Tecnica

Implementacin de la tcnica Yeast
Estrogen Screen para evaluar la

presencia de sustancias estrognicas
en agua
Patricia Cifuentes Prieto
Universidad Nacional de Colombia

Posgrado Interfacultades en Microbiologa
Bogot, Colombia
2013
Implementacin de la tcnica Yeast

Estrogen Screen para evaluar la
presencia de sustancias estrognicas
en agua
Patricia Cifuentes Prieto
Tesis o trabajo de grado presentada(o) como requisito parcial para optar al ttulo de:
Magister en Ciencias Microbiologa
Director (a):
MSc., Mnica Estupin Torres
Codirector (a):
Ph.D., Mara Consuelo Daz Bez
Lnea de Investigacin:
Ambiental rea Ecotoxicologa
Grupo de Investigacin:
RESA-Resiliencia y Saneamiento Universidad Nacional de Colombia
Calidad de Aguas - Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Posgrado Interfacultades Microbiologa
Bogot, Colombia
2013
Dedico
este
trabajo
mis
padres,
especialmente a mi madre por su apoyo

incondicional y desmedido. A mis hijos, Laura
Juanita y Juan Ricardo, gracias por sus
palabras de aliento y comprensin, y a mi
esposo Gerardo, gracias por su amor y
colaboracin. A todos ellos mil GRACIAS!!
Agradecimientos
Agradezco a Dios por haberme dado la oportunidad de realizar este posgrado, para
mejorar y crecer intelectualmente y como ser humano. A mi familia que de una u otra
forma me apoy con sus palabras de nimo o con su ayuda material.
Quiero dar un agradecimiento especial a la docente Mara Consuelo Daz Bez, quien
dedic su tiempo para brindarme sus conocimientos, as como su colaboracin y apoyo
en la elaboracin de este trabajo de investigacin. Tambin agradezco a las personas
que laboran en el laboratorio de ingeniera ambiental en donde se realizaron los anlisis
fsico-qumicos, principalmente a la docente Martha Cristina Bustos, quien me brind su
apoyo material e intelectual. A los seores Sal, Carlos Fernando y Carlos Martn, y
especialmente a la bacteriloga Johanna Torres ya que siempre mostraron disposicin y
apoyo.
Agradezco a las personas del laboratorio central de la Universidad Colegio Mayor de

Cundinamarca, los auxiliares Evaristo Peralta, Oscar Cubillos y Paola, y especialmente a
las docentes Judith Hurfano, Judith Camacho, Edith Hernndez y Ruth Snchez por su
disposicin y colaboracin. Agradezco a la docente Mnica Estupin, por su apoyo y
sus palabras de nimo.
Doy gracias a los docentes del posgrado Maestra en Microbiologa, pero especialmente
a la docente Martha Raquel Fontanilla, por compartir sus conocimientos y por sus
palabras de aliento y fuerza para superar las dificultades que se presentaban da a da.
Por ltimo agradezco a todos mis compaeros de la maestra, Lizeth, Melissa, Ana
Mara, a la monitora Vanesa Otero, y especialmente a Natalia Comba, quien me brind
su amistad de manera incondicional y fue un gran apoyo durante la carrera.
VIII
Implementacin de la tcnica Yeast Estrogen Screen para evaluar la presencia de sustancias estrognicas en agua
Doy gracias a Socorrito, secretaria del posgrado, por su paciencia y ayuda incondicional.
Agradezco a la Dra. Marcia Dezotti, quien realiz la donacin de la cepa para el
desarrollo de este trabajo y me dio su apoyo ante algunas inquietudes, as como la Dra.
Soledad Chamorro de la Universidad de Concepcin en Chile, y especialmente al Dr.
John Sumpter por el permiso para trabajar con dicha cepa y de esta forma contribuir en la
mejora del medio ambiente.
Resumen y Abstract
IX
Resumen
En este trabajo de investigacin se realiz la implementacin de la tcnica Yeast
Estrogen Screen (YES) para la deteccin de compuestos con actividad estrognica en
diferentes tipos de agua. Inicialmente, se determin la actividad estrognica para el 17 estradiol dentro de un intervalo de concentracin entre 0,128 ng/L y 16875 ng/L,
encontrando que la Concentracin Efectiva Mediana (EC 50) para este compuesto fue de
79,1 ng/L con una desviacin estndar de 11 ng/L. La prueba mostr una variabilidad
que oscil entre 14,17% y 33,96%, la cual aumenta significativamente cuando se trabaja
con bajas concentraciones (0,128 ng/L) 57,09%.
Aunque no se detect actividad estrognica en aguas tratadas, algunas de las muestras
de fuentes superficiales tomadas en los ros Bogot, Sumapaz, Magdalena y Tunjuelo,
especialmente en las zonas aledaas al relleno sanitario Doa Juana, las canteras, las
curtiembres y el frigorfico, mostraron actividades estrognicas que oscilaron entre 8
ng/L y 20 ng/L de equivalentes de estradiol (EEQ). Estos resultados permitieron concluir
que la
tcnica YES es una buena
herramienta para detectar la presencia de
compuestos con actividad estrognica, y por tanto utilizarse para la deteccin temprana
de estos compuestos.
Palabras clave: Disruptor endocrino, estrogenicidad, -galactosidasa, contaminantes
emergentes, contaminacin de aguas.
Resumen y Abstract
Abstract
This research was conducted to implement the Yeast Estrogen Screen (YES) technique
for the detection of compounds with estrogenic activity in different types of water.
Initially estrogenic activity was determined for the 17 -estradiol in a concentration range
between 0,128 ng/L and 16875 ng/L, finding that the Median Effective Concentration (EC
50) for this compound was 79,1 ng/L with a standard deviation of 11 ng / L.
The test showed a variability ranging between 14,17% and 33,96%, which increases
when working with low concentrations (0,128 ng/L) 57,09%.
Although no estrogenic activity was detected in treated waters, some of the samples
taken from surface sources in Bogot, Sumapaz, Magdalena and Tunjuelo rivers,
especially in areas near the Doa Juana landfill, quarries, tanneries and a
slaughterhouse, showed estrogenic activities ranging from 8 ng/L and 20 ng/L estradiol
equivalents (EEQ).
These results reveal that the YES technique is a good tool to detect the presence of
compounds with estrogenic activity, and therefore should be used for early detection of
these compounds.
Keywords: Endocrine disruptor, estrogenicity, -galactosidase, emergent contaminants,
water contaminants.
XII
Contenido
Resumen .........................................................................................................................IX
Contenido.......................................................................................................................XII
Lista de figuras ............................................................................................................ XIV
Lista de tablas.............................................................................................................. XVI
Lista de abreviaturas .................................................................................................. XVII
Introduccin ..................................................................................................................... 1
1. Marco referencial ...................................................................................................... 4
1.1
Disruptores endocrinos ................................................................................... 5
1.1.1 Estrgenos....................................................................................................... 6
1.1.2 Compuestos qumicos con actividad estrognica ........................................... 14
1.2
Sustancias con actividad estrognica en el medio ambiente ..................... 17
1.3
Deteccin de sustancias con actividad estrognica en agua ..................... 20
2. Objetivos ................................................................................................................. 26
2.1
Objetivo general ............................................................................................. 26
2.2
Objetivos especficos ..................................................................................... 26
3. Materiales y mtodos ............................................................................................. 27
3.1
Montaje e implementacin de la tcnica ....................................................... 27
3.1.1 Reconstitucin de la cepa de Saccharomyces cerevisiae .............................. 27
3.1.2 Evaluacin del crecimiento de la cepa ........................................................... 28
3.1.3 Implementacin de la prueba YES ................................................................. 29
3.2
Localizacin de los sitios de recoleccin de las muestras de agua
analizadas ..................................................................................................................... 33
3.2.1 Preparacin de las muestras.......................................................................... 35
3.3
Anlisis fsico qumicos y microbiolgicos .................................................. 36
4. Resultados y discusin.......................................................................................... 37
4.1
Caractersticas morfolgicas y de crecimiento de la cepa Saccharomyces
cerevisiae ...................................................................................................................... 37
4.2
Implementacin de la tcnica ........................................................................ 38
4.3
Tcnica YES .................................................................................................... 40
4.4
Curva concentracin-respuesta .................................................................... 41
Contenido
4.5
XIII
Determinacin de actividad estrognica de muestras ambientales ........... 42
5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 50

5.1
Conclusiones.................................................................................................. 50
5.2
Recomendaciones.......................................................................................... 50
Bibliografa .................................................................................................................... 61
Anexo A : Formulacin del medio mnimo segn Roughtledge y Sumpter (1996)
Anexo B : Requerimiento de componentes adicionales para preparar medio de
crecimiento segn Roughtledge y Sumpter (1996)
Anexo C : Tabla de densidades pticas corregidas de los 28 ensayos
Anexo D : Tabla de densidades pticas corregidas de los 20 ltimos ensayos para
la carta control
Anexo E : Tabla de densidades pticas corregidas de las muestras de agua
analizadas
XIV
Lista de figuras
Pg.
Figura 1-1: Agrupacin de hormonas esteroideas ........................................................... 7
Figura 1-2: Anillo fenlico A en diferentes estructuras qumicas estrognicas ................. 8
Figura 1-3 Sntesis de estrgenos naturales. Tomado de
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Steroidogenesis.svg ........................................................ 9
Figura 1-4:
Estructura del receptor estrognico . Tomado de
http://vitae.ucv.ve/pdfs/VITAE_3012.PDF ....................................................................... 12
Figura 1-5: Efectos genmicos del receptor de estrgeno. Tomado de
Figura 1-6: Mecanismo para efecto No Genmico. Tomado de:
Figura 1-7: Mecanismo de accin del Saccharomyces cerevisiae recombinante en la
tcnica Yeast Estrogen Screen. Tomado de:
http://www.engineering.auckland.ac.nz/uoa/water-pollution-assessment ........................ 24
Figura 3-1: Evaluacin del crecimiento de la cepa ......................................................... 29
Figura 3-2: Montaje de placa de ensayo ........................................................................ 31
Figura 3-3: Preparacin de medio para la prueba YES .................................................. 31
Figura 3-4: Procedimiento para el montaje de la prueba YES........................................ 32
Figura 3-5: Localizacin de fuentes hdricas analizadas ................................................ 34
Figura 3-6: Procedimiento para extraccin de muestras en fase slida ......................... 36
Figura 4-1: Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae recombinante a 28C,
30C y 32C en medio de crecimiento elaborado segn protocolo. ................................ 38
Contenido
XV
Figura 4-2: Efecto de la contaminacin con agua de condensacin sobre los resultados
de la prueba con 17 -estradiol. ..................................................................................... 39
Figura 4-3 Resultados de los ensayos de la prueba YES realizados con los diferentes
tipos de agua. a) agua grado HPLC de la Universidad Nacional de Colombia, b) agua
grado HPLC Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, c) agua estril para
inyectables y d) agua destilada desionizada. .................................................................. 39
Figura 4-4: Resultados de los ensayos de la prueba YES con a) metanol, b) etanol
absoluto, c) dimetilsulfxido y d) propanol como solventes del 17 -estradiol y e)
controles de solventes. ................................................................................................... 40
Figura 4-5: Carta control de tcnica Yeast Estrogen Screen con 17 estradiol ............. 41
Figura 4-6: Densidad ptica relativa vs. Concentracin de 17 -estradiol...................... 42
Figura 4-7: Variabilidad de los resultados de la pruebas fsico-qumicas, microbiolgicas
y de actividad estrognica en el ro Tunjuelo en el tramo comprendido entre el relleno
Doa Juana y el sector de Bosa. .................................................................................... 49
XVI
Lista de tablas
Pg.
Tabla 1-1: Efectos ambientales relacionados con la presencia de estrgenos en las

aguas residuales (Tomado y traducido de Teske y Arnold, 2008) ................................... 19
Tabla 4-1: Porcentaje de recuperacin de acuerdo a solventes utilizados en el
procedimiento de extraccin en fase slida .................................................................... 43
Tabla 4-2: Resultados de actividad estrognica obtenidos con las diferentes muestras de
aguas ............................................................................................................................. 44
Tabla 4-3: Resultados de las pruebas fsico-qumicas y microbiolgicas de las muestras
ambientales....48
Contenido
XVII
Lista de abreviaturas
Abreviatura
Trmino
E1
Estrona
E2
Estradiol
E3
Estriol
EE2
Etinilestradiol
EC50
Concentracin mediana efectiva
EEQ
Equivalentes de estradiol
EDC
Compuestos de disrupcin endocrina
ELISA
Enzyme Linked InmunoSorbent Assay
ELRA
Enzyme Linked Receptor Assay
RIANA
River Analyser
YES
Yeast Estrogen Screen
ERE
Elementos de Respuesta Estrognica
US EPA
Environment Protection Agency United States
PCBs
Bifenilos policlorados
RE
Receptor estrognico
LBD
Dominio de union a ligando
cGMP
Guanidin monofosfato cclico
cAMP
Adenin Monofosfato cclico
DDT
Diclorodifeniltricloro etano
XVIII
WHO
World Health Organization
TCDD
Tetraclorodibenzoparadioxina
PVC
Cloruro de polivinilo
FDHE
Ftalato de di2 etilo-hexilo
VTG
Vitelogenina
APEOs
Alquilfenoles polietoxilados
PDBE
Pilibromodifenilos teres
NP
Nonilfenol
COPs
Compuestos orgnicos persistentes
HPLC-FLD
GC/MS
GC-MS/MS
High Performance Ligand Chromatography with

post column Fluorescence derivatizction
Gas Chromatograph/Mass Spectrometer
Gas Chromatograph/Mass Spectrometer/Tandem
Mass Spectrometry
LC-MS
Liquid Chromatography- Mass Spectrometry
MCF-7
Michigan Cancer Foundation-7
CPRG
Cloro Fenol Rojo Beta D-Galactopiransido
ONPG
O-nitrofenil Beta D-Galactopiransido
OMPdecasa Orotidina 5fosfato decarboxilasa

MEM
Minimum Essential Medium
RPMI
Roswell Park Memorial Institute Medium
DBO
Demanda Bioqumica de Oxgeno
DQO
Demanda Qumica de Oxgeno
Introduccin
Aunque la contaminacin qumica del agua, aire, suelo y alimentos no es un problema
nuevo, desde hace algunos aos se ha sealado la presencia de ciertos compuestos
qumicos o contaminantes no regulados de origen antropognico o natural, que se han
dispersado en el ambiente y estn emergiendo en aguas superficiales y subterrneas, e
incluso agua potable, y que pueden constituir un riesgo para la salud de los organismos
vivos. Estos compuestos denominados como contaminantes emergentes se presentan
en bajas concentraciones (partes por billn o partes por trilln), por lo cual muchos de
ellos no estn regulados o reglamentados en la mayora de los pases (Kuster et al.,
2008).
Dentro de este variado grupo de compuestos, se encuentra un grupo denominado

disruptores endocrinos o (Endocrine Disrupting Compounds) EDCs, en el cual se
incluyen plaguicidas, productos qumicos industriales, farmacuticos, cosmticos y
fitoqumicos que pueden interactuar con el sistema endocrino de los organismos
induciendo alteraciones o cambios en el funcionamiento de este sistema. Estos
compuestos son capaces de imitar la accin de las hormonas endgenas, antagonizar
su accin, alterar su patrn de sntesis y metabolismo y/o modular los niveles de los
receptores correspondientes (Fernndez et al., 1998; Sonnenschein y Soto, 1998)
Los EDCs estn constituidos por una amplia variedad de compuestos, cuya complejidad
y heterogeneidad ha dificultado no solo implementar las tcnicas para su determinacin
analtica, sino estudiar su comportamiento en el ambiente, (Fernndez et al., 1997;
Sonnenschein y Soto, 1998). Por esta razn, en muchos pases la valoracin de este
problema y el impacto que estos compuestos puedan generar, no ha sido dimensionado
apropiadamente, a pesar de las publicaciones realizadas a nivel mundial.
Introduccin
En el caso de Colombia, aunque se cuenta con una normatividad ambiental, y existen

entidades gubernamentales encargadas de la proteccin de la salud de los ecosistemas
y la poblacin, el anlisis de las acciones desarrolladas muestra que todas estas
actividades no han sido suficientes, y es por ello que en la actualidad existe un alto
nmero de fuentes hdricas que presentan altos niveles de contaminacin orgnica,
microbiana y qumica (CONPES 3550, 2008).
Un elemento bsico para el manejo y control de la calidad del agua, es contar no solo
con la legislacin pertinente, sino con la infraestructura y personal calificado necesario
para desarrollar los procedimientos analticos necesarios para valorar la presencia de
contaminantes.
Sin
embargo,
en
el
caso
de
los
contaminantes
emergentes
especficamente con los EDCs, la situacin es crtica, dada la amplia variedad de

compuestos as como los requerimientos en trminos de equipos necesarios para su
determinacin. Aunque en Colombia, existen un gran nmero de laboratorios con la
infraestructura y personal necesario para llevar a cabo la determinacin de algunos de
estos compuestos, en la legislacin no se contempla su determinacin, razn por la cual
no se conoce si existe o no este problema.
Dada la complejidad y diversidad del problema, a nivel internacional se han adoptado dos
enfoques para la deteccin y cuantificacin de los EDCs. El primero se orienta a la
determinacin de la presencia y concentracin del compuesto estrognico, mediante
cromatografa ya sea de gases o lquida acoplada a espectrometra de masas, mientras
en el segundo, se busca establecer la actividad estrognica generada por estos
compuestos. Con base en estos dos enfoques, los mtodos utilizados se han agrupado
en tres categoras: mtodos cromatogrficos, mtodos no celulares y mtodos biolgicos.
Todos ellos presentan una serie de ventajas y desventajas ya sea por su especificidad,
sensibilidad, preparacin de las muestras, tiempo requerido, y costos.
Dentro de los ensayos no celulares, el mtodo ms conocido es el de ELISA (Enzyme

Linked Inmuno Sorbent Assay) en el cual, se produce la unin especfica de un
anticuerpo (protena) a un compuesto estrognico, y la respectiva produccin de
fluorescencia por la unin de las enzimas a los anticuerpos residuales libres. El ELRA
(Enzyme Linked Receptor Assay), es similar al ensayo de ELISA con la diferencia que
utiliza un receptor fisiolgicamente relevante en lugar de un anticuerpo. El Analizador de
Introduccin
Ros (River Analyser RIANA) es un inmuno-sensor ptico para mltiples analitos que
utiliza la fluorescencia total para detectar los niveles de compuestos orgnicos
especficos.
Los mtodos biolgicos son utilizados para detectar y monitorear la actividad estrognica
de los EDCs, y ofrecer un enfoque alternativo para la evaluacin de los impactos
potenciales que ellos puedan generar. La deteccin de la actividad estrognica en los
ensayos in vitro, se puede llevar a cabo mediante un gran nmero de mecanismos
como la proliferacin celular, la induccin de la produccin de vitelogenina, o la induccin
de genes reporteros en organismos recombinantes. Los ensayos ms conocidos son: el
E-Screen (proliferacin de clulas), y los ensayos ERE (Estrogen Receptor Elements) y
YES (Yeast Estrogen Screen) en los cuales se inducen genes especficos de organismos
recombinantes (Singhal et al., 2009).
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, as como el grado de contaminacin

de las fuentes de agua superficiales, y los patrones de uso de compuestos qumicos en el
pas, se consider que exista una alta probabilidad de encontrar sustancias con actividad
estrognica en estas fuentes. Por esta razn, y dado que en la mayora de los
laboratorios de aguas del pas no se cuenta con mtodos para la deteccin de EDCs, se
plante la necesidad de iniciar los estudios para la valoracin de este problema.
Aunque en condiciones ptimas, el mejor acercamiento al estudio de la contaminacin

con EDCs es combinar mtodos cromatogrficos y biolgicos, se plante como una
etapa inicial valorar el problema mediante la utilizacin de estos ltimos. Por esta razn,
el presente trabajo se orient al montaje, e implementacin del mtodo Yeast Estrogen
Screen, utilizando una levadura recombinante, y su posterior aplicacin a muestras de
aguas tratadas y superficiales. Este trabajo presenta las actividades desarrolladas para
la validacin de la prueba, as como la aplicacin de sta, a muestras
de agua
colectadas en los ros Bogot, Magdalena, Sumapaz, y Tunjuelo. Igualmente, a muestras

utilizadas para abastecimiento humano en Bogot, Funza y Agua de Dios.
1. Marco referencial
Desde hace algunos aos se ha venido reportando la presencia en el ambiente de
sustancias qumicas sintetizadas por el hombre (xenobiticos) o de origen natural
capaces de alterar el equilibrio hormonal y la regulacin del desarrollo embrionario
provocando efectos adversos sobre la salud de los organismos o de su progenie
(Krimsky, 2000; Parrot et al., 2001). Estas sustancias se han denominado disruptores
endocrinos (Endocrine Disruptor Chemical, EDCs), trmino acuado por un grupo
multidisciplinario de expertos, quienes reunidos en Wingspread, Racine, Wisconsin entre
Julio 26 y 28 de 1991, hicieron una declaracin pblica en la cual plantearon la hiptesis
que los efectos adversos observados en diferentes estudios, eran el resultado de
alteraciones del desarrollo embrionario y fetal por la exposicin a contaminantes
qumicos que denominaron disruptores endocrinos (Bern et al., 1992). Igualmente, en
este manifiesto se presentaba la preocupacin de estos investigadores por las
implicaciones que estos hallazgos significaban tanto para la salud pblica como para el
medio ambiente.
El trmino disruptor endocrino define un conjunto diverso y heterogneo de compuestos

qumicos, capaces de alterar la sntesis, liberacin, transporte, metabolismo, enlace,
accin o eliminacin de las hormonas naturales de los organismos. Los diferentes
estudios no solo han mostrado efectos sobre la fisiologa y comportamiento del hombre,
sino sobre diferentes animales. Los efectos sobre la salud humana por exposicin a
disruptores endocrinos, se relacionan principalmente con daos del sistema reproductor
masculino y femenino, induccin de tumores hormono-dependientes en rganos,
alteraciones en el desarrollo del sistema neurolgico, enfermedades metablicas, y
trastornos del sistema neuro-inmunolgico (Singhal et al., 2009; Gallardo 2005). En el
caso de los animales, se han reportado efectos sobre invertebrados, peces, anfibios,
Captulo 1
reptiles, aves y mamferos (Guillette et al., 1995; Aravindakshan, et al., 2004; Echeverry,
2010).
Se ha reportado que la exposicin de personas y animales a EDCs se realiza
principalmente a travs del consumo de agua o alimentos contaminados con estos
compuestos. Estudios realizados en pases europeos han mostrado la presencia de estos
compuestos en aguas superficiales prximas a plantas de tratamiento de aguas
residuales, as como su efecto en poblaciones de peces (Barcel, 2002). Igualmente, en
China, se han reportado valores significativos de equivalentes de estradiol tanto en
afluentes (15,7 2 ng/L) como en efluentes (10,4 0,4 ng/L) de plantas de tratamiento de
aguas residuales, lo cual seala no solo la baja remocin de estos sistemas, sino la
presencia de estos contaminantes en desechos domiciliarios, residuos industriales o
agroindustriales (Sun, 2008; Singhal et al., 2009) En el sector agropecuario, algunos
animales son tratados con hormonas para optimizar el crecimiento y la fertilidad, como
consecuencia de ello, lo que no es tomado por el organismo se elimina en las excretas
que puede llegar a los ros o fuentes de agua ms prximas. Igualmente, las entidades
del rea de la salud desechan grandes cantidades de medicamentos en botaderos o
rellenos sanitarios, pero en muchos casos se generan lixiviados que ocasionan
contaminacin para aguas subterrneas o superficiales (Daughton, 2006).
1.1 Disruptores endocrinos

De acuerdo con la Comisin de la Comunidad Europea, y la Agencia para la Proteccin
Ambiental de los Estados Unidos (USEPA), un disruptor o perturbador endocrino es una
sustancia o mezcla de sustancias exgenas capaces de alterar una o ms funciones del
sistema endocrino y, como consecuencia, causar efectos adversos en la salud de un
organismo intacto, su progenie o subpoblaciones (Damstra et al., 2002; CEC, 2007; US
EPA, 1997).
Los EDCs se pueden dividir en dos grupos: los estrgenos, y los qumicos que simulan la
accin de stos. En el primer grupo se incluyen sustancias de origen natural como la
estrona, el estradiol y el estriol y, en el segundo, compuestos como dietilestilbestrol
(DES) utilizado para evitar el aborto, y el etinilestradiol (EE2) usado como anticonceptivo
y medicamento en terapia de reemplazo hormonal. Dentro del grupo de los qumicos que
han demostrado tener actividad estrognica estn: plaguicidas organoclorados,
Marco referencial
fungicidas (mancozeb y zineb), bifenilos policlorados (PCB`s), detergentes no inicos,

ftalatos, bisfenol A, policarbonatos y resinas epxicas. Muchos de estos productos se
encuentran en plsticos, biberones, chupos, envases de alimentos y cosmticos (Olea et
al., 2001; Brotons et al., 1995; Brede et al., 2003; Sonnenschein y Soto, 1998; Olea et al.,
1996; Schlumpf et al., 2004; Hoppin et al., 2002).
1.1.1 Estrgenos
Las hormonas son mensajeros qumicos producidos por el cuerpo para transferir
informacin de un grupo de clulas a otras y coordinar las funciones de diferentes partes
del cuerpo. Son producidas en las glndulas endocrinas, secretadas al torrente
sanguneo y transportadas hasta los receptores donde se traducen en respuestas. Las
hormonas se agrupan en tres clases: aminas, pptidos y esteroides, aunque la mayora
son pptidos. Las hormonas esteroidales son lpidos derivados del colesterol, y son
secretadas por las gnadas, la corteza adrenal y la placenta. Estas hormonas, controlan
la determinacin, diferenciacin y desarrollo sexual, y pueden dividirse en estrgenos o
andrgenos. En mamferos, los principales estrgenos son la estrona, el estriol, y el 17- estradiol, mientras los principales andrgenos son la testosterona y el 5- -dihidrotestosterona (Singhal et al., 2009). La utilizacin clnica de estas hormonas naturales y
sus derivados, se ha orientado principalmente, hacia la terapia de sustitucin en varias
insuficiencias endocrinas de la etapa frtil de la mujer o en la menopausia. Tambin se
usan en tratamientos de enfermedades como el cncer de seno metasttico,
postmenopusico, cncer de prstata, endometriosis, cncer de endometrio, supresin
de lactancia y terapia anticonceptiva
Las hormonas esteroideas son derivados del colesterol, formadas por el ciclo-pentanoperhidro-fenantreno, compuesto por tres anillos de 6 carbonos (Ilamados A, B y C) y uno
de 5 carbonos (D). Este compuesto presenta dos metilaciones en las posiciones carbono
10 (metilo C19) y carbono13 (metilo C18) y una cadena lateral en el carbono 17. Las
hormonas esteroideas se agrupan en 3 familias de acuerdo al nmero de metilos y si
llevan o no cadena lateral (Figura 1-1).
Captulo 1
Figura 1-1: Agrupacin de hormonas esteroideas

Figura 1-1: Agrupacin de hormonas esteroideas
COLESTEROL (C27)
Pregnenolona (C21)
Progestgenos (C21)
Glucocorticoides (C21)
Mineralocorticoides (C21)
Andrgenos (C19)
Estrgenos (C18)
La estructura bsica de los estrgenos es de 18 tomos de carbono (Malgor, y Valsecia
2000), el anillo A es de tipo fenlico, por donde se une especficamente a los receptores
estrognicos. En la figura 1-2 se presentan algunas estructuras esteroidales (estrgenos
naturales y sintticos) con el anillo A de unin a los receptores estrognicos.
El estrgeno natural ms potente es el 17 -estradiol (E2), que es el principal producto
del ovario. El estradiol tiene tres dobles enlaces en el anillo A, un OH en el carbono tres
y otro OH en el carbono diecisiete, en posicin . Es sintetizado por las clulas
granulocticas del ovario a partir de precursores como el colesterol.
Marco referencial
Figura 1-2: Anillo fenlico A en diferentes estructuras qumicas estrognicas
Estradiol
Dietilestilbestrol
Estriol
Etinilestradiol
Los estrgenos estimulan el crecimiento y diferenciacin de las clulas del tejido

mamario, tero, vagina, ovario, testculo, epiddimo y prstata. Adems de tener este
efecto sobre tejido reproductor, tambin tienen efecto sobre tejidos del sistema
cardiovascular, seo y nervioso. Razn por la cual, debido a los niveles de estrgenos
de las mujeres premenopusicas, ellas tienen menor riesgo de enfermedad
cardiovascular, los inicios de la enfermedad renal es ms tardo, ayuda a mantener la
densidad sea, y el desarrollo y funcionamiento del sistema nervioso.
En el hgado, se realiza una interconversin del estradiol-estrona-estriol, y los tres
estrgenos se excretan por orina conjugados con cido glucurnico y sulfato (Malgor, y
Valsecia, 2000). El 17 estradiol dirige, junto con los otros estrgenos, el desarrollo del
genotipo femenino durante el desarrollo embrionario y la pubertad. Los niveles del
estradiol pueden alcanzar valores hasta de 130 ng/L durante la ovulacin (Lippert et al.,
1999).
El estradiol circulante es rpidamente oxidado en el hgado, a un grupo cetnico en el
carbono diecisiete convirtindose en estrona (E1). Esta reaccin es reversible. La estrona
es el componente estrognico primario de varios suplementos farmacuticos, incluyendo
estrgenos conjugados y esterificados. La estrona se degrada a estradiol formando
Captulo 1
previamente un intermediario, el 16--hidroxi-estrona que posee alta estrogenicidad

(Lippert et al., 1999). El estriol (E3) es una forma hidratada del estradiol, posee un grupo
OH adicional en el carbono diecisis, es el principal estrgeno producido por la unidad
feto-placentaria durante el embarazo y es usado como indicador del bienestar fetal. Es el
estrgeno ms abundante en la orina (Lippert et al.,1999; DAscenzo et al., 2003)
Figura
1-3
Sntesis
de
estrgenos
naturales.
Tomado
de
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Steroidogenesis.svg
La mayora de las presentaciones farmacuticas a partir de estrgenos naturales

corresponden a sales obtenidas por esterificacin del OH fenlico en el carbono tres, lo
cual favorece la accin endocrina. Dentro de los derivados esteroidales, semisintticos o
sintticos que tienen actividad estrognica los ms importantes son:
-
Etinilestradiol: tiene gran potencia estrognica (20 g es la dosis de tratamiento

para sustitucin durante la menopausia), posee un grupo etlico en el carbono
diecisiete que impide su inactivacin en el hgado (Malgor y Valsecia, 2000). El
etinilestradiol es tres veces menos soluble que los estrgenos naturales (Desbrow
Marco referencial
10
et al., 1998), lo cual aumenta la resistencia a la degradacin y la persistencia en

el medio ambiente.
-
Mestranol: es el ster metlico del etinilestradiol. Tiene un grupo metilo en el

carbono tres y es de menor potencia.
Quinestrol: es un ster ciclopentlico del etinilestradiol y se caracteriza por su gran

potencia estrognica.
Otros
derivados
de
accin
ms
prolongada
son
el
Cipionato
Ciclopentilpropianato (Estradep ), valerato (Progynon Depot ) y el benzoato

(Progynon B ).
-
Otro derivado sinttico de accin estrognica no esteroidal son dinestrol,

hexestrol y el clorotrianiseno, derivados del estilbeno. Su estructura tridimensional
tiene cierta similitud con los esteroides, por lo que son capaces de activar los
receptores estrognicos.
Receptores estrognicos
La especificidad de la accin estrognica depende de la presencia de receptores

intracelulares. Los estrgenos modulan la concentracin de los receptores. Por ejemplo,
el estradiol durante la fase folicular, induce la sntesis y el desarrollo de receptores
aumentando su concentracin. Este efecto ha podido comprobarse, cuando se
administran estrgenos, se observa un cambio en el nmero de receptores a las pocas
horas de la administracin y se alcanza un mximo en un periodo de 3 a 4 das (Malgor y
Valsecia, 2000). Se ha determinado la presencia del receptor de estrgenos en clulas
del tero, vagina, glndulas mamarias, trompas, hipotlamo, hipfisis, suprarrenales,
testculos, rin y otros rganos y sistemas.
El Receptor de Estrgeno (RE) es una protena perteneciente a la superfamilia de
receptores nucleares, en la cual se incluyen otros receptores de hormonas esteriodeas
como el receptor de la Vitamina D, retinoides, hormona tiroidea y algunos receptores
hurfanos. El receptor de estrgeno fue identificado en 1962 por el grupo de Jensen,
quienes describieron la presencia de sitios de unin del estrgeno en diferentes tejidos
de ratas (Jensen & Jacobson, 1962). Hasta hace poco se pensaba que todos los efectos
debidos a estrgenos eran mediados por un solo RE sin embargo, en 1996 fue
descubierto un nuevo receptor que tena gran homologa con el receptor conocido, razn
por la cual se los denomin RE-
al conocido previamente, y RE-
al nuevo. Este
Captulo 1
11
descubrimiento mostr que la fisiologa de estrgenos era altamente compleja, sin contar
que existen receptores localizados en la membrana, y que median tambin funciones de
estas hormonas (Kuipper & Gustaffson, 1997). Los
receptores alfa y beta poseen
diferentes funciones dependiendo del tejido donde ejercen su accin. Funcionalmente el

RE- est organizado en seis dominios denominados por letras de la A a la G (Figura
1-4). La regin A/B se localiza del lado amino terminal de la protena, y es la regin
menos conservada entre los receptores nucleares. Este dominio tiene la funcin de
activacin de la transcripcin gentica (Activation Function 1 o AF-1) y varios sitios de
fosforilacin que son importantes en el proceso de activacin de la protena,
especialmente cuando el receptor es activado en ausencia de hormona. Adyacente a
esta regin, se encuentra la regin de unin al ADN o dominio C. Es la ms conservada y
est compuesta por nueve residuos de cistena que estn presentes en todos los
receptores esteroidales. De ellos, ocho estn coordinados alrededor de dos iones de Zn+2
para formar dos dedos de zinc que le confieren al receptor la capacidad de unirse
especficamente al ADN. La unin a una secuencia especfica en el ADN est
determinada por la composicin de aminocidos entre estos dos dedos de zinc, y se
conoce como la caja P (P-box). Entre la regin de unin al ADN y el dominio E/F se
encuentra la regin D o regin de bisagra, que participa en la unin a la protena
chaperona de choque trmico hsp 90 (heat shock protein 90), la cual permanece unida al
receptor cuando se encuentra inactivo. En el extremo carboxlico terminal se encuentra la
regin F/G o dominio de unin al ligando (LBD), donde se une la hormona (E2). Esta
regin es altamente especfica para la hormona, es decir, se une al estrgeno con alta
afinidad pero no a otras hormonas esteroidales. Este dominio tambin est encargado de
la activacin de la transcripcin (Activation Function 2, AF-2), dimerizacin, interaccin
con otras protenas coactivadoras o correpresoras de la transcripcin, fosforilacin y
localizacin nuclear (Teppa & Tern, 2005)
Marco referencial
12
Figura 1-4:
Estructura
del
receptor
estrognico
Tomado
de
http://vitae.ucv.ve/pdfs/VITAE_3012.PDF
Efectos genmicos del receptor estrognico
El receptor es activado al unirse al ligando, y acta como un factor transcripcional al

unirse al ADN estimulando la transcripcin de algunos genes. Inicialmente ocurre una
homodimerizacin (-RE/-RE) o heterodimerizacin (-RE/-RE) del complejo hormonareceptor y se da el reconocimiento del elemento de respuesta estrognio (ERE). Despus
de esto se produce la transcripcin al formarse el complejo de iniciacin que incluye
coactivadores, correpresores y protenas reguladoras de la transcripcin (Figura 1-5 )
Figura
1-5:
Efectos
genmicos
del
receptor
de
estrgeno.
Tomado
de
Captulo 1
13
Efectos no genmicos del receptor estrognico
Son procesos rpidos que ocurren en minutos o segundos y no requieren procesos de

transcripcin y sntesis de protenas para producir un efecto (flujo de iones,
desencadenamiento de potenciales de reaccin, descarga de vesculas secretoras o
activacin de protenas quinasas asociadas a la membrana (Figura 1-6)
Figura
1-6:
Mecanismo
para
efecto
No
Genmico.
Tomado
de:
En el tero, por ejemplo, el estrgeno activa una o ms cascadas de seales que facilitan
la absorcin de compuestos mediada por hormonas y posibilita la unin de la hormona a
la membrana mediante la formacin de vesculas endocticas hasta el ncleo para ejercer
su funcin nuclear (Pietras &Szego, 1984)
En clulas del pncreas el estrgeno puede estimular el incremento del calcio
intracelular inducido por glucosa y los niveles de GMP cclico (cGMP) y por la asociacin
del receptor estrognico con la guanilato ciclasa de la membrana celular (Stefano et al.,
1999).
En clulas endoteliales produce el estmulo de cGMP y oxido ntrico y activa quinasas
celulares. El aumento de cAMP se ha descrito en clulas de cncer de seno, tero y
msculo liso (Aronica et al., 1994)
En el sistema cardiovascular los mecanismos de proteccin son mediados por los dos
receptores, alfa y beta, (Mendelsohn & Karas, 1999; Levin, 1999), dado que el estrgeno
inhibe los canales de calcio en el msculo liso vascular reduciendo la accin de ciertos
Marco referencial
14
vasoconstrictores y favoreciendo la de los vasodilatadores, lo cual mejora la perfusin del

corazn (Nakajima et al.,1995).
Con respecto al sistema seo, la disminucin de estrgeno est asociada a una prdida
significativa de hueso. Se han encontrado sitios de unin en los osteoclastos y
osteoblastos mediante el aumento
del calcio
intracelular, inositol trifosfato y
diacilglicerol, cAMP, cGMP, as como la activacin de la quinasa de las protenas

activadoras de mitogensis (Nemere & Farach-Carson, 1998; Endoh et al., 1997)
En el sistema nervioso central de ratas cuando se presenta isquemia cerebral, el
estrgeno es capaz de preservar las neuronas y el endotelio neurovascular, limitando la
extensin de la lesin y disminuyendo la mortalidad. Aqu los receptores de membrana
son capaces de activar cascadas de seales que producen efectos que terminan,
algunas veces, en la activacin de procesos genmicos y la induccin o inhibicin de la
expresin de genes (Simpkins et al., 1997)
1.1.2 Compuestos qumicos con actividad estrognica

Existe una gran variedad de compuestos que estn relacionados a la disrupcin
endocrina. Algunos grupos de estos se tratan a continuacin.
Plaguicidas organoclorados.
Son compuestos persistentes, tienen efectos a largo plazo y se bioacumulan, razn por la
cual se han dispersado y han logrado contaminar amplias zonas del planeta. Son
compuestos difciles de eliminar por el cuerpo y se almacenan en el tejido graso. Su
efecto es ms marcado en etapas tempranas del desarrollo como la etapa embrin-feto o
la infancia. Suelen acumularse en los alimentos con alto contenido graso como lo seala
Pandit y colaboradores (2002), quienes encontraron una mayor cantidad de
diclorodifeniltricloroetano (DDT) en derivados lcteos como la mantequilla, el queso y la
leche en polvo, aunque tambin se han hallado en el pescado y la carne (Shinas et al.,
2000)
En estudios desarrollados en Suecia (Wiklund et al., 1986) se mostr que el riesgo de
contraer cncer de testculo, era ms alto en trabajadores agrcolas expuestos a
pesticidas. Igualmente Safi en el 2002 pudo establecer una relacin entre la presencia de
cncer de tero, seno, tiroides, colon, prstata y cerebro, con personas expuestas a
Captulo 1
15
estos compuestos. Por otro lado los nios que estuvieron expuestos durante el embarazo
a compuestos como el DDT, hexaclorociclohexano, aldrn, dieldrn, endrn, endosulfn y
sus derivados y hexaclorobenceno presentaban una alta incidencia de hipospadia y
criptorquidia.
Tensoactivos no inicos.
Estos compuestos se caracterizan por presentar un grupo alquilo hidrfobo unido a un
grupo altamente polar. Otros, estn compuestos por una larga cadena de polioxietileno y
una cadena de hidrocarburo. Dentro de los primeros y de amplia utilizacin estn los
alquil-fenoles-etoxilados, que se emplean en detergentes domsticos e industriales,
especialmente en procesos textiles, fabricacin de papel, tratamiento del caucho y
fabricacin de pinturas de emulsin. Los tensoactivos alquil-fenol-etoxilatos como el octil,
nonil y dodecilfenoletoxilato son usados en aplicaciones industriales, pinturas, herbicidas
e insecticidas. Los plaguicidas, detergentes y productos de aseo personal pueden dar
origen a nonilfenoles. Por otro lado aunque los poli-etoxilatos no son estrognicos, las
bacterias que estn en el entorno los degradan a nonilfenol y otras sustancias que imitan
a los estrgenos. En 1996, dos grupos de investigadores, uno de la Universidad de
Brunnel y otro del Medical College of Wisconsin encontraron productos en los
surfactantes que causaban efectos estrognicos en la trucha arco iris (American
Chemical Society 2010)
Bifenilos policlorados (PCB`s).
Son compuestos formados por cloro, carbono e hidrgeno. El nmero y posicin de los
tomos del cloro determina las propiedades biolgicas y su comportamiento en el
ambiente. Son muy estables, tienen baja volatilidad a temperaturas ambiente, son
insolubles en agua, y solubles en grasas. Por las caractersticas anteriores son
considerados como contaminantes orgnicos persistentes. Los PCBs se usan como
refrigerantes y lquidos selladores. Los que tienen un menor nmero de tomos de cloro
se degradan con mayor facilidad, especialmente cuando son expuestos a la luz. Sin
embargo, debido a que ellos se acumulan en los sedimentos, o en el suelo su
degradacin es muy lenta. La exposicin en humanos se realiza principalmente por
contacto, inhalacin y/o ingestin de alimentos contaminados con estos compuestos. De
acuerdo a la Organizacin Mundial de la Salud (WHO) los PCBs son clasificados como
cancergenos potenciales. Adems, estos compuestos pueden inducir alteraciones del
16
Marco referencial
sistema inmunolgico y disminuir las hormonas sexuales en los hombres, y disminuir el

crecimiento de los nios (Miller et al., 2009).
En la fauna tambin se ha podido observar algunas alteraciones como: disfuncin
tiroidea en peces y aves, disminucin de fertilidad en peces, aves, moluscos y
mamferos, deformidad en aves, peces y tortugas, anormalidades metablicas en aves,
peces y mamferos, y anormalidades del comportamiento en aves (Valls et al., 2011).
Dioxinas.
Son compuestos orgnicos persistentes, que se obtienen como subproductos de
procesos de fundicin, blanqueo de pulpa de papel con cloro, o de la fabricacin de
herbicidas y plaguicidas. Se encuentran ampliamente distribuidas, especialmente en
suelos, sedimentos y alimentos, especialmente productos lcteos, carnes, pescados y
mariscos.. La 2,3,7,8, tetraclorodibenzo-para-dioxina (TCDD) es la ms txica. La
exposicin breve del ser humano a altas concentraciones de dioxinas, puede causar
lesiones cutneas como acn clrico y manchas oscuras, as como alteraciones
funcionales hepticas. Alteraciones de los sistemas inmunitario, nervioso, endocrino y
reproductivo se han relacionado con la exposicin prolongada a estos compuestos
(World Health Organization, 2010)
Ftalatos
Los steres de ftalato son usados como plastificantes para aumentar la flexibilidad de
plsticos rgidos como el cloruro de polivinilo (PVC) usado en tubos rgidos y vlvulas.
Por esta caracterstica, su uso se ha implementado en la elaboracin de juguetes y
chupos. El ms utilizado en la industria, es el ftalato de bis(2-etilhexilo (FDHE). Se ha
sealado como uno de los problemas de estos plastificantes, es que al no estar
polimerizados dentro de la matriz, con el tiempo y uso estos compuestos se liberan y
migran al ambiente. En investigaciones realizadas en ratas y primates se pudo
establecer que en ratas, el consumo de FDHE produce toxicidad subcrnica con
hepatomegalia y un aumento de albmina srica. Tambin se ha reportado que pueden
inducir efectos reproductores adversos en animales como imposexualidad en moluscos,
aves, lagartos, y feminizacin o alteracin en fertilidad de panteras. (Bustamante et al.,
2001).
Captulo 1
17
1.2 Sustancias con actividad estrognica en el medio

ambiente
En el anlisis histrico realizado por Romano en el ao 2012 se sealan como hechos
importantes: en 1947 la disminucin significativa (80%) de la reproduccin de aves
debido a que se alimentaban con peces contaminados. En este mismo ao, se registr la
desaparicin de nutrias en los ros de Inglaterra. En la dcada de los sesenta, se report
una prdida alta de las cras de visones que habitaban en el Lago Michigan, debido a la
alimentacin con pescados contaminados con PCBs. Diez aos despus, nuevamente
se public que un alto porcentaje de las cras de las gaviotas que habitaban en los
Grandes Lagos, moran antes de salir del cascarn. A finales de los aos ochenta, los
zologos reportaron que slo una pequea cantidad de los huevos de caimanes del Lago
Apopka eran viables, los machos presentaban deformaciones en sus rganos
reproductores con caractersticas femeninas, y las hembras adolescentes presentaban
deformaciones en los ovarios. Despus de un anlisis cuidadoso, se pudo establecer que
estos efectos podran ser el resultado de la exposicin de estos organismos a un
derrame de dicofol y DDT ocurrido diez aos atrs. A inicios de la dcada de los noventa,
se present una alta mortandad en la poblacin de delfines del Mar Mediterrneo,
consecuencia de la exposicin de ellos a PCBs, paralelamente en Inglaterra se observ
procesos de feminizacin de peces debida a la presencia de compuestos con actividad
estrognica en los vertidos de la planta de tratamiento de aguas municipales.
Posteriormente en estudios realizados por, Routledge y Sumpter en 1997 se pudo
determinar los niveles de vitelogenina, (precursor de la protena de la yema de huevo de
peces), inducidos por la exposicin a diversos qumicos estrognicos. El gen VTG
(vitelogenina) est presente en machos pero usualmente no se expresa a menos que se
produzca su induccin por la presencia de sustancias con actividad estrognica. Por
ejemplo, se ha observado que en trucha arco iris, concentraciones de estrona (E1) de
hasta 25 ng/L producen una respuesta vitelognica. (Routledge et al., 1998). Igualmente,
Thorpe y colaboradores (2000) determinaron que valores menores a 5 ng/L de estradiol
producan la presencia de vitelogenina en truchas.
Dada la importancia del agua como un medio de exposicin, as como los desordenes
reproductivos detectados en animales expuestos a compuestos con actividad estrognica
presentes en el agua, desde hace algunas dcadas se comenzaron a realizar estudios en
18
Marco referencial
fuentes hdricas de diferentes pases en la bsqueda de disruptores endocrinos. Estudios

como el realizado por Beck en 2006, en aguas costeras de Alemania pertenecientes al
Mar Bltico, mostraron que de 29 muestras de agua analizadas en diferentes estaciones
de muestreo, 27 mostraron actividad estrognica mayor al 10% con intervalos de
concentracin entre 0,01 ng/L EEQ (Peninsula de Darss) y 0,82 ng/L EEQ (Baha interna
de Wismar). Sin embargo, al comparar la actividad estrognica medida con el ensayo
Yeast Estrogen Screen, y la equivalente calculada con base en la determinacin
qumica de compuestos estrognicos, se encontr que existan diferencias significativas
en estos valores, probablemente debido a la presencia de compuestos antiestrognicos
y/o a actividad estrognica desconocida, es decir, contaminantes no identificados. Los
compuestos que se encontraron principalmente provocando la estrogenicidad fueron
hormonas naturales y sintticas.
Estudios realizados en Italia por Vigano y sus colaboradores en el 2008, mostraron la
presencia de actividad estrognica en sedimentos (15,6 ng/g de equivalentes de
etinilestradiol-EE2) de la seccin media del ro Po. Fenmeno previamente detectado por
la presencia de atresia folicular e intersexualidad en gran parte de los peces, y que se
haba relacionado con la carga contaminante aportada por el ro Lambro tributario del ro
Po. Se determinaron altas concentraciones de hormonas naturales y sintticas en el
lecho del ro Po aguas abajo de la confluencia con el ro Lambro. Este ro drena las
aguas de una cuenca densamente habitada, la ciudad de Miln, con alrededor de cuatro
millones de habitantes) con mucha actividad industrial y un extenso plan agrcola. Los
resultados mostraron que E1, E3 y el nonilfenol son principlamente responsables de
actividad estrognica detectada, pero tambin otros qumicos no definidos cuya
presencia fue determinada por la tcnica Yeast Estrogen Screen.
Captulo 1
19
Tabla 1-1: Efectos ambientales relacionados con la presencia de estrgenos en las

aguas residuales (Tomado y traducido de Teske y Arnold, 2008)
DC
Sitio de muestra
Especies
Efecto EDC
Mezcla de agua
residual con PCB,
PDBE APEOs,
plaguicidas
(hormonas no
identificadas)
Ro Potomac, Washington,
D.C.
Peces
Intersexo (Oocitos en
testculos)
Efluentes de plantas
de aguas residuales
Mezcla no
identificada de
componentes
Reino Unido (Recibo de

aguas planta de aguas
residuales (ros)
Gobio Reltilus rutihual
Intersexo (vitelogenina,
huevos y cambio en
tejidos) caractersticas en
hombres
Bisfenol A
Resumen de varios estudios
Humanos
Desarrollo de cncer de
prstata
Bisfenol A

de laboratorio
Humanos
Sndrome poliqustico del

ovario, efectos
uterotrficos, esperma
disminuido, aumento en la
liberacin de prolactina
Octifenol
Estudio de laboratorio
Cepas de ratas Fisher

344 y Donyru/2
Celo persistente
EE2
Orizias latipeal
Intersexualidad en
machos: huevos en
testculos y desarrollo de
tejido anormal
EE2
Humanos
Desarrollo de cncer de
prstata
Nonilfenol (NP)
Ratas hembra
Sprague-Rawley
Ciclo de celo irregular y

comienzo acelerado de
desarrollo de tejido
Nonilfenol (NP)
Hombres
Disminucin en produccin
espermtica
17 -estradiol
Ratas
Demora en edad del primer

celo y apertura vaginal;
irregular as que persiste el
celo; desordenes en
desarrollo ovrico y
mamario
17 -estradiol
Estudio de campo
Tortugas hembras
pintadas Chrysemys
pictall
Niveles de E2 necesarios
para induccin de
vitelogenina de huevos
feminizados
Micropterus dolomieu
boca pequea
20
Marco referencial
En el Congreso Internacional sobre Riesgos para la Salud Pblica y el Medio Ambiente,

celebrado en mayo de 2012 en Madrid, se activ nuevamente la alarma sobre la
presencia de contaminantes orgnicos persistentes (COPs). En este evento, se destac
la relacin entre la presencia de EDC con las alteraciones del sistema reproductor
masculino y femenino, as como la aparicin de cncer en rganos hormono
dependiente. Se resalt adems, lo planteado en los estudios publicados en el 2001 de
Nicols Olea y colaboradores de la Universidad de Granada, sobre la forma en que dosis
bajas de EDC pueden generar efectos ms potentes que dosis altas, y se recalc la
importancia de las mezclas en la contaminacin ambiental.
En la actualidad, en la Comunidad Europea se est preparando el Sptimo Programa de
Accin sobre Medio Ambiente, en donde se pretende reducir la exposicin a disruptores
endocrinos, nanopartculas y sustancias que ocasionan un elevado nivel de
preocupacin. La carencia de conocimiento de los efectos nocivos de los nuevos
productos que se introducen da a da, hace necesario la implementacin de programas
de control ms restrictivos. En el momento, solo se conocen evaluaciones de riesgo de
181 sustancias qumicas de las ms de cien mil, con las que se elaboran alrededor de un
milln de productos para el mercado europeo y se permite la comercializacin de muchos
que no han sido evaluados y que fueron desarrollados antes de los 80s (Cerrud, 2012)
A pesar de que la Unin Europea invierte en programas de investigacin sobre los
efectos de estos qumicos, los resultados no se incorporan a las recomendaciones
comunitarias por falta del protocolo administrativo de comprobacin de pruebas (GLP)
que exige Bruselas. Adems, como se considera que el tema de los efectos provocados
en el organismo por los EDC son recientes, su deteccin no hacen parte de la pruebas
de toxicidad exigidas en la eurozona. Se espera que a finales del ao 2013 se regule la
identificacin de los EDC como sustancias nocivas (Cerrud, 2012).
1.3 Deteccin de sustancias con actividad estrognica

en agua
Se estima que en Estados Unidos se utilizan en forma corriente ms o menos 70.000
qumicos pertenecientes al grupo de los disruptores endocrinos. Es por ello, que
entidades como la US EPA, la industria y grupos interesados en el medio ambiente, han
venido trabajando en la bsqueda de estrategias orientadas al control y manejo de esta
Captulo 1
21
problemtica. Aunque es claro que en la actualidad no se tiene un panorama preciso

sobre la dimensin de este problema, se ha podido establecer que existen
concentraciones
significativas
de
disruptores
endocrinos
en
aguas
residuales,
superficiales, subterrneas, y de bebida, as como en sedimentos. Las mayores

concentraciones se encuentran en los sedimentos y en el agua residual, y las menores
en el aire y en el agua de bebida (Benfenati et al., 2003; Petrovic et al., 2004).
Una de las dificultades en la deteccin de los disruptores endocrinos, es que los
procedimientos para su medicin deben ser muy sensibles, ya que los efectos biolgicos
ocurren a muy bajas concentraciones. Por ello para la valoracin de este problema, en un
gran nmero de pases se han adoptado dos enfoques: la determinacin de la
concentracin del componente por procedimientos analticos como la cromatografa, o la
evaluacin de la actividad estrognica mediante ensayos biolgicos o ensayos no
celulares.
Tcnicas cromatogrficas
Mediante estas tcnicas se pueden determinar concentraciones de disruptores
endocrinos especficos. Algunas de ellas son: Cromatografa lquida de alta eficiencia
de deteccin por fluorescencia (HPLC-FLD) (Fan et al., 2005), Cromatografa de
gases/Espectrometra de masas (GC/MS) (Hernando et al., 2004), Cromatografa de
gases-Espectrometra de masas/Espectrometra de masas(GC-MS/MS) (Huang and
Sedlak 2001), Cromatografa lquida-Espectrometra de masas (LC-MS) (Petrovic y
Barcel, 2000 y Cromatografa lquida-Espectrometra de masas / Espectrometra de
masas (LC-MS/MS) (Benijts et al., 2004).
Estas tcnicas proveen alta sensibilidad y precisin para cuantificar la concentracin
de los disruptores endocrinos. El desarrollo del mtodo es un poco dispendioso y de
larga duracin, particularmente si tienen mezcla de compuestos. Adems requieren
grandes cantidades de muestra, procedimientos extensos de limpieza para purificarla
y los costos son algo elevados con respecto a otros procedimientos.
Ensayos no celulares
Son mtodos que permiten cuantificar EDC en el ambiente. El ELISA, se basa en la
unin de un anticuerpo (una protena) a un disruptor endocrino. Puede producir
fluorescencia por unin de enzimas a anticuerpos residuales libres (Hunag and Sedlak,
22
Marco referencial
2001). El ELRA (Enzime Linked Receptor Assay) consiste en una enzima unida a un
receptor como protena de unin (Seifert, 2004). El RIver ANAlyser (RIANA) es un
inmunosensor multianalito que usa la reflexin de la fluorescencia interna total para
determinar niveles de un analito orgnico especfico. Por el cambio del ligando de unin,
el RIANA se puede adaptar para deteccin de varios compuestos como por ejemplo E1,
E2 y EE2 (Rodriguez-Mozaz et al., 2004; Le Blanc et al, 2009).
Ensayos biolgicos
Son usados para detectar y monitorear la actividad estrognica generada por la
presencia de disruptores endocrinos. En estos ensayos, los organismos se exponen a la
accin de EDCs ya sea en el laboratorio (in vitro) o en el ambiente (in vivo). Los
ensayos in vitro en comparacin con los in vivo, son ms rpidos y econmicos.
El efecto de los EDCs sobre organismos multicelulares se realiza midiendo efectos
caractersticos ya sea sobre la anatoma (ejemplo: anormalidades de las gnadas), o
midiendo los niveles atpicos de la expresin proteica (ejemplo: produccin de
vitelogenina en peces macho). Los ensayos in vitro son comparativamente con los
ensayos in vivo, menos costosos, requieren factores de concentracin menores y los
lmites de deteccin son mucho ms bajos que los de los anlisis qumicos debido a su
especificidad. La deteccin en los ensayos in vitro, puede darse por un variado nmero
de mecanismos dentro de los cuales estn: la proliferacin celular, la induccin de la
vitelogenina, o la induccin de genes reporteros en organismos recombinantes (Campbell
et al., 2006).
El ensayo E-screen es un ejemplo de la manera en que la proliferacin celular puede
usarse para determinar la estrogenicidad de muestras de agua. En este ensayo se
cuantifica el efecto sobre la mitosis de clulas MCF-7 de cncer de seno, al tener
contacto con compuestos estrognicos (Soto et al., 1995). La vitelogenina (protena de la
yema del huevo) se produce como una respuesta a la presencia de estrgenos y se
encuentra normalmente en las hembras de los peces. En el ensayo, se hace una
extraccin del plasma de peces macho y se hace su cuantificacin (Jimnez, 1997)
La induccin de genes reporteros se ilustra en los ensayos ER y YES. En el primero, los
estrgenos se unen a receptores (ER) los cuales, cuando se activan se unen a los
elementos de respuesta estrognica (ERE), provocando la expresin del gen. El gen
Captulo 1
23
recombinante de la luciferasa colocado corriente abajo del ERE, da como resultando la

expresin de la luciferasa produciendo luminiscencia cuando hay exposicin a
disruptores endocrinos. La luciferasa se cuantifica midiendo la luminiscencia producida
por la oxidacin del sustrato luciferina.
El ensayo YES (Yeast Estrogen Screen) es una tcnica promisoria para cuantificar
compuestos capaces de unirse al receptor humano de estrgenos, mediante el uso de
una levadura recombinante que induce la actividad de una enzima medible como una
respuesta a la exposicin de estrgenos. La levadura expresa el receptor (ER)
recombinante, activando un elemento de respuesta estrognica (ERE) unido al gen
reportero cuando se expone a estrgenos. Saccharomyces cerevisiae es la levadura
recombinante utilizada como biosensor, y ha sido usada extensamente para investigar la
estructura del receptor y su funcin, as como tambin la actividad de diferentes ligandos.
Las ventajas de las levaduras sobre otros sistemas biolgicos son: falta de receptores
endgenos conocidos y una disposicin gentica que facilita la insercin de protenas de
mamferos y genes reporteros.
En el momento hay dos variaciones del ensayo: en una se usa Saccharomyces
cerevisiae con un DNAc del receptor estrognico humano y un gen reportero Lac Z
regulado por el elemento de respuesta a estrgenos (ERE) que codifica para la beta
galactosidasa (Figura 1-7). El compuesto con potencial actividad estrognica se une al
receptor hormonal, el cual se convierte en un receptor activo, ste a su vez estimula al
activador transcripcional y se expresa el gen reportero, que induce a la expresin de la galactosidasa. Esta enzima es liberada el medio y acta sobre un sustrato cromognico
como es CPRG (cloro fenol rojo -D galactopiransido) u ONPG (o-nitrofenil -Dgalactopiransido) produciendo galactosa y clorofenol rojo u o-nitrofenol respectivamente
(Keel et al., 2010), observndose para CPRG un cambio de color del medio de amarillo a
rojo o para ONPG de incoloro a amarillo. El resultado se detecta mediante la lectura
espectrofotomtrica a 550 nm.
Marco referencial
24
Figura 1-7: Mecanismo de accin del Saccharomyces cerevisiae recombinante en la

tcnica
Yeast
Estrogen
Screen.
Tomado
de:
http://www.engineering.auckland.ac.nz/uoa/water-pollution-assessment
Las ventajas del mtodo segn Balsiger y colaboradores (2010) son: el rpido
crecimiento de la levadura, facilidad del cambio plasmdico, disponibilidad del promotor,
alta conservacin de mecanismos de regulacin entre las clulas de mamferos y de
levaduras en relacin a este sistema, es altamente sensible y permite la determinacin
de varias muestras en corto tiempo. Sin embargo los EC50 son altos comparados con los
observados con clulas de mamferos, en los cuales se tiene un lmite bajo (0,07 pM).
Esta tcnica ha sido utilizada para investigar actividades mediadas por receptores
estrognicos de una serie de organoclorados y tensoactivos inicos.
Dentro de las desventajas se deben tener en cuenta factores como la permeabilidad de la
pared celular, variaciones en las cepas de Saccharomyces cerevisiae, diferencias en los
receptores, mecanismos de protelisis y capacidades metablicas, son algunas de las
posibles explicaciones a las diferencias en los resultados en la determinacin de algunos
compuestos con respecto a los otros mtodos.
La segunda variacin es la utilizacin de una levadura que usa el marcador URA3 como
gen reportero, en un ensayo de transactivacin fenotpica mediado por receptores
estrognicos.
El
gen
URA3
codifica
para
orotidina-5`fosfato
decarboxilasa
Captulo 1
25
(OMPdecarboxilasa) una enzima involucrada en la sntesis de uracilo. La levadura es

deficiente en la actividad de esta enzima, falla al presentar viabilidad en medio mnimo a
menos que el medio haya sido suplementado con uracilo. La cepa recombinante PL3
expresa el receptor estrognico humano y contiene el gen reportero URA3 que es
regulado por tres tndem de elementos de respuesta estrognica.
Los ensayos in vitro son relativamente econmicos, se realizan rpidamente, son
altamente sensibles y permiten el anlisis de compuestos individuales o pueden ser
usados para dar una medida integrada del efecto sinergstico de todos los componentes
en una muestra dada. Algunos proporcionan una sensibilidad superior y permiten la
deteccin de compuestos que ejercen efectos a niveles bajos de lmites de deteccin.
Adems muchos ensayos in vitro son capaces de detectar compuestos para los cuales
no hay mtodos analticos disponibles.
La bioactivacin e inactivacin de algunas sustancias por hidroxilacin, metilacin,
sulfonacin y aromatizacin han sido observadas en algunos modelos in vitro. Para
minimizar falsos negativos debido a la falta de activacin metablica de proestrgenos,
es prudente tambin probar metabolitos de sustancias estrognicas.
Los ensayos in vitro son complementarios y no sustitutos de pruebas in vivo. Muchos
interesados incluyendo agencias reguladoras, entidades dedicadas a la investigacin
cientfica, organizaciones comerciales y otros grupos han desafiado la utilidad y validez
de ensayos in vitro cuando investigan el riesgo potencial de una sustancia o mezcla
compleja. Los ensayos in vitro son sugeridos como el paso inicial en un proceso
investigativo que debe incluir verificacin del efecto adverso in vivo antes de implicar una
sustancia como estrognica en los humanos, la fauna y el medio ambiente.
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
Implementar la tcnica Yeast Estrogen Screen para evaluar la presencia de sustancias
estrognicas en aguas.
2.2 Objetivos especficos

Implementar la tcnica Yeast Estrogen Screen que utiliza el biosensor
Saccharomyces cerevisiae recombinante.
Obtener
la
carta
control
experimental
para
Saccharomyces
cerevisiae
recombinante utilizando como control el 17-B estradiol.
Evaluar la presencia de sustancias con actividad estrognica en diferentes tipos

de agua y analizar los resultados experimentales. .
3. Materiales y mtodos
Con base en los objetivos del trabajo se formul la siguiente estrategia metodolgica:
1- Montar e implementar la tcnica YES, as como evaluar su desempeo utilizando
17- -Estradiol como compuesto de referencia, y comparar su sensibilidad con la
obtenida por otros autores.
2- Aplicar la tcnica para la determinacin de la posible presencia de sustancias con
actividad estrognica en muestras de aguas de diferentes fuentes
3.1 Montaje e implementacin de la tcnica

3.1.1 Reconstitucin de la cepa de Saccharomyces cerevisiae
Para realizar esta etapa se solicit la donacin de la cepa recombinante de
Saccharomyces cerevisiae a la Dra. Marcia Dezotti del Laboratorio de Control de
Polucin de Aguas del Programa de Ingeniera Qumica de la Universidad Federal de Ro
de Janeiro en Brasil, la cual fue autorizada por el Dr. John Sumpter profesor de la
Universidad de Brunnel en Inglaterra. Esta cepa contiene un receptor estrognico (hER) en el genoma de la levadura y un gen reportero a nivel plasmdico (Lac-Z), que
codifica para la sntesis de -galactosidasa gracias a la ayuda del promotor
transcripcional o elemento de respuesta estrognica (ERE) y a un promotor fuerte (PGk)
(Figura 1-7).
El biosensor detecta el compuesto con potencial estrognico, cuando ste se une al
receptor hormonal, y se convierte en un receptor activo que estimula al activador
transcripcional para que se exprese el gen reportero, quien induce la expresin de la galactosidasa. Esta enzima se libera al medio y acta sobre un sustrato cromognico, ya
sea el CPRG (cloro fenol rojo -D galactopiransido) o el ONPG (o-nitrofenil -D-
28
Materiales y mtodos
galactopiransido), los cuales producen galactosa y clorofenol rojo o el o-nitrofenol

respectivamente (Keel et al., 2010). En el medio se produce un cambio de color, con el
primer sustrato el cambio es de amarillo a rojo y con el segundo de incoloro a amarillo.
Cualquiera de estos productos se detecta mediante la lectura en el espectrofotmetro
(Routledge & Sumpter, 1996).
Inicialmente, la cepa fue inoculada en los medios Minimum Essential Medium (MEM) y
Roswell Park Memorial Institute (RPMI), logrndose un crecimiento abundante lo que
permiti su conservacin a -70C en los medios anteriormente mencionados y glicerol.
Sin embargo, lo recomendable es seguir el protocolo de Roughtledge y Sumpter (1996)
(ver Anexo A y B), medio que posteriormente se utiliz en la prueba.
3.1.2 Evaluacin del crecimiento de la cepa

Inicialmente la cepa se propag sobre el medio YNB recomendado por Keel y
colaboradores en el 2010, en donde se observaron las caractersticas macroscpicas y
microscpicas.
Aunque el protocolo recomienda propagar la cepa a una temperatura de 28C, se
consider importante evaluar el crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae
recombinante a temperaturas de 28C, 30C y 32C. Para hacer esta evaluacin se
elabor la curva de crecimiento a estas tres temperaturas. Los experimentos se llevaron
a cabo en frascos de 250 mL, se utiliz un volumen de medio de crecimiento de 100 mL y
un volumen de inculo de 1 mL. El cultivo se incub a las temperaturas mencionadas con
agitacin (100 rpm) y el seguimiento se hizo cada 24 horas tomando muestras y
midiendo la densidad ptica a 630 nm. El inculo tena una densidad ptica entre 0,8 y 1
cuya concentracin era de aproximadamente 4 x 10 7 ufc/mL.
Captulo 3
29
Figura 3-1: Evaluacin del crecimiento de la cepa
Con los resultados se elabor la curva de crecimiento a las tres temperaturas (28C,
30C y 32C), graficando densidad ptica (D.O) contra el tiempo en horas. Se calcul la
pendiente, que corresponde a la tasa de crecimiento ().
(3.1)
3.1.3 Implementacin de la prueba YES

Para el montaje de la prueba, se sigui el protocolo recomendado por Roughtledge y
Sumpter, (1996). Tal como se recomienda en el procedimiento, se procedi a separar el
material de vidrio para las pruebas, el cual fue sometido a una cuidadosa limpieza para
evitar la presencia de contaminantes que pudieran dar resultados de falsos positivos.
Todo el material se enjuag dos veces con etanol absoluto y se dej secar. Igualmente
se prepararon las soluciones de ensayo.
En la implementacin de la prueba se evaluaron: tipos de agua para elaborar el medio de
cultivo (agua destilada desionizada, agua grado HPLC (High Performance Liquid
Cromatography) y agua grado USP para farmacuticos inyectables), mtodo de secado
de las placas, cepa conservada en dos medios y temperaturas diferentes para elaborar el
inculo, y tiempo de elaboracin de la solucin patrn de estradiol.
Materiales y mtodos
30
Compuesto de Referencia
Para los ensayos se prepar una solucin patrn de 21,6 mg/L de 17-estradiol marca
Calbiochem (Merck) (CAS 50-28-2) de 97% de pureza en etanol absoluto marca Chem
de 98% de pureza, a partir de la cual se hicieron diluciones seriadas en etanol absoluto
en serie preparando las siguientes concentraciones: 16875, 8437.5, 4218.75, 2109.38,
1054.70, 527.35, 263.70, 131.85, 66, 33, 16.5, 8.25, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 y 0.128 ng/L.
Adems se elabor una solucin stock de 10 mg/mL de cloro fenol rojo -D
galactopiransido sal sdica de 98,9% de pureza marca Calbiochem (Merck) (sustrato
cromognico), la cual se pasa por filtro de 0,2 m, recogiendo el filtrado en frascos de
vidrio estriles, en cabina de flujo laminar. Luego se almacena a 4C.
Protocolo de Prueba
A partir de cada una de las diluciones preparadas de 17--estradiol, se transfirieron 10 L
a cada uno de los pozos de la fila de la microplaca de 96 pozos y se dej evaporar hasta
sequedad en cmara de flujo laminar. Una vez se complet el secado, se adicionaron
200 L del medio de trabajo (Figura 3-4). Este medio se prepar adicionando a 50 mL de
medio de crecimiento, 500 L del cultivo de levadura (previamente crecido durante 24
horas y con una densidad ptica ajustada a 1) y 500 L de la solucin del sustrato
cromognico cloro fenol rojo - D galactopiransido (Figura 3-3).
En cada microplaca se colocaron:
1. Dos filas con la curva de 17 estradiol (diluciones mencionadas anteriormente
desde 16875 ng/L hasta 0,128 ng/L) (pozos A1 a B6 segn figura 3-2)
2. Una fila para el blanco (CPRG y medio de crecimiento)
3. Una fila para el control negativo (solvente, CPRG y medio de crecimiento).
Terminada la incubacin, las placas se dejaron en reposo por una hora para dejar que la
levadura sedimentara y se fuera al fondo de los pozos. A continuacin se procedi a
realizar la lectura en un lector de placas de ELISA BioRad a 540 nm (densidad ptica
para CPRG) y a 630 nm (densidad ptica para la turbidez producida por el crecimiento de
la levadura).
Captulo 3
31
Figura 3-2: Montaje de placa de ensayo
Figura 3-3: Preparacin de medio para la prueba YES

Crecimiento inculo 24 horas a 28C con agitacin a 100 rpm
Ajustar a densidad ptica 1
Tomar 50 mL de medio de crecimiento, adicionar 500 L de inculo de 24 horas de

crecimiento y 500 L de solucin de sustrato cromognico CPRG
Materiales y mtodos
32
Figura 3-4: Procedimiento para el montaje de la prueba YES
Tomar 10 L de cada dilucin de la curva de 17 -estradiol o de la muestra (agua tratada)

o del extracto de la muestra y colocar en un pozo de la microplaca. Dejar secar
completamente en la cmara de flujo laminar
Adicionar 200 L de medio para la prueba YES
Cubrir la placa con papel de filtro estril
Dejar en bao serolgico a 28C por 72 horas
Leer a 540 nm y 630 nm
Una vez implementada la tcnica se procedi a elaborar la curva concentracinrespuesta. Se realizaron 20 ensayos por duplicado con el 17 -estradiol y los resultados
obtenidos fueron corregidos utilizando la ecuacin 3.2 (Beresford, et al., 2000):
Valor corregido= D.O.muestra(540 nm)-[D.Omuestra(630 nm)-D.O blanco (630 nm)]
(3.2)
La actividad estrognica de las muestras ambientales se calcul interpolando la lectura
corregida en la curva dosis-respuesta del 17 -estradiol (E2) realizada con
concentraciones entre 16875 ng/L a 0,128 ng/L. La actividad estrognica se expres en
Equivalentes de Estradiol (EEQ). La curva de 17 -estradiol se ajust (funcin sigmoidal
con pendiente variable) utilizando el programa Sigma Plot, el cual calcula los valores
mnimos y mximos, la pendiente, el valor EC50 y los limites de confianza al 95%. El
lmite de deteccin se calcul como la densidad ptica producida por el control del
solvente, alcohol absoluto, ms tres desviaciones estndar segn Keel y colaboradores
en 2010.
Para establecer la reproducibilidad de la prueba se construy la carta control con los
resultados de EC50 obtenidos en veinte pruebas sucesivas con 17 -estradiol, con la
Captulo 3
33
cual se puede verificar la estabilidad de la respuesta biolgica obtenida con el

Saccharomyces cerevisiae recombinante. Se calcul el valor promedio y la desviacin
estndar de los resultados obtenidos, as como el lmite superior e inferior (promedio ms
o menos dos desviaciones estndar) para definir el intervalo de variacin en el que se
encuentra el valor de EC50 (Castillo, 2004). Los valores EC50 se graficaron colocando el
punto final (EC50) en la ordenada y el nmero del ensayo en la abscisa.
3.2 Localizacin de los sitios de recoleccin de las

muestras de agua analizadas
Para evaluar el comportamiento de la tcnica implementada se analizaron muestras de
agua de diferente origen (Figura 3-5) y con diversas caractersticas.
Se tomaron en total 15 muestras:
Tres muestras de corrientes superficiales utilizadas para abastecimiento humano:
Agua del embalse de La Regadera
Agua del nacimiento Aguas Fras (Municipio de Agua de Dios)
Agua del nacimiento Las Albercas (Municipio de Agua de Dios)
Dos muestras de agua tratada:

A la salida de la planta de potabilizacin del municipio de Funza
Agua del grifo del laboratorio de ingeniera ambiental de la Universidad Nacional
de Colombia (Sede Bogot)
Una muestra de agua cruda de fuente subterrnea del municipio de Funza

Nueve muestras de corrientes superficiales de reconocido grado de contaminacin, como
son la cuenca media y baja del ro Tunjuelito y la cuenca baja del ro Bogot y el ro
Sumapaz a la altura del municipio de Melgar. Tambin se analiz una muestra del ro
Magdalena despus de recibir la descarga del ro Bogot.
Materiales y mtodos
34
Figura 3-5: Localizacin de fuentes hdricas analizadas
Ubicacin de los sitios en donde se

tomaron las muestras de agua
Tomado y modificado de:http://www.sogeocol.edu.co/dptos/cundinamarca_04_hidrografia.jpg. 9 de marzo de 2013
De los ros Bogot, Magdalena, Sumapaz y Tunjuelo y del Nacimiento Aguas Fras se
colectaron 3 litros de agua, la cual se dividi en tres submuestras: una para los anlisis
fsico-qumicos, otra para los anlisis microbiolgicos y otra para la prueba de actividad
estrognica. Cabe aclarar que las pruebas fsico-qumicas y microbiolgicas fueron
realizadas por el personal que labora en el laboratorio de ingeniera ambiental de la
Universidad Nacional de Colombia. De las dems muestras (Grifo Universidad Nacional,
Captulo 3
35
agua subterrnea tratada y no tratada de Funza y Nacimiento Las Albercas) solo se

colect un litro para realizar la determinacin de actividad estrognica.
3.2.1 Preparacin de las muestras

A las muestras se les determin la actividad estrognica sin ningn tratamiento. Con
excepcin de la muestra de agua del grifo de la Universidad Nacional de Colombia todas
las muestras fueron filtradas utilizando un
filtro de 0,45 m y a este filtrado se le
determin la actividad estrognica. Quinientos mililitros (500 mL) de las muestras filtradas
se sometieron a extraccin en fase slida y a estos extractos se les determin la
actividad estrognica mediante la tcnica Yeast Estrogen Screen (YES).
Se evalu el proceso de extraccin en fase slida llevando a cabo varios procedimientos
con diferentes solventes. Para ello se utilizaron 100 mL de agua de la llave a la cual se le
adicionaron 100 L de solucin de 17 -estradiol cuya concentracin era 21,6 mg/L. Los
procedimientos evaluados fueron los siguientes:
1. Acondicionamiento del cartucho C-18 (Sep-Pak) con agua miliQ, metanol, acetato
de etilo y n-hexano (2:1:1:1:1). Posteriormente se realiz la elucin con metanol,
acetato de etilo y n-hexano (1:1:1)
2. Acondicionamiento del cartucho C-18 con agua miliQ, metanol, acetato de etilo y
n-hexano (2:1:1:1). Posteriormente se realiz la elucin con metanol, etanol
absoluto y n-hexano (1:1:1)
3.
Acondicionamiento del cartucho C-18 con diclorometano, metanol y agua

grado HPLC (High Performance Liquid Cromatography) (1:1:1). Posteriormente se
eluye con etanol absoluto marca Merck grado analtico 99% de pureza (1).
Los resultados obtenidos mostraron que el mayor porcentaje de recuperacin fue 30,32%
logrado con el acondicionamiento del cartucho con diclorometano, metanol y agua grado
HPLC (High Performance Liquid Cromatography) (1:1:1) y elucin con etanol absoluto,
razn por la cual se adopt esta metodologa para la extraccin de sustancias con
actividad estrognica que se podan encontrar en las diferentes muestras de agua
tomadas para este estudio.
36
Materiales y mtodos
Figura 3-6: Procedimiento para extraccin de muestras en fase slida
3.3 Anlisis fsico qumicos y microbiolgicos

Aunque se haba previsto, realizar el anlisis fsico qumico y microbiolgico a todas las
muestras, a la muestra del nacimiento Las Albercas, y a las muestras de agua
subterrnea tratada y no tratada de Funza no se les realizaron. A todas las dems
muestras colectadas (ro Bogot, ro Magdalena, ro Sumapaz y ro Tunjuelo) se les
determin de DQO, DBO, pH, slidos disueltos, slidos suspendidos, conductividad,
turbiedad, grasas, SAAM, oxigeno disuelto, hierro, manganeso, fsforo y cromo (APHA,
2002). As como tambin se les realizaron los anlisis microbiolgicos coliformes totales
y Escherichia coli (APHA, 2002). Los anlisis fueron realizados en el Laboratorio de
Ingeniera Ambiental, del Departamento de Ingeniera Civil y Agrcola de la Universidad
Nacional de Colombia.
4. Resultados y discusin
Inicialmente la cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante fue repicada en los
medios MEM y RPMI. En estos medios se logr un adecuado crecimiento, por lo que se
procedi a preparar subcultivos que fueron preservados a -70C. Con estos subcultivos
se procedi a la realizacin de los ensayos preliminares para verificar la viabilidad de la
cepa, y la respuesta a la presencia de sustancias estrognicas.
4.1 Caractersticas morfolgicas y de crecimiento de la

cepa Saccharomyces cerevisiae
La inoculacin y propagacin de la cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante en
el medio mnimo y en el medio YNB (Yeast Nitrogen Base without aminoacids)
suplementado con lisina (2%) e histidina (2%), mostr un adecuado crecimiento, con
colonias caractersticas de color blanco, redondas y de borde liso.
Los resultados de los experimentos para evaluar el crecimiento de la cepa a
temperaturas de 280C, 300C, y 320C se presentan en la Figura 4-1. Como se puede
observar, a 280C la cepa inicia un rpido crecimiento el cual empieza a desacelerarse a
partir del segundo da cuando se inicia la fase estacionaria. En contraste, a 30C y 320C
durante las primeras 24 horas el crecimiento es ms lento, y solo a partir de este
momento se acelera hasta lograr su mximo a las 72 horas.
El mximo rendimiento celular se logra a 280 C cuando se alcanza una densidad ptica
de 1.8, mientras que a 30C y 320C para el mismo tiempo solo se logra una densidad
ptica de 1,43 y 1,48 respectivamente. Aunque no hay diferencia en las tasas de
crecimiento (0,35 d-1) a 30C y 320 C, la tasa obtenida a 280C es ligeramente mayor (0,36
d-1), por lo que se adopt esta temperatura para realizar los ensayos.
38
Resultados y discusin
Figura 4-1: Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae recombinante a 28C,

30C y 32C en medio de crecimiento elaborado segn protocolo.
4.2 Implementacin de la tcnica

Para la realizacin de los ensayos preliminares se utiliz agua destilada desionizada para
la preparacin del medio de cultivo y del control positivo de 17- estradiol (16875 ng/L), y
como control negativo etanol absoluto sin embargo, se encontr un cambio de color en
todos los pozos, es decir, una respuesta positiva (Figura 4-2). Este fenmeno fue el
resultado de la contaminacin de los pozos por los problemas de evaporacin y
condensacin del agua en el bao serolgico utilizado durante el estudio.
Este problema se solucion colocando papel de filtro estril entre la tapa y la base de la
placa, de tal forma que recogiera el agua de condensacin y a la vez mantuviera la placa
hmeda sin contaminarla, lo que fue una solucin efectiva para la realizacin de los
ensayos.
Captulo 4
39
Figura 4-2: Efecto de la contaminacin con agua de condensacin sobre los resultados
de la prueba con 17 -estradiol.
17 -estradiol
Control negativo
17 -estradiol
Control negativo
Adicionalmente, para descartar el agua como un promotor de falsos positivos

(Monsalvez, 2007), se prob la tcnica de acuerdo al protocolo especificado en la
metodologa utilizando diferentes tipos de agua: agua grado HPLC, agua grado USP para
farmacuticos inyectables y agua destilada desionizada (Figura 4-3). All se presentan los
resultados obtenidos para los diferentes tipos de agua. Como se puede observar no se
present viraje en el color, lo cual indica que ninguna de las aguas presenta sustancias
con actividad estrognica, es decir, que no daran resultados falsos positivos.
Figura 4-3 Resultados de los ensayos de la prueba YES realizados con los diferentes
tipos de agua. a) agua grado HPLC de la Universidad Nacional de Colombia, b) agua
grado HPLC Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, c) agua estril para
inyectables y d) agua destilada desionizada.
(a)
(b)
(c)
(d)
40
Igualmente se valor el efecto del solvente en la intensidad del color en el ensayo (Figura
4-4), encontrndose que no hay diferencias en los resultados de color obtenidos con
propanol, metanol y DMSO y los obtenidos con etanol absoluto.
Figura 4-4: Resultados de los ensayos de la prueba YES con a) metanol, b) etanol
absoluto, c) dimetilsulfxido y d) propanol como solventes del 17 -estradiol y e)
controles de solventes.
(a)
(b)
(e)
(c)
(d)
Los resultados de los ensayos preliminares mostraron que los siguientes elementos son
crticos para el desarrollo de la prueba:
a) Preparacin de las soluciones estndar: debe ser reciente para evitar riesgos de
degradacin.
b) Hacer el secado de las placas en cabina de flujo laminar o a temperatura
ambiente
c) Utilizar un inculo fresco proveniente de congelacin y no de repiques sucesivos
a partir de agar
4.3 Tcnica YES

Con los resultados de los ensayos preliminares se procedi a implementar el protocolo
recomendado por Routgledge y Sumpter (1996). Se realizaron 28 ensayos con 17 beta
estradiol con concentraciones entre 16875 ng/L y 0,128 ng/L. Los resultados de las 28
pruebas se presentan en la tabla del Anexo C. En dicha tabla se presentan los resultados
del coeficiente de variacin del ensayo para las 28 pruebas realizadas, en donde se
Captulo 4
41
evidencian porcentajes entre 14,17% hasta 33,96% entre las concentraciones 16875 ng/L
a 0,256 ng/L, observndose a mayores concentraciones menor variabilidad, diferente a lo
que se observa a la menor concentracin analizada, 0,128 ng/L, en donde se encontr
una variabilidad de 57,09%.
Se calcul para cada ensayo la concentracin efectiva 50 (EC50) utilizando el programa
estadstico Sigma Plot, junto con los lmites de confianza al 95%. Con estos valores se
elabor la carta control de la prueba, mostrando el promedio ms o menos dos
desviaciones estndar (Figura 4-5). Los resultados correspondientes a los veinte ensayos
mostraron que el valor promedio de la EC50 fue de 79,1 ng/L con una desviacin
estndar de 11 ng/L, valores del mismo orden de magnitud que los obtenidos por Keel y
colaboradores (2010) de 70,8 ng/L 13 ng/L y los reportados por Gaido y colaboradores
(1997) de 65,9 ng/L 8 ng/L en 1997 y Roughledge (1996) de 55,3 ng/L 18 ng/L. Se
obtuvo adems el lmite de deteccin, la cual se calcul como la concentracin de 17 estradiol obtenida con el control negativo, es decir etanol absoluto, ms tres desviaciones
estndar. El resultado que se obtuvo fue 4 ng/L de EEQ (Equivalentes de 17 -estradiol).
EC50 17- estradiol (ng/L)
Figura 4-5: Carta control de tcnica Yeast Estrogen Screen con 17 estradiol
120
100
EC50
promedio
P. + 2 Desvest
P. - 2 Desvest
80
60
40
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
nmero de ensayo
4.4 Curva concentracin-respuesta

En la figura 4-6 se presenta la curva concentracin-respuesta para las diferentes
concentraciones de 17 -estradiol (0,128 ng/L a 16875 ng/L) expresada como la actividad
de la -galactosidasa. Para la medicin de esta actividad se utiliz el programa Sigma
Plot.
42
Como se puede apreciar, la respuesta mxima en trminos de densidad ptica se

encontr que oscilaba entre 0,85 y 0,96. La EC50 promedio fue de 79,1 ng/L 11 ng/L
con un r2 de 0,99 valor aceptable de acuerdo al r2 >0,95 (Nelson, 2007).
Figura 4-6: Densidad ptica relativa vs. Concentracin de 17 -estradiol
4.5 Determinacin de actividad estrognica de muestras

ambientales
Los resultados de la evaluacin del proceso de extraccin en fase slida (EFS) se
presentan en la tabla 4-1. Como el procedimiento con el que se obtuvo mayor porcentaje
de recuperacin fue el C, se procedi a hacer la extraccin de las muestras.
Captulo 4
43
Tabla 4-1: Porcentaje de recuperacin de acuerdo a solventes utilizados en el

procedimiento de extraccin en fase slida
Solventes
acondicionamiento
Procedimiento
del cartucho C-18

Agua grado HPLC,
metanol, acetato de
etilo y n-hexano
Agua grado HPLC,
metanol, acetato de
etilo y n-hexano
Solventes para
Porcentaje de
elucin
recuperacin
Metanol, acetato de
etilo y n-hexano
Metanol, etanol
absoluto y n-hexano
0%
13 %
Diclorometano,
C
metanol y agua grado
Etanol absoluto
30,32 %
HPLC
Los resultados de los ensayos de actividad estrognica de las muestras de aguas

superficiales, sometidas a filtracin (0,45 m) y a extraccin en fase slida se presentan
en la tabla 4-2, para lo cual se tuvo en cuenta el promedio de las densidades pticas (ver
Anexo E). Se observaron resultados positivos despus del proceso de extraccin en fase
slida en las muestras del ro Bogot a nivel de Tocaima, y en el ro Tunjuelo a nivel del
relleno sanitario de Doa Juana, en los sitios de canteras, en la zona de curtiembres y en
frente del frigorfico.
Como se puede observar en la Tabla 4-2, al efectuar la prueba de estrogenicidad con
muestras de agua sin filtracin, ni extraccin, de los ros Sumapaz, Magdalena, Bogot, y
ro Tunjuelo a nivel de las curtiembres y del sector de Bosa, se observa una respuesta
positiva. Es posible, que debido a los altos recuentos bacterianos obtenidos con estas
muestras (Tabla 4-3) pueden contribuir a dar reaccin falsa positiva, ya que estas
poblaciones pueden actuar sobre el sustrato cromognico (CPRG) dando una respuesta
positiva, fenmeno previamente descrito por Cline (1992).
44
Tabla 4-2: Resultados de actividad estrognica obtenidos con las diferentes muestras de
aguas
LUGAR
ACTIVIDAD ESTROGNICA (ng/L EEQ)

MUESTRA
COMPLETA
MUESTRA
FILTRADA
EXTRACCION EN
FASE SLIDA
(EFS)
Agua No tratada Funza
< 4 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
Agua tratada Funza
< 4 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
Nacimiento Las Albercas
< 4 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
Nacimiento Aguas Fras
< 4 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
Grifo UNAL
< 4 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
Ro Sumapaz
6 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
Ro Magdalena
12 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
Ro Bogot
8 ng/L
< 4 ng/L
12 ng/L
< 4g/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
Zona Usme
< 4 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
Zona relleno
< 4 ng/L
< 4 ng/L
8 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
8 ng/L
65 ng/L
< 4 ng/L
14 ng/L
< 4 ng/L
< 4 ng/L
20 ng/L
12 ng/L
65 ng/L
< 4 ng/L
Embalse La
Regadera
Rio Tunjuelo
Doa Juana
Zona
canteras
Zona
curtiembres
Zona
frigorfico
Sector Bosa
Captulo 4
45
Al comparar los resultados de las muestras sin filtrar con los resultados obtenidos con las
muestras filtradas y extradas de los ros Sumapaz y Magdalena, se observa que la
remocin de slidos, y la subsiguiente extraccin de sustancias solubles en etanol, hace
que en algunos casos no se evidencie la presencia de sustancias con actividad
estrognica. Es posible que algunos de los compuestos con actividad estrognica se
encuentren unidos a los slidos suspendidos (Drews et al., 2006) y por ello al realizar la
lectura inicial, es decir, sin tratamiento dio resultado positivo. En el caso del ro Sumapaz
el valor de slidos suspendidos fue 476 mg/L y el valor de sustancias con actividad
estrognica fue 6 ng/L de equivalentes de estradiol (EEQ). Posteriormente al ser
removidos estos slidos se elimina su actividad dando como resultado una respuesta no
detectable (<4 ng/L).
Sin embargo, en el caso de las muestras del ro Bogot y del ro Tunjuelo a nivel de las
curtiembres, los resultados mostraron que la prueba despus de la filtracin produce un
resultado negativo, y despus de la extraccin en fase slida la respuesta es positiva.
Estos resultados estaran evidenciando que parte de la actividad estrognica podra estar
asociada a los slidos suspendidos, pero que existe una fraccin soluble suficiente para
dar una respuesta positiva despus de la extraccin. Es importante anotar que las aguas
del ro Bogot a nivel de Tocaima han recibido las descargas de todos sus afluentes y las
de las aguas provenientes de la planta de tratamiento de aguas residuales del Salitre, por
lo que existe una alta probabilidad de encontrar compuestos con actividad estrognica
que no son degradados durante el recorrido del ro, como se seala en estudios
realizados en otros pases (Matsuoka et al., 2005; Hohenblum et al., 2004; Vigano et al.,
2008 )
En el ro Tunjuelo a la altura del relleno de Doa Juana se observan valores de actividad
estrognica de 8 ng/L EEQ (muestra de extraccin en fase slida). Estos valores se
podran relacionar con los lixiviados provenientes de la zona que se mezclan con las
aguas superficiales, para lo cual se deben tener en cuenta adems los valores de slidos
suspendidos (550 mg/L) conductividad (128,9 S/cm), fsforo (8,42 mg/L) y hierro (1,4
mg/L). Ms adelante, a la altura de las canteras, se siguen manteniendo los valores de
actividad estrognica y debido a los productos, subproductos y desechos de la actividad
minera que se obtienen en este lugar, se observa un valor un poco ms elevado de la
conductividad (167,2 S/cm), con respecto a la muestra del relleno, con la deteccin de
valores de manganeso y hierro.
46
En la zona de las curtiembres se obtuvieron resultados detectables de sustancias con

actividad estrognica (14 ng/L de EEQ). Esto se puede relacionar con el tratamiento que
se realiza a las pieles usando una variedad de compuestos qumicos, los cuales en la
mayora de las ocasiones al ser utilizados se arrojan a las fuentes hdricas ms cercanas
sin previo tratamiento. Se destacan adems los valores de SAAM (0,138 mg/L) y trazas
de cromo.
Es importante resaltar que en el rea del rio Tunjuelo cerca al frigorfico, aunque los
valores de DBO y DQO no son tan altos, las grasas (8,2 mg/L) muestran el valor ms alto
de los sitios estudiados. Los residuos que se producen de esta industria generalmente,
tienen un buen porcentaje de grasa, dado los procesos de sacrificio y faenado de los
animales para comercializar. Por otro lado en este tipo de actividades se utilizan
detergentes etoxilados como productos de limpieza, lo que puede evidenciar la respuesta
estrognica que se encontr en dicha muestra (20 ng/L EEQ).
Es interesante sealar con respecto a la muestra del sector de Bosa que cuando se
remueve el material suspendido y coloidal por filtracin la actividad estrognica aumenta,
pero al hacer la extraccin en fase slida, la actividad no se detecta. Es posible que la
extraccin elimine algunos compuestos que pueden haber reaccionado, dando lugar a la
respuesta negativa. A este nivel, el agua tiene un alto valor de DBO y DQO, gran
cantidad de slidos disueltos y grasas, as como sustancias activas al azul de metileno
(SAAM), nutrientes (fsforo y nitrgeno) y bacterias (tabla 4-3), lo cual puede contribuir a
que se presenten interferencias alterando los resultados de la prueba (Mahecha 2012).
Adems de toda la contaminacin que trae el ro en su previo recorrido, se puede notar
por el valor de sustancias activas al azul de metileno (0,33 mg/L) que por el sector se
adicionan muchos compuestos de origen domstico.
Por otro lado, es importante sealar que el crecimiento de la levadura a las 72 horas
(tiempo de lectura de la prueba) fue muy pobre, lo cual habra podido contribuir a estos
resultados. Autores como Lyttle (Lyttle et al., 1992) sealan que en algunos casos,
especialmente cuando hay una alta concentracin de contaminantes, se genera una
condicin de estrs que altera la permeabilidad de la pared de la levadura, y por tanto la
entrada de contaminantes (Aguilar-Uscanga et al. 2003) (Klis,. 2006).
En el caso del ro Tunjuelo la actividad detectada puede ser el resultado del tipo de
descargas que este ro recibe a lo largo de su recorrido. Aunque no se hicieron
Captulo 4
47
mediciones por otro mtodo que evidencie la presencia de compuestos capaces de

desencadenar actividad estrognica, los valores de equivalentes de estradiol
encontrados (entre 8 y 20 ng/L EEQ) corresponden a intervalos de concentracin
reportados por otros autores en corrientes superficiales con caractersticas similares, en
los cuales se ha podido demostrar la presencia de estradiol y estrona (Bryant, 1993;
Kolpin, 2002).
En la Figura 4-7 se observa que los valores de DBO, DQO, slidos disueltos,
conductividad elctrica, SAAM, coliformes totales y fecales y actividad estrognica
aumentan en el ro Tunjuelo para el tramo entre el relleno Doa Juana y el sector de
Bosa. Se puede identificar un aumento debido a la carga de materia orgnica que recibe
el ro por la descarga de los lixiviados en el relleno, los efluentes de las canteras, los
residuos del tratamiento del cuero en las curtiembres y los productos de desecho
provenientes del frigorfico y la contaminacin de tipo domstico en el sector de Bosa.
48
Captulo 4
49
Figura 4-7: Variabilidad de los resultados de la pruebas fsico-qumicas, microbiolgicas

y de actividad estrognica en el ro Tunjuelo en el tramo comprendido entre el relleno
(ng/L) EEQ
Actividad
estrognica
Colif. fecales
(ufc/100mL)
Colif. Totales
(ufc/100mL)
SAAM
(mg/L)
conductividad
(S/cm)
S. disueltos
(mg/L)
DBO
(mg/L)
DQO
(mg/L)
Doa Juana y el sector de Bosa.
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
Los resultados obtenidos en la presente investigacin permitieron hacer las siguientes
conclusiones:
La tcnica Yeast Estrogen Screen es sensible y puede ser utilizada como una
herramienta inicial para la deteccin de la presencia de compuestos con actividad
estrognica y puede ser utilizada con muestras ambientales.
La combinacin de anlisis fisicoqumicos y microbiolgicos con pruebas

biolgicas como la tcnica Yeast Estrogen Screen, permite valorar en forma
amplia los problemas de contaminacin especialmente, cuando se abordan
problemas complejos como los del Ro Bogot y Tunjuelo.
5.2 Recomendaciones
A partir de los presentes resultados se hacen las siguientes recomendaciones:
Hacer determinaciones de actividad estrognica mediante la tcnica Yeast

Estrogen Screen en muestras de agua, y confirmar con anlisis cromatogrfico la
presencia de compuestos qumicos especficos.
Iniciar estudios en plantas de tratamiento de aguas residuales con el fin de

establecer la posible degradacin de estos compuestos estrognicos
Anexo A: Formulacin del medio mnimo

segn Roughtledge y Sumper (1996)
Para la preparacin de un litro de medio mnimo se requieren las siguientes cantidades
de reactivos:
Compuesto
Cantidad (g/L de agua destilada

desionizada)
KH2 PO4
13.61
(NH4)2S04
1.98
KOH pellets
4.2
MgSO4
0.2
Fe2(S04)3 solution (40 mg/50 ml H20)
1 mL
L-Ieucine
0,050
Histidina
0,050
adenine,
0,050
L-arginine-HCI
0,020
L-methionine
0,020
L-tyrosine
0,030
L-isoleucine
0,030
lysine-HCI
0,030
L phenylalanine
0025
L-glutamic acid
0,100
L-valine
0,150
Lserine
0,375
52
Anexo A
Colocar en agitacin con calor para disolver. Dispensar en alcuotas de 45mL en frascos
de vidrio y esterilizar a 121C por 10 min, y almacenar a temperatura ambiente.
Anexo B: Requerimiento de componentes

adicionales
para
preparar
medio
de
crecimiento segn Roughtedge y Sumpter
(1996)
Componentes
Cantidad para elaborar

50mL de medio de
crecimiento
Solucin de glucosa al 20%
5 mL
Solucin de Acido asprtico 4mg/mL
1,25mL
Solucin de vitaminas (90mL)
0,5 mL
4 mg tiamina
4 mg piridoxina
4 mg cido pantotnico
20 mg inositol
10 mL de solucind de biotina (2mg/100mL agua )
Solucin de treonina 24mg/mL
0,4mL
Solucin de sulfato de cobre II 20mM
125L
Para la preparacin del medio de crecimiento se requieren las siguientes soluciones:

D (+) Glucosa:
Preparar una solucin al 20% p/v. Esterilizar en alcuotas de 20mL a 121C por 10 min.
Almacenar a temperatura ambiente.
54
Anexo B
L-Acido asprtico:
Preparar una solucin stock de 4mg/mL. Esterilizar en alcuotas de 20mL a 121C por 10
min. Almacenar a temperatura ambiente.
Solucin de vitaminas:
A 180 mL de agua doblemente destilada adicionar 8 mg de tiamina, 8mg de piridoxina,
8mg de cido pantotnico, 40mg de inositol y 20mL de solucin de biotina (2mg/100mL
de agua).
Esterilizar mediante filtro de 0,2m en cabina de flujo laminar. Dejar en alcuotas de
10mL. Almacenar a 4C.
L-treonina:
Preparar una solucin de 24mg/mL. Esterilizar en alcuotas de 10mL a 121Cpor 10 min.
Almacenar a 4C.
Sulfato de cobre:
Preparar una solucin a 20mM. Esterilizar mediante filtro de 0,2m en cabina de flujo
laminar. Almacenar el filtrado en frascos en alcuotas de 5mL. Almacenar a temperatura
ambiente.
Anexo C: Tabla de densidades pticas

corregidas de los 28 ensayos
56
Anexo C
Anexo D: Tabla de densidades pticas

corregidas de los 20 ltimos ensayos para
la carta control
Anexo E: Tabla de densidades pticas

corregidas de las muestras de agua
analizadas
Tunjuelo.
**Las muestras procesadas con esta curva y este control fueron las muestras de la cuenca media y baja del
Magdalena, Nacimiento Las Albercas y Aguas Fras, y las aguas tratadas y no tratadas de Funza.
*Las muestras procesadas con esta curva y este control fueron las muestras del ro Bogot. Sumapaz,
Promedio de densidades pticas de muestras analizadas
60
Anexo E
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Implementacin de la tcnica Yeast

Estrogen Screen para evaluar la

Patricia Cifuentes Prieto

Universidad Nacional de Colombia

Implementacin de la tcnica Yeast

Universidad Nacional de Colombia

especialmente a mi madre por su apoyo

Agradezco a las personas del laboratorio central de la Universidad Colegio Mayor de

tcnica YES es una buena

herramienta para detectar la presencia de

5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 50

Tabla 1-1: Efectos ambientales relacionados con la presencia de estrgenos en las

Concentracin mediana efectiva

Compuestos de disrupcin endocrina

Enzyme Linked InmunoSorbent Assay

Enzyme Linked Receptor Assay

Yeast Estrogen Screen

Elementos de Respuesta Estrognica

Environment Protection Agency United States

Dominio de union a ligando

Guanidin monofosfato cclico

Adenin Monofosfato cclico

World Health Organization

Ftalato de di2 etilo-hexilo

Compuestos orgnicos persistentes

High Performance Ligand Chromatography with

Liquid Chromatography- Mass Spectrometry

Michigan Cancer Foundation-7

Cloro Fenol Rojo Beta D-Galactopiransido

O-nitrofenil Beta D-Galactopiransido

OMPdecasa Orotidina 5fosfato decarboxilasa

Minimum Essential Medium

Roswell Park Memorial Institute Medium

Demanda Bioqumica de Oxgeno

Demanda Qumica de Oxgeno

Dentro de este variado grupo de compuestos, se encuentra un grupo denominado

En el caso de Colombia, aunque se cuenta con una normatividad ambiental, y existen

especficamente con los EDCs, la situacin es crtica, dada la amplia variedad de

Dentro de los ensayos no celulares, el mtodo ms conocido es el de ELISA (Enzyme

Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, as como el grado de contaminacin

Aunque en condiciones ptimas, el mejor acercamiento al estudio de la contaminacin

colectadas en los ros Bogot, Magdalena, Sumapaz, y Tunjuelo. Igualmente, a muestras

El trmino disruptor endocrino define un conjunto diverso y heterogneo de compuestos

1.1 Disruptores endocrinos

fungicidas (mancozeb y zineb), bifenilos policlorados (PCB`s), detergentes no inicos,

Figura 1-1: Agrupacin de hormonas esteroideas

Figura 1-2: Anillo fenlico A en diferentes estructuras qumicas estrognicas

Los estrgenos estimulan el crecimiento y diferenciacin de las clulas del tejido

previamente un intermediario, el 16--hidroxi-estrona que posee alta estrogenicidad

La mayora de las presentaciones farmacuticas a partir de estrgenos naturales

Etinilestradiol: tiene gran potencia estrognica (20 g es la dosis de tratamiento

et al., 1998), lo cual aumenta la resistencia a la degradacin y la persistencia en

Mestranol: es el ster metlico del etinilestradiol. Tiene un grupo metilo en el

Quinestrol: es un ster ciclopentlico del etinilestradiol y se caracteriza por su gran

Ciclopentilpropianato (Estradep ), valerato (Progynon Depot ) y el benzoato

Otro derivado sinttico de accin estrognica no esteroidal son dinestrol,

La especificidad de la accin estrognica depende de la presencia de receptores

al conocido previamente, y RE-

receptores alfa y beta poseen

diferentes funciones dependiendo del tejido donde ejercen su accin. Funcionalmente el

Efectos genmicos del receptor estrognico

El receptor es activado al unirse al ligando, y acta como un factor transcripcional al

Efectos no genmicos del receptor estrognico

Son procesos rpidos que ocurren en minutos o segundos y no requieren procesos de