los lpidos en los organismos vivos cumplen diversas funciones vitales tales como: a)
reservar energa, b) aislar la superficie de plantas y animales para evitar infecciones y
mantener el equilibrio hdrico en ellos, c) ser componentes estructurales de las
membranas biolgicas en donde contribuyen a la formacin de compartimentos con
respuestas bioqumicas especficas, d) constituir sistemas aislantes contra choques
trmicos, elctricos y qumicos a nivel de la hipodermis o en cubiertas de rganos
internos, e) otros pueden ser hormonas que participan en el control de procesos
metablicos y f) adems funcionan como precursores de otros compuestos complejos
como lipoprotenas, glicoprotenas, y vitaminas liposolubles (Garcs de Granada et al.,
2009). Tambin considerables cantidades de lpidos son requeridas para emergencias
celulares durante la proliferacin y la actividad fsica de las clulas y sus derivados
(msculos); por otra parte en animales multicelulares, los lpidos pueden ser
almacenados en los oocitos para realizar el desarrollo estable de sus huevos (Rothchild,
2003). En la clula, existen tres fuentes de lpidos: a) la sntesis endgena de molculas
de lpidos (in situ), b) el transporte de los sitios de sntesis activa, hacia las zonas de
mayor demanda y c) el transporte de alimentos con lpidos (Perevozchikov, 2008).
1.2.1 Esteroides: clasificacin, estructura molecular y funciones que

desempean en los organismos.
Los esteroides se clasifican dentro del grupo de lpidos derivados, su estructura bsica
es la del ncleo ciclopentanoperhidrofenantreno (Figura 3) que consiste de cuatro
anillos fusionados, tres de ellos con seis tomos de carbono y uno con cinco. Los
distintos tipos de esteroides se diferencian entre s por el grado de saturacin del
esterano, la existencia de cadenas laterales diversas y por la existencia de grupos
funcionales sustituyentes; los esteroides se clasifican en esteroles, cidos y sales
biliares y hormonas esteroideas (Hostettman et al., 1991; Lehninger et al., 1995).
2011
Los esteroles son el tipo de esteroide ms abundante, estructuralmente se consideran

derivados del colestano (27 carbonos) y sus principales caractersticas son la presencia
de un grupo OH en el carbono 3 y una cadena lateral de 8 tomos de carbono en el
carbono 17 (Figura 3). El ncleo esteroide es casi plano y relativamente rgido ya que
sus anillos fusionados no permiten la rotacin alrededor de los enlaces carbono-carbono
(C-C). De los esteroles, el colesterol es el principal en los tejidos animales, es
anfiptico, con un grupo de cabeza polar (el grupo hidroxilo en el carbono 3) un cuerpo
hidrocarbonado apolar (el ncleo esteroide y la cadena lateral hidrocarbonada en el
carbono 17) casi tan largo como un cido graso de 16 carbonos en su forma extendida
(Lehninger et al., 1995).
Figura 3. Molcula de Colesterol con los tomos de carbono enumerados; los anillos A, B y C de
seis tomos de carbono (amarillo) y el anillo D con cinco tomos de carbono (verde)
conforman el anillo ciclopentanoperhidrofenantreno. Grupo OH (color rosa) y cadena
lateral de 8 tomos de carbono (color rojo) caractersticos de los esteroles.
Los esteroles, se encuentran presentes en la mayora de las clulas eucariticas como

constituyentes de las membranas celulares, y son los precursores de diversos
productos con actividades biolgicas especficas (Kontiza et al., 2006). Por ejemplo en
invertebrados marinos, se han encontrado cerca de 200 nuevos monohidroxiesteroles, y
2011
algunos estudios muestran que, en una especie marina, se pueden encontrar ms de 70

esteroles capaces de formar compuestos como las saponinas esteroidales (DAuria et
al., 1993). Los esteroles tambin intervienen tanto en el desarrollo como en los cambios
evolutivos, que van desde invertebrados primitivos hasta vertebrados superiores
(Perevozchikov, 2008).
En otra perspectiva, es importante considerar que no todos los esteroides son
hormonas o factores paracrinlogos, algunos de ellos estn involucrados en la digestin
de lpidos (cidos y alcoholes biliares), en la comunicacin intra o interespecfica
(feromonas y toxinas), y otros son reguladores metablicos de la homeostsis del
esterol (Schroepfer, 2000). Por otro lado, tambin se ha establecido que las hormonas
esteroides tienen funciones extras no hormonales durante el desarrollo embrionario
(Hsu et al., 2006).
1.2.2 Biosntesis de esteroles en organismos marinos

En invertebrados marinos el origen de los esteroles es variado, ya que pueden ser
obtenidos del alimento y la presencia de las relaciones simbiticas (DAuria et al.,
1993), o sintetizado en la clula a partir del acetato o mevalonato. Algunos crustceos
como los decpodos, cangrejos y langostas, no pueden sintetizar esteroles (Kanazawa,
2001), a diferencia de los gasterpodos y cefalpodos que pueden sintetizar sus propios
esteroles; esto ltimo tambin aplica en equinodermos que tienen una dieta libre de
esteroles; la estructura de los esteroles en los invertebrados marinos muestra la
complejidad de los mismos (Goad, 1981; Kanazawa, 2001).
El sustrato inicial para la sntesis de los esteroles de todas las especies es acetilcoenzima A con la enzima limitante 3-hidroxi-3-metilglutaril-Coenzima A reductasa
(HMG-CoA reductasa). En los equinodermos, otras enzimas involucradas en la
biosntesis endgena de esteroles son el citocromo P450 mono-oxigenasa (CYPs)
(Rewitz
et
al.,
2006)
oxireductasa
(HSDs
cadenas
cortas
de
deshidrogenasas/reductasas (SDRs)) (Payne y Hales, 2004). Algunas enzimas pueden

utilizar sustratos endgenos (esteroles) y/o exgenos (xenobiticos) en la sntesis
(Oppermann et al., 1992). Los esteroles pueden ser oxidados in vivo a hidroxiesteroles y
otros compuestos que contienen oxgenos (esteroides) (Lehninger et al, 1995;
Perevozchikov, 2008).
Los equinodermos son capaces de sintetizar el 7-colestenol a partir del acetato o
mevalonato, probablemente va escualeno y lanosterol, sin embargo, estos organismos
2011
no pueden introducir el doble enlace en el C-22, ni agregar grupos alquilo en el C-24 del
7-colestenol, por lo que se asume, que los equinodermos que presentan en su
composicin esteroles como el 7-colestenol, derivan de la biosntesis y de los recursos
exgenos, pero la presencia de esteroles con 26, 28, 29 y 30 carbonos, dependen
nicamente de la dieta del organismo. Los asteroideos, adems son capaces de
sintetizar el 7-colestenol a partir de colesterol va colestanol (Kanazawa, 2001).
En los invertebrados marinos que no pueden sintentizar esteroles, la produccin de
hormonas esteroides depende del alimento con esteroles, los cuales pierden grupos
alquilo hasta formar el colesterol, l nico sustrato conocido para la sntesis de
esteroides (Perevozchikov, 2008).
De los diversos grupos de invertebrados marinos, la demostracin completa de la
sntesis endgena de hormonas esteroides slo se conoce en moluscos y
equinodermos, los cuales poseen la mayora de las enzimas para producirlas a partir del
colesterol, progesterona, testosterona y estradiol (Sandor, 1981 y Schoenmakers,
1981).
1.2.3 Esteroides presentes en invertebrados marinos

Los principales grupos de hormonas esteroides conocidas en vertebrados mamferos
son las hormonas sexuales masculinas y femeninas, adems de las hormonas de la
corteza suprarrenal, el cortisol y la aldosterona. Estas se transportan por el torrente
sanguneo, hacia el tejido blanco, para fijarse a receptores proticos muy especficos;
desencadenando cambios en la expresin gnica y en el metabolismo (Lehninger et al.,
1995). Las hormonas son molculas que regulan una funcin receptora del organismo;
por ejemplo, la progesterona (Figura 4a) prepara al endometrio para la implantacin del
vulo fecundado; adems tambin activan molculas receptoras que sirven como
transcriptores de la expresin gnica (Berg et al., 2001). La presencia de esteroides
similares al de los vertebrados ha sido documentada en diferentes grupos de
invertebrados (Lehoux y Sandor, 1970). Por estas similitudes las hormonas sexuales de
los vertebrados mamferos son utilizadas para inducir la expulsin de los gametos y
llevar a cabo la fecundacin en los equinodermos (Lafont y Mathieu, 2007; Barbaglio et
al., 2007).
Los holoturoideos utilizan como mecanismo de defensa saponinas (Hostettman et al.,
1991), las cuales tienen la propiedad de formar espuma en medios acuosos. Estas
constan de una parte glucdica y de una genina, denominada sapogenina, que puede
2011
ser de naturaleza esteroide o triterpnica (Taiz y Zeiger, 1998; Lpez, 2001). Las
saponinas esteroidales derivan de un esqueleto hexacclico de 27 tomos de carbono,
que es el ncleo espirostano (Lpez, 2001). Los azcares ms frecuentes
constituyentes en los dos tipos de saponsidos son: glucosa, arabinosa, ramnosa,
galactosa y xilosa. Las saponinas tambin son metabolitos predominantes en las
estrellas marinas (Figura 4b), las cuales slo se han estudiado para su aplicacin
biotecnolgica. Son considerados como precursores nicos de muchos medicamentos
esteroides tales como hormonas sexuales, corticoides, contraceptivos orales y
diurticos (Martnez, 2001).
NaO 2SO
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
HO
CH3
NaO 2SO
a) Progesterona
d) Poliol esteroidal sulfatado
CH3
O
OMe
CH3
Ciclopentanoperhidrofenantreno
O
O
H3C
OMe
HO
CH3
CH3
HO
CH3
CH3
HO
CH3
CH3
OH
HO
CH3
COOH
HO
OH
OH
b) Asterosaponina
c) Polihidroxiesteroide
Figura 4: Compuestos de invertebrados marinos que poseen en su estructura el ncleo esteroide.
10
2011
Constituyentes comunes de las estrellas de mar son los polihidroxiesteroides

glucsidos, estos compuestos son molculas anfipticas, constituidas por diferentes
grupos de azcares unidos por un enlace glucosdico a un ncleo esteroide hidrofbico.
Su funcin biolgica es incrementar la permeabilidad inica en la bicapa lipdica de la
membrana, sin embargo sta actividad depende del nmero de monosacridos libres.
Para muchos de estos compuestos se ha reportado actividad antifngica, antiviral y
antineoplsica, adems de sus propiedades anti-inflamatorias, citotxicas, efectos
ictiotxicos y actividad hemoltica (Prokofeva et al., 2003).
Los polihidroxiesteroides (Figura 4c) se diferencian de los polioles por tener en las
posiciones C-3 y C-21 grupos hidroxilos adicionales, los cuales se localizan en el anillo
A y C (McKee et al., 1994). Este tipo de compuestos ha mostrado un gran espectro de
actividades biolgicas, debido a sus propiedades antivirales (Anderson et al., 1989),
accin citotxica, y su participacin en la inhibicin de la protena tirosina kinasa (Fu et
al., 1994).
Otros compuestos derivados del metabolismo secundario de las estrellas de mar son los
polioles esteroidales sulfatados (Figura 4d), estos son poco comunes en la naturaleza,
sin embargo, exhiben una interesante gama de actividades biolgicas, incluyendo su
accin citotxica y la inhibicin de algunas actividades enzimticas (Federov et al.,
1994).
1.3 Mtodos de extraccin de lpidos

El procedimiento de extraccin usado para obtener lpidos de tejidos biolgicos depende
de la clase de lpido y de la naturaleza del tejido. Debido a que los lpidos son menos
polares que los dems constituyentes celulares, son extrados selectivamente con
disolventes orgnicos (Boyer, 2000). Inicialmente, los lpidos se extraan con ter,
acetona, hexano, y otros disolventes orgnicos de diferente polaridad. En 1957 Folch
utiliz con xito la mezcla de cloroformo y metanol 2:1 para la extraccin de lpidos
totales asociados con protenas en las membranas plasmticas. La desventaja que
present este sistema de disolventes fue la tendencia a disolver algunos compuestos
que no eran lpidos, incluyendo protenas, adems de no ser seguros por sus
propiedades txicas. Por lo que, Radin en 1981 propuso un sistema de disolventes
hexano-isopropanol en proporcin (3:2) por su baja toxicidad, teniendo como ventaja la
poca dilucin de material no lipdico en el extracto. Actualmente cualquiera de los dos
11
2011
sistemas de disolventes es utilizado, adems de combinar con extracciones en hexano,

etanol, y en menor proporcin el butanol.
1.4 Determinacin de colesterol y derivados

La reaccin del colesterol con diferentes cidos fuertes del tipo Brnsted y Lowry da
como resultado coloraciones verdes-azules y violetas. Liebermann (1885) aprovech
este fundamento para proponer la reaccin colorimtrica que lleva su nombre. Esta
reaccin ha sido utilizada durante aos para la determinacin cualitativa y cuantitativa
de colesterol (Burke et al., 1974). Inicialmente, el cloroformo se utiliz como disolvente,
para la reaccin Liebermann-Burchard (L-B), en la actualidad, esta prueba puede
realizarse en un medio constituido por cido sulfrico, cido actico cloroformo y
anhdrido actico (Burke et al., 1974; Clavo-Valdivieso y Ramrez-Vega, 2002).
HOAc/H2SO4
HO
Colesterol
Ion carbono 3, 5-Colestadieno
Ac2O (SO3)
Cation Pentaenlico
Ion carbono 3, 5-Colestadieno
SO2
SO2 OH
cido Colesta-hexaeno-sulfnico
Figura 5. Mecanismo de la reaccin Liebermann-Burchard ejemplificado para el colesterol

(modificado de Burke et al., 1974).
12
2011
En la Figura 5 se observa que en la reaccin L-B, el colesterol se oxida en tres etapas,

formndose en cada una de ellas una molcula de colestapolieno que posee un doble
enlace adicional con respecto al compuesto del cual deriva. La etapa inicial de la
reaccin L-B consiste en la protonacin del grupo OH del colesterol, con la consiguiente
prdida de agua obtenindose el in carbono 3,5-colestadieno que constituye el primer
paso de la reaccin de color. La oxidacin secuencial de este in carbonio allico por el
SO2- produce un cido colesta-hexaeno-sulfnico, cromforo con un intervalo de
absorbencia de 295 a 620 nm (Burke et al., 1974; Clavo-Valdivieso y Ramrez-Vega,
2002).
1.5 Tcnica de cuantificacin por curva de calibracin

La tcnica de cuantificacin por curva de calibracin est fundamentada en la Ley de
Lambert-Beer, la cual establece que la absorbencia de una solucin es directamente
proporcional a la concentracin y a la longitud del paso de la luz. Por ello la curva de
calibracin permite determinar la concentracin de una sustancia en una muestra
desconocida a partir de un estndar en concentracin conocida. Los datos de
absorbencia y concentracin que se obtienen de las concentraciones del estndar
permiten formar una lnea recta, la cual se expresa matemticamente por la ecuacin
Y= aX+ b. A partir de esta Ecuacin se puede determinar la concentracin o en su caso
la absorbencia de una sustancia en una muestra desconocida (Garca et al., 2005).
1.6 Mtodos de separacin de lpidos

Las clases individuales de lpidos son difciles de separar de los extractos crudos y
adems requieren de una gran inversin de tiempo, en algunos casos, los lpidos son
separados del extracto crudo por medio de una extraccin selectiva con disolventes. En
la separacin extensiva, los mtodos cromatogrficos desempean un papel importante,
ya que permiten la separacin de mezclas complejas de lpidos en componentes
individuales de una clase de lpidos (Boyer, 2000; Martnez-Martnez, 2002).
1.6.1 Mtodos cromatogrficos

La cromatografa es una tcnica de separacin empleada en anlisis qumico, que
permite la separacin de los componentes qumicos en mezclas complejas, y se define
como la separacin de una mezcla de dos o ms compuestos por distribucin entre dos
fases, una de las cuales, es estacionaria y la otra; es una fase mvil (Scott, 2003). La
fase mvil, puede ser un lquido o un gas y la estacionaria un slido o un lquido. Todos
13
2011
los slidos finamente pulverizados tienen el poder de adsorber en mayor o menor grado
otras sustancias sobre su superficie. Similarmente, todas las sustancias pueden ser
adsorbidas, unas con ms facilidad que otras. Este fenmeno de adsorcin selectiva es
el principio fundamental de la cromatografa (Gmez-Ullate y Serrano, 2009; Meyer,
2004). Varios tipos de cromatografa son posibles, slido-liquido (capa fina, papel o
columna), lquido-lquido y gases-lquido (fase vapor), (Skoog y James, 1994).
Actualmente, sta tcnica probablemente es la ms poderosa y verstil, debido a que
puede separar gases y sustancias voltiles por cromatografa de gases (GC, por sus
siglas en ingls), compuestos no voltiles y materiales de extremadamente alto peso
molecular (incluyendo biopolmeros) por cromatografa de lquidos (LC, por sus siglas
en ingls) y si es necesario muy econmicamente por cromatografa en capa fina (TLC,
por sus siglas en ingls) (Scott, 2003).
1.6.1.1 Cromatografa en capa fina (TLC)

La cromatografa en capa fina (TLC) es un mtodo simple, rpido y de bajo costo, define
rpidamente el nmero de compuestos que se encuentran en una mezcla, las placas de
TLC pueden ser de vidrio, metal, aluminio o plstico, los cuales son recubiertos con una
delgada capa de un adsorbente slido, usualmente slica o almina. En la placa con la
muestra a analizar, los disolventes se desplazan y pasan por el punto de la aplicacin,
estableciendo un equilibrio molecular para cada componente de la mezcla, los cuales
son adsorbidos por el slido y las molculas que estn en la solucin. En principio, los
componentes difieren en solubilidad y en la fuerza de adsorcin, por lo que algunos
componentes sern llevados un poco ms arriba de la placa que otros, si los
compuestos separados tienen coloracin, la visualizacin es sencilla, mientras que para
los incoloros, se utiliza una lmpara UV para revelarlos (Day y Underwood, 1989;
Orgchem, 2009). La evaluacin cualitativa de los cromatogramas en cromatografa en
capa fina se realiza con un parmetro denominado factor de retencin (Rf, Ecuacin 1)
el cual se define como el cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el
origen (dc) y la distancia del origen a la mxima altura alcanzada por el eluyente (de)
(Scott, 2003):
Ecuacin 1: Frmula para calcular el factor de retencin.
14
2011
1.6.1.2 Separacin en columna abierta

El mejor mtodo preparativo para la separacin y purificacin de lpidos, es el uso de
columnas empacadas con slica gel. La slica gel (SiO2
xH2O) es un adsorbente
relativamente polar, por lo que los lpidos que tienen baja polaridad se separan con
mayor rapidez, que los de mayor polaridad. En la prctica, en una columna de cristal se
empaca una determinada cantidad de slica gel en un disolvente hidrocarbonado (ter
de petrleo, pentano o hexano), esto considerando que la slica retiene un 5% del peso
de la muestra. El extracto crudo a separar, es disuelto en el mismo disolvente
hidrocarbonado y es aplicado en la parte superior de la columna, conforme el disolvente
o la mezcla de disolventes con diferentes polaridades avanza en la columna. Diversas
clases de lpidos se separan a manera de bandas que a su vez son recuperados en la
parte inferior de la misma. La polaridad de los disolventes se va aumentando
gradualmente hasta obtener la ltima fraccin de la muestra (Boyer, 2000).
1.6.1.3 Extraccin en fase slida

Actualmente, la extraccin en fase slida es utilizada en estudios donde el material
biolgico disponible es limitado y los compuestos individuales presentan bajas
concentraciones (Pea et al., 2003).}
Figura 6: Procedimiento para la extraccin en fase slida (Tomado de Macherey-Negel, 2003).
15
2011
ste es un mtodo rpido y econmico, en donde la muestra se limpia de impurezas al

pasarse a travs de un cartucho para volmenes pequeos (0.4-15 mL) (Figura 6),
empacado con un material slido o poroso, el cual puede ser un adsorbente (slica o
almina), una fase no polar (octilslica o poliestireno), de intercambio inico o con una
alta afinidad especfica. El cartucho es operado por gravedad o por la aplicacin de
vaco. El material de empaque es acondicionado con un disolvente apropiado, antes de
iniciar la separacin. La fase o sistema de disolventes es elegido de acuerdo a los
analitos de inters. Finalmente, las molculas del analito son eluidos con un tercer
disolvente o solucin amortiguadora con diferente pH (Meyer, 2004).
1.7 Tcnicas de dilucidacin

Despus de aislar un compuesto de una fuente natural, se determina su estructura para
posteriormente sintetizarlo qumicamente, es por ello que la espectroscopa es utilizada
como una herramienta que ayuda a detectar grupos funcionales, identificar compuestos
y analizar mezclas, sin destruir los compuestos, por lo que se pueden examinar en
diferentes tipos de espectros, sin prdida de la muestra. Lo anterior permite que una
misma muestra pueda ser identificada por diferentes mtodos espectroscpicos, ya que
en muchos casos es difcil de identificar completamente, partiendo solo de una tcnica
si contar con la informacin complementaria. En general, las tcnicas espectroscpicas
consisten en irradiar una muestra por medio de una fuente luminosa, midiendo la
cantidad de luz transmitida en varias longitudes de onda mediante un detector (Wade,
1993).
Los principales mtodos en solucin son: a) la espectroscopa de absorcin, la cual
mide la cantidad de luz absorbida por un compuesto en funcin de la longitud de onda
de la luz; b) la espectroscopa infrarroja, que detecta las vibraciones de enlaces y
proporciona evidencia de los grupos funcionales presentes, c) la espectroscopa de
masas, la cual bombardea las molculas con electrones y las rompe, permitiendo
conocer el peso molecular, posiblemente la frmula molecular, y la estructura de los
grupos funcionales; d) la espectroscopa de resonancia magntica nuclear, que mide la
absorcin de radiacin, que depende del ambiente qumico de los tomos de hidrgeno
(o de los tomos de carbono), proporcionando evidencia de la estructura de los grupos
alquilo e indicaciones acerca de los grupos funcionales; y e) la espectroscopa
ultravioleta, proporciona informacin acerca del enlazamiento electrnico en la muestra
y las transiciones electrnicas (Day y Underwood, 1989).
16
2011
1.8
Estudios
realizados
nivel
bioqumico
biotecnolgico
en
equinodermos
Los asteroideos (estrellas de mar) y los equinoideos (erizos de mar) son los
equinodermos con la mayor cantidad de estudios en lo que a composicin esteroidal
respecta. En ellos, se describieron por primera vez compuestos similares al estrgeno,
siendo los primeros descritos en los ovarios de un equinodermo (Donahue y Jennings,
1937), otros estudios se centraron en la identificacin de los sitios biosintticamente
potenciales para la produccin de esos compuestos (Schoenmakers, 1979 y 1981). Por
otra parte, el conocimiento del proceso de biosntesis y el rol fisiolgico que
desempean los esteroides en el mismo organismo y en otros invertebrados, ha sido
documentado (Schoenmakers, 1979; Schoenmakers y Voogt 1980, 1981; Hines et al.,
1992a; Lafont y Mathieu, 2007).
La importancia de estos estudios radica en que, los equinodermos poseen compuestos
esteroidales similares al de los vertebrados. Por lo que, para el ao 2000 ya se haban
obtenido y caracterizado ochenta compuestos de equinodermos del Antrtico (Amsler et
al., 2007).
Con referencia a la evolucin, el estudio en estrellas de mar de polihidroxiesteroides
sulfatados con estructuras similares al de los compuestos de ofiuros, sugiere que existe
una relacin evolutiva ms cercana entre ellos, que entre otros equinodermos (Lebar et
al., 2007).
1.8.1 Estudios bioqumicos y biotecnolgicos realizados en la clase

Ophiuroidea
En la clase Ophiuroidea los estudios a nivel bioqumico se iniciaron en 1918 con
Wintzell, quien report la presencia de proteinasas en Ophiura texturata. En 1931
Lnnberg y Hellstrm demostraron que los carotenoides son los responsables de la
coloracin de algunas especies de ofiuroideos europeos. Fox y Scheer en 1941
determinaron en tres especies de California, que los carotenoides encontrados se
deben a la presencia de xantophyllas. En 1949, Bergmann trabaj el contenido de
colesterol en estos organismos. Vinagradov (1953), por su parte se concentr en la
composicin qumica de estos organismos. Sin embargo, fue hasta finales de los 80s y
principios de los 90s que se iniciaron los trabajos enfocados al aislamiento, estudio y
caracterizacin de los esteroides en estos organismos. El primer registro es el de
Anderson et al. (1989) quienes estudiaron los polioles esteroidales, encontrando que
17
2011
estos compuestos poseen accin citotxica. Posteriormente, Fu et al. (1994)

demostraron que los compuestos antes mencionados, tambin participan en la
inhibicin de la protena tirosina kinasa. Roccatagliata et al. (1996, 1997 y 1998 ) y
Duque et al. (1997), trabajaron especies como Ophiocoma echinata (Lamarck, 1816),
Ophioplocus januarii (Ltken, 1856) y Astrotoma agassizii Lyman, 1875; y evaluaron con
xito la actividad antiviral de los esteroides polihidroxilados y sulfatados que contienen
estos organismos.
Duque et al., en 1997 realizaron una comparacin de la composicin esteroidal de
cuatro especies de ofiuroideos, dos de aguas fras: Ophioplocus januarii y Ophionotus
victoriae Bell, 1902; y dos de aguas tropicales: Ophiocoma echinata y Ophiocoma
wendtii Mller & Troschel, 1842. Las especies pertenecientes al gnero Ophiocoma
presentaron en su composicin polioles esteroidales como el 24-norcolesta-5,22-dien3-ol y el 24-metil-27-norcolesta-5,22-dien-3-ol, mientras que los gneros Ophioplocus
y Ophionotus presentaron el (22E-24S)-metilcolesta-5,22-dien-3-ol. Los autores
concluyeron que las diferencias encontradas en la composicin esteroidal de stos
gneros, depende principalmente de los hbitos alimenticios de estas.
Comin et al. (1999) y Santos et al. (2003), demostraron respectivamente que los
derivados sintticos y anlogos de los esteroides polihidroxilados y sulfatados poseen
actividad biolgica en el virus HSV-2, agente responsable de algunas infecciones
recurrentes de las mucosidades de membranas, lesiones genitales, infecciones
neonatales y meningitis, incluyendo tambin en estos estudios a el HSV-1 causante del
Herpes, el Junin Virus, agente de la fiebre hemorrgica Argentina, el Polio Virus y
finalmente el RSV, virus que provoca algunas afecciones respiratorias, obteniendo
resultados positivos en la inhibicin de estos.
18
2011
2. HIPTESIS
El gnero Ophiocoma ha presentado en su composicin esteroides por lo que se espera
encontrar en la especie Ophiocoma aethiops compuestos esteroideos.
3. OBJETIVOS
3.1 General
Determinacin parcial de la composicin esteroidal del ofiuroideo Ophiocoma aethiops
(Ltken, 1859).
3.2 Particulares
Obtener extractos de compuestos esteroidales del tejido corporal de O. aethiops
utilizando dos tratamientos: la extraccin fraccionada y la extraccin por
disolvente, empleando tres tiempos de extraccin 6, 12 y 24 horas.
Determinar la presencia de compuestos esteroidales en los extractos crudos de
O. aethiops mediante la prueba Liebermann-Burchard.
Cuantificar el contenido de compuestos esteroidales en los extractos crudos de
O. aethiops.
Determinar el mejor tratamiento para obtener mayor cantidad de extracto crudo
del tejido corporal de O. aethiops.
Determinar el mejor tiempo de maceracin para obtener mayor cantidad de
extracto crudo del tejido corporal de O. aethiops en los tratamientos 1 y 2.
Determinar el mejor tratamiento y disolvente para obtener compuestos
esteroidales del tejido corporal de O. aethiops.
Aislar y purificar los compuestos esteroidales contenidos en los extractos crudos
de O. aethiops mediante tres tcnicas cromatogrficas: capa fina, columna
abierta y fase slida.
Evaluar por cromatografa en capa fina seis fases mviles para determinar cul
es la adecuada para la separacin de los compuestos esteroidales en los
extractos crudos de O. aethiops.
Identificar los compuestos esteroidales aislados de los extractos crudos de O.
aethiops mediante Resonancia Magntica Nuclear (1H y
13
C) y Espectrometra
de Masas.
19
2011
4. MATERIAL Y METODOS
4.1 Zona de recolecta
La playa Tijera (Figura 7) est ubicada en el Municipio de San Pedro Pochutla, Oaxaca,
(15 41 14.00 N y 96 26 35.47), sta se encuentra dentro del golfo de Tehuantepec,
presenta una termoclina permanente alrededor de los 60-80 metros de profundidad, la
capa de mezcla se encuentra entre los 20 y 30 metros de largo de la costa (Fiedler,
1992).
Figura 7: Zona de recolecta de los organismos en playa "La Tijera", Pochutla, Oaxaca.
Las corrientes que afectan sta zona son: a) una rama dbil de la corriente de California
que fluye hacia el sur, trae agua fra y es de salinidad baja; b) la contracorriente
Ecuatorial que fluye hacia el este con agua caliente y alta salinidad; c) la corriente
Ecuatorial del norte que se alimenta de la corriente de California y del agua del Pacfico
oriental tropical, y fluye hacia el oeste; d) la corriente de Costa Rica se mueve hacia el
noroeste y al oeste, esta ltima es una masa de agua clida (Wyrtki, 1965; Fiedler,
1992).
Los vientos Tehuanos son determinantes para la distribucin y comportamiento de los
parmetros fisicoqumicos del golfo de Tehuantepec, especialmente durante invierno,
poca en la que son ms intensos. Con los Tehuanos, suceden las surgencias o
20
2011
afloramientos, que dependen del viento, a diferencia del mezclado vertical turbulento
que es consecuencia de la violenta agitacin del agua por las olas superficiales (Lavin
et al., 1992). Las surgencias en el golfo de Tehuantepec se presentan de octubre a
abril, temporada en la cual las aguas son ms productivas (Lluch-Cota et al., 1997).
El litoral, tiene playas arenosas que granulomtricamente presentan una tendencia por
arenas medias (Carranza-Edwards et al., 1988). La zona rocosa est compuesta por
rocas gneas intrusivas cidas con incrustaciones cristalinas, adems de cuarzo,
feldespatos y minerales accesorios (Morales de la Garza y Carranza-Edwards et al.,
1988). El tipo de clima que prevalece en la zona es seco, clido subhmedo (AW2), con
lluvias en verano y en invierno menos del 5% de lluvias (Garca, 1973). La temporada
de lluvias comprende de julio a octubre y la temperatura superficial flucta entre los 26 y
28 C con una oscilacin trmica de 3 a 4 C (Zamorano de Haro, 2004).
4.2 Recolecta e Identificacin

Se realizaron dos muestreos, uno en Abril del 2009 y el segundo en Marzo del 2010. La
recolecta de los organismos se realiz por medio de buceo libre en la Playa Tijera, se
eligieron organismos con tallas de 1.5 a 2.5 cm de dimetro del disco. En el primer
muestreo se recolectaron 600 g de biomasa (32 organismos), y en el segundo 1,325 g
(66 organismos), de los ofiuroideos obtenidos en el segundo muestreo se utilizaron dos
organismos (25 g) para la identificacin taxonmica, los cuales se conservaron en
frascos etiquetados de 250 mL con alcohol al 70%. La identificacin se realiz en el
laboratorio de Biologa ubicado en la Universidad del Mar, con la gua de identificacin
de Hickman (1999). El resto de los organismos, con un peso total de 1300 g se
congelaron a -40 C hasta su procesamiento, en un ultracongelador modelo NU-6514.
4.3 Trabajo de laboratorio

La parte experimental de este trabajo se llev a cabo en el Laboratorio de Investigacin
de Qumica y Biologa de la Universidad del Mar.
4.3.1 Extraccin de los compuestos esteroidales

Los organismos obtenidos en el primer muestreo (600g) se descongelaron al chorro de
agua. Posteriormente, los brazos y los discos fueron fragmentados. La biomasa total se
dividi en tres porciones de 200 g cada uno y se colocaron en vasos de precipitado de
1000 mL cubiertos con papel aluminio. Cada porcin fue sometida al tratamiento 1 (T1),
el cual consisti en una extraccin fraccionada con disolventes de mayor a menor
21
2011
polaridad, que inici con metanol, seguido de acetato de etilo, cloroformo, butanol y
finalmente hexano. Del disolvente correspondiente se agregaron 600 mL a cada vaso
de precipitado, los cuales tenan un tiempo de extraccin asignado, siendo el tiempo 1
(t1) de 6 h, el tiempo 2 (t2) de 12 h y el tiempo 3 (t3) de 24 horas; en el t2 y t3, cada seis
horas se realizaron recambios de 600 mL del disolvente utilizado. Una vez transcurrido
el tiempo de extraccin se obtuvo el filtrado; para eliminar cualquier resto de materia
orgnica, la biomasa fue lavada tres veces ms con 100 mL del disolvente; el extracto
obtenido se almacen en matraces Erlenmeyer de 1000 mL protegidos de la luz con
papel aluminio y a temperatura de refrigeracin (4C), para su posterior concentracin.
Del peso total restante (1,300 g) del segundo muestreo se utilizaron 900 g de biomasa,
la cual se dividi en 36 porciones de 25 g cada uno, colocados en matraces de 250 mL,
cada porcin fue sometida al tratamiento 2 (T2), el cual consisti en asignar una porcin
control con dos rplicas para cada disolvente y tiempo de extraccin como se muestra
en el Cuadro 1. Los disolventes que se utilizaron fueron: metanol, acetato de etilo,
cloroformo y hexano, de los cuales se colocaron 200 mL a los matraces respectivos.
Los tiempos que se manejaron fueron tiempo 1 (t1) de 6 h, tiempo 2 (t2) de 12 h y tiempo
3 (t3) de 24 h. Cada muestra se filtr, y se coloc en un matraz limpio y fue preservado
en refrigeracin (4 C). Este procedimiento se realiz para determinar el mejor tiempo y
disolvente de extraccin. Los 400 g restantes de biomasa de este muestreo fueron
colocados en hexano por 21 das, para obtener una mayor cantidad de extracto.
Todos los extractos se concentraron por evaporacin a presin reducida en un
rotavapor BCHI R-114, considerando el punto de ebullicin de cada disolvente. Cada
extracto se guard en viales mbar con tapa, limpios, secos, pesados y previamente
etiquetados, los cuales se conservaron en refrigeracin a 4 C para su posterior anlisis.
Cuadro 1. Matriz del T2 para determinar el mejor disolvente y tiempo de extraccin de compuestos
esteroidales contenidos en el tejido corporal de Ophiocoma aethiops.
Disolvente
t1 (6h)
t2 (12 h)
t3 (24 h)
(200 mL)
(25 g)
(25 g)
(25 g)
Metanol
R1
R2
R1
R2
R1
R2
Acetato de etilo
R1
R2
R1
R2
R1
R2
Cloroformo
R1
R2
R1
R2
R1
R2
Hexano
R1
R2
R1
R2
R1
R2
C= control; R1= rplica 1 y R2= rplica 2
22
2011
4.3.2
Determinacin
colorimtrica
de
esteroides
por
la
reaccin
Liebermann-Burchard (modificado de Parekh y Chanda, 2006)

De los extractos secos, se pesaron 4 mg de cada muestra en una balanza analtica
(OHAUS) y se colocaron en tubos eppendorf para microcentrfuga, se agreg 1mL de
cloroformo a cada muestra y se agit en un vortex para disolverla completamente, de
esta solucin se tomaron 200 L, se aadieron 200 L de anhdrido actico
[(CH3CO)2O] y dos gotas de cido sulfrico (H2SO4). Finalmente, se dej estabilizar la
reaccin durante 10 minutos; en esta etapa de la prueba es importante cuidar que la
muestra no se agite, ya que el anillo verde-azul (Figura 8)
que se forma por la
presencia de colesterol o sus derivados en el extracto, puede desaparecer como

consecuencia de la reaccin misma. Se utiliz colesterol como control positivo de la
reaccin Liebermann-Burchard (L-B).
Figura 8: Tubo eppendorf con la solucin verde-azul que forma el anillo en la reaccin colorimtrica
de Liebermann-Burchard con el colesterol.
4.3.3 Cuantificacin de compuestos esteroidales

4.3.3.1 Curva de calibracin
Para la curva de calibracin se realiz la prueba L-B, se utiliz colesterol grado
cromatogrfico (99% pureza, SIGMA) en cantidades de 1 a 5 mg, con dos rplicas cada
uno, colocados en tubos eppendorf; la dilucin se hizo en 1 mL de cloroformo, de los
cuales se tomaron 200 L, en seguida se agregaron 200 L de anhdrido actico y
finalmente dos gotas de cido sulfrico. Una vez estabilizada la reaccin se realizaron
las lecturas en el espectrofotmetro de UV-Vis marca Beckman modelo Du 350. El
23
2011
blanco fue la mezcla de los disolventes utilizados en la prueba L-B. Posteriormente, se

realiz un barrido con 300 L de la muestra con la concentracin ms alta del colesterol
(5 mg/mL) utilizando un intervalo de (longitud de onda) de 200 a 1100 nm. La de
mxima absorbencia detectada en el barrido (295 nm) fue la aplicada para medir la
absorbencia de todas las disoluciones. Los datos de absorbencia obtenidos se
graficaron contra la concentracin y se les realiz una regresin lineal, teniendo como
resultado la curva de calibracin y la ecuacin lineal correspondiente para determinar la
concentracin de compuestos esteroidales en los extractos crudos de O. aethiops.
4.3.3.2 Determinacin de la concentracin de compuestos esteroidales en

los extractos crudos de O. aethiops
Para realizar la cuantificacin de los compuestos esteroidales en los extractos crudos
de O. aethiops la reaccin L-B se realiz con 4 mg, tal y como se especific
anteriormente (ver 4.3.2). De la solucin que form el anillo, como resultado de la
reaccin L-B en todos los extractos, se colocaron 350 L en una celda de cuarzo de 400
L y se tom la lectura de cada una, utilizando una = 295 nm. Los datos obtenidos
fueron introducidos en la ecuacin lineal obtenida de la curva de calibracin para
conocer la concentracin de compuestos esteroidales en las muestras.
4.3.3.3 Anlisis estadstico

Se realiz un anlisis de la varianza de una va (ANDEVA) y as mismo una MANOVA
(p= 0.05) utilizando el paquete estadstico Statistica 7.0; para determinar diferencias
significativas entre la cantidad obtenida de extracto crudo por tratamiento utilizado, y el
efecto de los tiempos de extraccin entre los tratamientos. Para realizar la cuantificacin
de compuestos esteroidales por curva de calibracin y la regresin lineal se utiliz el
software Microsoft Office Excel 2007 y posteriormente se realiz un ANDEVA de una va
con el paquete estadstico antes mencionado.
4.3.4 Separacin de los compuestos esteroidales mediante tcnicas

cromatogrficas
4.3.4.1 Cromatografa en capa fina
Se utilizaron cromatofolios de slica gel FLUKA de 10 x 20 cm con un indicador
fluorescente a 254 nm, activadas en una estufa a 40 C por 40 minutos. Primero se
diluyeron los extractos con el respectivo disolvente, se tom una muestra con un tubo
24
2011
capilar de 10 L y se aplic sobre la base de la placa de manera rpida, para evitar una
saturacin en la placa y que la muestra se traslape con otra. Posteriormente, se
colocaron en una cmara cromatogrfica rectangular de 12.1 x 10.8 x 8.3 cm, con 10
mL de la fase mvil a probar; una vez que termin de ascender la fase sobre la placa,
se retiraron los cromatofolios de la cmara, se fotografiaron y se observaron en un
gabinete con luz UV a longitud de onda corta (254 nm) y larga (366 nm). Se probaron 6
fases mviles (Cuadro 2) y el revelador Liebermann-Burchard. Para revelar los
compuestos separados, previamente se sumergi cada placa de forma rpida en el
revelador, se le retir el exceso y se coloc en una plancha caliente para hacer
reaccionar el revelador.
Cuadro 2. Sistemas de disolventes propuestos por diferentes autores para separar compuestos
esteroidales.
Fase mvil
Proporcin
Separa
Autor
Benceno-acetato de etilo
50:10
Esteroles
Duque et al. (1997)
Esteroides
Roccatagliata et al.
sulfatados
(1996)
Esteroles
Garrido et al., (2003)
Butanol-acetato de etiloagua
Butanol-acetato de etiloagua
40:50:10
120:30:10
Etil ter-ter de petrleo
1:99
4:96
8:92
steres de
colesterol
Triacilgliceroles y
Boyer (2000)
cidos grasos
Esteroides
4.3.4.2 Cromatografa en fase slida y columna abierta (Pea et al., 2003)

Despus de haber identificado por cromatografa en capa fina (TLC) la muestra con los
compuestos de inters y la fase mvil que mejor los separ. Se procedi a la separacin
de los compuestos con 1.2 g de slica y 60 mg de la muestra seleccionada. Se utilizaron
dos fases de separacin, etil ter-ter de petrleo proporcin 6:94 y 8:92. Se mont un
sistema de extraccin utilizando una cmara de vacio con un vial en el interior para
recuperar las fraccione. En la base exterior se coloc un cartucho plastibrand de 2.5 mL
con un algodn en la base humedecido con la fase. Los 1.2 g de slica sin humedecer
25
2011
se colocaron en el cartucho y se aadieron 2 mL de la fase etil ter-ter de petrleo

(6:94), se eliminaron las burbujas de aire para evitar que la columna se fracturara. En un
vial por separado, la muestra disuelta con el mismo disolvente y con ayuda de una
pipeta Pasteur se coloc sobre la slica. La muestra fue absorbida por gravedad, y se
aadieron de la primera fase (etil ter-ter de petrleo 6:94) 5 mL, mililitro a mililitro,
enseguida y de la misma forma se aadieron 7mL de la segunda fase (etil ter - ter de
petrleo 8:92). La separacin de compuestos se observ al formarse bandas con
diferente coloracin a lo largo de la columna, a cada banda se le consider una fraccin,
las cuales fueron recuperadas y concentradas en el rotavapor en su respectivo vial.
Para tener una mejor visualizacin de las fracciones se expuso la columna a la luz UV
utilizando la longitud de onda larga (366 nm).
La separacin de compuestos en columna abierta se realiz para extractos de hexano
con mayor cantidad de muestra (>1 g), utilizando una columna de vidrio de 40 cm de
largo y 1 cm de dimetro interno, la cantidad de slica se determin, de acuerdo a la
cantidad de muestra a separar. La polaridad de las fases mviles se increment
gradualmente, utilizando 100 mL de los siguientes sistemas de disolventes: hexano
(100%), seguido de hexano-acetato de etilo (90:10 y 70:30), acetato de etilo (100%),
acetonitrilo (100%) y finalmente metanol (100%). Las fracciones fueron recuperadas en
viales y los disolventes se evaporaron a temperatura ambiente.
4.3.4.3 Evidencia y limpieza de los compuestos esteroidales de las

fracciones obtenidas de los extractos crudos de O. aethiops.
Para comprobar si en las fracciones obtenidas por separacin en fase slida y columna
abierta haba presencia de compuestos esteroidales se realiz lo siguiente:
1. En cromatografa en capa fina se compararon las fracciones obtenidas con el
colesterol, preparando una solucin de 4 mg en 350 L de hexano. Se probaron
diferentes fases mviles: etil ter, ter de petrleo, hexano y acetato de etilo.
Finalmente los cromatofolios fueron revelados con el reactivo de LiebermannBurchard.
2. Se realizaron barridos en el espectrofotmetro con las soluciones de las
fracciones y la solucin de colesterol, utilizando una de 100 hasta 1100 nm.
Una vez obtenidos los espectros se compararon y se seleccionaron los que
tuvieron un espectro de absorcin parecido al del colesterol.
26
2011
Una vez identificadas las fracciones que contenan los compuestos esteroidales, se
purificaron mediante separacin en fase slida, utilizando la fase que mejor los separ
en cromatografa en capa fina. Los compuestos se recuperaron en viales, y se
conservaron en refrigeracin para su posterior identificacin por Resonancia Magntica
Nuclear.
4.3.4.4 Identificacin de los compuestos obtenidos del extracto en hexano

de O. aethiops
La identificacin de compuestos fue realizada en el Departamento de Qumica del
CINVESTAV-IPN, mediante espectroscopa Infrarroja usando una pastilla de KBr en un
espectrmetro Perkin Elmer GX. El espectrograma de masas se realiz en un
espectrgrafo HP 5989A MS Engine Hewlett-Packard y en el LC/MSD TOF Agilent
Technologies con fuente de ionizacin ESI. Los puntos de fusin se determinaron en un
equipo Mel Temp II en tubo capilar abierto. Con los espectros de resonancia magntica
nuclear se obtuvieron espectros en una dimensin de 1H,
13
C] Hetcor y [1H/
13
C y en dos dimensiones [1H/
13
C] Cosy en equipos Jeol Eclipse 400MHz y Bruker Advance 300
MHz.
27
2011
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
5.1 Obtencin de extractos crudos del tejido corporal de O. aethiops
A la biomasa obtenida de los dos muestreos, se le realiz el proceso de extraccin de
compuestos esteroidales mediante el procedimiento descrito en la seccin 4.3.1
utilizando como disolventes hexano, butanol, cloroformo, acetato de etilo y metanol con
tiempos de extraccin de 6 (t1), 12 (t2) y 24 horas (t3). El Cuadro 3 presenta los pesos
totales obtenidos de cada extracto. Con estos datos se realizaron el ANDEVA y la
MANOVA, para determinar estadsticamente el mejor tratamiento y
el tiempo de
extraccin ms eficiente en el tratamiento 2.

Cuadro 3. Masa total (seca) obtenida por extracto crudo de O. aethiops.
Disolvente
Metanol
Acetato de etilo
Cloroformo
Butanol
Hexano
Tiempo
t1
t2
t3
t1
t2
t3
t1
t2
t3
t1
t2
t3
t1
t2
t3
T1
Peso Total
(mg)
9,386.57
16,284.19
15,365.96
366.19
170.78
231.87
189.56
141.7
142.26
16,957.68
16,065.37
9,477.13
312.97
151.12
273.04
T2
Peso Promedio
(mg)
0
0
0
210.4
582
295.37
66.71
81.43
52.9
0
0
0
8.29
9.07
16.36
En el tratamiento 1 se utiliz la extraccin fraccionada de compuestos esteroidales de

Ophiocoma aethiops, teniendo como referencias a Roccatagliata et al., (1996 y 1997) y
Duque (1997) quienes emplearon la extraccin fraccionada utilizando disolventes como
el metanol, butanol y hexano, sin embargo en este estudio se agregaron los disolventes
cloroformo y acetato de etilo. El cloroformo por ser utilizado en la extraccin de lpidos
totales en combinacin con el metanol (Boyer, 2000), y el acetato de etilo por extraer
hormonas sexuales de gnadas de erizos marinos (Barbaglio et al., 2007). Por otra
parte el butanol tambin ha sido utilizado como nico disolvente de extraccin para
obtener polihidroxiesteroides sulfatados de ofiuros (Shubina et al., 1998; Federov et
28
2011
al.,1994). De los extractos del T1, los obtenidos en butanol presentaron los valores ms
altos en peso seco, sin embargo, debido a su difcil evaporacin y alto punto de
ebullicin (117-118 C certificado por la Agencia de Proteccin Ambiental de los E.U
(EPA por sus siglas en ingls, 1994)), no se utiliz este disolvente en el tratamiento 2
(T2), ya que provoc que el secado de las muestras fuera muy lento, requirindose
hasta ms de 15 das, para dicho proceso. Por lo que no se consideraron los datos
obtenidos de este disolvente, para los anlisis estadsticos posteriores. Sin embargo, se
observ en los resultados del T1 que si es un disolvente capaz de obtener una cantidad
aceptable de peso seco. El metanol no se utiliz en el T2 debido a que es un disolvente
de alta polaridad y por lo tanto no extrae suficiente cantidad de compuestos esteroidales
del tejido corporal de O. aethiops.
5.1.2. Anlisis estadstico

En los anlisis estadsticos realizados no se consideraron los datos de los extractos
crudos en butanol y metanol, puesto que estos no fueron utilizados en el T2, el primero
por su alto punto de ebullicin y el segundo por no extraer cantidades suficientes de
compuestos esteroidales.
5.1.2.1 ANDEVA de una va para determinar el efecto de los tratamientos en

la masa obtenida por extracto crudo de O. aethiops
En la Figura 9 se muestra que en el anlisis de la varianza de una va no hubo
diferencias significativas (p>0.05) en cuanto a la masa obtenida de extracto crudo en el
T1 y el T2. Lo que indica que para obtener el extracto crudo se puede usar cualquiera
de los dos tratamientos, sin embargo esto slo se refiere a la mezcla de compuestos
presentes en los extractos y no al contenido de compuestos esteroidales.
29
2011
400
350
300
Peso (mg)
250
200
150
100
50
0
1
2
Tratamientos
Figura 9. ANDEVA de una va de los tratamientos 1 y 2 realizados a los extractos crudos

de O. aethiops respecto a la cantidad de masa obtenida.
5.1.2.2 MANOVA para determinar el efecto del tiempo en la masa obtenida

por extracto crudo de O. aethiops
Respecto a la cantidad obtenida de extracto por tiempo de maceracin, el anlisis
MANOVA mostr que no hubo diferencias significativas (p>0.05) entre ninguno de los
tiempos de extraccin aplicados en los tratamientos 1 y 2 (Figura 10); lo que indica que
probablemente los intervalos de tiempo no fueron lo suficientemente amplios como para
observar diferencias. Por otro lado, si se considera como se utilizaron los disolventes en
la extraccin de los compuestos esteroidales en cada tratamiento, entonces no se
puede conocer el verdadero efecto del tiempo, ya que la cantidad de extracto obtenido
no slo est dado en funcin del tiempo sino tambin por el disolvente utilizado. Por lo
que una buena comparacin del efecto del tiempo se dara en la extraccin realizada
con disolventes individuales como el realizado en el T2.
30
2011
600
500
400
Peso (mg)
300
200
100
-100
-200
1
Tratamiento
1
Tratamiento
2
Tiempo
Figura 10. MANOVA de los tiempos de extraccin utilizados en los tratamientos 1 y 2.
5.2 Determinacin colorimtrica de compuestos esteroidales en los

extractos crudos de O. aethiops
Los extractos crudos que contenan compuestos esteroidales, en la prueba colorimtrica
de Liebermann-Burchard (Burke et al., 1974) presentaron una solucin de color verdeazul, que forma el anillo de reaccin positiva. En el T1 la prueba fue positiva para los
extractos en hexano, butanol, cloroformo, acetato de etilo y en el t1 y t2 en metanol
(Cuadro 4); mientras que para el T2 fueron positivos los extractos en cloroformo y
acetato de etilo.
Debido a la poca cantidad de extractos obtenidos con hexano en el T2, no se realiz la
prueba L-B ni la cuantificacin de compuestos esteroidales en estos extractos por ser
un procedimiento destructivo, que no permitira disponer de una cantidad suficiente para
realizar el posterior anlisis en cromatografa. Los extractos del t1 y t2 en metanol del T1,
formaron un anillo pequeo, el cual, no fue suficiente para medir la absorbencia,
mientras que el t3 del mismo extracto no reaccion. Debido a lo anterior estos extractos
no fueron considerados para la cuantificacin.
31
2011
Cuadro 4. Resultados de la prueba Liebermann-Burchard en los extractos crudos de

O. aethiops obtenidos en el T1.
+ = positivo; - = negativo; t1=tiempo 1 (6 h); t2= tiempo 2 (12 h) y t3= tiempo 3 (24 h)
5.3 Cuantificacin de compuestos esteroidales por curva de calibracin

5.3.1 Longitud de onda de mxima absorcin en la reaccin L-B con
colesterol
Del barrido realizado a la solucin que forma el anillo en la reaccin L-B (ver 4.3.3.1), se
obtuvo la longitud de onda a la cual tiene su mxima absorcin (Figura 11). La reaccin
L-B produce diferentes compuestos: el colesteril sulfato, colesteril acetato, trazas de
3,5-ciclocolestanos, adems de otros esteroles (Xiong et al., 2007), los cuales
absorben a distinta longitud de onda, lo que explica la presencia de varios picos en el
32
2011
espectro. A 295 nm fue la mxima absorbencia correspondiente al compuesto

mayoritario, siendo sta la longitud de onda a la cual se hizo la lectura de las muestras.
Figura 11. Espectro de absorcin de la solucin que forma el anillo en la reaccin LiebermannBurchard con el colesterol desde una de 200-1100 nm, pico de mxima absorcin a 295
nm.
5.3.2 Curva de calibracin del colesterol y ecuacin lineal obtenida para la

cuantificacin de compuestos esteroidales en extractos crudos de O.
aethiops
Con los datos de absorbencia (Cuadro 5) de la solucin que forma el anillo en la
reaccin L-B con las distintas concentraciones del colesterol, se obtuvo la curva de
calibracin (Figura 12).
33
2011
Cuadro 5. Absorbencias de la solucin que forma el anillo en la reaccin L-B a distintas

concentraciones de colesterol y su desviacin estndar.
Colesterol (mg)
Absorbencia
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0.7 + 0.034
1.1 + 0.042
1.8 + 0.084
2.5 + 0.095
3.1 + 0.036
+ = desviacin estndar
3.5
3.0
Absorbencia
Absorbencia
2.5
Lineal
(Absorbencia)
2.0
1.5
1.0
0.5
y = 3.17x - 0.0635
R = 0.9933
0.0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
Colesterol (mg)
Figura 12. Curva de calibracin y Ecuacin lineal ( y= 3.17x-0.0635) obtenidas a partir de los datos de
absorbencia de la solucin que forma el anillo en la reaccin L-B en las distintas
concentraciones del colesterol.
De la curva de calibracin (Figura 12) se obtuvo la Ecuacin 2; cuya linealidad est

representada por el valor de la R2 (0.9933) indicando as que la mayora de los valores
obtenidos de absorbencia contra concentracin estn dentro de la lnea de tendencia.
De la Ecuacin 2 se sustituy el valor de la absorbencia en y se despej x para estimar
la concentracin (mg) de compuestos esteroidales contenidos en los 0.8 mg de extracto
que se encontraban disueltos en los 200 L utilizados para realizar la prueba L-B.
34
2011
Ecuacin 2: Ecuacin para calcular el contenido de compuestos esteroidales.
Donde:
5.3.3 Concentracin de compuestos esteroidales en los extractos crudos

de O. aethiops
Para realizar la cuantificacin de compuestos esteroidales como equivalentes de
colesterol en los extractos crudos de O. aethiops; a la solucin que form el anillo en la
reaccin L-B en cada uno de los 0.8 mg de los extractos y sus rplicas, se les midi la
absorbencia a 295 nm. Los valores de absorbencia obtenidos se sustituyeron en la
Ecuacin 2 para obtener el valor de x (ver ejemplo en Cuadro 6).
Cuadro 6. Clculos para obtener la concentracin de compuestos esteroidales en 0.8 mg de las

rplicas del extracto en hexano del t1 y T1.
Extracto
(0.8 mg)
Muestra
Absorbencia
Hexano
t1, T1
C
R1
0.138
0.194
Sustitucin de datos en la Concentracin

Ecuacin 2
de CE
x=((y+0.0635)/1.268)
(mg)
x=((0.138+0.0635)/3.17)
=((0.194+0.0635)/3.17)
x= 0.243
= 0.261
C= control, R1= rplica 1, t1= tiempo 1, T1= tratamiento 1, + = desv. estd.
El resultado obtenido en cada una de las rplicas, se extrapol a la masa total de los
extractos enlistados en el Cuadro 3, de esta forma se obtuvo la concentracin total de
compuestos esteroidales por extracto crudo de O. aethiops. La extrapolacin se realiz
mediante una regla de proporcionalidad directa (Ecuacin 3), considerando que el
contenido de compuestos esteroidales (B) estn presentes en la masa (A) utilizada para
realizar la prueba L-B (0.8 mg); por lo tanto, la masa del extracto en el tiempo y
tratamiento respectivo (x) contiene una cierta cantidad de compuesto esteroidales (y).
35
2011
Ecuacin 3: Ecuacin de proporcionalidad directa para estimar el contenido de compuestos

esteroidales.
Tomando el dato de la muestra control (0.243 mg) del ejemplo (Cuadro 6), se sustituyen
los valores de B, A y x en la Ecuacin 3 y obtenemos el valor de y (Ecuacin 4):
Ecuacin 4: Cantidad de compuestos esteroidales contenidos en la masa total del extracto.
Por lo tanto en 312.97 mg de extracto crudo hay 95.39 mg de compuestos esteroidales.

A partir del ejemplo anterior se realiz la cuantificacin de compuestos esteroidales en
la masa total de los extractos por rplica de los tratamientos. Con los datos de
concentracin de compuestos esteroidales en los extractos, se realiz una regla de
proporcionalidad directa para obtener el porcentaje de compuestos esteroidales en el
extracto; esto suponiendo que la masa total de los extractos es el 100% (Cuadro 7).
Los porcentajes de esteroides en los extractos se utilizaron para realizar un ANDEVA de
una va (Figura 13), para determinar si existan diferencias significativas entre el
porcentaje de compuestos esteroidales obtenidos por tratamiento y disolvente utilizado
para realizar las extracciones.
36
2011
Cuadro 7. Concentracin y porcentaje de compuestos esteroidales en extractos crudos de O.

aethiops obtenidos con los tratamientos 1 y 2.
Extracto
Concentracin
CE en 0.8 mg
Concentracin
CE en extracto
(mg)
T1
T2
T1
T2
Hex-t1
0.243
0.261
0
0
0
95.396
102.307
Hex-t2
0.268
0.275
0
0
0
Hex-t3
0.230
0.271
Clo-t1
% de CE
en extracto
% promedio de CE
T1
T2
T1
T2
0
0
0
30.48
32.68
0
0
0
31.58+1.56
50.651
52.021
0
0
0
33.51
34.42
0
0
0
33.97+0.64
0
0
0
78.811
92.807
0
0
0
28.86
33.99
0
0
0
31.43+3.62
0.246
0.259
0.540
0.500
0.545
58.452
61.592
45.063
41.748
45.510
30.83
32.49
67.54
62.57
68.21
31.66+1.17
Clo-t2
0.264
0.294
0.390
0.409
0.421
46.879
52.243
39.753
41.679
42.932
33.08
36.86
48.81
51.18
52.72
34.98+2.68
50.91+1.97
Clo-t3
0.235
0.252
0.463
0.447
0.425
41.847
44.989
30.663
29.599
28.160
29.41
31.62
57.96
55.95
53.23
30.52+1.56
55.72+2.37
AE-t1
0.253
0.278
0.466
0.440
0.480
116.239
127.357
122.705
115.736
126.439
31.74
34.77
58.32
55
60.09
33.26+2.15
57.81+2.58
AE-t2
0.305
0.308
0.347
0.496
0.470
65.119
65.860
252.444
361.455
342.406
38.13
38.56
43.37
62.10
58.83
38.35+0.31
54.77+10.00
AE-t3
0.244
0.267
0.498
0.465
0.418
70.950
77.442
184.025
171.796
154.442
30.59
33.39
62.30
58.16
52.28
32.00+1.98
57.58+5.03
66.11+3.08
CE= compuestos esteroidales, Hex= hexano, Clo= Cloroformo, AE=acetato de etilo, t1= tiempo 1, t2= tiempo2, t3=
tiempo 3, T1= tratamiento 1, T2= tratamiento 2, %= porcentaje, += desviacin estndar.
37
2011
70
60
Porcentaje de CE en el extracto
50
40
30
20
10
0
-10
-20
1
Hexano
2
Cloroformo
3 etilo
Ac. de
Tratamiento 1
Tratamiento 2
Extracto
Figura 13. ANDEVA de una va de los extractos crudos de O. aethiops en los tratamientos 1 y 2
respecto al porcentaje obtenido de compuestos esteroidales.
En la Figura 13 se aprecia que entre los extractos de los tratamientos 1 y 2 no existieron

diferencias significativas (p>0.05). La barra del extracto en hexano del T2 est en 0
debido a que en este no se obtuvieron datos para la cuantificacin. Por otro lado se
observa que el T2 fu el mejor dado que los porcentajes obtenidos son mayores a los
del T1. Las diferencias que se presentaron en los porcentajes de compuestos
esteroidales entre ambos tratamientos, pudieron deberse a dos factores: el tratamiento
qumico realizado a las biomasas y el estado metbolico de los organismos. En lo que al
tratamiento qumico respecta, en el T1 se realiz una extraccin fraccionada usando
disolventes de mayor a menor polaridad, lo cual provoc que la obtencin de los
compuestos esteroidales por disolvente estuviera influenciada por el disolvente anterior;
ya que las diferentes polaridades de los compuestos hace que estos se vayan
difundiendo parcialmente en el disolvente utilizado previamente, por lo tanto la
concentracin de dichos compuestos ser menor por cada uno de los disolventes. En el
T2 la extraccin nicamente estuvo influenciada por el tiempo de maceracin, ya que se
utiliz un disolvente diferente por biomasa, permitindo de esta forma que el disolvente
38
2011
de acuerdo a su polaridad extrajera todos los esteroides de la biomasa, logrando as

una mayor concentracin de los mismos.
El estado metablico de los organismos fue considerado debido a que en el T1 se
obtuvieron los porcentajes menores, a pesar de haber obtenido los extractos crudos de
una biomasa de 200 g, mientras que en el T2 se obtuvieron mayores porcentajes y en
este se usaron 75 g de biomasa para obtener los extractos. Esto permite deducir que la
produccin de compuestos esteroidales
de los organismos utilizados en el T2 era
mayor a los de los utilizados en el T1. Con respecto a esto Hines et al. (1992 b), Voogt
et al. (1991) y Schoenmakers y Dieleman (1981) mencionan que en las gnadas tanto
de ofiuroideos como de otros equinodermos, se encuentran la mayor parte de los
compuestos esteroidales, y cualquier cambio en dichos rganos sexuales afecta la
composicin de los mismos. Wasson y Watts (2000) adems mencionan que algunos
factores especficos que pueden producir tales cambios son: a) el crecimiento gonadal
debido al almacenamiento de nutrientes; b) iniciacin de la gametognesis; c) la misma
gametognesis; d) el desove; e) la reabsorcin de gametos o recesin gonadal y f) el
relajamiento gonadal; sin embargo Pearse y Cameron (1991) relacionan los cambios
anteriores con los factores ambientales como la salinidad, temperatura, fotoperodo y la
disponibilidad de nutrientes, en cuanto a ste ltimo factor Xu y Barker (1990)
mencionan que la calidad y cantidad de la alimentacin de los organismos afectan la
composicin bioqumica de los mismos. Por otro lado, las bajas cantidades obtenidas en
el T1 pueden deberse segn Van der Plass y Voogt (1982) al inicio de la produccin de
carbohidratos, la cual se presenta despus del desove. Otros factores que influyen en la
estimacin de las concentraciones de esteroides en el tejido de los invertebrados, es la
variabilidad entre especies, rganos, procedimientos de extraccin y los mismos
mtodos de cuantificacin (Gauthier-Clerc et al., 2006).
Los porcentajes promedios del Cuadro 7 fueron graficados en la Figura 14 y en esta se

observa que el mayor porcentaje de compuestos esteroidales (66.11 %) estuvo en el
extracto en cloroformo del t1, por otro lado los valores del t2 y del t3 del mismo extracto
se esperaba fueran mayores dado que el tiempo de maceracin fu mayor, sin embargo
los porcentajes obtenidos en estos tiempos fueron menores. Estos porcentajes menores
de compuestos esteroidales se obtuvieron debido al mayor tiempo de maceracin ya
que segn Serrano (2000) los esteroides se degradan si son expuestos por mucho
tiempo a la luz, el aire y temperaturas elevadas.
39
2011
66.11
70
Porcentaje de CE
60
50.9
55.71
57.8
54.77
57.58
50
40
31.58
33.97
30
31.42 31.66 34.9730.52 33.26
38.34
31.99
Tratamiento 1
20
10
Tratamiento 2
0
Extractos
Figura 14. Porcentajes promedio de compuestos esteroidales presentes en los extractos crudos de
O. aethiops.
5.4 Tcnicas cromatogrficas

5.4.1 Cromatografa en capa fina de los extractos crudos de O. aethiops
obtenidos con el T1
De los extractos que resultaron positivos en la prueba L-B del T1 se analizaron en
cromatografa en capa fina, probando seis fases mviles diferentes (Cuadro 2). Para
facilitar la comparacin de las separaciones, en cada cromatofolio se coloc el extracto
por tiempo de extraccin (t1, t2 y t3), obteniendo de esto los siguientes resultados:
De las seis fases mviles probadas para el extracto en acetato de etilo, las fases que
arrastraron compuestos (Figura 15) fueron: benceno-acetato de etilo (50:10); butanolacetato de etilo-agua (40:50:10) y butanol-acetato de etilo-agua (120:30:10).
Compuestos
separados
Compuestos
retenidos
A)
B)
C)
Figura 15: Cromatofolios con aplicaciones en cada carril, de los extractos en acetato de etilo por
tiempo de extraccin (t1, t2 y t3) del T1, que muestran la separacin con las fases: A)
benceno-acetato de etilo (50:10); B) butanol-acetato de etilo-agua (40:50:10) y C) butanolacetato de etilo-agua (120:30:10); en la parte superior en un crculo compuestos
separados y en la parte inferior los retenidos.
40
2011
Para el extracto en cloroformo de las seis fases probadas, la nica que arrastr
compuestos fue la de butanol-acetato de etilo-agua (40:50:10) (Figura 16: A y B).
Compuestos
separados
t1
t2
Compuestos
retenidos
t1 t2 t3
t3
Figura 16: Cromatofolios con aplicaciones en cada carril, del extracto en cloroformo por tiempo de
extraccin (t1, t2 y t3). A) Separacin de los compuestos con la fase butanol-acetato de
etilo-agua (40:50:10); y B) cromatofolio revelado con luz UV a una =254 nm.
Como se observa en las Figuras 15 y 16, los compuestos no tienen una buena
separacin, ya que estos se encuentran muy juntos y adems otros estn retenidos en
la base de la placa. Por lo tanto las fases butanol-acetato de etilo-agua (40:50:10),
benceno-acetato de etilo (50:10) y butanol-acetato de etilo-agua (120:30:10), no son
sistemas de disolventes eficientes para la separacin de compuestos esteroidales en
estos extractos. Por otro lado, de las seis fases probadas en los extractos en hexano del
t1, t2 y t3, slo en el extracto del t3, las fases mviles etil ter-ter de petrleo (1:99),
(4:96) y (8:92) separaron un compuesto mayoritario de coloracin azul intenso bajo la
luz UV (= 366 nm). La separacin se mejor conforme se aument la concentracin de
1:99 a 8:92. En los extractos correspondientes al t1 y t2 no se observ ninguna
separacin de compuestos (Figura 17).
Compuesto
mayoritario
t1
t2
t1
t3
A)
t2
t3
t1
B)
t2
Compuestos
retenidos
t3
C)
Figura 17: Cromatofolios bajo luz UV (366 nm). En cada carril separacin de las aplicaciones de los
extractos en hexano por tiempo de extraccin (t1, t2 y t3) con las fases: A) etil ter-ter
de petrleo 1:99, B) etil ter-ter de petrleo 4:96 y C) etil ter-ter de petrleo 8:92. En
crculos superiores el compuesto mayoritario separado, en el crculo inferior
compuestos retenidos.
41
2011
Dado que la fase etil ter-ter de petrleo (8:92) separ un compuesto mayoritario en
el extracto en hexano obtenido en el t3, se prob esta misma fase mvil con todos los
extractos obtenidos en el t3, con la finalidad de observar si separaba algn otro
compuesto en estos extractos. Para realizar esto, se coloc en una misma placa los
extractos en acetato de etilo, hexano, cloroformo y butanol obtenidos en el t3. En el
cromatofolio de la Figura 18 se muestra que slo el extracto en hexano es en el que se
separa el compuesto (Rf= 0.611); comprobando de esta forma que la nica separacin
se dio con esta fase en el extracto en hexano obtenido en el t3.
Rf= 0.611
AE
HEX
CLO
BUT
Figura 18: Cromatofolio revelado bajo la luz UV (=366 nm) en cada carril separacin de las
aplicaciones de los extractos crudos en acetato de etilo, hexano, cloroformo y
butanol obtenidos en el t3, utilizando la fase etil ter-ter de petrleo 8:92. En el
crculo compuesto nico separado (Rf= 0.611). AE= extracto en acetato de etilo,
HEX= extracto en hexano, CLO= extracto en cloroformo y BUT= extracto en butanol.
5.4.2 Cromatografa en fase slida del extracto crudo en hexano de O.

aethiops obtenido en el t3.
En la cromatografa en capa fina, la fase mvil etil ter-ter de petrleo (8:92) mostr
ser la adecuada para separar compuestos en el t3 del extracto en hexano, por lo que se
realiz cromatografa en fase slida con dicho sistema de disolventes, obteniendo de
esta forma la fraccin con el compuesto de inters denominado 3H, H por ser la fraccin
obtenida del extracto en hexano y 3 por que se obtuvo en el t3.
42
2011
Dado que el compuesto fue obtenido con disolventes de muy baja polaridad, se supuso
era un esteroide y para comprobarlo se realiz un barrido (200-600 nm) de la fraccin
3H, comparndolas con el colesterol. Se utiliz el colesterol como estndar por ser el
precursor principal de los esteroides y por que posee la estructura base de cualquier
esteroide (ciclopentanoperhidrofenantreno).
En la Figura 19 se observa que el barrido de la fraccin 3H, presenta un
comportamiento similar al del colesterol, sin embargo, dos picos son visibles, el
mayoritario con una absorbencia de 3.537 a una de 227 nm y el minoritario 0.419 a
una de 419 nm, lo cual indic que existan dos compuestos en la fraccin, por lo que
se procedi a separar nuevamente por fase slida, utilizando esta vez la fase mvil
hexano-acetato de etilo (9:1 v/v), obtenindo de esta forma el compuesto 3H (12 mg).
Figura 19. Espectros de absorcin del colesterol y la fraccin 3H, separada del extracto crudo en
hexano de O. aethiops (obtenido del T1 en el t3). En el espectro de absorcin de la
fraccin 3H se localizan dos picos de mxima absorcin 3.53 (= 227 nm) y 0.419 (= 410
nm).
43
2011
5.4.3 Cromatografa en capa fina de los extractos crudos de O. aethiops

obtenidos en el T2
En los extractos crudos de O. aethiops del T2 se realiz CCF para buscar el compuesto
3H obtenido por separacin en fase slida del extracto en hexano del T1, para esto, se
analizaron los extractos en acetato de etilo y coloroformo del T2 utilizando la misma
fase mvil con la que se separ la fraccin 3H (etil ter-ter de petrleo 8:92). En este
anlisis, no se consideraron las muestras de hexano, debido a que no se obtuvo la
cantidad suficiente para realizar la posterior separacin en fase slida. Dado que el
compuesto 3H tuvo un Rf= 0.611, se obtuvo el Rf correspondiente a cada compuesto
separado en TLC de los extractos crudos del T2, y como se observa en el Cuadro 8
ninguno de los compuestos separados obtuvo un Rf igual al del 3H. Con esto se puede
decir que el compuesto 3H no se encontr en los extractos crudos del T2.
Cuadro 8. Factor de retencin (Rf) calculado para cada uno de los compuestos separados de los
extractos crudos de O. aethiops en el T2.
Extracto
Fracciones Separadas
en CCF
Rf
Clo-t1
0.139
Clo-t2
1
2
0.189
0.511
Clo-t3
0.183
AE-t1
0.178
AE-t2
0.200
AE-t3
0.189
Clo= cloroformo, AE= acetato de etilo, t1= tiempo 1, t2= tiempo 2, t3= tiempo 3
La bsqueda del compuesto 3H en los extractos crudos del T2 se realiz para obtener
una mayor cantidad del compuesto, pero debido a que no fue encontrado en estos, se
realiz la bsqueda del mismo, en el extracto obtenido en 21 das con hexano; sin
embargo este no fue visualizado, por lo que se procedi a fraccionar en columna
abierta, para ver si el compuesto 3H se encontraba presente en alguna fraccin.
44
2011
5.4.4 Cromatografa en columna abierta del extracto crudo de O. aethiops

obtenido en 21 das con hexano
En la Figura 20 se muestra el procedimiento de la separacin en columna abierta para
el extracto crudo en hexano obtenido en 21 das. Las fracciones finales obtenidas de la
separacin fueron A del cual se obtuvo 61. 77 mg y de la fraccin Z3 20 mg.
La tcnica se realiz en dos etapas, en la primera se utilizaron 300 mg de extracto, en
15 g de slica. Se usaron 50 mL de las fases mviles etil ter-ter de petrleo (8:92),
hexano-acetato de etilo (3:70) y acetato de etilo (100), obteniendo 12 fracciones
clsificadas como A, B, C, etc., a las cuales posteriormente se les realiz cromatografa
en capa fina (CCF) y se utiliz el revelador L-B, para determinar las fracciones con los
compuestos esteroidales. De las primeras 12 fracciones obtenidas, las fracciones A y E
fueron las de utilidad, ya que reaccionaron con el revelador L-B. La fraccin E fue
fraccionada nuevamente por fase slida utilizando como fase mvil hexano-acetato de
etilo (3:70), obteniendo de esto 6 nuevas subfracciones (E1, E2,E6), a las que se les
hizo CCF con el respectivo revelado, E6 fue la subfraccin con el compuesto
mayoritario, sin embargo present restos de la subfraccin A5, por lo que esta fraccin
fue limpiada por fase slida y se obtuvieron las subfracciones Z1, Z2 y Z3 de las cuales la
fraccin Z3 reaccion con el revelador L-B. En la segunda etapa se busc aumentar la
cantidad de las fracciones A y Z3 obtenidos en la primera etapa, para lo cual se
utilizaron 500 mg del mismo extracto y se sigui el mismo procedimiento. Las primeras
12 fracciones obtenidas en esta segunda etapa fueron clasificadas como A, B, C, etc.,
mientras que las obtenidas de la separacin en fase slida de la fraccin E fueron
especificadas como E1, E2, E6. Las fracciones obtenidas de la limpieza en fase
slida de la subfraccin E6 se nombraron Z1, Z2 y Z3. Las fracciones A y A se
agruparon por presentar los mismos compuestos, las subfracciones Z3 y Z3 tambin
fueron agrupadas.
45
2011
Separacin en columna
abierta del extracto
crudo en hexano (21
das)
300 mg
500 mg
12
fracciones
12
fracciones
A, B, C, D, E,
F, G,..
A' , B', C', D',

E', F', G',..
CCF y
Revelado
con L-B
CCF y
Revelado con
L-B
Fraccin A y E
c/ compuestos
de inters
Fraccin E a
separar en
fase slida
E1, E2, E3,

E4, E5, E6
CCF y
revelado
con L-B
E6
subfraccin
de inters
Limpieza fase
slida
(subfracciones
Z1, Z2 y Z3), Z3 la
de inters
Fraccin A' y E'

c/ compuestos
de inters
Fraccin E a
separar en
fase slida
Fraccin A y
fraccin A' se
mezclaron
E'1,E'2, E'3,
E'4, E'5, E'6
Subfraccin
Z3 y Z'3 se
mezclaron
CCF y
revelado
con L-B
E'6 subfraccion
de inters
Limpieza fase
slida
(subfracciones
Z'1, Z'2, y Z 3), Z'3
la de inters
Figura 20. Procedimiento realizado para separar compuestos esteroidales a partir del extracto en
hexano obtenido en 21 das utilizando cromatografia en columna abierta y fase slida.
46
2011
El compuesto 3H se observ en la subfraccin E4 (Figura 21), sin embargo no se pudo

separar por fase slida con las fases etil ter-ter de petrleo (8:92), hexano (100) o
hexano-acetato de etilo (30:70), ya que el otro compuesto que se encontraba en la
fraccin tambin era de muy baja polaridad, adems la fraccin en la que se encontr
tena un peso seco de 15 mg, y si se lograba separar por fase slida, la cantidad que se
obtendra del compuesto 3H sera mnima.
Compuesto
3H
E1 E2 E3 E4 E5
Figura 21. Cromatofolio con muestras en cada carril de las fracciones obtenidas de la separacin del
extracto en hexano de 21 das (E1, E2, E3, E4 y E5). En la fraccin E4 el compuesto 3H,
separado utilizando la fase etil ter-ter de petrleo (8:92).
5.5 Identificacin de compuestos por Resonancia Magntica Nuclear y

Espectrometra de Masas
Las fracciones con compuestos identificados fueron la fraccin 3H, Z3 y A; los espectros
obtenidos de cada una de las fracciones se agrupan en la seccin de anexos. A
continuacin se describen los resultados obtenidos de las tres fracciones, los cuales
fueron descritos por la Dra. Angelina Flores Parra.
47
2011
5.5.1 Fraccin 3H
La muestra contena solo un compuesto, con punto de fusin 60-61C. Por
espectrometra de masas de alta resolucin (+)TOF (Anexo A) se encontr una posible
frmula mnima [C19H41O3] cuya masa es de 317.30 uma. En el espectro tambin se
obtuvieron las masas de un segundo compuesto 339.20 uma y que corresponde para
una sal sdica con formula mnima de [C17H40O3Na], este ltimo se forma en el
tratamiento que se le da a las muestras para este anlisis.
En el espectro de IR (Anexo B) no se presentaron seales para grupos carbonilo de
steres, cidos, aldehdos cetonas, ni para sistemas insaturados.
En la RMN de 1H y
13
C se deduce que no hay sistemas insaturados ya que las seales
aparecen de 0.5 ppm a 4.00 ppm. En la zona de 3.4 a 4.0 ppm se observan seales
muy acopladas
debido a la presencia de sustituyentes electroatractores como los
grupos hidroxilo (-OH). La ausencia de seales caractersticas de grupos metilo (CH3)

indica que puede ser un sistema de ciclos fusionados.
En RMN
13
C (Anexo C) hay alrededor de 22 carbonos de los cuales solo uno es un
metino (RRRC-H) y aparece (en 70.3 ppm), el resto de seales corresponden a

carbonos (-CH2-). El Cuadro 9 muestra la posicin y los desplazamientos de los
carbonos presentes en el compuesto 3H.
Las 4 seales mas desplazadas a frecuencias altas [72.5, 71.8, 70.3 y 64.2 ppm]
corresponden a carbonos unidos a tomos electroatractores como el oxgeno o el
nitrgeno. En el espectro 1H/13C HETCOR (Anexo D) estas seales se correlacionan
con las seales desplazadas a alta frecuencia de 3.0 a 4.0 ppm.
La espectroscopia de dos dimensiones 1H/1H COSY (Anexo E) muestran correlaciones
entre las seales que aparecen de 0.5 a 1.6 ppm con las seales de 3.0 a 4.0 ppm. De
los datos anteriores solo se propone que el compuesto tiene un esqueleto como el que
se presenta en la Figura 22.
48
2011
Cuadro 9. Datos del espectro de RMN
Posicin
Tipo de carbono
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
CH
CH
CH
CH2
CH
CH2
CH2
CH
CH
CH
CH
CH2
CH
CH
CH2
13
C del compuesto 3H.
Desplazamiento
(ppm)
77.446
77.221
77.023
76.599
72.535
71.87
70.378
64.284
31.934
29.69
29.468
29.377
26.088
22.703
14.138
Figura 22. Estructura molecular obtenida a partir de los espectros de Resonancia Magntica
Nuclear para el compuesto de la fraccin 3H.
5.5.2 Subfraccin Z3
Esta muestra contiene dos diferentes compuestos que se observan al medir el punto de
fusin: una parte funde a 59-60 C y la otra a 121-124 C. En el espectro de IR (Anexo
F) no se encontraron seales caractersticas para las funciones carbonlcas de cetona,
aldehdo steres.
En la RMN de
13
C aparece un compuesto mayoritario al que corresponden seales que
se describen a continuacin (Cuadro 10):

El esqueleto del esteroide lo forman las 7 seales que corresponden a grupos -CH2- en
{42.2, 39.5, 31.8, 31.6, 28.2, 24.3 y 21.0 ppm} observadas en el espectro normal de
carbono-13 (Anexo G). En el experimento APT de carbono-13 (Anexo H) se establece
que las seales en 71.8, 56.7 y 50.1 ppm son de carbonos saturados unidos a un solo
49
2011
tomo de hidrgeno (RRRC-H). De ellos y por su desplazamiento a frecuencias altas,

la seal en 71.8 estara unido a un grupo hidroxilo (-OH).
De los mismos espectros se establece que, los grupos sustituyentes en los anillos
esteroidales son:
Dos grupos metilos (-CH3) con seales que aparecen entre 11.8 a 19.41ppm.
Un grupo [RRC=CH(R)] cuyas seales aparecen a frecuencias altas, en la zona
caracterstica de tomos de carbn insaturados: en 140.7 ppm [carbono cuaternario,
RRC=] y en 121.7 ppm un carbono metino olefnico [=CHR]. En el espectro HETCOR
(Anexo I), esta ltima seal correlaciona con la seal de carbono-13 en 37.2 ppm e
indica que R es un grupo etilo.
De la RMN de protn solo se pueden analizar las seales de su grupo vinlico en el
compuesto mayoritario. Para este estudio se hicieron experimentos de correlacin en
dos dimensiones: de 1H/13C HETCOR (Anexo I) y 1H/1H COSY (Anexo J).
En el espectro HETCOR se encontr que la seal del protn en 3.5 ppm correlaciona
con una de las seales del carbn (RRRC-H), en 71.8 ppm. Adems en el espectro
COSY, la misma seal del protn en 3.5 ppm correlaciona con otras seales de protn
en 1.5 y 2.3 ppm de grupos metilenos (-CH2-) del esqueleto esteroidal.
Para el grupo vinlico descrito en carbono-13, en el espectro HETCOR se observa
correlacin de la seal en 121.7 ppm, del carbn vinlico [C-H], con el protn en 5.3
ppm. En el espectro COSY se encontraron correlacin de ese protn en 5.3 ppm con la
seal alrededor de 2.3 ppm de metilnico (-CH2-).
El compuesto de menor cantidad solo se observa una interaccin de la seal en 5.2
ppm con 1.96 ppm.
La integracin del protn en la zona de los protones unidos a carbonos saturados, de
0.5 a
2.5 ppm indica que se tienen 58 protones para los dos compuestos y que
corresponden a la parte del esqueleto del esteroidal.

Los dos compuestos presentes en la muestra son derivados esteroides con estructuras
muy parecidas: los esqueletos cclicos no contienen grupos carbonilo, presentan un
sustituyente olefnico con un sustituyente etilo, posiblemente dos grupos metilo y grupo
hidroxilo (Figura 23).
50
2011
Cuadro 10. Datos del espectro de RMN
Posicin
Tipo de carbono
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
1'
CH2
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH2
CH
CH
C
CH2
CH2
C
CH
CH2
CH2
CH
CH2
CH2
CH2
C
CH
CH3
CH3
CH
CH2
CH3
13
C del compuesto Z3.
Desplazamiento
(ppm)
140.74
138.12
136.08
131.8
121.74
77.451
77.028
76.605
71.815
56.756
56.133
55.922
50.119
43.072
42.277
40.172
39.765
39.518
37.243
36.506
36.186
35.799
33.891
33.23
31.897
31.636
29.706
Figura 23. Estructura molecular obtenida de los espectros de Resonancia Magntica Nuclear para el
compuesto de la fraccin Z3.
51
2011
5.5.3 Fraccin A
La muestra contiene mnimo dos compuestos [50/50 %] diferentes a los detectados en
las fracciones Z3 y fraccin 3H.
En la espectrometra de masas de alta resolucin (+)TOF no fue posible obtener
informacin pues la muestra es inestable y se descomponen fcilmente durante el
tratamiento que se le da durante este anlisis.
En el espectro de IR (Anexo K) se observ que uno de los compuestos (o los dos)
contienen un grupo carbonilo en 1743.2 cm-1.
La RMN de
13
C (Anexo L) encontr seales de dos tipos de carbonilos, la seal ms
grande aparece en 173.3 ppm y junto a ella otra seal de menor tamao, en 172.9 ppm.
En el espectro se encuentran tambin dos seales en 129.9 y 128.2 ppm,
caractersticas de grupos metinos insaturados (=C-H). A frecuencias menores se tienen
otras dos seales que corresponden en el espectro ATP de carbono-13 (Anexo M), a
grupos metinos saturados (RRRC-H) y dos grupos metileno cuyos desplazamientos
(68.9 y 62.09 ppm respectivamente) indican que estn unidos a
un tomo
electroatractor como oxgeno o nitrgeno. En el espectro HETCOR (Anexo N), la seal

a 62.09 correlaciona con las seales en 4.2 ppm con una multiplicidad caracterstica
para un sistema AB (-CH2-). En 14.1 ppm se encuentra una seal que corresponde a
un grupo (-CH3) y que en el espectro COSY (Anexo ) correlaciona con la seal en
1.24 ppm {seal para 17 protones de grupos (-CH2-)}. Las seales restantes a
frecuencia baja corresponden a grupos metilenos saturados (-CH2-) del esqueleto
esteroidal. Sin embargo, debido a las concentraciones de los compuestos en la muestra
[50/50 %] result imposible identificar plenamente las seales para cada uno y por lo
tanto proponer una estructura.
La estructura propuesta para el compuesto obtenido en la subfraccin Z3 es un
esteroide, confirmando de esta forma la presencia de compuestos esteroidales en la
especie O. aethiops, sin embargo este esteroide no se dilucid completamente, y por lo
tanto no pudo ser nombrado. A pesar de esto los datos obtenidos pudieron ser
introducidos en la base de datos NAPROC13 de la Universidad de Salamanca, Espaa
y no se encontr ningn compuesto similar, esto permite suponer que el esteroide
obtenido del tejido corporal de la especie Ophiocoma aethiops no ha sido reportado
anteriormente. Para el gnero Ophiocoma otros esteroides han sido descritos, lo cual es
un indicativo de la variabilidad de la composicin qumica de las especies; y en lo que a
esto respecta Drazen et al. (2008) y Duque et al. (1997) mencionan que las diferencias
52
2011
en la composicin lipdica de los equinodermos y en particular de los ofiuroideos, son un

claro indicativo de las diferentes estrategias de alimentacin. Por otro lado, Rozner y
Garti (2006) y Drazen et al.(2008) aseveran que la composicin de esteroles de los
equinodermos es un indicativo de su alimentacin. Dado que algunos de estos
compuestos son nicamente sintetizados por algas y plantas donde su funcin principal
es regular la fluidez de la membrana; en el ambiente marino estos compuestos se
encuentran presentes en el fitoplancton (Volkman, 1986, 2003). Tambin se sabe que
los ofiuroideos son consumidores oportunistas, ya que pueden alimentarse tanto de
material fitodetrital, como animal (Warner, 1982; Pearson y Gage 1984) y esto tambin
se ve reflejado en la composicin de esteroles, por lo que la presencia de colesterol y
sus derivados, en la composicin de estos organismos refleja adems una dieta
carnvora (Nelson et al., 2001).
Drazen et al. (2008) mencionan que, si una especie de ofiuroideo presenta un fuerte
contraste en cuanto a la composicin de esteroles, comparado con otras especies,
indica que la especie es selectiva, dado que utiliza mtodos eficientes de captura,
favorecidos adems, por una capacidad locomotora eficaz, logrando de esta forma,
obtener una mayor cantidad de alimento en menor tiempo y en un rea pequea. A
diferencia de los holoturoideos que tienen que cubrir grandes reas del fondo marino en
busca de partculas alimenticias (Kauffman y Smith 1997; Roberts et al., 2000),
marcando as la diferencia en el contenido de esteroles. Por otro lado, las diferencias
entre las especies en la composicin de esteroles y sus derivados, Duque et al. (1997)
lo atribuyen, adems de los hbitos alimenticios a los diferentes hbitats en que se
encuentran estos organismos, ya que el tipo de alimento que estos consuman
depender de las condiciones del mismo hbitat. El tipo de alimentacin del gnero
Ophiocoma es del tipo micrfago, es decir, se alimentan de una mezcla de material
animal y vegetal (Calva, 2002), y por dicha estrategia alimenticia es congruente
encontrar compuestos derivados del colesterol en su composicin qumica.
Adems de la biologa de las especies, los factores ecolgicos tambin tienen un rol
importante en la composicin qumica de los organismos, dado que, el xito de una
especie depende de la respuesta de su metabolismo, dado que
los productos
secundarios de las vas metablicas, son los que brindan dichas ventajas ecolgicas a
presiones como: a) la competencia por el espacio, b) el alimento, c) la depredacin, d)
interacciones invasivas y e) la comunicacin intraespecfica.
53
2011
6. CONCLUSIONES
Los tratamientos y tiempos de extraccin empleados no influyeron en la cantidad
de extracto obtenido por biomasa. Sin embargo la extraccin fraccionada con
disolventes de mayor a menor polaridad, y el tiempo en que se realiza la
obtencin de los compuestos esteroidales, influyen en la cantidad y pureza
obtenida de compuestos esteroidales. Por otro lado, el uso de disolventes
individuales, obtiene mezclas complejas, que requieren mtodos de purificacin
adicionales, aumentando el costo y la inversin de tiempo.
La prueba L-B demostr que el acetato de etilo, cloroformo y hexano son

disolventes que obtienen compuestos esteroidales, dado que resultaron
positivos en dicha prueba, sin embargo la tcnica en cromatografa en capa fina
mostr que el extracto obtenido en el tratamiento 1 en 24 horas con hexano, fue
el extracto ptimo para la separacin, permitiendo obtener fracciones con un
80% de pureza, esto porque fue el ltimo disolvente en la extraccin fraccionada
y por lo tanto el que arrastr la mezcla de compuestos menos compleja.
El tratamiento 2 demostr ser el ms eficiente, ya que obtuvo el mayor

porcentaje de compuestos esteroidales, sin embargo al ser evaluados por
cromatografa en capa fina los extractos crudos de este tratamiento ningn
compuesto pudo ser separado, lo cual indica que estos extractos posean una
mezcla compleja de compuestos.
El cloroformo como disolvente nico de extraccin fue el ms eficiente, dado que
present el mayor porcentaje de compuestos esteroidales.
Seis horas fue el tiempo de extraccin con mayor porcentaje de compuestos
esteroidales.
De los sistemas de disolventes utilizados, la fase mvil etil ter-ter de petrleo

(8:92) demostr ser la ms eficiente para la separacin de compuestos
esteroidales del extracto en hexano.
54
2011
De los extractos obtenidos de los tratamientos slo del extracto en hexano del
tratamiento 1 se separ una fraccin con compuestos esteroidales (3H),
mientras que del extracto en hexano de 21 das se separaron dos fracciones con
compuestos de inters (A y Z3), los cuales fueron los identificados por
Resonancia Magntica Nuclear. 3H se identific parcialmente, sin embargo este
present en su estructura el anillo esteroidal, mientras que Z3 se identific como
un esteroide.
El esteroide identificado en la subfraccin Z3 demuestra que la especie O.

aethiops presenta en su composicin qumica compuestos esteroideos, siendo
este el primer reporte para dicho organismo.
El proceso, tiempo de extraccin y disolvente utilizado son determinantes para la

obtencin de los compuestos esteroidales en cantidades suficientes, para su
purificacin y dilucidacin qumica.
55
2011
7. PERSPECTIVAS
Obtener mayor cantidad del compuesto 3H para que pueda ser dilucidado
completamente.
Realizar pruebas de citotoxicidad y actividad biolgica para los compuestos Z3 y
3H.
Continuar con el estudio de la composicin qumica del resto de los extractos
obtenidos de Ophiocoma aethiops.
Estudiar la composicin qumica de Ophiocoma aethiops en diferentes pocas
del ao empleando el mtodo establecido en este trabajo.
Efectuar estudios sobre la biosntesis de esteroides en ofiuroideos y el rol
biolgico que desempean.
Estudiar si existe relacin entre el contenido de esteroides y los contenidos
alimentarios, las relaciones ecolgicas y las variables ambientales.
56
2011
8. REFERENCIAS
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Licenciatura. Universidad del Mar. Oaxaca, Mxico.
69
2011
9. ANEXOS
ANEXO A. Espectro de masas de alta resolucin +(TOF) de la fraccin 3H
70
2011
ANEXO B. Espectro infrarrojo (IR) de la fraccin 3H
71
2011
ANEXO C. Espectro de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) para
13
C de la
fraccin 3H
72
2011
ANEXO D. Espectro 1H/13C HETCOR de la fraccin 3H
73
2011
ANEXO E. Espectro de dos dimensiones 1H/1H COSY de la fraccin 3H
74
2011
ANEXO F. Espectro de infrarrojo IR de la fraccin Z3
75
2011
ANEXO G. Espectro de Resonancia Magntica Nuclear (RMN)
13
C de la fraccin
Z3
76
2011
ANEXO H. Espectro APT de 13C de la fraccin Z3
77
2011
ANEXO I. Espectro HETCOR de 13C de la fraccin Z3
78
2011
ANEXO J. Espectro de dos dimensiones 1H/1H COSY de la fraccin Z3
79
2011
ANEXO K. Espectro infrarrojo IR de la fraccin A
80
2011
ANEXO L. Espectro de Resonancia Magntica Nuclear de 13C de la fraccin A
81
2011
ANEXO M. Espectro ATP de 13C de la fraccin A
82
2011
ANEXO N. Espectro HETCOR de 13C de la fraccin A
83
2011
ANEXO . Espectro de dos dimensiones 1H/1H COSY de la fraccin A
84

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UNIVERSIDAD DEL MAR

CAMPUS PUERTO NGEL, OAXACA

ESTUDIO PRELIMINAR DE LA COMPOSICIN

QUE PARA OBTENER EL TTULO DE

MARA ZULEMA JUREZ CORTS

Puerto ngel, Oaxaca Febrero del 2011

Puerto ngel, Oaxaca, Febrero del 2011

HIDROBIL. GABRIELA GONZLEZ MEDINA

Despus de haber analizado y evaluado la tesis

composicin esteroidal del ofiuroideo Ophiocoma aethiops (Ltken,1859) que

M. en C. Ma Nieves Trujillo Tapia

Dra. Angelina Flores Parra

Dra. Ma. del Socorro Garca Madrigal

Dr. J. Marco Vinicio Ramrez Mares

M. en C. Julia Patricia Daz Martnez

En la actualidad, se ha demostrado que el estudio de la composicin esteroidal de

y una extraccin por

disolvente individual respectivamente, utilizando los disolventes metanol, butanol,

El trabajo en equipo permite la realizacin de un objetivo o meta, por ello deseo

A mis amigas y amigo: Aurora Villa Esparragoza, Hermelinda Santiago Gutirrez,

A Ins Cruz Salinas y Bricio de Nova por abrirme la puerta de su hogar y

Al Dr. Rolando Cardea, Cristina Hernndez, Ma. Trinidad Domnguez, H. Hiram

A la Dra. Angelina Flores Parra, Profesora en el Departamento de Qumica del Centro

1 Ophiocoma aethiops (Ltken, 1859). ......................................................................... 4

ciclopentanoperhidrofenantreno. Grupo OH (color rosa) y cadena lateral de

Tubo eppendorf con la solucin verde-azul que forma el anillo en la

9 ANDEVA de una va de los tratamientos 1 y 2 realizados a los extractos

14 Porcentajes promedio de compuestos esteroidales presentes en los

colesterol y la fraccin 3H, separada del

extracto crudo en hexano de O. aethiops (obtenido del T1 en el t3). En el

21 Cromatofolio con muestras en cada carril de las fracciones obtenidas de la

Matriz del T2 para determinar el mejor disolvente y tiempo de extraccin

2 Sistemas de disolventes propuestos por diferentes autores para separar

Masa total (seca) obtenida por extracto crudo de O. aethiops .............................. 27

Resultados de la prueba Liebermann-Burchard en los extractos crudos de

Absorbencias de la solucin que forma el anillo en la reaccin L-B a

Clculos para obtener la concentracin de compuestos esteroidales en 2

Concentracin y porcentaje de compuestos esteroidales en extractos

Factor de retencin (Rf) calculado para cada uno de los compuestos

Datos del espectro de RMN 13C del compuesto 3H ............................................. 49

10 Datos del espectro de RMN 13C del compuesto Z3 .............................................. 51

1 Frmula para calcular el factor de retencin............................................................ 14

Mara Zulema Jurez Corts

1.1 Phylum Echinodermata

1.1.1 Clase Ophiuroidea

Mara Zulema Jurez Corts

1.1.1.1 Ophiocoma aethiops (Ltken, 1859)

Figura 1: Ophiocoma aethiops (Ltken, 1859). Foto: Jurez-Corts 2010 (Indita).

La especie se distribuye (Figura 2) desde Baja California hasta el Ecuador (Hickman,

aseguran proteccin y alimento, viviendo en las bursas de los adultos de la misma

Figura 2: Distribucin de Ophiocoma aethiops en Mxico.

1.2 Los lpidos: clasificacin y funcionalidad en los organismos vivos

Mara Zulema Jurez Corts

b) Lpidos complejos: De estructura similar a los lpidos simples, pero adems

1.2.1 Esteroides: clasificacin, estructura molecular y funciones que

Mara Zulema Jurez Corts

Los esteroles son el tipo de esteroide ms abundante, estructuralmente se consideran

Los esteroles, se encuentran presentes en la mayora de las clulas eucariticas como

algunos estudios muestran que, en una especie marina, se pueden encontrar ms de 70

1.2.2 Biosntesis de esteroles en organismos marinos

deshidrogenasas/reductasas (SDRs)) (Payne y Hales, 2004). Algunas enzimas pueden

1.2.3 Esteroides presentes en invertebrados marinos

Figura 4: Compuestos de invertebrados marinos que poseen en su estructura el ncleo esteroide.